Nghiên cứu một số mầm bệnh vi khuẩn gây bệnh trên cá thát lát còm Chitala Chitala

TÓM TẮT Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định một số mầm bệnh vi khuẩn gây bệnh trên cá thát lát còm. Nghiên cứu tiến hành thu 124 mẫu cá từ 2 tỉnh Hậu Giang và Đồng Tháp. Kết quả đã phân lập và định danh được 47 chủng Edwarsiella tarda (40,3%) và 62 chủng Aeromonas hydrophila (59,7%) trên cá thát lát bệnh. Cá nhiễm vi khuẩn E.tarda có các dấu hiệu như mắt bị lồi và xuất huyết, nhiều đốm đỏ xuất huyết quanh miệng và thân, trên lưng có vết loét chứa dịch. Tuy nhiên, đối với vi khuẩn Aeromonas hydrophila khi gây bệnh, cá có những dấu hiệu bệnh đặc trưng, đó là màu sắc cơ thể nhợt nhạt, bụng trương, hậu môn sưng to và có vết xuất huyết rõ bắt đầu từ hậu môn kéo dài đến 1/3 vây hậu môn. Thí nghiệm cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm với 2 chủng vi khuẩn E. tarda (DT37 và HG41) và 2 chủng A.hydrophila (D2F71 và H1F39) được thực hiện trên cá thát lát còm giống khỏe có trọng lượng 15±4 g/con. Phương pháp ngâm được tiến hành đối với cá ương giai đoạn 40 ngày tuổi (trọng lượng 0,7±0,3 g/con) với một chủng E.tarda (HG41) và một chủng A. hydrophila (H1F39). Kết quả thí nghiệm hoàn toàn thỏa mãn các nguyên tắc của định đề Koch, xác định vi khuẩn E. tarda chính là tác nhân gây bệnh đốm đỏ và vi khuẩn A. hydrophila là tác nhân gây bệnh đỏ lườn trên cá thát lát còm. Qua thí nghiệm, ghi nhận giá trị độc lực LD của vi khuẩn E. tarda trong phương pháp tiêm lần lượt là 4,89x10 CFU/mL (HG41) và phương pháp ngâm là 1,62x10 5 50 CFU/mL (DT37) và 4,07x10 4 CFU/ml (HG41). Hai chủng A. hydrophila trong phương pháp tiêm có giá trị độc lực LD lần lượt 1,26x10 4 CFU/mL (D2F71); 4,06x10 3 CFU/mL (H1F39) và 6,12x10 CFU/ml (H1F39) trong phương pháp ngâm. Kết quả này cũng cho thấy chủng vi khuẩn E.tarda (DT37) và A. hydrophila (D2F71) thu từ Đồng Tháp có giá trị độc lực LD 50 cao hơn của 2 chủng vi khuẩn (HG41 và H1F9) thu từ Hậu Giang. Kết quả kháng sinh đồ được tiến hành trên 20 chủng vi khuẩn E. tarda và 20 chủng vi khuẩn A. hydrophila với 11 loại kháng sinh cho thấy các chủng vi khuẩn E.tarda và A.hydrophila đều nhạy với enrofloxacin, florfenicol, flumequine, oxytetracycline, trimethoprim+sulfamethoxazol và kháng với streptomycin. Các chủng E. tarda cũng nhạy cao với ampilcillin nhưng kháng với doxycycline. Ngược lại, vi khuẩn A.hydrophila kháng hoàn toàn với ampicillin và nhạy cao với doxycycline. Giá trị MIC của 4 chủng E.tarda và 4 chủng A.hydrophila đối với oxytetracycline là thấp nhất (0,5-1 ppm). Từ khóa: Cá thát lát còm, E. tarda, A. hydrophila, kháng sinh, LD 1.1 Giới Thiệu Đồng bằng sông Cửu Long là vùng trọng điểm nuôi trồng thuỷ sản cả nước, hằng năm cung cấp một lượng sản phẩm thuỷ sản đáng kể cho nước nhà, với sản lượng đạt 1.940 ngàn tấn vào năm 2010, chiếm 90% tổng sản lượng nuôi trồng của cả nước (Tổng cục Thống kê, 2010). Trong khi nghề nuôi cá tra, cá điêu hồng, cá rô đang gặp một số khó khăn nhất định về giá cả và dịch bệnh thì nghề nuôi cá thát lát còm đang trên đà phát triển và trở thành đối tượng nuôi quan trọng ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long. Các tỉnh Hậu Giang, Đồng Tháp, Tiền Giang, Vĩnh Long, Bạc Liêu, Trà Vinh đã và đang tập trung gia tăng diện tích nuôi đối tượng này. Chỉ riêng tỉnh Hậu Giang đã có hơn 168 ha diện tích nuôi vào năm 2010 và quy hoạch sẽ tăng lên đến 494 ha năm 2020, hàng năm cho sản lượng trên 3000 tấn cá thương phẩm (www.haugiang.gov.vn). Ở Việt Nam, cá thát lát còm có tên khoa học là Chitala chitala , là loài cá có kích thước lớn, tăng trưởng nhanh, đạt trọng lượng 320- 360g/con chỉ sau 4 tháng thả nuôi (Dương Nhựt Long, 2006). Và đặc biệt chất lượng thịt ngon…. nên hiện nay cá thát lát còm là loài cá đang được ưa chuộng trên thị trường, các sản phẩm từ cá không chỉ được tiêu thụ trong nước mà còn được xuất khẩu ra nước ngoài. Ngoài giá trị do thịt ngon, cá còn được giới nuôi cá cảnh yêu thích bởi hình dáng đẹp với các chấm trên thân mà nhiều người tin có ý nghĩa phong thuỷ tốt và mang lại nhiều điều may mắn. Nuôi cá thát lát còm hiện giúp người nuôi tăng thu nhập, giúp các gia đình khó khăn thoát nghèo và thậm chí vươn lên làm giàu, giải quyết vấn đề việc làm và phát triển nông thôn mới. Việc phát triển nhanh chóng của nghề nuôi và gia tăng mật độ thâm canh hoá đồng nghĩa với sự gia tăng tình hình dịch bệnh trong đó bệnh do vi khuẩn là phổ biến nhất và gây thiệt hại nghiêm trọng cho nghề nuôi thuỷ sản nói chung. Các bệnh do vi khuẩn Aeromonas spp., Pseudomonas spp., Streptococcus spp.,… đã được nhiều tác giả ghi nhận là gây hao hụt lớn trên nhiều loài cá nuôi nước ngọt như cá tra, cá rô phi, điêu hồng, cá lóc, cá chép (Noga, 2010; Stocskopf, 1993; Inglis et al., 1993; Bùi Quang Tề và ctv, 2006; Lư Trí Tài, 2010). Tuy nhiên, tại Việt Nam vẫn chưa có công trình nghiên cứu nào về bệnh vi khuẩn và biện pháp phòng trị bệnh trên cá thát lát còm được công bố. Trong lúc nghề nuôi phát triển nhanh chóng, môi trường nuôi ngày càng bất lợi, diễn biến dịch bệnh ngày càng phức tạp thì việc hiểu rõ về các tác nhân vi khuẩn gây bệnh, tình hình kháng thuốc kháng sinh càng trở nên cấp thiết. Chính vì thế đề tài “Nghiên cứu một số mầm bệnh vi khuẩn gây bệnh trên cá thát lát còm Chitala Chitala” được thực hiện, nhằm cung cấp những thông tin cho việc chẩn đoán, phòng và điều trị bệnh do vi khuẩn trên cá thát lát còm một cách hợp lý. 1.2 Mục tiêu đề tài Đề tài được thực hiện nhằm xác định một số mầm bệnh vi khuẩn gây bệnh trên cá thát lát còm, từ đó làm cơ sở đề xuất các biện pháp phòng trị bệnh trên cá một cách có hiệu quả. 1.3 Nội dung đề tài  Điều tra thu mẫu bệnh trên cá thát lát còm ở tỉnh Hậu Giang và Đồng Tháp.  Xác định một số mầm bệnh vi khuẩn trên cá thát lát còm.  Gây cảm nhiễm một số bệnh do vi khuẩn gây bệnh trên cá thát lát còm.  Xác định tính nhạy và nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) một số loại thuốc kháng sinh trên vi khuẩn gây bệnh cho cá thát lát còm.

Luan van nay, v a i tira de la "Nghien cuu mot so mam benh vi khuan tren ca that lat com (Chitala chitala Hamilton, 1822)", do hoc vien Tran Thi M y Han thuc

hien theo sir huang dan cua T S Tir Thanh Dung Luan van da bao cao va dugc

H o i dong cham luan van thong qua ngay 30 thang 11 nam 2013

Chu tich Hoi dong

T S T u Thanh Dung P G S T S Truang Qu6c Phu

LỜI CẢM TẠ

Tác giả xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, Ban Chủ Nhiệm Khoa Thủy sản Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện học tập và thực hiện đề tài

Tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Ts.Từ Thanh Dung đã tận tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin gửi lời cảm ơn đến các bạn học viên lớp cao học khóa 18 đã luôn bên cạnh giúp đỡ tôi trong quá trình học tập cũng như trong thời gian thực hiện đề tài

Cảm ơn em Nguyễn Minh Trí lớp Nuôi Trồng Thủy Sản Tiên Tiến K34, Nguyễn Bảo Trung lớp Cao học Nuôi trồng Thủy sản K20 đã giúp đỡ rất nhiệt tình trong quá trình thực hiện đề tài

Xin chân thành cám ơn sự tài trợ kinh phí đề tài cấp Tỉnh của sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Hậu Giang

Sau cùng, con xin cám ơn gia đình với lòng biết ơn sâu sắc nhất gửi đến

ba và mẹ đã luôn yêu thương, khuyên nhủ, động viên giúp con có đủ nghị lực

và nhiệt huyết vượt qua chặng đường dài học tập

Tác giả

Trần Thị Mỹ Hân

TÓM TẮT

Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định một số mầm bệnh vi khuẩn gây bệnh trên cá thát lát còm Nghiên cứu tiến hành thu 124 mẫu cá từ 2 tỉnh Hậu Giang và Đồng Tháp Kết quả đã phân lập và định danh được 47 chủng

Edwarsiella tarda (40,3%) và 62 chủng Aeromonas hydrophila (59,7%) trên

cá thát lát bệnh Cá nhiễm vi khuẩn E.tarda có các dấu hiệu như mắt bị lồi và

xuất huyết, nhiều đốm đỏ xuất huyết quanh miệng và thân, trên lưng có vết

loét chứa dịch Tuy nhiên, đối với vi khuẩn Aeromonas hydrophila khi gây

bệnh, cá có những dấu hiệu bệnh đặc trưng, đó là màu sắc cơ thể nhợt nhạt, bụng trương, hậu môn sưng to và có vết xuất huyết rõ bắt đầu từ hậu môn kéo dài đến 1/3 vây hậu môn

Thí nghiệm cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm với 2 chủng vi khuẩn

E tarda (DT37 và HG41) và 2 chủng A.hydrophila (D2F71 và H1F39) được

thực hiện trên cá thát lát còm giống khỏe có trọng lượng 15±4 g/con Phương pháp ngâm được tiến hành đối với cá ương giai đoạn 40 ngày tuổi (trọng

lượng 0,7±0,3 g/con) với một chủng E.tarda (HG41) và một chủng A

hydrophila (H1F39) Kết quả thí nghiệm hoàn toàn thỏa mãn các nguyên tắc

của định đề Koch, xác định vi khuẩn E tarda chính là tác nhân gây bệnh đốm

đỏ và vi khuẩn A hydrophila là tác nhân gây bệnh đỏ lườn trên cá thát lát

còm Qua thí nghiệm, ghi nhận giá trị độc lực LD50 của vi khuẩn E tarda

trong phương pháp tiêm lần lượt là 4,89x105 CFU/mL (DT37) và 4,07x105 CFU/mL (HG41) và phương pháp ngâm là 1,62x104 CFU/ml (HG41) Hai

chủng A hydrophila trong phương pháp tiêm có giá trị độc lực LD50 lần lượt 1,26x104 CFU/mL (D2F71); 4,06x103 CFU/mL (H1F39) và 6,12x104 CFU/ml (H1F39) trong phương pháp ngâm Kết quả này cũng cho thấy chủng vi khuẩn

