Nghiên cứu ứng dụng dung dịch thủy phân từ phụ phẩm cá bằng enzyme làm phân bón cho một số loại rau trong nhà màng

Khảo sát quá trình thủy phân phụ phẩm cá Tra bằng enzym. Phối chế dung dịch thuỷ phân thành phân bón lá để dùng cho rau ăn lá và rau ăn quả. Khảo nghiệm chế phẩm phân bón lá từ cá Tra cho một số loại rau trong nhà màng, ngoài đồng ruộng và công nhận phân bón mới.

ỦY BAN NHÂN DÂN TP HCM

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

BÁO CÁO NGHIỆM THU

(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu)

ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG DUNG DỊCH THỦY PHÂN

TỪ PHỤ PHẨM CÁ BẰNG ENZYM LÀM PHÂN BÓN CHO MỘT SỐ LOẠI RAU TRONG NHÀ MÀNG

THÔNG TIN CHUNG CỦA ĐỀ TÀI

1 Tên đề tài: Nghiên cứu ứng dụng dung dịch thủy phân từ phụ phẩm cá bằng enzym

làm phân bón cho một số loại rau trong nhà màng

2 Chủ nhiệm đề tài: ThS Phạm Đình Dũng và CN Trần Văn Lâm

3 Cơ quan chủ trì đề tài: Trung tâm Nghiên cứu & Phát triển Nông nghiệp Công

nghệ cao Tp HCM

4 Cơ quan quản lý đề tài: Sở Khoa Học và Công Nghệ TP.HCM

5 Cán bộ tham gia thực hiện đề tài:

- ThS Phạm Đình Dũng

- KS Trần Văn Lâm

- KS Hoàng Đắc Hiệt

- ThS Dương Thị Mỹ Thu

- KS Nguyễn Hoàng Duy Lưu

- KS Bùi Văn Sơn

9 Nội dung nghiên cứu:

Nội dung 1: Khảo sát quá trình thủy phân phụ phẩm cá Tra bằng enzym

Thí nghiệm 1: Khảo sát hiệu quả thủy phân của một số loại enzym đến quá trình thủy phân protein phụ phẩm cá Tra

Thí nghiệm 2: Khảo sát hoạt độ của enzym Alcalase thủy phân phụ phẩm cá Tra

Thí nghiệm 3: Xác định thời gian thủy phân protein cá Tra tối ưu nhất

Thí nghiệm 4: Ổn định dung dịch thủy phân bằng Natribenzoat

Nội dung 2: Phối chế dung dịch thuỷ phân thành phân bón lá để dùng cho rau ăn lá và

rau ăn quả

Nội dung 3: Khảo nghiệm chế phẩm phân bón lá từ cá Tra cho một số loại rau trong

nhà màng, ngoài đồng ruộng và công nhận phân bón mới

Thí nghiệm 1: Khảo nghiệm chế phẩm phân bón lá cho cải xanh trồng trong điều kiện nhà màng

Thí nghiệm 2: Khảo nghiệm chế phẩm phân bón lá cho dưa leo trồng trong điều kiện nhà màng

Thí nghiệm 3: Khảo nghiệm chế phẩm phân bón lá (chế phẩm 1) cho cải xanh và rau dền ngoài đồng ruộng

10 Sản phẩm của đề tài:

TT Tên sản phẩm Yêu cầu khoa học dự kiến đạt được

(tiêu chuẩn chất lượng)

1

Quy trình công nghệ sản xuất dịch thủy

phân làm nguyên liệu cho việc sản xuất

TÓM TẮT

Đề tài “Nghiên cứu ứng dụng dung dịch thủy phân từ phụ phẩm cá bằng enzym

làm phân bón cho một số loại rau trong nhà màng” đã được tiến hành từ tháng 03/2011

đến 11/2013 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là xây dựng quy trình sản xuất dịch thủy phân làm nguyên liệu cho việc sản xuất phân bón lá từ phụ phẩm cá Tra Đồng thời tiến hành khảo nghiệm chế phẩm phân bón lá trên cải xanh, dưa leo trồng trong nhà màng và khảo nghiệm trên diện rộng để công nhận phân bón mới Đề tài được thực hiện trong phòng thí nghiệm bằng cách sử dụng enzym thủy phân phụ phẩm cá Tra và thử nghiệm chế phẩm phân bón lá ngoài đồng ruộng

