Qui định chung
Kỹ thuật này áp dụng để thử vô khuẩn nhằm phát hiện sự có mặt của vi khuẩn, nấm mốc và nấm men trong các nguyên liệu, chế phẩm và dụng cụ mà theo tiêu chuẩn riêng cần phải vô khuẩn. Thử vô khuẩn phải được tiến hành trong điều kiện vô khuẩn như trong buồng thổi khí vô khuẩn hoặc trong buồng sạch để mẫu thử không bị ô nhiễm. Trong quá trình thử, mẫu không được tiếp xúc với các tác nhân có ảnh hưởng đến vi khuẩn, nấm mốc, nấm men (như: tia tử ngoại, chất sát khuẩn, nhiệt độ cao ...). Các dụng cụ, dung môi, môi trường nuôi cấy phải được diệt khuẩn trước khi dùng.
Phƣơng pháp thử
Nguyên tắc
Nếu vi khuẩn, nấm mốc, nấm men được cấy vào môi trường có chất dinh dưỡng và nước, được giữ ở điều kiện nhiệt độ thích hợp thì chúng sẽ phát triển. Sự có mặt của vi sinh vật làm cho môi trường biến đổi trạng thái từ trong sang đục, hoặc có cặn lắng ở đáy môi trường, hoặc thay đổi màu sắc môi trường.
Chọn một trong hai phương pháp thử thường dùng là phương pháp màng lọc hoặc phương pháp cấy trực tiếp. Khi tiến hành thử phải làm sạch bề ngoài của ống (hoặc chai, lọ, bình ...) đựng chế phẩm bằng một chất sát khuẩn thích hợp. Sau đó lấy một lượng chế phẩm đủ dùng theo qui định, cấy trực tiếp vào môi trường (nếu theo phương pháp cấy trực tiếp) hoặc theo phương pháp màng lọc: Đem chế phẩm sau khi đã được hoà loãng với dung môi thích hợp lọc qua màng lọc, rồi cắt các màng lọc thành miếng nhỏ đem nhúng vào môi trường, ủ môi trường đã cấy chế phẩm hoặc cấy màng lọc trong thời gian qui định.
Chuẩn bị môi trƣờng và dung môi
Môi trường để phát hiện vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí
Môi trường thioglycolat có thạch (dùng cho thử nghiệm những chế phẩm lỏng và trong). Môi trường thioglycolat không có thạch (dùng cho thử nghiệm những chế phẩm đặc hoặc đặc sền sệt dạng cao).
48
Cả hai loại môi trường trên phải được pha chế và kiểm tra chất lượng theo đúng qui định ở mục "Cách pha chế và kiểm tra chất lượng các môi trường" trước khi dùng.
Dung môi dùng để hoà loãng
Khi những mẫu thử không ở dạng dung dịch lỏng, cần hoà loãng để thử nghiệm. Chỉ được dùng làm dung môi hoà loãng là một chất lỏng bất kỳ không có tính kháng khuẩn và không tác động đến độ xốp của màng lọc. Thường dùng các dung môi sau đây:
Dung môi A: Hoà tan 1 g pepton vào nước cho vừa đủ 1 lít. Lọc (hoặc ly tâm) cho trong.
Điều chỉnh pH bằng 7,1 0,2. Đựng vào nhiều bình, mỗi bình khoảng 100 ml. Hấp ở 1210 C trong 18 - 20 phút.
Dung môi B: Như dung môi A, nhưng thêm 1 ml polysorbat 80 cho 1 lít dung môi, dùng để hoà loãng những chế phẩm thử có lecithin.
Dung môi C: isopropyl myristat
Dùng để pha loãng những chế phẩm dạng dầu hay dung dịch dầu.
Tiến hành thử theo phƣơng pháp màng lọc
Dụng cụ
Các dụng cụ dùng trong thử nghiệm phải đảm bảo vô khuẩn gồm: - Các ống nghiệm hoặc các bình đựng môi trường.
- Bộ lọc gồm có: Phễu lọc, giá đỡ màng lọc, bình hứng, và các phụ kiện để ghép nối; hệ thống hút chân không.