E.tarda (DT37) và A hydrophila (D2F71) thu từ Đồng Tháp có giá trị độc lực

LD50 cao hơn của 2 chủng vi khuẩn (HG41 và H1F9) thu từ Hậu Giang

Kết quả kháng sinh đồ được tiến hành trên 20 chủng vi khuẩn E tarda

và 20 chủng vi khuẩn A hydrophila với 11 loại kháng sinh cho thấy các chủng

vi khuẩn E.tarda và A.hydrophila đều nhạy với enrofloxacin, florfenicol,

flumequine, oxytetracycline, trimethoprim+sulfamethoxazol và kháng với

streptomycin Các chủng E tarda cũng nhạy cao với ampilcillin nhưng kháng với doxycycline Ngược lại, vi khuẩn A.hydrophila kháng hoàn toàn với ampicillin và nhạy cao với doxycycline Giá trị MIC của 4 chủng E.tarda

và 4 chủng A.hydrophila đối với oxytetracycline là thấp nhất (0,5-1 ppm)

Từ khóa: Cá thát lát còm, E tarda, A hydrophila, kháng sinh, LD 50

ABSTRACT

The aim of this study is to determine agents causing infected diseases

on clown knifefish (Chitala chitala) in the Mekong Delta The total of 124

samples were collected from hatcheries and commercial farms in Haugiang

and Dongthap provinces There were 47 isolates of Edwardsiella tarda (40.3%) and 62 isolates of Aeromonas hydrophila (59.7%) obtained from diseased fish The E tarda in fish causes gross signs of abnormal swimming,

exophthamia with hemorrhages, skin ulcerations and petechiae on body while

fish infected with A hydrophila shows haemorrhagic in all fins, swollen

abdormen, haemorrhages along one –third of anal fin

In this study, two E tarda (DT37 and HG41) and two A hydrophila

(H1F39 and D2F71) isolates were selected for injected challenge in healthy fingerling clown knifefish (mean weight 15±4g) in other to determine agent and lethal doses Moreover, the experimental infection by immersion with

E.tarda (HG41) and A.hydrophila (H1F39) was performed in healthy

fingerling clown knifefish (mean weight 0.7±0.3g).The result fulfilled Koch’s postulates and the LD50 values of two E tarda (DT37 and HG41) in

inoculation were 4.89x105; 4.07x105 CFU/ml and 1.62x104 CFU/ml in immersion; Similarly, the value of LD50 of two A hydrophila (H1F39 and

D2F71) isolates were 1.26x104; 4.06x103 CFU/ml respectively and 6.12x104CFU/ml in immersion Result showed that the value of LD50 of E tarda and A

hydrophila isolated from Dongthap were higher than those from giang

The results of in vitro antibiotic susceptibility testing showed that both

20 E tarda and 20 A hydrophila isolates were highly susceptive with

trimethoprim+sulfamethoxazole but resistance with streptomycin E tarda

isolates aslo had resistance to doxycycline and susceptibility to ampiciline

while A.hydrophila isolates were highly sensitive with doxycycline The lowest MIC value of 4 E tarda and 4 A hydrophila isolates was

oxytetracycline (0.5-1 ppm)

Keywords: Clown knifefish (Chitala chitala), Aeromonas hydrophila, E Tarda,

LD50

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ i

TÓM TẮT ii

ABSTRACT iii

CAM KẾT KẾT QUẢ iv

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH……… viii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT x

Chương 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Giới Thiệu 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

1.3 Nội dung đề tài 2

Chương 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về cá thát lát còm 3

2.1.1 Đặc điểm phân loại 3

2.1.2 Đặc điểm sinh học 3

2.1.3 Tình hình nuôi cá thát lát còm 4

2.2 Các bệnh vi khuẩn trên cá nuôi nước ngọt 5

2.2.1 Bệnh do vi khuẩn Gram âm trên cá nuôi nước ngọt 5

2.2.1.1 Bệnh do nhóm vi khuẩn Aeromonas spp 5

2.2.1.2 Bệnh do nhóm vi khuẩn Pseudomonas spp 7

2.2.1.3 Bệnh do nhóm vi khuẩn Edwardsiella spp 8

2.2.1.4 Bệnh do nhóm vi khuẩn Flavobacterium spp 10

2.2.2 Bệnh do vi khuẩn Gram dương trên cá nuôi nước ngọt 12

2.3 Thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản 13

2.3.1 Những hiểu biết về thuốc kháng sinh 13

2.3.2 Tình hình kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh trên cá nước ngọt 15

2.3.2.1 Tình hình kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh trên cá nước ngọt trên thế giới 15

2.3.2.2 Tình hình kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh trên cá nước ngọt ở Việt Nam 15

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 20

3.2 Vật liệu nghiên cứu 20

3.3 Phương pháp nghiên cứu 20

3.3.1 Phương pháp điều tra 20

3.3.2 Phương pháp thu mẫu cá và phân lập vi khuẩn 20

3.3.3 Phương pháp định danh vi khuẩn 21

3.3.4 Phương pháp làm kháng sinh đồ 21

3.3.5 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 21

3.3.6 Thí nghiệm cảm nhiễmvi khuẩn trên cá thát lát còm 22

3.4 Phương pháp xử lý số liệu 24

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 Thông tin điều tra nông hộ 25

4.1.1 Thông tin về kỹ thuật nuôi 25

4.1.2 Thông tin về tình hình xuất hiện bệnh và sử dụng thuốc hóa chất 26

4.2 Kết quả thu mẫu cá thát lát bệnh 28

4.2.1 Số lượng thu mẫu cá thát lát bệnh 28

4.2.2 Dấu hiệu bệnh lý của cá thát lát bệnh 29

4.2.2.1 Dấu hiệu bệnh lý của bệnh đốm đỏ trên cá thát lát 30

4.2.2.2 Dấu hiệu bệnh lý của bệnh đỏ lườn trên cá thát lát 32

4.3 Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh 33

4.3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn 33

4.3.2 Kết quả định danh vi khuẩn 35

4.3.2.1 Kết quả định danh vi khuẩn phân lập từ cá bệnh đốm đỏ 35

4.3.2.2 Kết quả định danh vi khuẩn phân lập từ cá bệnh đỏ lườn 39

4.4 Kết quả cảm nhiễm vi khuẩn E tarda và A hydrophila 42

4.4.1 Kết quả cảm nhiễm vi khuẩn E tarda 42

4.4.1.1 Kết quả cảm nhiễm E tarda bằng phương pháp tiêm 42

4.4.1.2 Kết quả cảm nhiễm E tarda bằng phương pháp ngâm 45

4.4.2 Kết quả cảm nhiễm vi khuẩn A hydrophila 47

4.4.2.1 Kết quả cảm nhiễm A hydrophila bằng phương pháp tiêm 47

4.4.2.2 Kết quả cảm nhiễm A hydrophila bằng phương

pháp ngâm 49

4.5 Kết quả kháng sinh đồ và nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 51

4.5.1 Kết quả kháng sinh đồ và MIC của vi khuẩn E tarda 51

4.5.1.1 Kết quả kháng sinh đồ của chủng vi khuẩn E tarda 51

4.5.1.2 Kết quả nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của vi khuẩn E tarda 53

4.5.2 Kết quả kháng sinh đồ và MIC của vi khuẩn A hydrophila 55

4.5.2.1 Kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn A hydrophila 55

4.5.2.2 Kết quả nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của A hydrophila 57

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

PHỤ LỤC 66

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1: Đặc điểm sinh hóa 3 loài vi khuẩn Aeromonas spp 6

Bảng 2.2: Một vài đặc điểm sinh hóa của 2 loài Pseudomonas spp 8

Bảng 2.3: Một số chỉ tiêu sinh hóa của E ictaluri và E tarda 10

Bảng 2.4: Một số chỉ tiêu sinh hóa của F columnare 12

Bảng 4.1: Kết quả thu mẫu các bệnh ở Đồng Tháp và Hậu Giang 29

Bảng 4.2: Dấu hiệu bệnh lý của cá thát lát bệnh đốm đỏ và đỏ lườn 30

Bảng 4.3: Kết quả phân lập vi khuẩn 34

Bảng 4.4: Đặc điểm sinh hóa cơ bản của vi khuẩn phân lập từ cá bệnh đốm đỏ 35

Bảng 4.5: Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa bằng bộ kit API 20E 36

Bảng 4.6: Đặc điểm sinh hóa cơ bản của vi khuẩn phân lập từ cá bệnh đỏ lườn 39

Bảng 4.7: Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa bằng bộ kit API 20E 40

Bảng 4.8: Kết quả MIC của các chủng E tarda 54

Bảng 4.9: Kết quả MIC của các chủng A hydrophila 57

DANH SÁCH HÌNH

Hình 4.1: Tình hình dịch bệnh trên cá thát lát 27

Hình 4.2: Các nhóm kháng sinh thường được sử dụng 28

Hình 4.3: Dấu hiệu bệnh lý bên ngoài và bên trong của bệnh đốm đỏ 31

Hình 4.4: Dấu hiệu bệnh lý bên ngoài và bên trong của bệnh đỏ lườn 33

Hình 4.5: Khuẩn lạc vi khuẩn phân lập từ cá bệnh đốm đỏ trên môi trường TSA và cá bệnh đỏ lườn trên môi trường GSP 34

Hình 4.6: Kết quả test API 20E của chủng vi khuẩn E tarda 36

Hình 4.7: Tỉ lệ cá chết tích lũy (%) theo giờ cảm nhiễm 2 chủng DT37 và HG41 43

Hình 4.8: Tỉ lệ cá chết tích lũy (%) bằng phương pháp ngâm của chủng DT37 46

Hình 4.9: Tỉ lệ cá chết tích lũy (%) theo giờ cảm nhiễm 2 chủng H1F39 và D2F71 48

Hình 4.10: Tỉ lệ cá chết tích lũy (%) bằng phương pháp ngâm của chủng H1F39 50

Hình 4.11: Kết quả kháng sinh đồ của các chủng vi khuẩn E tarda 52

Hình 4.12: Kết quả kháng sinh đồ của các chủng vi khuẩn A Hydrophila 55

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

BHIB Brain Heart Infusion Broth

Chương 1 GIỚI THIỆU

1.1 Giới Thiệu

Đồng bằng sông Cửu Long là vùng trọng điểm nuôi trồng thuỷ sản cả nước, hằng năm cung cấp một lượng sản phẩm thuỷ sản đáng kể cho nước nhà, với sản lượng đạt 1.940 ngàn tấn vào năm 2010, chiếm 90% tổng sản lượng nuôi trồng của cả nước (Tổng cục Thống kê, 2010) Trong khi nghề nuôi cá tra, cá điêu hồng, cá rô đang gặp một số khó khăn nhất định về giá cả và dịch bệnh thì nghề nuôi cá thát lát còm đang trên đà phát triển và trở thành đối tượng nuôi quan trọng ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long Các tỉnh Hậu Giang, Đồng Tháp, Tiền Giang, Vĩnh Long, Bạc Liêu, Trà Vinh đã và đang tập trung gia tăng diện tích nuôi đối tượng này Chỉ riêng tỉnh Hậu Giang đã

có hơn 168 ha diện tích nuôi vào năm 2010 và quy hoạch sẽ tăng lên đến 494

ha năm 2020, hàng năm cho sản lượng trên 3000 tấn cá thương phẩm (www.haugiang.gov.vn)