Kết quả nghiên cứu của đề tài đã cho thấy: Sử dụng enzym Alcalase thủy phân phụ phẩm cá Tra tối ưu trong điều kiện pH = 8, nhiệt độ 650C và thời gian là 120 phút

Để bảo quản dịch thủy phân thì bổ sung 0,5% natribenzoat cho hiệu quả cao nhất

Dịch sau khi thủy phân phụ phẩm cá Tra có hàm lượng các chất: 1,2% N; 0,11%

P2O5; 0,12% K2O; 18 ppm Fe; 11 ppm Zn; 3,4 ppm Mn; 1 ppm Cu; 17 ppm Bo

Từ dịch thủy phân phụ phẩm cá Tra đã phối trộn thành hai chế phẩm phân bón

lá có hàm lượng các chất như sau:

- Chế phẩm 1: dùng cho rau ăn lá: 5,06% N; 1,13% P2O5; 1,1% K2O; 252 ppm Fe; 209 ppm Zn; 206 ppm Mn; 107 ppm Cu; 110 ppm Bo

- Chế phẩm 2: dùng cho rau ăn quả: 3,25% N; 2,2% P2O5; 4,17% K2O; 323 ppm Fe; 109 ppm Cu; 214 ppm Zn; 317 ppm Mn; 536 ppm Bo

Trong 2 chế phẩm phân bón lá từ dịch thủy phân cá Tra có hàm lượng axit amin (3,19%)

Khi khảo nghiệm chế phân bón lá trong nhà màng thì chế phẩm 1 với nồng độ 0,5% (5ml/ lít nước) cho hiệu quả cao nhất trên rau cải xanh và chế phẩm 2 với nồng

độ 0, 5% (5ml/ lít nước) có hiệu quả cao nhất trên dưa leo trồng trong nhà màng

Sử dụng phân sinh học cá (chế phẩm 1) với liều lượng 10ml/ lít nước cho rau cải xanh và rau dền trồng ngoài đồng cho năng suất và hiệu quả kinh tế cao nhất

SUMMARY OF RESEARCH CONTENT

"The study enzymatic hydrolysis of by-product catfish (Pangasius

hypophthalmus) by enzymes as fertilizer for some vegetables" which was conducted

from March, 2011 to November, 2013 aimed production of protein hydrolysates from the catfish by-product At the same time, we also test this protein hydrolysates for

Brassica juncea and Cucumis sativus The experiments on using enzymatic hydrolyse

were carried in laboratory and test at the field

According to the study result, the protein waste of catfish (P hypophthalmus)

hydrolyzed optimum conditions were pH 8 , 650C, 120 minutes by Alcalase To preserve protein hydrolysate by supplying natribenzoat 0.5 % is the highest efficiency

Protein hydrolysate produced contained: 1.2 % N; 0.11 % P2O5; 0.12 % K2O; 18 ppm Fe; 11 ppm Zn; 3.4 ppm Mn; 1 ppm Cu; 17 ppm Bo

From Protein hydrolysate were mixed into two kinds:

- The first kind is used for leaves vegetables: 5.06 % N; 1.13 % P2O5; 1.1 %

K2O; 252 ppm Fe; 209 ppm Zn; 206 ppm Mn; 107 ppm Cu; 110 ppm Bo

- The second kind is used for fruits vegetables: 3.25 % N; 2.2 % P2O5; 4.17 %

K2O; 323 ppm Fe; 109 ppm Cu; 214 ppm Zn; 317 ppm Mn; 536 ppm Bo Two kinds contained high amino acid (3.19%)

When the first kind tested with a concentration of 0.5 % (5 ml / liter) brought on

the highest efficiency on B juncea and the second one with a concentration of 0,5 % (5

ml / liter) have the highest efficiency on C sativus in the greenhouse

The first kind used with concentration of 1% (10 ml / liter) for B juncea and

Amaranthus mangostanus got the highest productivity and economic efficiency in the field

