Nghiên cứu được thực hiện nhằm khảo sát khả năng thu sinh khối của vi khuẩn L.casei trên môi trường tối ưu MRS và môi trường cải biến rau cải xanh, đồng thời tiến hành khảo sát khả năng
Trang 1NGHIÊN CỨU CHẾ BIẾN NHỮNG SẢN PHẨM HỖ TRỢ HỆ TIÊU HÓA TỪ
LỢI KHUẨN PROBIOTICS
Trần Thị Vân Anh, Võ Thị Kim Ngân, Trương Thị Yến Linh
Lớp 08SH1D – Khoa Khoa Học Ứng Dụng
TÓM TẮT: Ngày nay việc sử dụng các lợi khuẩn Probiotics ứng dụng trong các
sản phẩm hỗ trợ tiêu hóa ngày càng phổ biến Nghiên cứu được thực hiện nhằm khảo sát
khả năng thu sinh khối của vi khuẩn L.casei trên môi trường tối ưu MRS và môi trường
cải biến rau cải xanh, đồng thời tiến hành khảo sát khả năng tạo bào tử của vi khuẩn
B.clausii, tạo ra một số chế phẩm sinh khối và bào tử vi khuẩn ở dạng bột khô và dạng
lỏng giúp đa dạng hóa các chế phẩm probiotics hiện có trên thị trường Việt Nam
QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ 1.Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 1.1 Vi sinh vật
+ Chủng Lactobacillus casei phân lập từ sữa chua uống Yakult của Công ty
Honkusha
+ Chủng Bacillus clausii phân lập từ Thuốc tiêu hóa Enterogermina của Công ty
Sanofi-Aventis
1.2 Môi trường
Sử dụng môi trường MRS và môi trường cải biến rau cải xanh khảo sát đặc tính
và khả năng thu sinh khối vi khuẩn L.casei
Môi trường Cao thịt – Pepton và Acetate để nhân giống, khảo sát khả năng thu
sinh khối và tạo bào tử vi khuẩn B.clausii
1.3 Phương pháp nghiên cứu
Sử dụng các phương pháp nghiên cứu vi sinh vật thông dụng trong nghiên cứu khảo sát các đặc tính của vi sinh vật và một số phương pháp khảo sát đường cong sinh
Trang 2trưởng, phương pháp nhân giống và thu nhận sinh khối vi khuẩn, phương pháp xác định
số lượng tế bào vi sinh vật…
2 Kết quả và thảo luận 2.1 Phân lập vi khuẩn
Từ mẫu sữa chua uống Yakult của Công ty Honkusha Việt Nam và mẫu thuốc hỗ trợ tiêu hóa Enterogemina của Công ty Sanofi-Aventis đã phân lập được hai chủng vi
khuẩn L.casei và B.clausii
Hình 1 Hình thái khuẩn lạc
L.casei
Hình 2 Hình thái khuẩn lạc
B.clausii
Các chủng vi khuẩn được làm thuần và đem giữ giống trên ống thạch nghiêng để tiến hành nhân giống
2.2 Nuôi cấy và thu sinh khối của vi khuẩn L.casei
Để xác định thời gian thu sinh khối tối ưu, chúng tôi tiến hành xác định đường
cong sinh trưởng của vi khuẩn L.casei bằng cách đo OD610nm mật độ tế bào vi khuẩn thay đổi trong vòng 48 tiếng trong hai môi trường rau cải xanh lỏng và MRS lỏng
Trang 3Đồ thị 1 Mối tương quan giữa thời gian và mật độ tế bào sống của L.casei trong môi
trường rau cải xanh
Đồ thị 2 Mối tương quan giữa thời gian và mật độ tế bào sống của chủng
L.casei trong môi trường MRS
Sau khi tiến hành xây dựng đường cong sinh trưởng của L.casei trên hai môi
trường, tiến hành xác định số lượng tế bào trong quãng thời gian vi khuẩn đạt sinh khối lớn nhất bằng phương pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu
Thu sinh khối vi khuẩn bằng phương pháp ly tâm 10.000 vòng/5 phút 100mL môi trường nhân giống cấp 2, sau đó rửa lại với nước cất vô trùng và đem ly tâm lại Sinh khối vi khuẩn thu được đem đi sấy khô và cân khối lượng để cho ra sản phẩm dạng bột hoặc đem hòa với 10mL nước cất vô trùng để cho ra sản phẩm dạng dịch lỏng