- Màng lọc: Thường dùng loại có dường kính lỗ lọc khoảng 0,2 - 0,45 m. Loại màng Cellulose nitrat được dùng cho các chế phẩm dạng nước, dạng dầu và các dung dịch có lượng cồn thấp độ. Loại màng lọc dạng cellulose acetat được dùng cho các chế phẩm dạng có nồng độ cồn cao. Đặc biết đối với các chế phẩm kháng sinh cần phải chọn loại màng lọc thích hợp đảm bảo không còn dư lượng kháng sinh trên màng sau khi lọc. - Kéo cắt màng lọc.
Lượng mẫu thử cần dùng cho một lần thử nghiệm
Tuỳ theo từng loại mẫu thử, lấy số lượng thích hợp theo qui định ở bảng 1.
49
STT Loại mẫu thử Lượng tối thiểu chế phẩm cần lấy 1
2
3
Dung dịch thuốc tiêm có chứa trong một đơn vị đóng gói: - Dưới 1 ml - Có từ 1 đến ít hơn 4 ml - Có từ 4 đến ít hơn 20 ml - Có từ 20 đến 100 ml - Lớn hơn 100 ml Dung dịch thuốc nhỏ mắt và các chế phẩm lỏng không tiêm Những mẫu thử là chất rắn, dịch treo, nhũ dịch, kem, hoặc thuốc mỡ.
Toàn bộ một đơn vị đóng gói 1/2 đơn vị đóng gói
2 ml 2 - 10 ml 1/2 đơn vị đóng gói
5 - 10 ml của dung dịch đã hoà loãng đến 10 lần (tt/tt) bằng dung môi thích hợp nêu ở (mục c)
0,5 - 1 g mẫu thử đã được hoà loãng thành dung dịch với tỉ lệ 1% (kl/tt) bằng dung môi thích hợp (nêu ở mục dung môi dùng để hoà loãng)
Kỹ thuật thử
Dùng dung môi A vừa đủ để thấm ướt màng lọc. Rót lên màng lọc một lượng mẫu cần thử như qui định ở bảng 1. Dùng máy hút chân không để rút ngắn thời gian lọc. Rửa màng lọc ít nhất 3 lần, mỗi lần dùng 100 ml dung môi thích hợp, vô khuẩn. Lấy màng lọc ra khỏi giá đỡ trong phễu lọc. Cấy màng lọc vào môi trường bằng nhúng chìm vào loại môi trường để phát hiện nấm hoặc vi khuẩn (mục chuẩn bị môi trường và dung môi ).
Khi mẫu thử có tính kháng khuẩn, rửa màng lọc ít nhất ba lần bằng cách lọc qua màng dung môi tiệt trùng đã chọn dùng cho thử nghiệm.Làm thí nghiệm kiểm tra để biết chắc chắn không còn tác dụng kháng khuẩn của mẫu thử hấp thụ trên màng. Chuyển toàn bộ màng lọc vào môi trường nuôi cấy thích hợp để phát hiện vi khuẩn, nấm mốc.
Nếu không có chỉ dẫn trong chuyên luận riêng, ủ môi trường thyoglycolat ở 300C đến 350 C và ủ môi trường soybean - casein ở 200C đến 250C ít nhất 14 ngày.
50
Nếu mẫu thử là dụng cụ (bộ dây truyền, túi lọc máu...) thì dùng 100 ml dung môi B cho chảy qua dụng cụ. Hứng lấy dung môi, rót lên màng lọc đã được thấm ướt bằng dung môi A, rồi làm tiếp theo kỹ thuật ghi ở mục kỹ thuật thử.
Tiến hành thử theo phương pháp cấy trực tiếp
Dụng cụ:
Các dụng cụ dùng cho thử nghiệm đều phải đảm bảo vô khuẩn mới được sử dụng vào thử nghiệm. Dụng cụ dùng cho phương pháp cấy trực tiếp gồm: Bơm tiêm, pipet, các ống nghiệm hoặc các bình đựng môi trường.
Lượng chế phẩm cần dùng để thử nghiệm
Tuỳ theo từng loại mẫu thử, lấy lượng chế phẩm thích hợp theo qui định ở bảng 2.