MỤC LỤC

Trang

Thông tin chung của đề tài i

Tóm tắt… iii

Mục lục… … v

Danh sách chữ viết tắt vii

Danh sách bảng viii

Danh sách hình x

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Thành phần hóa học của cá 3

1.2 Sử dụng enzym trong thủy phân protein 4

1.2.1 Nghiên cứu ngoài nước 4

1.2.2 Nghiên cứu trong nước 10

1.3 Quá trình thủy phân của cá 13

1.3.1 Các hệ enzyme tham gia phân giải 14

1.3.2 Sự tham gia của vi sinh vật trong quá trình phân giải 14

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân cá 14

1.4 Tình hình xuất khẩu rau quả của Việt Nam 17

1.5 Giới thiệu về cây dưa leo 18

1.5.1 Nguồn gốc và lịch sử phát triển cây dưa leo 18

1.5.2 Phản ứng của cây với điều kiện sinh thái 18

1.5.3 Nhu cầu dinh dưỡng của cây dưa leo 20

1.6 Giới thiệu về cây cải xanh 21

1.7 Một số nghiên cứu về sử dụng phân bón trên cây trồng 23

II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 25

2.2 Nội dung nghiên cứu 25

2.3 Phương pháp nghiên cứu 25

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Hoàn thiện quy trình thủy phân phụ phẩm cá Tra bằng enzym 37

3.1.1 Khảo nghiệm hiệu quả thủy phân protein của một số enzym 37

3.1.2 Xác định hoạt độ enzym Alcalase đến khả năng thủy phân protein cá Tra 38

3.1.3 Xác định thời gian thủy phân protein phụ phẩm cá Tra bằng enzym Alcalase 39

3.1.4 Ổn định dung dịch thủy phân 39

3.2 Phối chế dung dịch thuỷ phân thành phân bón lá để dùng cho rau 42

3.3 Khảo nghiệm 2 chế phẩm phân bón từ dịch thủy phân cá Tra cho một số loại rau trong nhà màng 48

3.3.1 Khảo nghiệm chế phẩm phân bón lá cho cải xanh trồng trong nhà màng 48

3.3.2 Khảo nghiệm chế phẩm phân bón lá cho dưa leo trồng trong nhà màng 51

3.3.3 Khảo nghiệm phân sinh học cá trên rau cải trồng ngoài đồng ruộng 54

3.3.4 Khảo nghiệm phân sinh học cá trên rau dền trồng ngoài đồng ruộng 55

3.3.5 Hiệu quả kinh tế khi sử dụng phân sinh học cá 56

IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 58

4.1 Kết luận 58

4.2 Đề nghị 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

DANH SÁCH CÁC BẢNG

2.2 Kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng trong phân sinh học

2.3 Kết quả phân tích kim loại nặng và vi sinh vật hại trong phân

3.1 Hiệu quả thủy phân protein phụ phẩm cá của một số enzym 37

3.2 Ảnh hưởng của hoạt độ enzym Alcalase đến quá trình thủy phân

3.3 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân protein cá Tra 39

3.5 Hàm lượng các chất trong dịch thủy phân trước phối trộn 42 3.6 Hàm lượng hóa chất phối trộn trong dịch thủy phân 42 3.7 Hàm lượng các chất trong dịch thủy phân sau khi phối trộn 43

3.8 Hàm lượng các axit amin trong chế phẩm phân bón lá 44

3.9 Chi phí sản xuất chế phẩm 1 từ dịch thủy phân cá Tra 45

3.10 Chi phí sản xuất chế phẩm 2 từ dịch thủy phân cá Tra 46

3.11 Ảnh hưởng của chế phẩm phân bón lá đến chiều cao cây rau cải 47

3.12 Ảnh hưởng của chế phẩm phân bón lá đến số lá rau cải 48

3.13 Ảnh hưởng của chế phẩm phân bón lá đến một số chỉ tiêu rau

3.17 Ảnh hưởng của chế phẩm phân bón lá đến đến năng suất và hàm

3.18 Ảnh hưởng của phân sinh học cá đến năng suất rau cải 53

3.19 Ảnh hưởng của phân sinh học cá đến năng suất rau dền 54

DANH SÁCH HÌNH

3.4 Năng suất lí thuyết và năng suất thực thu dưa leo 53

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây thì ngành thủy sản ở nước ta ngày càng phát triển mạnh mẽ Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, năm 2011 diện tích nuôi cá Tra của nước ta ước đạt 5571,6 ha với sản lượng là 1.136.253 tấn Vùng nuôi cá Tra tập trung ở các tỉnh An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Vĩnh Long, Bến Tre, Sóc Trăng, Tiền Giang, Hậu Giang và Trà Vinh Theo ước tính, phần phụ phẩm của cá Tra trong chế biến philê chiếm đến từ 65 - 70% tổng khối lượng cá Điều này đồng nghĩa với việc phát sinh một lượng phụ phẩm rất lớn khoảng 700.000 - 800.000 tấn gồm đầu, xương, ruột, vi cá Đây là nguồn chất thải có nguy cơ gây ô nhiễm môi trường rất lớn nếu không có dây chuyền xử lý thích hợp Tuy nhiên nếu biết cách xử lý với công nghệ phù hợp thì chúng ta có thể thu được một lượng lớn nguồn đạm dễ hấp thu có giá trị nhằm sản xuất phân bón lá phục vụ trong sản xuất nông nghiệp Hiện nay, nông dân cũng đã từng bước sử dụng phế phẩm từ cá để sản xuất phân bón lá với quy mô nhỏ phục vụ cho sản xuất nông hộ