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
Thời gian (giờ)
0 0.5 1 1.5 2
Thời gian (giờ)
Trang 42.2.1 Sản phẩm sinh khối dạng dịch lỏng của L.casei trên môi trường cải biến
rau cải xanh
Số lượng tế bào vi khuẩn có trong 1mL môi trường rau cải xanh: 26,25 triệu tế bào
Sản phẩm chứa 26,25 x 100 = 2,625 tỉ tế bào/ 10mL
2.2.2 Sản phẩm sinh khối L.casei trên môi trường MRS
Hình 3 Sinh khối vi khuẩn L.casei thu được sau khi li tâm
Số tế bào vi khuẩn có trong 1mL môi trường MRS: 1,255 (tỉ tế bào/mL) Khối lượng sinh khối vi khuẩn sau khi sấy khô: 0,41g (hiệu suất đạt 41%) + Sản phẩm dạng bột khô
Tương ứng với 0,41g sản phẩm chứa 1,225 x 100 =125,5 tỉ tế bào + Sản phẩm dạng lỏng
Sản phẩm sẽ chứa 1,225 x 100 = 122,5 tỉ tế bào/10mL
Hình 4 Sản phẩm sinh khối L.casei dạng lỏng
Trang 5Nhận xét khả năng thu sinh khối giữa hai môi trường rau cải xanh và MRS:
Dựa trên kết quả khảo sát về số lượng tế bào vi khuẩn trong hai môi trường MRS và môi trường cải biến rau cải xanh, nhận thấy số lượng tế bào vi khuẩn có mặt trong môi trường rau cải xanh ít hơn so với môi trường MRS Tuy nhiên, khi so sánh giá thành của hai môi trường, môi trường rau cải xanh vẫn có giá rẻ hơn rất nhiều so với môi trường MRS (nhiều hóa chất đắt tiền) Ngoài ra, đường cong sinh trưởng cho thấy thời gian thu sinh
khối của L.casei trong môi trường rau cải xanh sẽ sớm hơn so với MRS
2.3 Nuôi cấy và thu sinh khối và tạo bào tử vi khuẩn B.clausii
Trước khi tiến hành thu sinh khối ta tiến hành đo mật độ tế bào thay đổi trong 48
tiếng để xác định đường cong sinh trưởng của vi khuẩn B.clausii
Đồ thị 3 Mối tương quan giữa thời gian và mật độ tế bào sống của chủng B.clausii
trong môi trường Cao thịt-Pepton
2.3.1 Thu nhận sinh khối B.clausii
Tiến hành xác định số lượng tế bào vi khuẩn trong khoảng thời gian tối ưu bằng phương pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu, sau đó đem ly tâm thu sinh khối vi khuẩn rồi hòa toàn bộ sinh khối thu được với 10mL nước cất vô trùng
Số tế bào vi khuẩn có trong 1mL môi trường: 131,5 (triệu tế bào/mL)
Sản phẩm sinh khối vi khuẩn B.clausii dạng lỏng sẽ chứa 131,5 x 100 = 1,315 tỉ tế
bào/10mL
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
Thời gian (giờ)
Trang 62.3.2 Thu nhận bào tử B.clausii
Khả năng hình thành bào tử của B.clausii được khảo sát trên 4 điều kiện:
- Môi trường Cao thịt – Pepton ở nhiệt độ 15°C trong 2 tuần
- Môi trường Cao thịt – Pepton ở nhiệt độ 15°C trong 3 tuần
- Môi trường Acetate ở nhiệt độ 15°C trong 1 tuần
- Môi trường Acetate ở nhiệt độ phòng trong 1 tuần Sau khoảng thời gian khảo sát, tiến hành nhuộm bào tử để xác định sự tồn tại của bào tử trong môi trường nuôi cấy
Hình 5 Bào tử chủng B.clausii
Kết quả cho thấy bào tử B.clausii đã xuất hiện trên các môi trường trên
Sau đó tiến hành đếm số lượng bào tử hình thành trong bốn điều kiện trên bằng phương pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu, kết quả thu được được trình bày trong bảng sau:
Trang 7Môi trường Cao thịt – Pepton Acetate