Ở Việt Nam, cá thát lát còm có tên khoa học là Chitala chitala , là loài

cá có kích thước lớn, tăng trưởng nhanh, đạt trọng lượng 320- 360g/con chỉ sau 4 tháng thả nuôi (Dương Nhựt Long, 2006) Và đặc biệt chất lượng thịt ngon… nên hiện nay cá thát lát còm là loài cá đang được ưa chuộng trên thị trường, các sản phẩm từ cá không chỉ được tiêu thụ trong nước mà còn được xuất khẩu ra nước ngoài Ngoài giá trị do thịt ngon, cá còn được giới nuôi cá cảnh yêu thích bởi hình dáng đẹp với các chấm trên thân mà nhiều người tin

có ý nghĩa phong thuỷ tốt và mang lại nhiều điều may mắn Nuôi cá thát lát còm hiện giúp người nuôi tăng thu nhập, giúp các gia đình khó khăn thoát nghèo và thậm chí vươn lên làm giàu, giải quyết vấn đề việc làm và phát triển nông thôn mới

Việc phát triển nhanh chóng của nghề nuôi và gia tăng mật độ thâm canh hoá đồng nghĩa với sự gia tăng tình hình dịch bệnh trong đó bệnh do vi khuẩn là phổ biến nhất và gây thiệt hại nghiêm trọng cho nghề nuôi thuỷ sản

nói chung Các bệnh do vi khuẩn Aeromonas spp., Pseudomonas spp.,

Streptococcus spp.,… đã được nhiều tác giả ghi nhận là gây hao hụt lớn trên

nhiều loài cá nuôi nước ngọt như cá tra, cá rô phi, điêu hồng, cá lóc, cá chép

(Noga, 2010; Stocskopf, 1993; Inglis et al., 1993; Bùi Quang Tề và ctv, 2006;

Lư Trí Tài, 2010) Tuy nhiên, tại Việt Nam vẫn chưa có công trình nghiên cứu nào về bệnh vi khuẩn và biện pháp phòng trị bệnh trên cá thát lát còm được công bố Trong lúc nghề nuôi phát triển nhanh chóng, môi trường nuôi ngày

càng bất lợi, diễn biến dịch bệnh ngày càng phức tạp thì việc hiểu rõ về các tác nhân vi khuẩn gây bệnh, tình hình kháng thuốc kháng sinh càng trở nên cấp thiết Chính vì thế đề tài “Nghiên cứu một số mầm bệnh vi khuẩn gây bệnh

trên cá thát lát còm Chitala Chitala” được thực hiện, nhằm cung cấp những

thông tin cho việc chẩn đoán, phòng và điều trị bệnh do vi khuẩn trên cá thát lát còm một cách hợp lý

1.2 Mục tiêu đề tài

Đề tài được thực hiện nhằm xác định một số mầm bệnh vi khuẩn gây bệnh trên cá thát lát còm, từ đó làm cơ sở đề xuất các biện pháp phòng trị bệnh trên cá một cách có hiệu quả

1.3 Nội dung đề tài

 Điều tra thu mẫu bệnh trên cá thát lát còm ở tỉnh Hậu Giang và Đồng Tháp

 Xác định một số mầm bệnh vi khuẩn trên cá thát lát còm

 Gây cảm nhiễm một số bệnh do vi khuẩn gây bệnh trên cá thát lát còm

 Xác định tính nhạy và nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) một số loại thuốc kháng sinh trên vi khuẩn gây bệnh cho cá thát lát còm

Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về cá thát lát còm

2.1.1 Đặc điểm phân loại

Theo Fish Base (2010) thì cá thát lát còm có hệ thống phân loại như sau:

Loài: Chitala chitala Hamilton, 1822

Cá thát lát còm (Chitala chitala) có thân dẹp bên, càng về phía bụng

càng mỏng, lưng gù, toàn thân phủ vẩy nhỏ mịn, đầu nhọn, miệng rộng, rạch miệng kéo dài (Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương, 1993) Vây đuôi không chẻ, vây hậu môn và vây đuôi dính liền tạo thành viền mỏng, vây lưng nhỏ trong và nằm lệch về phía sau

Cá có màu xám bạc, mặt lưng và đầu có màu xanh rêu, hai bên lườn và bụng màu trắng, phía dưới viền xương nắp mang sáng hơn Lúc nhỏ trên thân

có từ 10- 15 lằn sọc đen ngang thân nhưng khoảng hai tháng tuổi thì các sọc đen này gom tụ lại thành những đốm đen đậm viền trắng dọc theo hai bên thân

phía trên vây hậu môn (Sarkar et al, 2006) Đây là đặc điểm khác biệt của cá

thát lát còm với những loài khác

2.1.2 Đặc điểm sinh học

Cá thát lát còm (Chitala chitala) sống ở các khu vực sông rạch, ao đầm,

ruộng trũng, nơi có nhiều thực vật thuỷ sinh lớn Ở Việt Nam cá xuất hiện ở các nhánh sông lớn và các ao đầm thuộc hệ thống sông Cửu Long Đây là loại

cá nước ngọt có thể sinh trưởng và phát triển tốt ở độ mặn 6 ppt, khả năng chịu được oxy thấp do có cơ quan hô hấp phụ, nhiệt độ thích hợp cho cá sinh trưởng và phát triển là 26 – 28oC (Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương, 1993; Walter, 1996; Nguyễn Chung, 2006; Lã Ánh Nguyệt, 2011)

Về đặc điểm dinh dưỡng đây là loài cá ăn thiên về động vật do có miệng rộng, dạ dày dạng túi, tỷ lệ giữa chiều dài ruột và chiều dài thân từ 0,3-

0,5 (Trần Thị Thanh Hiền và ctv, 2007) Thành phần thức ăn của cá thát lát

còm gồm có: động vật nguyên sinh, luân trùng, giáp xác chân chèo, giáp xác

có vỏ, giun, côn trùng nước Thức ăn ưa thích của loài là động vật tươi sống và côn trùng, đôi khi cả giáp xác và thịt đồng loại, trong điều kiện ương nuôi có thể sử dụng thức ăn chế biến hoặc thức ăn công nghiệp (Lê Ngọc Diện, 2004; Trần Thị Thanh Hiền và Nguyễn Hương Thuỳ, 2008; Lã Ánh Nguyệt, 2011)

Cá thát lát còm là loài cá tăng trưởng nhanh trong tự nhiên cá 1 năm tuổi có thể đạt chiều dài 16 cm, trọng lượng từ 40-60g (Mai Đình Yên, 1983)

Cá có thể sống 8-10 năm, chiều dài có thể hơn 80 cm và nặng từ 8-10 kg Trong nuôi thương phẩm cá tăng trọng nhanh từ tháng thứ 3 và sau 6 tháng nuôi có thể đạt trọng lượng 400 – 500 g, sau 1 năm nuôi cá đạt 1 kg (Nguyễn Chung, 2006) Thời điểm thả cá giống tốt nhất vào cuối tháng 4 đến đầu tháng

5 và thu hoạch cá sau 6 tháng nuôi

2.1.3 Tình hình nuôi cá thát lát còm

Đồng bằng sông Cửu Long là vùng trọng điểm sản xuất thuỷ sản cả nước Toàn vùng có khoảng 7.000 hecta mặt nước và cung cấp thuỷ sản cho

trên 100 quốc gia khác nhau trên thế giới (Tam et al., 2010) Trong 10 tháng

đầu năm 2011 sản phẩm thuỷ sản đã đạt 1,1 triệu tấn đạt giá trị 4,3 tỉ USD tăng 23,9 % (Tổng cục Thống kê, 2012) Hiện nay với nhu cầu đa dạng hoá đối tượng nuôi thuỷ sản và những khó khăn trong nghề nuôi cá tra truyền thống, cá thát lát dần được chú trọng phát triển ở nhiều tỉnh và trở thành đối tượng nuôi mang tính đặc trưng của vùng

Do có khả năng chống chịu tốt với điều kiện môi trường oxy thấp, nuôi mật độ cao và sử dụng được nhiều loại thức ăn, chất lượng thịt cá ngon nên hiện nay cá thát lát còm là loài cá đang được ưa chuộng trên thị trường, các sản phẩm từ cá không chỉ được tiêu thụ trong nước mà còn được xuất khẩu ra nước ngoài Một điều thuận lợi và cũng là một trong các lý do khiến nhiều người nuôi thuỷ sản chọn cá thát lát còm nuôi là bởi không như một số loài cá khác do bị giới hạn bởi một số yếu tố nên khi nuôi một thời gian dù giá cá tại thời điểm bán không cao vẫn phải bán cá ra thị trường, còn với cá thát lát còm thì người nuôi hoàn toàn có thể tiếp tục giữ cá lại chờ đến khi giá cá hợp lý mới quyết định bán vì cá càng nuôi thì trọng lượng càng tăng và chất lượng thịt càng ngon Với những lý do trên, hoàn toàn không ngạc nhiên khi cá thát lát còm hiện là một trong những đối tượng cá đồng nuôi phổ biến ở nhiều tỉnh thành như: An Giang, Bến Tre, Đồng Tháp, Long An, Tiền Giang Đi đầu

trong đó là tỉnh Hậu Giang với thương hiệu “Cá thát lát Hậu Giang” (www.haugiang.gov.vn)

Hiện nay, tại các tỉnh cá thát lát còm được nuôi chủ yếu trong ao đất, diện tích từ 300 – 400 m2 với mật độ thả từ 5 – 15 con/m2 Ở giai đoạn giống

cá được nuôi trong vèo khi đạt kích cỡ từ 4 - 6 cm/ con cá được đưa vào ao nuôi để ít bị hao hụt Tại Hậu Giang số hộ nuôi cá thát lát còm tăng lên nhiều lần so với các năm trước do có sự hỗ trợ của nhà nước Toàn tỉnh có hơn 50 hecta mặt nước nuôi cá thát lát còm cho sản lượng trên 3000 tấn cá mỗi năm (www.haugiang.gov.vn)

Ngoài ra trong mùa nước nổi, mô hình nuôi cá thát lát trong vèo, mùng lưới cũng đang phát triển ở nhiều tỉnh như An Giang, Đồng Tháp Mỗi mùng lưới với kích thước khoảng 20 – 30 m2, sâu 2 m, với thiết kế đơn giản mỗi mùng lưới có thể thả nuôi khoảng 8000 cá giống Theo nhiều nông hộ cứ đầu

tư khoảng 3,6 kg thức ăn sẽ cho ra 1kg cá thương phẩm Trung bình mỗi đợt nuôi trên 5 tháng và cho thu nhập từ 10 – 50 triệu đồng Chỉ riêng xã An Phong huyện Thanh Bình tỉnh Đồng Tháp đã có trên 15 hộ nuôi mô hình mùng lưới

2.2 Các bệnh vi khuẩn trên cá nuôi nước ngọt

2.2.1 Bệnh do vi khuẩn Gram âm trên cá nuôi nước ngọt

2.2.1.1 Bệnh do nhóm vi khuẩn Aeromonas spp

Vi khuẩn giống Aeromonas spp thuộc họ Aeromonadaceae gồm 2 nhóm: di động Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae và Aeromonas

sorbia và không di động Aeromonas salmonicada Đặc tính chung của ba loài

vi khuẩn thuộc nhóm di động là vi khuẩn Gram âm, dạng hình que ngắn, yếm

khí tùy tiện Tại Việt Nam, vi khuẩn thuộc giống Aeromonas spp di động được phân lập từ cá nước ngọt nhiễm bệnh, thường gặp nhất là loài A

hydrophila (Bùi Quang Tề và ctv, 2006)

Bệnh do vi khuẩn Aeromonas spp được nghiên cứu đầu tiên bởi

Scaperclous, (1930) trích dẫn bởi Aoki (1999) Thập niên 1960, bệnh do vi

khuẩn A hydrophila đã được tập trung nghiên cứu Nhóm vi khuẩn này đã được biết đến là nguyên nhân gây bệnh xuất huyết trên cá chình (Anguilla

anguilla) và cá chép (Cyprinus carpio) ở nhiều nước trên thế giới (Inglis et al.,