Hiện nay thì phương pháp xử lý nguồn phụ phẩm cá bằng các biện pháp sinh học đang rất được quan tâm, đặc biệt là sử dụng enzym thủy phân để tạo ra những sản phẩm

có nhiều công dụng như làm phân bón lá Việc sử dụng các enzym protease để thủy phân protein phụ phẩm cá đã được ứng dụng rất phổ biến trên thế giới do những ưu điểm là rút ngắn được thời gian thủy phân và tận dụng được các nguồn phụ phẩm của cá

Rau là một trong những cây thực phẩm quan trọng, là loại thức ăn cần thiết không thể thiếu được trong bữa ăn hàng ngày Theo Hiệp hội rau quả Việt Nam, kim ngạch xuất khẩu rau hoa quả năm 2012 đạt 829 triệu USD, tăng 33,1% so với năm 2011 Như vậy, có thể thấy vị trí quan trọng của cây rau trong đời sống và đối với nền kinh tế Tuy nhiên, năng suất rau của nước ta còn thấp, chỉ bằng 87% so với trung bình của thế giới Chất lượng rau chưa đảm bảo tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm đang là vấn đề bức xúc của xã hội Sản xuất rau an toàn hiện nay đang là vấn đề được hầu hết các địa phương quan tâm Các tỉnh đều đã xây dựng chương trình sản xuất rau an toàn Tuy

nhiên, tình hình ngộ độc thức ăn do rau gây ra vẫn thường xuyên xảy ra và là mối lo ngại cho người tiêu dùng

Một trong những hướng đi quan trọng để giải quyết vấn đề trên là sản xuất rau trong nhà màng, sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc hữu cơ hướng tới việc tạo ra những sản phẩm an toàn đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường Trồng cây không sử dụng đất là kiểu canh tác tiên tiến và phổ biến trong điều kiện nhà màng cho phép nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm Việc ứng dụng các phụ phẩm của ngành chế biến thủy sản để sản xuất phân bón lá phục vụ cho sản xuất nông nghiệp là việc làm cần thiết hiện nay Nó vừa giảm thiểu ô nhiễm môi trường do nguồn phụ phẩm thủy sản gây ra vừa góp phần thúc đẩy trồng trọt phát triển tạo ra sản phẩm an toàn cho người sử dụng Điều này là hoàn toàn phù hợp với định hướng hiện nay, đó là

ưu tiên phát triển nền nông nghiệp theo hướng hữu cơ nhằm tạo ra những sản phẩm sạch cho thị trường

Xuất phát từ những thực tế đó, việc thực hiện đề tài “Nghiên cứu ứng dụng

dung dịch thủy phân từ phụ phẩm cá bằng enzym làm phân bón cho một số loại rau trong nhà màng” là cần thiết

I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Thành phần hóa học của cá

Thành phần hóa học của cơ thịt cá gồm có nước, protein, lipid, glucid, muối vô

cơ, vitamin, enzym, hormone

Với thành phần hóa học của da cá: nước 60 ÷ 70 %, một ít chất vô cơ còn chủ yếu là protein và chất béo Protein của da cá chủ yếu là collagen, elastin, keratin, rutin, globulin và albulmin Công dụng của da cá chủ yếu là nấu keo, loại da dày như cá voi,

cá nhám dùng trong công nghiệp thuộc da

Thành phần hóa học của vây cá: tương tự như xương sụn, protein trong vây cá chủ yếu là chondromucoid, collagen, chondroalbumin, đối với vây cá sau khi chế biến các chất tan phân ly thành arginin, histidin và lysine chiếm 1/3 tổng lượng acid amin Thường lấy vây đuôi, bụng, ngực của một số loài cá nhám để đem chế biến thành sản phẩm vây cá