Điều kiện Nhiệt độ 15°C
trong 2 tuần
Nhiệt độ 15°C trong 3 tuần
Nhiệt độ 15°C trong 1 tuần
Nhiệt độ phòng trong
1 tuần
Số lượng bào tử đếm
Số lượng bào tử/mL 93,5 triệu bào
tử/mL
122,5 triệu bào tử/mL
15,25 triệu bào tử/mL
12,75 triệu bào tử/mL
Số lượng tế bào đếm
được trong 5 ô lớn
(trước khi cho tạo bào
tử)
Số lượng tế bào/mL 121,5 triệu tế bào/mL 14,15 triệu tế bào/mL
Tỉ lệ hình thành bào tử 76,95% 100,82% 107,77% 86,57%
Bảng 3.1 Số liệu so sánh tỉ lệ hình thành bào tử
Dựa vào bảng kết quả số liệu trên, ta có thể nhận thấy trong cùng môi trường
nuôi cấy, khả năng hình thành bào tử của B.clausii phụ thuộc vào thời gian, nhiệt độ và
thành phần môi trường Đối với môi trường Cao thịt – Pepton, sau một khoảng thời gian, chất dinh dưỡng trong môi trường sẽ cạn dần, môi trường nuôi cấy sẽ trở thành môi trường khắc nghiệt kích thích vi khuẩn tạo bào tử, mặt khác điều kiện nhiệt độ thấp cũng thúc đẩy quá trình hình thành bào tử vi khuẩn Khi so sánh trên hai môi trường, vi khuẩn
có khả năng tạo bào tử nhiều hơn trên môi trường Acetate là môi trường nghèo chất dinh dưỡng
Lấy 100mL dịch nhân giống đã xác định có bào tử lớn nhất trên đem ly tâm 10.000 vòng/5 phút, thu cặn bào tử rửa với nước cất vô trùng và đem ly tâm lại lần hai, ta
thu được bào tử của B.clausii
Trang 8Hình 6.Bào tử B.clausii thu được sau khi li tâm
Sau khi ly tâm, toàn bộ bào tử vi khuẩn được chuyển vào ống nghiệm chứa 10mL nước cất vô trùng tạo dịch huyền phù bào tử
Sản phẩm chứa 122,5 x 100 = 1,225 tỉ bào tử/ 10mL
Hình 7 Sản phẩm lỏng bào tử của chủng B.clausii
2.4 Dự đoán giá thành các sản phẩm Probiotics
Tiến hành tính sơ bộ giá thành của hóa chất sử dụng trong pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật, cụ thể chúng tôi sử dụng hóa chất để pha 100mL môi trường thu được các sản phẩm Probiotics nghiên cứu
Chúng tôi thu được bảng dự đoán kết quả giá thành sơ bộ sản phẩm và kèm theo
so sánh với một số sản phẩm Probiotics hiện có trên thị trường
Trang 9Sản phẩm Probiotics Thể tích (trọng
lượng)
Hàm lượng vi
Sinh khối khô L.casei 0,41g 125,5 tỉ tế bào 5000 VNĐ
Sinh khối L.casei lỏng 10mL 125,5 tỉ tế bào 5000 VNĐ
Sinh khối L.casei trên môi
trường rau cải xanh 10ml 2,625 tỉ tế bào 200VNĐ
Sinh khối B.clausii lỏng 10mL 1,315 tỉ tế bào 3000 VNĐ
Bào tử B.clausii lỏng 10mL 1,225 tỉ bào tử 3000 VNĐ
Bảng 3.2 Dự đoán sơ bộ giá thành của các sản phẩm thu được Probiotics và so sánh
với một số sản phẩm Probiotics trên thị trường Nhận xét:
+ Đối với sản phẩm chứa L.casei
Sau khi tính toán sơ bộ giá thành, thu được kết quả như bảng trên Giá thành
phẩm của sản phẩm sinh khối của L.casei tương đương so với Enterogermina, nhưng số lượng tế bào có trong sinh khối của sản phẩm chứa L.casei nhiều hơn gấp nhiều lần so
với số bào tử trong Enterogermia Bên cạnh những ưu thế về số lượng, với những đặc
tính giúp L.casei có thể sống sót qua môi trường acid của dạ dày đi vào ruột mà vẫn đảm
bảo hoạt tính và có tác dụng về đường tiêu hóa như mong muốn Trong khi đó, dạng bào
tử của B.clausii có thể đi vào thành ruột nhưng cần có thời gian để phát triển từ bào tử thành tế bào, nên sản phẩm này chưa thể có tác dụng ngay lập tức giống như L.casei Đây