Kỹ thuật thử
Dùng bơm tiêm hoặc pipet lấy mẫu thử cấy vào hai loại môi trường theo số liệu ở bảng 2. Nếu mẫu thử là chất rắn thì cấy trực tiếp vào môi trường và chú ý lắc để mẫu thử phân tán đều trong môi trường. Nếu không có chỉ dẫn ở chuyên luận riêng thì ủ môi trường phát hiện vi khuẩn ở 300
C - 350C ; ủ môi trường phát hiện nấm mốc ở 200
C - 250C, thời gian ít nhất 14 ngày; thường xuyên theo dõi các môi trường đã cấy. Nếu chế phẩm làm đục môi trường, để có thể dễ dàng quan sát sự mọc của vi khuẩn, sau khi ủ môi trường 3 - 7 ngày nên chuyển một phần nhỏ môi trường này sang một loạt môi trường mới cùng loại. Tiếp tục ủ các ống môi trường đã cấy lại ít nhất 7 ngày.
Trường hợp mẫu thử là băng, gạc, chỉ khâu phẫu thuật: Nếu kích thước và hình dạng cho phép, nhúng toàn bộ mẫu thử vào 100 ml môi trường tương ứng. Khi mẫu thử là dụng cụ (dây truyền, ống lọc máu, ...) thì dùng dung môi A hoặc B (mục chuẩn bị môi trường và dung môi) cho chảy qua để thu được ít nhất 15 ml dịch rửa, cấy vào ít nhất 100 ml mỗi loại môi trường nuôi cấy. ủ và đọc kết quả như đã ghi ở trên.
Bảng 2
ST
T Loại mẫu thử
Lượng tối thiểu chế phẩm cần lấy Thể tích tối thiểu môi trường cần lấy Ghi chú
51
1 Mẫu thử là chất lỏng chứa trong một đơn vị đóng gói loại: Dưới 1 ml Từ 1 ml đến ít hơn 5 ml Từ 5 ml đến ít hơn 20 ml Từ 20 ml đến ít hơn 50 ml Từ 50 ml đến 100 ml Toàn bộ đơn vị đóng gói 1/2 đơn vị đóng gói 2 ml 5 ml 10 ml 15 ml 15 ml 20 ml 40 ml 80 ml Nếu mẫu thử là dầu hay dung dịch dầu phải thêm vào môi
trường 1% polyethoxy- ethanol hoặc 1% polysorbat để nhũ hoá. 2 Mẫu thử là chất rắn, thuốc mỡ hay kem, chứa trong một đơn vị đóng gói loại: Dưới 50 mg Từ 50 mg đến 200 mg Lớn hơn 200 mg Toàn bộ 1 đơn vị đóng gói
1/2 khối lượng của 1 đơn vị đóng gói 100 mg 40 ml 80 ml 80 ml Nếu mẫu thử là thuốc mỡ hay kem thì cần hoà loãng với dung môi B theo tỷ lệ 1/10 (kt/tt) trước khi cấy vào môi trường.
Theo dõi và đánh giá kết quả
Trong suốt thời gian ủ, hàng ngày phải quan sát các môi trường đã cấy màng lọc hoặc mẫu thử . Nếu không thấy có vi khuẩn, nấm mốc mọc trong suốt thời gian qui định, mẫu thử được coi là đạt tiêu chuẩn vô khuẩn.
Nếu có từ 1 trở lên trong số các môi trường nuôi cấy, có vi khuẩn hoặc nấm mốc mọc, cần phải:
52
Thử lại các mẫu thử nghi ngờ.
Giữ lại các môi trường có vi khuẩn, nấm mốc mọc.
Tiến hành phân lập, so sánh vi khuẩn hoặc nấm trên môi trường, cấy lại với vi khuẩn hoặc nấm đã mọc ở môi trường cũ.
Nếu trên tiêu bản phân lập, vi khuẩn (hoặc nấm mốc) giống với tiêu bản làm lần đầu, mẫu thử được coi là không đạt tiêu chuẩn vô khuẩn.
Nếu trên tiêu bản phân lập, vi khuẩn (hoặc nấm mốc) khác biệt so với lần thí nghiệm đầu tiên, cần thực hiện phép thử lặp lại với số lượng mẫu gấp đôi. Nếu không phát hiện thấy vi khuẩn (hoặc nấm mốc), mẫu thử được coi là đạt tiêu chuẩn vô khuẩn. Nếu vẫn thấy vi khuẩn (hoặc nấm) mọc ở lần lặp lại này, mẫu thử được coi là không đạt tiêu chuẩn vô khuẩn.