1993; Aoki, 1999) Tại Việt Nam, bệnh xuất huyết do vi khuẩn A hydrophila gây ra khá phổ biến trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus), cá basa (Pangasius bocorti) và nhiều loài cá nước ngọt khác như cá lóc, cá rô đồng, cá

điêu hồng (Bùi Quang Tề và ctv, 2006; Từ Thanh Dung và ctv, 2005; Lư Trí

Tài, 2010)

Vi khuẩn Aeromonas spp là vi khuẩn Gram âm, dạng hình que, di động

nhờ tiên mao Đường kính 0,1-1,0 µm, dài 1,0-3,5 µm, không tạo bào nang, nhiệt độ cực thuận là 28°C, có thể phát triển ở 37°C Khuẩn lạc trên môi trường NA có màu trắng đến hồng nhạt, tròn, lồi, rìa trơn Trên môi trường đặc trưng GSP, chúng tạo thành những khuẩn lạc màu vàng, to, trơn láng ủ ở 28°C sau 24 giờ Là vi khuẩn kị khí không bắt buộc, catalase, oxidase dương

tính, lên men đường Vi khuẩn Aeromonas spp dương tính với O/F, nitrate

dương tính, không thể phát triển trong môi trường chứa 6,5% NaCl và kháng

tự nhiên với ampicillin, (Inglis et al., 1993; Noga, 2010) Vi khuẩn được phân

lập từ bệnh phẩm ở gan, thận, tỳ tạng và cả trên cơ của cá nuôi Có 4 chỉ tiêu

sinh hóa cơ bản để phân biệt A hydrophila, A caviae và A sobria là thủy

phân asculin, tạo sản phẩm acetom, lysine decarboxylation và gas từ glucose

Bảng 2.1: Đặc điểm sinh hóa 3 loài vi khuẩn Aeromonas spp

Đặc điểm A hydrophila A caviae A sobria

(nguồn: Inglis et al, 1993)

Cá bị nhiễm loài vi khuẩn này thường có biểu hiện xuất huyết trên da của vây và thân, thường được gọi là bệnh đỏ vây (Hoshina, 1962 trích dẫn bởi

Aoki, 1999) Cá tra bị nhiễm vi khuẩn A hydrophila thường có biểu hiện xuất

huyết da, vây, cơ, phù đầu mắt lồi, gan thận tùy tạng xuất huyết, xoang bụng

có dịch hồng hoặc vàng, một số trường hợp có thể gây nhũn cơ (Từ Thanh

Dung và ctv., 2005)

Các nghiên cứu cho thấy, ngoài cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) loài vi khuẩn A hydrophila còn gây bệnh trên một số các loài cá nước ngọt nuôi và hoang dã: cá chép (Cyprinus carpio), cá nheo Mỹ (Ictalurus

punctatus), cá trê (Clarias batrachus), cá basa (Pangasianodon bocorti), cá

chình Nhật Bản (Anguilla jabonica), cá chình Châu Mỹ (Anguilla rostrata), cá vàng (Carassius auratus), cá lóc (Ophicepphalus striatus) và cá rô phi (Tilaphia nilotica) Phân bố nhiều trong môi trường nước và lớp bùn đáy Vi khuẩn A hydrophila là vi khuẩn gây bệnh cho cả động vật lưỡng cư, bò sát,

rắn và cả trên người

Tại Việt Nam, bệnh xuất huyết do vi khuẩn A hydrophila đã được biết

đến từ những năm 2002, gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi cá tra tại ĐBSCL bệnh thường xảy ra quanh năm, nhưng nặng nhất xảy ra vào lúc giao mùa giữa mùa khô và mùa mưa Một số nghiên cứu đã ghi nhận bệnh xảy ra nhiều nhất vào tháng 6, 7 khi lượng mưa gia tăng Ngược lại những tháng mùa khô (tháng

1-4) dịch bệnh này trên cá tra ít xảy ra (Từ Thanh Dung và ctv., 2005)

Trong những năm gần đây, tình hình xuất hiện bệnh xuất huyết do vi

khuẩn A hydrophila trên cá tra nuôi ở ĐBSCL rất phổ biến và thành dịch

bệnh ở một số địa phương Tại các tỉnh An Giang, Cần Thơ qua khảo sát cho thấy có đến 100% ao nuôi bị nhiễm bệnh xuất huyết gây ra tỷ lệ hao hụt từ 60-70% nếu không được điều trị kịp thời (Nguyễn Chính, 2005) Tuy nhiên, theo điều tra của Trần Anh Dũng (2005) các tỉnh Trà Vinh, Bến Tre thì tỷ lệ nhiễm này chỉ khoảng 70%, vào thời gian lũ rút thì các hộ nuôi cá tra ao ghi nhận bệnh xuất huyết xuất hiện cao nhất 85,4% Điều này cho thấy khả năng gây bệnh của loài vi khuẩn này có sự khác nhau giữa những vùng địa lý khác nhau

2.2.1.2 Bệnh do nhóm vi khuẩn Pseudomonas spp

Nhóm vi khuẩn Pseudomonas spp thuộc họ vi khuẩn

Pseudomonodaceae, là nhóm vi khuẩn được ghi nhận sớm nhất là tác nhân

gây bệnh trên cá bởi Kluyver and Van Niel (1936) trích dẫn bởi Inglis et al (1993) Các loài vi khuẩn Pseudomonas spp thường gây bệnh trên cá, trứng

và trên cả cây trồng Chúng được biết đến như là tác nhân gây bệnh rất phổ biến và gây thiệt hại nghiêm trọng trên cá nước ngọt lẫn nước mặn Hai loài

phổ biến nhất là P anguilliseptica và P fluorescens

Pseudomonas spp là giống vi khuẩn Gram âm, hình que, kích thước từ

0.5 -1.5µm, không sinh bào tử và di động bằng tiêm mao Đây là nhóm vi khuẩn hiếu khí, oxidase dương tính, catalase dương tính, không oxi hóa và

không lên men trong môi trường O/F Chúng có khả năng tạo sắc tố vàng xanh hoặc xanh trên môi trường nuôi cấy Nhiệt độ phát triển rộng từ 4-43oC Vi khuẩn thường được phân lập từ bệnh phẩm ở da, gan, thận của cá bệnh Vi khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc to, tròn, trơn láng, màu trắng đục trên môi trường TSA (Tryptic Soya agar), hoặc khuẩn lạc màu đỏ có sắc tố tím xanh xung quanh trên môi trường GSP sau khi ủ ở 28oC trong 24 giờ (Inglis et

al., 1993; Buller, 2004; Bùi Quang Tề và ctv, 2006)

Pseudomonas spp có thể gây bệnh xuất huyết ở một số loài cá nước

ngọt như: cá trắm cỏ, cá chép, cá rô phi, cá rô đồng Loài vi khuẩn thường

được phân lập là P fluorescens (Pal and Pradhan, 1990) Cá bệnh thường có

dấu hiệu xuất huyết ở da, vây, gan, thận, tỳ tạng Ở giai đoạn giống cá có thể hao hụt hàng hoạt và nhanh chóng nếu không được phát hiện sớm

Bảng 2.2: Một vài đặc điểm sinh hóa của 2 loài Pseudomonas spp

cho cá nước ngọt Chúng đã gây ra nhiều tổn thất về kinh tế cho nghề nuôi cá

da trơn tại Mỹ, nghề nuôi cá tra tại Việt Nam

Loài E ictaluri được mô tả đầu tiên bởi Hawke (1979) Loài vi khuẩn

này được biết đến là nguyên nhân gây bệnh nhiễm trùng máu (ESC) trên cá

nheo Mỹ (Ictalurus punctatus), tỉ lệ hao hụt cao Đến năm 2001 và 2004 các tác giả Ferguson và Từ Thanh Dung đã nghiên cứu và kết luận loài vi khuẩn này cũng là nguyên nhân gây ra bệnh gan thận mủ trên cá tra (Pangasianodon

hypophthalmus) nuôi tại Việt Nam Tuy nhiên theo những ghi nhận hiện nay

thì đây là loài vi khuẩn chỉ gây bệnh trên các loài cá da trơn Đối với cá tra, cá basa nuôi tại Việt Nam, cá bệnh thường có các đặc điểm bên ngoài không có

gì thay đổi, tuy nhiên gan, thận, tỳ tạng xuất hiện nhiều đốm mủ màu trắng, có dịch vàng trong xoang bụng

Loài E tarda được phân lập đầu tiên trên cá chình tại Nhật Bản bởi Hoshinae (1962), được mô tả đầy đủ và đặt tên bởi Ewing et al (1965) Đây là loài vi khuẩn được biết đến gây ra bệnh Edwardsiella septicaemia trên cá nheo

Mỹ (Ictalurus punctatus), cá chình Nhật Bản (Anguilla jabonica), cá rô phi và

trên 21 loài cá nước ngọt, nước mặn khác, chim bò sát, các loài động vật hữu

nhủ và cả trên người Tại Việt Nam, chưa có báo cáo nào phát hiện E tarda gây bệnh trên cá tra, nhưng E tarda đã được tìm thấy trên cá trê đen và cá trê vàng, cá lóc (Bùi Quang Tề và ctv, 2006; Lư Trí Tài, 2010) Vi khuẩn E tarda

khi gây bệnh trên cá sẽ làm cá ít vận động do vây đuôi bị tưa, rách Cá xuất hiện nhiều vết thương tổn trên da (đường kính khoảng 3-5 mm), những vết thương này sẽ hình thành những khối rỗng bên trong cơ, da bị mất sắc tố Ngoài ra, cá bệnh sẽ có những vết thương bên đươi biểu bì và cơ, khi ấn vào

sẽ phát ra khí có mùi hôi, vác vết thương này sẽ làm hoại các vùng cơ xung quanh Gan cá bệnh thường có dấu hiệu sung huyết, nhiều chấm lốm đốm

Thận cá bệnh thường trương to hơn (Inglis et al., 1993; Noga, 2010)

Loài vi khuẩn Edwardsiella thuộc họ vi khuẩn Enterobacteriaceae, là

vi khuẩn Gram âm, yếm khí tùy tiện, hình quen ngắn, kích thước 1x2-3 µm, không sinh bào nang, chuyển động nhờ tiên mao, catalase dương tính, cytochrom oxidase âm tính, lên men trong O/F, phản ứng oxi hóa âm tính Vi

khuẩn E tarda có hình que, di động ở 25oC – 35oC Vi khuẩn này phát triển

nhanh hơn vi khuẩn E ictaluri trên môi trường nuôi cấy E tarda phát triển tốt

ở nhiệt độ 30oC, trong 24 – 48 giờ, có thể phát triển ở 40oC và trong môi trường có độ mặn đến 3%, tạo thành những khuẩn lạc nhỏ trên môi trường nuôi cấy Vi khuẩn này có thể được phân lập từ cơ, gan, thận, tỳ tạng của cá trên môi trường chung là Tryptic Soya agar (TSA) hoặc nutrient agar (NA)

(Inglis et al., 1993) Vi khuẩn E ictaluri là vi khuẩn hình que, di động yếu ở

25oC – 30oC, phát triển chậm, trong 36 – 48 giờ trên môi trường BHIA (Brain Heart Infusion Agar) ở 28oC – 30oC, tạo thành những khuẩn lạc nhỏ và phát triển rất kém hoặc không phát triển ở 37oC Không hiện diện ở độ mặn lớn hơn

1,5% (Inglis et al., 1993)