chính là khả năng cạnh tranh trong lĩnh vực dược phẩm của sản phẩm chúng tôi nghiên cứu
Tuy nhiên, để thu được sinh khối của L.casei phải tiến hành trong môi trường với
hóa chất mắc tiền Vì vậy nhóm chúng tôi tiến hành khảo sát trên môi trường cải biến rau cải xanh Sau thời gian khảo sát chúng tôi có thể thu được hàm lượng vi sinh vật là xấp
Trang 10công nghiệp và đảm bảo được điều kiện môi trường vô trùng tối ưu thì đây là mức giá rất cạnh tranh với những sản phẩm khác
+ Đối với sản phẩm chứa B.clausii
Ngoài ra, nhóm chúng tôi còn tiến hành khảo sát thêm về thu sinh khối, bào tử
của B.clausii trên môi trường Cao thịt – pepton thì thu được sản phẩm và giá thành tương
đương với sản phẩm Enterogermina Vì thời gian hạn chế, chúng tôi chưa thể đi sâu vào nghiên cứu trên môi trường Acetate tạo bào tử Nhưng với đánh giá sơ bộ ban đầu, chúng tôi nhận thấy tỷ lệ sinh bào tử trên môi trường Acetate lớn hơn môi trường Cao thịt – pepton Nên nếu được triển khai thu bào tử trên môi trường Acetate chúng ta có thể thu được số lượng bào tử lớn hơn nhiều
KẾT LUẬN
Sau gần 5 tháng nghiên cứu, chúng tôi đã nghiên cứu cho ra các sản phẩm hỗ trợ tiêu hóa từ lợi khuẩn Probiotics, đa dạng hóa sản phẩm Probiotics trên thị trường.:
1 Sản phẩm sinh khối vi khuẩn L.casei dưới hai dạng: bột và lỏng
2.Sản phẩm sinh khối và bào tử B.clausii
3.Khảo sát thành công khả năng thu sinh khối của L.casei trên môi trường cải biến
rau cải xanh cho ra sản phẩm có giá thành rẻ
4.Khảo sát sơ bộ khả năng tạo bào tử của vi khuẩn B.clausii ở các điều kiện khác
nhau
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
[1] Lê Thành Hưng – “Đặc điểm và vai trò của probiotic ở người và động vật” –
Luận văn Tốt nghiệp 2010
Trang 11[2] Mai Đàm Linh, Đỗ Minh Phương, Phạm Thị Tuyết, Kiều Hữu Ảnh, Nguyễn
Thị Giang – Đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn lactic phân lập trên địa bàn Hà Nội – Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa Tự nhiên và Công nghệ 24 (2008) 221-226
[3] Phan Thị Phương Thảo – “Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Bacillus subtilis
vào sản phẩm lên men từ đậu hủ có khả năng hỗ trợ tiêu hóa” – Luận văn Tốt nghiệp
Trường ĐH Tôn Đức Thắng, năm 2005
[4] Tài liệu Thí nghiệm vi sinh đại cương trường ĐH Tôn Đức Thắng [5] Thông cáo báo chí ngày 15/07/2006 Công ty Sanofi-Aventis _ Bác sĩ Nguyễn
Thị Ngọc Diệp
[6] “Đồ án Công nghệ sản xuất acid lactic” - Trường Đại Học Sư Phạm Kỹ
Thuật Tp Hồ Chí Minh - GVHD Ngô Lâm Tuấn Anh
Tài liệu tiếng Anh [7] Sandholmand Maria Saarela, edited by Tiina Mattila - Funcitional dairy
products 2003 –CRC Press
Trang web điện tử [8] http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_clausii [9] http://en.wikipedia.org/wiki/Lactobacillus_casei [10] http://www.probiotic.org/lactobacillus-casei.htm [11] http://www.ehow.com/about_5531574_lactobacillus-casei.html [12] http://en.wikipedia.org/
[13] http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Bacillus_clausii [14] http://free.vietscience.org