Thành phần hóa học của xương cá: xương cá được chia làm hai nhóm, đó là xương cứng và xương sụn Xương sụn: thành phần chủ yếu là protein phức tạp, keo và albumin; chất vô cơ nhiều nhất là Na, Ca, K, Mg, Fe…Các acid amin cấu tạo thành protein trong xương sụn chủ yếu là acid amin tính bazơ như arginin, histidin, lysin…Xương cứng: lượng chất hữu cơ và vô cơ tương đương, muối vô cơ chủ yếu là

Ca3(PO4)2 ngoài ra còn có CaCO3, Ca(OH)2,…

Thành phần hóa học của bong bóng cá: chủ yếu là collagen, dùng để nấu keo hoặc phơi khô làm dược phẩm (Viện Cisdoma, 2005)

Theo Trương Công Phát, thành phần các chất trong cá Tra gồm:

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng trong cá tra (trên trọng lượng khô)

1.2 Sử dụng enzym trong thủy phân protein

1.2.1 Nghiên cứu ngoài nước

Trong những năm gần đây, có nhiều nghiên cứu để thủy phân phụ, phế phẩm từ ngành thủy sản tạo ra sản phẩm hữu ích Trong đó có hai nhóm phương pháp chính là phương pháp hóa học và phương pháp sinh học Phương pháp sinh học chủ yếu là dùng các enzym protease để thủy phân Nguồn protease có thể từ động vật, thực vật và vi sinh vật

Bromelin là tên gọi chung cho nhóm enzym thực vật chứa nhóm sulfhydryl, có khả năng phân giải protein được thu nhận từ họ Bromeliaceae đặc biệt là ở cây dứa

(Ananas comusus L.) Bromelin chiếm 50% protein trong quả dứa, có khả năng thủy

phân mạnh và hoạt động tốt ở pH từ 5 – 8 Bromelin có trọng lượng phân tử 33 kdalton, có tâm hoạt động chứa cystein với cầu nối S-S giữa 2 sợi peptid với nhau Bromelin hoạt động ở nhiệt độ từ 45 – 650C và mất hoạt tính ở 700C, biên độ pH từ 3 –

9 tùy thuộc vào loại cơ chất Các chất có tác dụng hoạt hóa bromelin gồm cystein, muối bisulfite, NaCN, H2S, Na2S và benzoate Bromelin trong quả xanh có hoạt tính phân giải casein cao nhất, kế đến là trong quả chín và cuối cùng là bromelin trong thân Đây là enzym được sử dụng nhiều trong ngành công nghiệp chế biến thực phẩm như giúp làm mềm thịt, làm rượu bia, thủy phân các nguồn protein khác nhau để thu hồi sản phẩm hòa tan là các axit amin có giá trị dinh dưỡng cao Giống như các cấu trúc sinh học khác, bromelin chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố như: cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng

độ enzym, nhiệt độ, pH…Trên những loại cơ chất khá nhau thì bromelin có hoạt tính

khác nhau Đối với cơ chất tổng hợp như BAA (Benzoyl-L-Arginine amide), BAEE (Benzoyl-L-Arginine ethyl ester) thì khả năng thủy phân của bromelin yếu hơn papain

* Giới thiệu enzym papain

Papain là một endoprotease có trong nhựa cây đu đủ (Carica papaya L.) chứa

16,1% N và 1,2% S Theo kết quả phân tích bằng tia X thì phân tử Papain là một chuỗi polypeptide gồm 212 amino acid, trọng lượng phân tử là 23.350 Da, phân tử là một mạch polypeptide với đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine, có 6 gốc cysteine tạo thành 3 cầu disulfur ở các vị trí 22-63, 56-95, 153-200 không có chức năng sinh học, chỉ làm tăng tính bền vững của cấu trúc và một nhóm –SH tự do ở vị trí 25

- Cấu trúc không gian

Phân tử papain có dạng hình cầu với kích thước 36x48x36Ao và mạch chính bị gấp thành hai phần riêng biệt bởi một khe Trung tâm hoạt động nằm tại bề mặt của khe này, nhóm -SH hoạt động của cysteine 25 nằm bên trái khe và nhóm histidine 159 nằm bên phải khe Phần xoắn chiếm 20% toàn bộ các amino acid có trong phân tử