Cách pha chế và kiểm tra chất lƣợng các môi trƣờng
Môi trường để phát hiện các vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí
Môi trường thioglycolat:
Dùng cho thử nghiệm những chế phẩm lỏng và trong L - Cystin Natri clorid Dextrose (C6H12O6.H2O) Thạch bột (có độ ẩm nhỏ hơn 15%) Cao men bia (có khả năng tan trong
nước)
Casein pancreatic Natri thioglycolat
(hoặc acid thioglycolic 0,3 g )
Resazurin (dung dịch 0,1% mới pha) Nước cất pH sau khi tiệt khuẩn: 7,1 0,2
0,50 g 2,50 g 5,50 g 0,75 g 5,00 g 15,00 g 0,50 g 1,0 ml 1000 ml
Trộn tất cả các thành phần theo thứ tự đã ghi ở trên (trừ resazurin và thioglycolat) trong cối nghiền, thêm vào một ít nước nóng, trộn kỹ, chuyển sang dụng cụ thích hợp. Thêm số nước còn lại, đun hỗn hợp cách thuỷ sôi đến khi tạo thành dung dịch trong. Thêm natri thioglycolat, dùng dung dịch natri hydroxyd 1 N điều chỉnh sao cho môi trường sau khi
53
tiệt khuẩn có pH7,1 0,2. Đun nóng lại dung dịch (tránh đun sôi). Lọc (nếu cần) qua giấy lọc đã thấm ướt, rồi thêm dung dịch resazurin trộn đều. Đóng vào các ống nghiệm (hoặc bình) thích hợp, hấp vô khuẩn ở 1210
C trong 18 - 20 phút. Lấy ra làm nguội nhanh tới 250C, tiếp tục bảo quản ở nhiệt độ 20 - 300C, tránh ánh sáng. Nếu 1/3 thể tích phía trên của ống (hoặc bình) môi trường có màu hồng, môi trường không thích hợp để thử nghiệm. Có thể phục hồi lại môi trường bằng cách đun cách thuỷ cho mất màu rồi làm lạnh đột ngột. Nhưng chỉ sử dụng môi trường đã phục hồi này một lần, không dùng môi trường phục hồi lần 2. Các môi trường thioglycolat lỏng chỉ dùng trong khoảng 3 tuần.
Môi trường thioglycolat không có thạch
Dùng cho thử nghiệm những chế phẩm đục hoặc đặc sền sệt dạng cao. L. Cystin
Natri clorid Dextrose (C6H12O6.H2O) Cao men bia (có khả năng tan trong
nước)
Casein pancreatic
Natri thioglycolat (hoặc acid thioglycolic 0,3 g )
Resazurin (dung dịch 1% mới pha) Nước cất pH sau khi tiệt khuẩn: 7,1 0,2
0,50 g 2,50 g 5,50 g 5,00 g 15,0 g 0,50 g 10 ml 1000 ml
Cho tất cả các thành phần trên vào một dụng cụ thích hợp, đun cách thuỷ, khuấy đều đến khi thành dung dịch, dùng dung dịch natri hydroxyd 1N điều chỉnh để cho pH sau khi tiệt khuẩn đạt 7,1 0,2. Có thể lọc (nếu cần). Phân chia vào các ống nghiệm (hoặc bình) thích hợp. Hấp tiệt khuẩn 1210C trong khoảng 18 - 20 phút. Sau khi tiệt khuẩn đem làm nguội nhanh tới 250C, môi trường không được đun nóng trở lại.
Môi trường phát hiện vi khuẩn hiếu khí và nấm
Môi trường Soybean - casein
Casein pancreatic Bột papaic soybean Natri clorid 17,0 g 3,0 g 5,0 g
54
Dikali hydrophosphat (K2HPO4)
Dextrose (C6H12O6.H2O) Nước cất pH sau khi tiệt khuẩn: 7,3 0,2
2,5 g 2,5 g 1000 ml
Hoà tan tất cả các chất rắn trong nước, đun nóng nhẹ để cho tan hoàn toàn. Để nguội ở nhiệt độ phòng. Dùng dung dịch natri hydroxyd 0,1N để điều chỉnh (nếu cần) cho pH sau khi tiệt khuẩn khoảng 7,1 đến 7,5. Lọc (nếu cần) để cho môi trường trong. Phân chia vào những dụng cụ thích hợp, hấp tiệt khuẩn ở 1210C trong khoảng 20 phút.