Bảng 2.3: Một số chỉ tiêu sinh hóa của E ictaluri và E tarda

Ornithin decarboxylase + + Acid from:

arabinose

Tạo H2S (TSI) - + inositol - -

Nhóm vi khuẩn Flavobacterium thuộc họ vi khuẩn Flavobacteriaceae,

ảnh hưởng rất lớn đến nghề ương nuôi cá thương phẩm Nhóm vi khuẩn Gram

âm này rất đa dạng, phân bố khắp nơi ngoài tự nhiên bao gồm cả hệ sinh thái nước ngọt, lợ Chúng gây bệnh trên nhiều giống loài cá khác nhau: nhóm cá bống, cá chình, cá chạch, cá rô, cá nheo, nhóm cá hồi, cá phi, nhóm cá chép,

cá tra Nhóm vi khuẩn này gồm nhiều loài vi khuẩn khác nhau, gây bệnh ở

những điều kiện môi trường khác nhau như F columnare gây bệnh Columnaris trong nước ngọt, F psychrophilum gây bệnh vùng nước lạnh, F

branchiophilum gây bệnh trên mang và F maritimus gây bệnh columnaris trên

thủy vực mặn tuy nhiên đáng chú ý nhất là loài vi khuẩn Flavobacterium

columnare (Speare, 1999)

Vi khuẩn F columnare qua nhiều lần đổi tên trong suốt 74 năm Cuối cùng vào năm 1996 dựa trên cơ sở lai tạo DNA-rDNA, Bernard et al khẳng định là loài Flavobacterium columnare và tên này ổn định cho đến nay Chúng

được biết đến như là mầm bệnh phổ biến trên các loài cá nước ngọt bao gồm

cá không vẩy và cá có vẩy ở nhiều nước trên thế giới Ở Mỹ, F columnare gây

thiệt hại hơn 70% tại các trại ương nuôi cá nheo và được xếp thứ hai trong khả

năng gây bệnh cũng như thiêt hại chỉ sau bệnh nhiễm trùng máu do E ictaluri

Đáng chú ý hơn, khả năng gây hao hụt cá có thể lên đến 100% Với mức độ thiệt hại như vậy, thì việc tìm hiểu về mầm bệnh là điều thật sự cần thiết cho

phòng và trị bệnh do F coulmnare gây ra (trích dẫn bởi Inglis et al.,1993)

Loài vi khuẩn F columnare là vi khuẩn Gram âm, hình que dài, mảnh,

kích thước 0,3-0,5x3-8 µm Đây là loài vi khuẩn có tính di động, hiếu khí, catalase, cytochrom oxidase dương tính, nitrate dương tính Vi khuẩn phân lập đòi hỏi môi trường nghèo dinh dưỡng như Cytophaga agar, Hsu-Shotts agar và

Shieh agar Sự phát triển của F columnare thuận lợi hay không sẽ phụ thuộc

vào các thành phần có trong môi trường Điểm đặc trưng về hình thái khuẩn lạc là sắc tố vàng, rìa dạng rễ, bám chặt và sâu vào môi trường thạch Bộ rễ có thể dài ngắn, nhiều hay ít, bám chặt hay không chặt sâu vào môi trường được

xem là nhân tố đặc trưng cho F columnare Một đặc điểm đáng chú ý là

chúng phát triển chậm trong môi trường nuôi cấy, thời gian từ 24-48 giờ ở nhiệt độ 25oC-28oC, khoảng nhiệt độ thích hợp là 18oC-30oC, không phát triển

ở nhiệt độ dưới 14oC và trên 33oC (Michel et al., 2002) và ở độ mặn 0-0,5%

NaCl

Vi khuẩn F columnare thường bị ức chế khả năng tăng trưởng trong

môi trường có hàm lượng dinh dưỡng cao và có sự hiện diện các loài vi khuẩn

khác Vi khuẩn này thường được phân lập từ các vết loét bên ngoài, vùng này

có nhiều loài vi khuẩn cùng tồn tại, cạnh tranh lấn áp vi khuẩn này khi phân lập trên môi trường giàu dinh dưỡng Vì thế, việc bổ sung kháng sinh vào môi trường khi phân lập là rất cần thiết, nhằm để kìm hãm sự phát triển cùa các

loài vi khuẩn khác, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của F columnare

Thông thường thì môi trường Cytophaga agar, Hsu-Shotts agar cho sự nuôi cấy và phân lập nhưng môi trường Shieh thường sử dụng cho việc đếm khuẩn lạc, xác định độ đục hay để thu được khuẩn lạc rời

Đa số các loài vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể cá chủ yếu theo con đường máu và thận là cơ quan đầu tiên cho sự tấn công nhưng đối với vi

khuẩn F columnare thì ngược lại, chúng tấn công bên ngoài cơ thể cá chủ yếu

ở da và mang Trước hết bắt đầu từ miệng, vây và mang đây là cơ quan chủ yếu bị tổn thương và bị hoại nghiêm trọng Dấu hiệu lâm sàn của cá bệnh là hình thành vùng lở loét trên thân, mang bị hoại, hàm bị mòn dần, nhiều vết loét trắng trên mặt lưng từ đầu đến vây đuôi, có sự tạo ra đường viền màu đỏ nhạt bao quanh vị trí vùng tổn thương hay vùng có vệt trắng Những vùng mô

bị loét thường tương đối lớn so với cơ thể cá, chúng có đường kính khoảng 3-4

cm Vi khuẩn F columnare không giới hạn đối tượng gây bệnh, không chỉ trên

cá da trơn mà cả cá có vẩy với nhiều dấu hiệu bệnh lý khác nhau như vệt trắng

ở lưng hay gần vây lưng, bong trốc vẫy ở đầu, vết loét ở thân, lớp nhớt dày và vệt trắng ở thân

Bảng 2.4: Một số chỉ tiêu sinh hóa của F columnare

Thủy phân tinh bột - Acid from:

arabinose

-

Simmon citrate - glucose -

Tạo H2S (TSI) - inositol -

(Nguồn: Inglis et al., 1993)

2.2.2 Bệnh do vi khuẩn Gram dương trên cá nuôi nước ngọt

Hiện nay đã có nhiều nghiên cứu ghi nhận 1 số tác nhân vi khuẩn gây bệnh phổ biến trên cá nước ngọt tại Việt Nam và nhiều nước trên thế giới Các

loài vi khuẩn Gram dương này phần lớn thuộc nhóm vi khuẩn Streptococcus

spp Nhóm vi khuẩn này đã gây thiệt hại nghiêm trọng trên nhiều đối tượng nuôi như cá điêu hồng, cá rô phi (El-Sayed, 2006; Noga, 2010; Đặng Thụy Mai Thy và Đặng Thị Hoàng Oanh, 2011)

Vi khuẩn Streptococcus spp là vi khuẩn dạng hình cầu hoặc ovan, các

tế bào của vi khuẩn Streptococcus spp thường ghép với nhau thành từng chuỗi

dài, nên được gọi là liên cầu khuẩn, thuộc loại Gram dương, không di động, không tạo bào tử, lên men trong môi trường O/F, oxidase và catalase âm tính,

có khả năng lên men và oxi hóa đường glucose, sucrose và maltose, vi khuẩn không có khả năng sinh khí H2S, cho phản ứng âm tính với citrate, không có khả năng thủy phân gelatine và starch Nhóm vi khuẩn này sinh trưởng tốt trên môi trường TSA có thêm 0,5% glucose, môi trường BHIA, môi trường thạch máu (blood agar) Nuôi cấy ở 20-30oC, sau 24 - 48 giờ hình thành khuẩn lạc

nhỏ đường kính 0,5-1,0 mm, màu hơi vàng, hình tròn, hơi lồi (Inglis et al.,

1993; Buller, 2004)

Khi bị nhiễm bệnh, cá có một số biểu hiện như: màu sắc đen tối, bơi lội không bình thường, mắt cá lồi và đục, xuất huyết ở các vây và xương nắp mang Các vết xuất huyết lan rộng thành lở loét, nhưng các vết loét thường nông hơn các bệnh có lở loét khác Cá bị bệnh vận động khó khăn, bơi không định hướng, cá bệnh có hình thức bơi xoắn, thận và lá lách tăng lên về thể tích

do phù nề Sự thương tổn nội quan là lý do gây chết Tuy vậy, bệnh có thể xảy

ra ở thể nhẹ (mãn tính), chỉ có một vài nốt xuất huyết trên thân mà không có hiện tượng thương tổn nội tạng Tuy nhiên, nếu bệnh ở dạng cấp tính thì gây

chết ở tỉ lệ cao Hai loài vi khuẩn thường được phân lập là S agalactiae và S

iniae (Buller, 2004; El-Sayed, 2006; Noga, 2010)

Bệnh nhiễm vi khuẩn S agalactiae được báo cáo lần đầu tiên ở cá hồi (Oncorhynchus mykiss) ở tỉnh Shizuoka, Nhật Bản vào năm 1957 (Hoshina et

al., 1958) Bệnh do vi khuẩn S agalactiae xảy ra ở nhiều nơi trên thế giới, ở

cả cá nước ngọt và nước mặn Bệnh có thể xảy ra ở một số loài cá nước ngọt

như: cá basa (Pangasius bocourti), cá rô phi (Oreochrromis niloticus), cá chép (Cyprinus carpio), và một số loài cá biển như cá chẽm (Lates calcarifer)

(Stoskop, 1993; Buller, 2006)

Phương thức lan truyền của vi khuẩn Streptococcus agalactiae là

truyền ngang, với sự lây nhiễm xảy ra do tiếp xúc trực tiếp với cá bị nhiễm bệnh hoặc lây nhiễm từ thức ăn Robinson and Meyer (1966) cho thấy bệnh có thể lây nhiễm trực tiếp bằng cách gây cảm nhiễm khi ngâm cá vào bể kính với

vi khuẩn 106 CFU/ml trong 10 phút Thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn

Streptococus spp đã được nhiều tác giả nghiên cứu cũng như công bố không

chỉ trên cá điêu hồng mà còn những đối tượng khác Có nhiều phương pháp

gây cảm nhiễm như: tiêm, tắm và ngâm Suanyuk et al (2005) đã tiến hành gây cảm nhiễm vi khuẩn S agalactiae trên cá rô phi (Oreochromis niloticus)

và đã thu được kết quả là LD50 được xác định từ 3,6x101 – 1,72x107 CFU/ml,

với tỉ lệ chết từ 20-90% Amal et al (2008) cũng tiến hành gây cảm nhiễm vi khuẩn S agalactiae trên cá điêu hồng có trọng lượng trung bình từ 85-100g

Kết quả xác định được vi khuẩn gây chết ở nồng độ 3x106 CFU/ml, LD50 = 3x1010 CFU/ml

2.3 Thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản

2.3.1 Những đặc điểm của thuốc kháng sinh

Cho đến nay thuốc kháng sinh vẫn còn sử dụng một cách phổ biến để phòng trị bệnh vi khuẩn trong nuôi trồng thủy sản Thuốc kháng sinh là hợp chất được sản xuất bởi sinh vật hay tổng hợp, ở nồng độ thấp thì có thể ức chế hoặc giết các sinh vật khác Thuốc kháng sinh được Fleming phát hiện đầu tiên là penicillin vào năm 1929 Những năm sau thuốc kháng sinh khác được sản xuất từ vi sinh vật hoặc tổng hợp hay bán tổng hợp Với những tác dụng hữu hiệu của các thuốc kháng sinh đối với mầm bệnh nên chúng được dùng rộng rãi trong việc điều trị bệnh cho người, vật nuôi nói chung ở cả động vật

thủy sản (Prescott et al., 2000)

Các loại thuốc kháng sinh tác động vào tế bào vi khuẩn thông quá các

cơ chế như: (1) Tác động lên quá trình tạo thành tế bào vi khuẩn như các kháng sinh nhóm thuốc beta lactam; (2) Các kháng sinh nhóm polymcycin tác động lên màng nguyên sinh chất, làm mất phương hướng hoạt động của màng; (3) Các kháng sinh nhóm fenicol và aminoglycoside gây rối loạn và ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn ở mức ribosome; (4) Kháng sinh nhóm quinolone và macrolide tác dụng ức chế tổng hợp acid nucleic; (5) Các kháng

sinh như trimethoprim gây ức chế quá trình tạo acid folic (Prescott et al.,

2000)

Tuy nhiên, hiện nay việc sử dụng kháng sinh để trị bệnh trong nuôi trồng thủy sản không theo qui định đã tạo điều kiện thuận lợi hình thành các vi khuẩn kháng kháng sinh, dẫn đến những tác hại nghiêm trọng cho động vật nuôi và cả con người Sự kháng thuốc của vi khuẩn nói chung và của vi khuẩn gây bệnh trên trên động vật thủy sản nói riêng đã được quan tâm, nghiên cứu

từ rất lâu Từ những năm 50 của thế kỷ 20 các nhà khoa học Nhật Bản đã nghiên cứu sự lan truyền rộng rãi của các loài vi khuẩn kháng cùng lúc nhiều loại thuốc kháng sinh thông dụng

Kháng thuốc của vi khuẩn là hiện tượng 1 chủng vi khuẩn nào đó có khả năng chống lại tác dụng ức chế, kìm hãm, tiêu diệt của 1 số loại kháng sinh đối với vi khuẩn đó Khả năng kháng thuốc này được qui định bởi gen kháng thuốc nằm trên plasmid, nằm trong nguyên sinh chất của tế bào vi

khuẩn (Prescott et al., 2000) Cũng theo tác giả này thì sự đề kháng thuốc của

vi khuẩn có 2 dạng:

(1) Kháng thuốc tự nhiên: do bản chất của vi khuẩn có thể kháng với

1 hay nhiều loại kháng sinh nào đó Đây là hiện tượng bất khả kháng vì nó

thuộc về bản chất của vi khuẩn VD: Streptococcus kháng tự nhiên với aminosid, Aeromonas kháng tự nhiên với ampicillin, E ictaluri kháng tự nhiên

với colistin (2) Kháng thuốc thu nhận: vi khuẩn thu được những yếu tố

kháng thuốc trong quá trình sống do đột biến ngẫu nhiên hoặc do tiếp xúc Trong kiểu kháng thuốc này có 2 dạng đề kháng đó là: (1) Kháng thuốc do đột biến của nhiễm sắc thể, có liên quan đến gen Loại này ít xảy ra (10% - 20%), mang tính tự phát Loại này phát triển chậm nhưng bền (2) Và kháng thuốc do plasmid Loại này lan tràn nhanh do tiếp hợp hoặc qua trung gia thực khuẩn thể (chiếm 80% - 90%) Sự kháng bằng plasmid có thể tạo ra nhiều chủng vi khuẩn kháng với nhiều loại kháng sinh, dẫn đến hiện tượng đa kháng thuốc ở

vi khuẩn (Bùi Kim Tùng, 2001)

Theo Bùi Kim Tùng (2001) thì kháng thuốc do plasmid không bền Loại này qua vài thế hệ, plasmid có thể biến mất và đề kháng không còn Bên cạnh đó, còn có dạng kháng thuốc chai lì, ở đây các khuẩn này chịu đựng được tác dụng của kháng sinh mà không bị tiêu diệt chúng sống trong tình trạng trì trệ, khi gặp thuận lợi lại tiếp tục phát triển và thế hệ sau vẫn nhạy cảm với thuốc Một số cơ chế kháng kháng sinh hình thành ở vi khuẩn để chống lại tác

động của thuốc kháng sinh được các tác giả mô tả như sau: (Prescott et al.,

2000; Treves-Brown, 2000; Bùi Kim Tùng, 2001)

(1) Tiết enzym phân hủy thuốc: VD: nhiều vi khuẩn tiết ra β-lactamase

phân hủy kháng sinh nhóm β-lactam (2) Giảm hấp thụ kháng sinh: màng tế

bào thay đổi tính thấm chọn lọc và thuốc kháng sinh không thể vào trong tế

bào (VD: các khuẩn kháng tetracycline, aminosid) (3) Thay đổi điểm tác

dụng: thay đổi các thụ thể trên ribosom mà kháng sinh gắn vào  kháng sinh

vô hiệu (VD: các khuẩn kháng aminosid) (4) Đổi quy trình tổng hợp: các vi

khuẩn thay đổi quy trình tổng hợp vỏ tế bào, hay các quy trình khác  kháng

sinh vô hiệu (vi khuẩn kháng với penicillin) (5) Sản xuất chất cạnh tranh với

kháng sinh: có những vi khuẩn tiết ra nhiều APAB (acid para aminobenzoic)

là chất kháng sulfonamide nên chúng đề kháng được với kháng sinh này

Hiện nay trên thị trường tồn tại nhiều loại thuốc kháng sinh và việc sử dụng chúng rất tùy tiện, không đúng liều, đúng cách vì thế mà vi khuẩn kháng thuốc ngày càng tăng, đặc biệt là sự đa kháng thuốc được tìm thấy ngày một nhiều hơn, với nhiều loại thuốc hơn

2.3.2 Tình hình kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh trên cá 2.3.2.1 Tình hình kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh ở cá trên thế giới

Từ lâu các nhà khoa học đã quan tâm đến vấn đề kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn nói chung và vi khuẩn gây bệnh trong thủy sản nói riêng

Nhóm vi khuẩn A hydrophila cũng không nằm ngoài xu hướng đó Từ rất lâu

đã có nhiều công trình nghiên cứu về sự kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn này đã được công bố rộng rãi như: Aoki (1974); Fass (1981); Akashi (1986); Austin and Austin (1987); Chang (1987) Mức độ kháng với nhiều loại kháng sinh như ampicillin, chloramphenicol, streptomycin, nitrofurantoin, kháng sinh nhóm sulfonamides, tetracyclines của loài vi khuẩn này trên cá nheo Mỹ

(Ictalurus punctatus) đã được ghi nhận (Aoki, 1988; DePaola et al., 1988)

Bên cạnh đó, những công trình nghiên cứu về cơ chế kháng thuốc cũng đã

được tiến hành Đối với vi khuẩn A hydrophila được xem là kháng tự nhiên

với nhóm β-lactam, cơ chế kháng nhóm thuốc này đã được tìm hiểu bởi

Wen-Chen (1988) Vi khuẩn đã tiết ra enzyme β-lactamase làm vỡ vòng β-lactam, dẫn đến đề kháng được với kháng sinh β-lactam Tiếp theo đó, có nhiều nhóm kháng sinh được ghi nhận là đã bị nhóm vi khuẩn này đề kháng như trimethoprim-sulfamethoxazole, gentamycin, cefazolin, ticarcillin, cefalotin, cefalexin, erythromycin, oxytetracycline, với giá trị MIC khá cao, có tới 24,32% chủng có giá trị MIC trên 128ppm và chỉ có 4,75% chủng nhạy với các kháng sinh ở nồng độ thấp 0,1-0,25ppm (Akinbowel, 2006)

Bên cạnh đó, 2 loài vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Edwardsiella

tarda thuộc nhóm vi khuẩn Edwardsiella spp là 2 tác nhân gây bệnh phổ biến

trên cá cũng đã được nghiên cứu và có nhiều ghi nhận về đặc tính nhạy, kháng với nhiều loại thuốc Hawke (1979) là nhà khoa học đầu tiên đã thực hiện

kháng sinh đồ trên 10 chủng vi khuẩn E ictaliri Sau đó, Walman và Shotts (1986) kiểm tra sự kháng thuốc trên 118 chủng E ictaluri phân lập được ở

Hoa kỳ với 37 loại thuốc kháng sinh, kết quả cho thấy, đa số vi khuẩn kháng với nhóm sulfonamides và thuốc colistin nhưng lại nhạy với nhóm penicillins, quinolones, tetracyclines và kháng sinh chloramphenicol Tương tự, vi khuẩn

E tarda phân lập từ cá bệnh tại Mỹ và Đài Loan cũng đã được ghi nhận là

nhạy cao với các loại kháng sinh ampicillin, chloramphenicol, tetracycline, sulfamethoxazole-trimethoprim, cefotaxim, gentamycin, nhưng trong đó 90%

số chủng vi khuẩn kháng cao với polymycin và colistin (Reinhardt et al.,

1985; Walman and Shotts, 1986) Tương tự, tác giả Reger (1993) cũng ghi

nhận các chủng E tarda nhạy cao với kháng sinh thuộc nhóm quinolones,

kháng sinh gentamycin và doxycycline Một số công trình công bố gần đây cũng cho kết quả nhạy tương tự với nhóm kháng sinh tetracyclines,

chloramphenicol, gentamycin (Stock and Wiedemann, 2001; Lim et al., 2003) Tuy nhiên, không như loài vi khuẩn Aeromonas spp có enzyem β-lactamase nên có khả năng kháng tự nhiên với nhóm thuốc β-lactam, những chủng E

tarda và E.ictaluri cũng sản xuất được enzyme β-lactamase nhưng chúng

không thể hiện tính kháng đối với nhóm kháng sinh này (Clark et al., 1991;

Reger, 1993) nhưng nhóm vi khuẩn này lại được ghi nhận là có thể kháng tự nhiên với colistin và có khả năng kháng cao với kháng sinh nhóm macrolides

và glycopeptides

Đối với bệnh trắng đuôi do vi khuẩn F columnare gây ra, là một dịch

bệnh nguy hiểm gây hao hụt cao trên nhiều loại cá nước ngọt, trên thế giới có nhiều tác giả đã đưa ra nhiều ý kiến khác nhau về việc điều trị, trong đó kháng sinh và hóa chất là hai biện pháp được dùng hiệu quả và phổ biến nhất

(Soumalainen et al., 2005) Tuy nhiên, do đây là nhóm vi khuẩn ngoại ký sinh

nên việc điều trị bằng hóa chất thường được nhiều tác giả đề cập hơn, những

nghiên cứu về dùng kháng sinh điều trị dịch bệnh này chỉ được một số tác giả

nghiên cứu như sau Theo Tripathi et al (2003), điều trị bệnh Columnaris

bằng các loại kháng sinh khác nhau bao gồm benzylpenicillin, oxytetracycline, chloramphenicol… cho hiệu quả cao Trong khi phương pháp của hai tác giả

Robert (1998), Schäperclaus et al (1992) và Francis-Floyd (1998) là dùng

Terramycin® (oxytetracycline HCl) trị bệnh Columnaris với liều lượng

50-100 mg/kg của trọng lượng cơ thể Ngoài ra sau khi đã thử nghiệm với nhiều

loại kháng sinh khác nhau, Kubilay et al (2008) còn xác định vi khuẩn F

columnare nhạy với rất nhiều loại kháng sinh trong đó có chloramphenicol

(30μg), furazolidone (100μg), nitrofurantoin (300µg), erythromycin (15μg) và streptomycin (10μg)

Ngoài ra, sự đa kháng thuốc của các họ vi khuẩn: Enterobacteriacae,

Pseudomonas, Vibrio cũng đã được ghi nhận Nghiên cứu của Akinbowale et

al (2006) về sự kháng thuốc của vi khuẩn phân lập từ môi trường nuôi thủy

sản ở Úc với 19 loại kháng sinh, trong đó: Vibrio spp chiếm 60%, Aeromonas spp 21%, Pseudomonas spp 4%, E tarda 2%, Flavobacterium spp 2% cho thấy sự kháng cao của Pseudomonas spp với cefotaxim (75%),

chloramfenicol , flofenicol, sxt (50%), ampicillin (50%), các giống vi khuẩn còn lại kháng với ampicillin (54,8%), erythromycin (47,1%), cefotaxim (41,4%)