Kiểm tra chất lượng môi trường
a) Độ vô khuẩn:
Lấy ngẫu nhiên một vài ống (hoặc bình) môi trường mới sản xuất, đem ủ ở nhiệt độ 30 - 350C trong 4 ngày đối với những loại môi trường dùng nuôi cấy vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí; ủ ở nhiệt độ 20 - 250C trong ít nhất 7 ngày đối với những loại môi trường dùng nuôi cấy vi khuẩn, nấm mốc. Các loại môi trường phải không được có vi khuẩn, nấm mốc mọc.
b) Khả năng dinh dưỡng:
Cấy vào môi trường dùng để thí nghiệm khoảng 100 tế bào sống của những loại vi khuẩn sau:
Loại hiếu khí dùng Staphylococcus aureus ATCC 6538.
Loại vi khuẩn hiếu khí có nha bào dùng Bacillus subtilis ATCC 6633. Loại vi khuẩn kỵ khí dùng Clostridium sporogenes ATCC 9404.
Loại nấm dùng Candida albicans ATCC 10231. Aspergillus niger ATCC 16404
Mỗi loại chủng chỉ thị được cấy vào loại môi trường tương ứng, rồi mang ủ ở nhiệt độ thích hợp cho từng loại ít nhất 3 ngày đối với vi khuẩn và ít nhất 5 ngày đối với nấm mốc. Trên mỗi loại môi trường, sau thời gian ủ đều phải thấy vi khuẩn mọc tốt.
c) Kiểm tra tác dụng ức chế ở mẫu mang thử:
Một số chế phẩm do yêu cầu của sản xuất hoặc ở những chế phẩm mới người ta đã cho thêm chất bảo quản. Loại chế phẩm này có ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn, nấm mốc, nên cần phải kiểm tra tác dụng ức chế của chúng đối với vi khuẩn nấm mốc.
55 Đối với vi khuẩn kỵ khí
Dùng 4 ống môi trường phát hiện vi khuẩn kỵ khí. Hai ống dùng làm chứng chỉ cấy vào mỗi ống chứng này 100 nha bào vi khuẩn kỵ khí Clostridium sporogenes ATCC 9404
(khoảng 0,1 ml nhũ dịch nha bào đã pha loãng thích hợp). Hai ống còn lại cấy vào mỗi ống một lượng bằng nhau chế phẩm cần kiểm tra, rồi cũng cấy vào mỗi ống 100 nha bào
Clostridium sporogenes ATCC 9404. Đem ủ tất cả các ống ở 30 - 350C ít nhất 7 ngày.
Đối với vi khuẩn hiếu khí
Dùng 4 ống môi trường phát hiện vi khuẩn hiếu khí. Hai ống dùng làm chứng chỉ cấy vào mỗi ống chứng này 100 tế bào vi khuẩn hiếu khí Staphylococcus aureus ATCC 6538 (khoảng 0,1 ml nhũ dịch tế bào đã pha loãng thích hợp). Hai ống còn lại cấy vào mỗi ống một lượng bằng nhau chế phẩm cần kiểm tra, và cũng cấy vào mỗi ống 100 tế bào
Staphylococcus aureus ATCC 6538. Đem ủ tất cả các ống ở 30 - 350C ít nhất 7 ngày.
Đối với nấm mốc
Dùng 4 ống môi trường phát hiện nấm, mốc. Hai ống dùng làm chứng chỉ cấy vào mỗi ống chứng này 100 tế bào nấm Candida albicans ATCC 10231. Hai ống dùng kiểm tra,
cấy vào mỗi ống 100 tế bào nấm Candida albicans ATCC 10231 và một lượng chế phẩm
bằng nhau. Đem ủ tất cả các ống ở 20 - 250C ít nhất 7 ngày.
Đánh giá kết quả:
Nếu trong thời gian ủ, vi khuẩn, nấm mốc mọc tốt, (dễ dàng và phong phú), đối với từng loại, mọc giống nhau giữa ống kiểm tra và ống chứng: Mẫu thử không có tác dụng ức chế.
Nếu trên các ống môi trường có cấy mẫu thử, vi khuẩn, nấm, mốc mọc yếu, chậm