Ngoài những thông tin về sự kháng thuốc của các nhóm vi khuẩn Gram

âm đã được nhiều tác giả công bố, những công trình nghiên cứu về sự kháng

thuốc của nhóm vi khuẩn Gram dương, đặc biệt là nhóm Streptococcus spp

gây bệnh trên các loài cá nước ngọt cũng được một số tác giả nước ngoài đề

cập đến (Horodniceanu et al., 1979; Culebras et al., 2002; Lim, 2003; Martel, 2004; Domelier et al., 2008; Park et al., 2009) Từ những năm 1979 các nghiên cứu của Horodniceanu về sự kháng thuốc của 18 chủng Streptococcus

agalactie đối với 20 loại thuốc kháng sinh đã ghi nhận loài vi khuẩn này

kháng với nhiều loại kháng sinh như tetracycline, chloramphenicol, macrolide (erythromycine), lincomycine với giá trị MIC dao động từ 0,1-250 ppm Nghiên cứu của Culebras (2002) gần đây cho thấy loài vi khuẩn Gram dương này đề kháng cao với kháng sinh macrolide và tetracycline ở mức MIC 90% là

64 ppm Tương tự, loài Streptococcus iniae phân lập trên cá bơn (Paralicthys

olivaceus) tại Nhật cũng được công bố là kháng cao với kháng sinh nhóm

macrolide và kháng sinh tetracycline với giá trị MIC lên đến 256 ppm và 128

ppm (Park et al., 2009) Tuy nhiên loài vi khuẩn này cũng nhạy với nhiều loại

kháng sinh phổ biến như cefotaxim, ofloxacin, penicillin, cephalexin,

gentamicin (Park et al., 2009; Lim et al., 2003)

2.3.2.2 Tình hình kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh trên cá

ở Việt Nam

Tại Việt Nam, nhiều chủng A hydrophila phân lập từ cá tra cho thấy

kháng cao với streptomycin nhưng lại nhạy với gentamycin Ngoài ra, một số loại kháng sinh khác như: sulfonamide và amoxicillin cũng được phát hiện là

đã bị kháng với chủng vi khuẩn gây bệnh trên cá tra tại ĐBSCL (Phuong et

al., 2005) Tương tự, nghiên cứu của Phạm Thanh Hương (2010) cũng ghi

nhận được những chủng A hydrophila phân lập trên cá tra tại Cần Thơ, Đồng

Tháp, Sóc Trăng nhạy cao với tetracycline, florfenicol, chloramphenicol và kháng cao với sulfamethoxazole-trimethoprim (32,8%), streptomycin (55,7%); giá trị MIC của streptomycin khá cao đến 64ppm, ngoài ra, giá trị MIC 90% của các loại kháng sinh như: florfenicol, enrofloxacin, oxytetracycline có giá trị lần lượt là 12,7 ppm, 6,1 ppm, 48 ppm Nghiên cứu cũng cho thấy có đến 23% các chủng vi khuẩn thể hiện sự đa kháng

Ngoài ra, có rất nhiều nghiên cứu về sự kháng thuốc của vi khuẩn E

ictaluri đã được công bố, ghi nhận sự đa kháng cao với nhiều loại kháng sinh

phổ biến (Dung et al., 2008; Từ Thanh Dung và ctv 2010; Nguyễn Thiện Nam

và ctv, 2010; Phạm Thanh Hương, 2011) Tương tự, loài vi khuẩn E tarda

cũng được nhiều tác giả trên thế giới tập trung nghiên cứu về sự kháng thuốc

do đặc tính gây bệnh phổ biến của loài vi khuẩn này Tuy nhiên tại Việt Nam hiện vẫn chưa có công trình nào được công bố chính thức về sự kháng thuốc của loài vi khuẩn này trên các loại cá

Tiếp sau đó, nghiên cứu của Sarter (2007) với 92 dòng vi khuẩn

(Enterobacteriaceae spp chiếm 49,1%, Pseudomonad spp chiếm 35,2% và

Vibrionaceae chiếm 15,7% ) được phân lập từ môi trường thuộc 3 trại nuôi cá

da trơn tại Đồng bằng sông Cửu Long cho thấy sự kháng cao của các chủng vi khuẩn này với 6 loại thuốc kháng sinh oxytetracycline, chloramphenicol, trimethoprim-sulphamethoxazol, nitrofurantion, nalidic acid và ampicillin Tổng cộng có 73 dòng là đa kháng thuốc (kháng trên 2 loại kháng sinh) Phần lớn các chủng vi khuẩn đều có hiện tượng đa kháng thuốc

Theo Phuong et al., (2005) có nhiều loại thuốc kháng sinh thường được

sử dụng ở các trại nuôi và sản xuất giống cá da trơn tại Đồng bằng sông Cửu Long như: -lactams, quinolones, aminosids, sulfonamides, tetracyclines Nhưng việc kết hợp nhiều loại kháng sinh với nhau trong phòng và trị bệnh cũng được người nuôi sử dụng phổ biến Những tác giả này đã kiểm tra sự kháng thuốc của các dòng vi khuẩn phân lập từ môi trường nước và bùn đáy ở các trại nuôi các trại nuôi các đối tượng khác nhau: cá da trơn, cá rô phi ở 5 tỉnh thuộc Đồng bằng sông Cửu Long Kết quả cho thấy 90% dòng vi khuẩn

kháng với tetracycline, 76% kháng với ampicillin, 100% kháng với chloramphenicol, 65% kháng với nitrofurantoin và 89% kháng với trimethoprim-sulphamethoxazole Từ kết quả, có thể thấy sự kháng thuốc của các vi khuẩn trong môi trường ao nuôi thuỷ sản đang ở mức độ rất cao

Từ những thông tin nêu trên cho thấy, đặc tính kháng kháng sinh của vi khuẩn này thay đổi rất đa dạng, chúng khác nhau qua từng năm và từng vùng địa lý.Vì thế hiện nay rất cần thiết tiến hành thí nghiệm xác định đặc tính kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn nhằm mang đến những biện pháp điều trị có hiệu quả hơn

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài

Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Bệnh học Thủy sản- Đại học Cần Thơ

từ tháng 10/2012 đến tháng 07/2013

3.2 Vật liệu nghiên cứu

Thiết bị: Tủ cấy, tủ ấm, tủ sấy, tủ đông, máy tiệt trùng, máy vortex Dụng cụ: Bộ tiểu phẩu, que cấy vi sinh, đèn cồn, đĩa petri, ống nghiệm Hóa chất:

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Tryptic Soya Agar (TSA, Merck ) Môi

trường chọn lọc 2 giống vi khuẩn Pseudomonas và Aeromonas Selective Agar

(GSP Agar, Merck) Môi trường nuôi vi khuẩn Nutrient Broth (NB, Merk,

Darmstadt, Germany)

Các loại kháng sinh đĩa giấy: ampicillin (AMP/10µg), doxycyclinee

florfenicol (FFC/30µg), flumequine (UB/30µg), streptomycin (S/10µg), trimethoprim+sulfamethoxazole (SXT/1,25/23,75µg), cephalexin (CL/10µg), cefotaxim (CTX/10µg), cefazolin (KZ/10µg), colistin (CT/50 g) (Hãng Oxoid)

trimethoprim+sulfamethoxazole (hãng Sigma)

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp điều tra

Điều tra thu mẫu để xác định nguyên nhân và tác nhân gây bệnh trên cá thát còm nuôi trong ao ở một số địa bàn tỉnh Hậu giang và Đồng Tháp Điều tra theo phương pháp chuẩn bị câu hỏi và các thông tin có liên quan đến điều

kiện bộc phát bệnh (các kỹ thuật nuôi, cách quản lý môi trường và dịch bệnh)

3.3.2 Phương pháp thu mẫu cá và phân lập vi khuẩn

Địa điểm thu: Cá thát lát còm có biểu hiện bệnh ở hai tỉnh: Hậu Giang

và Đồng Tháp Cá được thu từ 15 ao và bể nuôi có biểu hiện bệnh, mỗi lần thu 6-8 con cá biểu hiện bệnh và 2-4 con cá khỏe Cá được giữ sống trong thùng xốp có sục khí, vận chuyển về phòng thí nghiệm của bộ môn Bệnh học Thủy sản-Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ Sau đó, mẫu cá được tiến hành phân tích trong ngày và chỉ phân tích mẫu khi cá còn sống Cá được phân tích

mẫu theo phương pháp của Frerichs và Millar (1993) Vi khuẩn được phân lập

từ các cơ quan khác nhau: gan, thận, tỳ tạng của từng con cá và cấy trên môi trường TSA Tryptichoặc môi trường đặc trưng cho vi khuẩn phát triển Những khuẩn lạc rời rạc và hình dạng đặc trưng được tách ròng, lưu giữ để định danh

3.3.3 Phương pháp định danh vi khuẩn

Các đặc điểm về hình thái, sinh-hoá của vi khuẩn được xác định bằng cách kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản (primary test) và sử dụng bộ kit API 20E, (MicrobankTM, PRO-LAB Diagnostics, UK) Vi khuẩn được định danh theo phương pháp của Cowan and Steel’s (Barrow and Feltham, 1999)

3.3.4 Phương pháp làm kháng sinh đồ

Phương pháp làm kháng sinh đồ được thực hiện theo tiêu chuẩn của Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2006) Dùng tâm bông tiệt trùng nhúng vào dung dịch vi khuẩn đã được xác định đạt mật độ 108 CFU/ml bằng máy so màu quang phổ, trãi đều lên mặt môi trường thạch TSA Sau đó dùng pel tiệt trùng lấy đĩa thuốc kháng sinh đặt vào đĩa petri sau cho khoảng cách giữa 2 tâm của đĩa thuốc kháng sinh khoảng 24 mm và khoảng cách giữa tâm đĩa kháng sinh với rìa của đĩa petri là: 10-15 mm Sau khi hoàn tất việc đặt đĩa thuốc kháng sinh, đặt đĩa petri vào tủ ấm ở điều kiện 28oC Sau 24 giờ tiến hành đọc kết quả

Đo đường kính vòng vô trùng (mm): dựa vào chuẩn đường kính vòng

vô trùng theo tiêu chuẩn của Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2006) để xác định loại kháng sinh nhạy, trung bình nhạy và kháng

3.3.5 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc kháng sinh lên vi khuẩn

MIC được xác định bằng phương pháp pha loãng thuốc kháng sinh trong ống nghiệm (phương pháp Broth), theo Clinical and Laboratory Standards Institute, 2006 (CLSI M49-A)

Thí nghiệm sử dụng 4 loại thuốc kháng sinh tinh: ampicillin, enrofloxacin, oxytertracycline và trimethoprim+sulfamethoxazole

Các bước tiến hành:

Chuẩn bị dung dịch thuốc gốc: Pha dung dịch thuốc gốc trong 2 chai (50 ml) có nồng độ 1024 và 256 µg/ml bằng dung môi phù hợp Pha loãng dung dịch thuốc kháng sinh gốc bằng nước cất tiệt trùng, nồng độ thuốc giảm đi một nửa: 1024; 256; 128; 64; 32; 16; 8; 4; 2; 1; 0,5 µg/ml

Chuẩn bị vi khuẩn: Vi khuẩn được nuôi tăng sinh trong dung dịch

BHI-B ủ ở 28oC, trong 24 giờ Đo mật độ vi khuẩn bằng máy quang phổ (OD 625

= 0,085-0,13) tại giá trị này vi khuẩn đạt mật độ 108 CFU/ ml Pha loãng mật độ vi khuẩn bằng môi trường BHB với độ pha loãng 1:10 Mật độ vi khuẩn cần cho tiến hành MIC là 105 CFU/ml

Tiến hành thí nghiệm: cho 2 ml dung dịch vi khuẩn vào từng ống nghiệm chứa 2 ml thuốc có các nồng độ khác nhau Đối chứng âm (2 ml BHB+ 2 ml nước cất) và đối chứng dương (2 ml vi khuẩn + 2 ml nước cất)

3.3.6 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn trên cá thát lát còm

3.3.6.1 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn trên cá thát lát còm

Thí nghiệm được tiến hành tại phòng cảm nhiễm tại phòng thí nghiệm

-Bể nhựa 60 L được khử trùng bằng chlorine và xà phòng sau đó rửa lại bằng nước sạch và sục khí cho hết chlorine

Phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn

Chọn 2 chủng vi khuẩn E.tarda (DT37 và HG41) và 2 chủng vi khuẩn

A.hydrophila (D2F71 và H1F39) để tiến hành thí nghiệm cảm nhiễm Vi

khuẩn được phục hồi trên môi trường TSA ở 28°C và nuôi tăng sinh vi khuẩn trong môi trường BHI-B được đặt lên máy lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ Sau đó tiến hành ly tâm 4000 vòng/phút ở 4°C trong 15 phút Sau khi ly tâm loại bỏ dung dịch phía trên và dùng nước muối sinh lý đã được thanh trùng để rửa vi khuẩn (lặp lại 3 lần).Tiến hành xác định mật số vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ với bước sóng 610 nm và OD = 1±0,1 tương ứng với mật độ

vi khuẩn là 109 CFU/ml Sau đó dung dịch vi khuẩn được pha loãng đến các nồng độ: 104, 106, 108 CFU/ml Mật số vi khuẩn của từng nghiệm thức được khẳng định bằng phương pháp trải dung dịch trên đĩa agar

Bố trí thí nghiệm

Phương pháp tiêm: Cá thát lát giống mua từ trại ở Hậu Giang có trọng

lượng khoảng 15±4 g/con, cá khỏe, có da sáng và phản ứng linh hoạt với tiếng động được trữ trong bể composite, có sục khí, cho ăn thức ăn công nghiệp, cho ăn theo nhu cầu của cá Cá được kiểm tra kí sinh trùng và vi sinh trước khi tiến hành thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức có mật

độ vi khuẩn lần lượt là: 104, 106, 108 CFU/ml, nghiệm thức đối chứng không tiêm và nghiệm thức đối chứng tiêm nước muối sinh lý, mỗi nghiệm thức lặp lại 2 lần với mật độ cá thí nghiệm 10 con/bể Cá được tiêm vi khuẩn với các nồng độ thí nghiệm ở gốc vi bụng của cá Tiêm 0,1 ml/cá thể và cho ăn suốt quá trình thí nghiệm Thời gian theo dõi sau khi gây cảm nhiễm là 14 ngày

Phương pháp ngâm được tiến hành trên cá thát lát bột 40 ngày tuổi

với chủng vi khuẩn E.tarda (HG41) và A.hydrophila (H1F39)

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức có mật

độ vi khuẩn lần lượt là: 104, 105, 106 CFU/ml, nghiệm thức đối chứng không ngâm và nghiệm thức đối chứng ngâm nước muối sinh lý, mỗi nghiệm thức lặp lại 2 lần với mật độ cá thí nghiệm 10 con/bể Cá được ngâm tiếp xúc với dung dịch vi khuẩn với các nồng độ thí nghiệm trong thời gian 30 phút Thời gian theo dõi sau khi gây cảm nhiễm là 14 ngày

3.3.6.2 Phương pháp xác định LD50

LD50: Lethal dose (nồng độ vi khuẩn gây chết cá 50%) Xác định LD50

theo phương pháp của Reed và Muench (1938) để biết được khả năng gây bệnh của vi khuẩn và so sánh độc lực giữa các chủng vi khuẩn

Xác định LD50 theo công thức Reed & Muench (1938):

3.2.6.4 Tái phân lập và định danh vi khuẩn

Tiến hành thu mẫu và phân lập vi khuẩn ở cá có biểu hiện lờ đờ hay vừa mới chết, đồng thời ghi lại thời gian, dấu hiệu bên ngoài và bên trong cơ thể mẫu cá Phân lập vi khuẩn ở 3 cơ quan: gan, thận và tỳ tạng Các đặc điểm

về hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn phân lập được tái định danh theo

phương pháp của Cowan and Steel’s (Barrow and Feltham, 1999)

3.4 Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu được thu thập và xử lý để vẽ đồ thị, biểu bảng, viết luận văn bằng phần mềm Microsoft Excel và Microsoft Word Xử lý thống kê bằng phương pháp phép kiểm T-test 2 biến độc lập trong phần mềm SPSS 16.0

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thông tin điều tra nông hộ

4.1.1 Một số thông tin chung về hộ nuôi

Qua kết quả điều tra 25 hộ nuôi cho thấy có 2 mô hình nuôi cá thát lát còm phổ biến là nuôi trong ao đất và nuôi trong vèo, có thả ghép với cá sặc rằn với các yếu tố về ao nuôi được trình bày trong Phụ lục 1 Về vấn đề con giống, các hộ nuôi thường chọn nguồn giống từ các trại sản xuất giống của địa phương, trong số 25 hộ điều tra, chỉ có 20% là tự sản xuất con giống Tuy nhiên, qua điều tra cho thấy các hộ nuôi đều nhận định chất lượng con giống chưa cao và không ổn định vì bên cạnh một số trại giống có uy tín và sản xuất chú trọng đến chất lượng con giống thì do tình trạng nhu cầu con giống lớn, hiện tại địa phương vẫn chưa đáp ứng được đủ nhu cầu người nuôi, dẫn đến tình trạng giá cá giống rất cao nên một số trại giống chỉ quan tâm đến việc sản xuất đạt số lượng cao để thu về nhiều lợi nhuận hơn chứ chưa chú trọng đến chất lượng con giống sản xuất ra Đó cũng chính là một trong những yếu tố dẫn đến tình trạng các hộ nuôi cho rằng không nên xử lý con giống trước khi thả, Đa số cho rằng con giống còn nhỏ, giá giống lại rất đắt nên lo ngại nếu xử

lý sẽ làm cá bị sốc và gây hao hụt Theo kinh nghiệm của hộ nuôi, nếu nuôi ở mật độ cao thì dịch bệnh dễ xảy ra và cá dễ bị phân đàn Theo đó, các hộ thường thả nuôi với mật độ 30 con/m2 đối với nuôi trong ao đất và 120 con/m2 đối với mô hình nuôi trong vèo (Phụ lục 1) Các hộ cho biết tuy có sử dụng thức ăn công nghiệp cho cá thát lát còm nhưng giai đoạn đầu hầu như đều phải sử dụng hoàn toàn trùn chỉ và cá tạp làm thức ăn cho cá thát lát do đặc tính ăn động vật của cá thát lát, hơn nữa giá cá tạp lại thấp nên giảm được giá thành sản xuất Tuy nhiên, các hộ cũng nhận thấy rằng khi sử dụng thức ăn

là cá tạp thì nước rất mau dơ Về chế độ thay nước, các hộ nuôi thường hạn chế thay nước trong tháng đầu tiên, chỉ có 32% hộ là định kỳ 15-20 ngày thì thay nước, các hộ chỉ thay khi nhận định cảm tính rằng nước dơ và hoàn toàn không kiểm tra các chỉ tiêu môi trường nước trong suốt vụ nuôi Hầu hết các

hộ được phỏng vấn đều không sử dụng ao lắng, bơm và thải nước trực tiếp nước ra sông

Qua khảo sát điều tra cho thấy vấn đề chất lượng con giống chưa cao, việc sử dụng thức ăn là trùn chỉ và cá tạp dẫn đến rất khó kiểm soát chất lượng nước, cùng với sự chưa quan tâm quản lý môi trường nước đúng mức của các

hộ nuôi và nuôi mật độ cao là một trong số các yếu tố dẫn đến sự xuất hiện của bệnh trên cá thát lát còm

4.1.2 Thông tin về tình hình xuất hiện bệnh và sử dụng thuốc hóa chất

Sau vấn đề con giống và thức ăn thì chi phí dùng cho thuốc và hóa chất

để xử lý khi cá bệnh cũng là một vấn đề mà các nông hộ được điều tra quan tâm nhất? Theo các hộ nuôi thì cá thát lát còm ít bị bệnh hơn cá lóc và cá rô Kết quả ghi nhận cho thấy, các loại bệnh xuất hiện phổ biến như: Kí sinh trùng, xuất huyết hay còn gọi là đỏ lườn và bệnh đen thân hay còn gọi là đốm

đỏ (Hình 4.1)

Trong đó bệnh do ký sinh trùng đã xuất hiện khá phổ biến, tần suất xuất hiện trung bình khoảng 64% số hộ khảo sát Bệnh ký sinh trùng cũng được ghi nhận là đã có xảy ra ở các vụ nuôi trước và xuất hiện suốt vụ nuôi nhưng thường gây thiệt hại cao ở giai đoạn cá giống Trùng bánh xe và sán lá là 2 tác nhân ký sinh trùng được ghi nhận là tác nhân ký sinh trùng phổ biến trên cá thát lát Các hộ thường xử lý bằng tạt formol hoặc các thuốc xử lý ngoại ký sinh

Bệnh xuất huyết hay còn gọi là bệnh đỏ lườn được các hộ cho biết là một bệnh nguy hiểm trên cá thát lát với tỷ lệ nhiễm 76% Bệnh xuất hiện hầu như suốt vụ nhưng phổ biến và gây thiệt hại nhiều nhất ở giai đoạn chuyển thức ăn cho cá từ trùn chỉ qua thức ăn công nghiệp và thời điểm các tháng mùa

lũ (tháng 7-9) khi mưa nhiều liên tục

Kế đến một bệnh đốm đỏ hay còn gọi là bệnh đen thân, xuất hiện chủ yếu lúc đầu vụ khi vận chuyển cá về nuôi và vào những cơn mưa đầu mùa (tháng 4-6) So với 2 dịch bệnh trước thì bệnh đốm đỏ ít phổ biến hơn, khi chỉ

có 40% số hộ ghi nhận có dịch bệnh xảy ra

Hình 4.1: Tình hình xuất hiện bệnh trên cá thát lát

Theo nhận định từ phía hộ nuôi, bệnh trên cá còm xảy ra hầu như quanh năm nhưng thường tập trung vào các tháng mùa mưa Điều này có thể xuất phát từ việc môi trường vào các tháng mùa mưa thường thay đổi và gây sốc cho cá, môi trường nước nhiều vật chất hữu cơ và mầm bệnh theo nguồn nước xâm nhiễm vào ao nuôi gây bệnh Ngoài ra, hiện nay,dịch bệnh có phần tiến triển phức tạp và gia tăng nhiều hơn so với những năm đầu mới triển khai

mô hình Điều này có thể là do mật độ thâm canh ngày càng cao, môi trường trong ao nuôi tích tụ mầm bệnh trong thời gian dài và quá trình cải tạo cũng đã không diệt hết các mầm bệnh ở những vụ trước

Trước tình hình xuất bệnh xảy ra trên cá còm ngày càng nhiều đòi hỏi công tác phòng và điều trị bệnh càng trở nên cấp thiết và chú trọng hơn Hiện này, để đối phó với dịch bệnh, thuốc kháng sinh vẫn là lựa chọn phổ biến với người nuôi, 100% người nuôi thường sử dụng kháng sinh để điều trị khi dịch bệnh xảy ra Theo kết quả điều tra cho thấy, tổng cộng khoảng 12 loại kháng sinh, thuộc 7 nhóm kháng sinh là: beta lactams, tetracyclines, fenicols, quinolones, polymyxins, aminoglycosids và trimethorprim+sulfamethoxazole, được người nuôi sử dụng để điều trị bệnh nhưng đa số các hộ sử dụng thuốc theo kinh nghiệm bản thân từ những vụ nuôi trước hoặc theo sự hướng dẫn của những người nuôi có kinh nghiệm trong vùng, của cửa hàng thuốc hoặc sự hướng dẫn của trại giống nơi mình mua giống Những loại kháng sinh được người nuôi sử dụng phổ biến gồm oxytetracycline, doxycycline, florfenicol, trimethorprim+sulfamethoxazole, chloramphenicol, streptomycin, ampicillin, amoxicilin, colistin, enrofloxacin, ciprofloxacin, cephalexin Người nuôi sử dụng kháng sinh bằng cách trộn vào thức ăn cho cá ăn liên tục đến khi thấy