Hoạt tính của papain dựa trên hai tâm hoạt động là Cys25 và His159 Khoảng

pH hoạt động của papain khá rộng (3.5 – 8.0) tùy thuộc vào cơ chất Khi cơ chất là casein thì hoạt tính tối ưu của papain trong vùng pH từ 5.7 – 7.0 và nhiệt độ thích hợp

là 50 – 570C

- Cấu trúc tâm hoạt động của papain

Tâm hoạt động của papain gồm có nhóm –SH của cysteine 25 và nitrogen bậc 3 của histidine 159 Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi liên kết hydrogen

Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các amino acid là: Lys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys

Hoạt tính enzym và cơ chất tác dụng:

Papain thủy phân peotein thành các polypeptide và các polypeptide và các amino acid, đóng vai trò vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase

Các endopeptidase thủy phân protein chủ yếu thành các peptid:

(-NH-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-)n + HOH  (-NH-CH(R)-COOH)I + (H2N- CH(R)-CO-)k

Các exopeptidase thủy phân các peptide thành các amino acid

(H2N-CH(R )-CO-NH-CH(R )-CO-)n + HOH  (H2N-CH(R)-COOH)n` + (H2N-CH(R)-CO-)k

n`+k = n

So với các protease có nguồn gốc động vật và vi sinh vật khác thì papain có khả năng thủy phân sâu hơn Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng vì nó có khả năng phân hủy hầu hết các liên kết peptide trừ các liên kết với proline và các glutamic acid

có nhóm carboxy tự do

Hoạt hóa papain:

Papain chỉ thể hiện hoạt tính xác tác của mình khi nhóm –SH ở dạng tự do Vì vậy ta sử dụng chất hoạt hóa để đưa papain từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động do trung tâm hoạt động của papain có tính khử nên các chất hoạt hóa là các chất có tính khử như cysteine, glytation aicd, hdrocyanic… trong đó cysteine là chất hay dùng nhất Khi có mặt các chất này thì nhóm –SH của papain được phục hồi

và làm tăng hoạt tính papain Để thu được hoạt tính cao nhất thì thích hợp là dùng hỗn

hợp cysteine và EDTA, trong đó cysteine đóng vai trò là chất hoạt hóa papain, còn EDTA đóng vai trò chất liên kết tạo phức với ion kim loại nặng có trong nhựa đu đủ

Bất hoạt:

Papain bị kìm hãm (ức chế bất thuận nghịch) bởi các chất oxy hóa như: O2, O3,

H2O2, iodur acetate, cysteine và các hợp chất disufur khác Các chất này phản ứng với nhóm –SH ở trung tâm hoạt động của papain làm phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó

Papain bị bất hoạt thuận nghịch bởi không khí, cysteine ở nồng độ thấp Các ion kim loại như Cd+, Cu2+, Zn2+, Hg2+, Pb2+, Fe2+ và các tác nhân gây ức chế papain Papain tác dụng với chloromethyl cetone của phenylalanine và lysine thì mất hoàn toàn hoạt tính Tuy nhiên papain lại rất bền với các tác nhân biến tính là dung môi hữu cơ (độ quay cực của papain hầu như không biến đổi trong ethanol 70%)

- Phản ứng của papain

Papain thủy phân protein thành các polypeptide và các acid amin, nó đóng vai trò vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase

Đây là enzym chịu được nhiệt độ tương đối cao, ở dạng nhựa khô papain không

bị biến tính ở 1000C trong 3 giờ Ở dạng dung dịch, papain bị mất hoạt tính sau 30 phút

ở 82,50C Nên lấy nhựa ở những quả còn xanh, khoảng 10 tuần tuổi là tốt nhất và lấy vào lúc sáng sớm Dùng dao inox rạch vài đường dọc theo quả, hứng nhựa cho vào lọ thủy tinh có nắp kín, giữ trong tối và bảo quản ở 40C (Monti và cộng sự, 2000)

* Giới thiệu enzym Bromelin

- Đặc điểm enzym Bromelin

Bromelin là tên gọi chung cho nhóm enzyme thực vật chưa nhóm sulfhydryl, có

khả năng phân giải protein được thu nhận từ họ Bromeliaceae, đặc biệt là ở cây dứa Bromelin chiếm 50% protein trong quả dứa Nó có khả năng thủy phân khá mạnh và hoạt động tốt ở pH từ 6 – 8 Bromelin có hoạt tính xúc tác sự phân giải protein tương

tự như papain trong mủ đu đủ hay ficin trong cây họ Sung

- Tính chất enzym Bromelin

Thành phần chủ yếu của bromelin có chứa nhóm sulfhydryl thủy phân protein Trong dịch chiết bromelin còn có chứa một ít peroxidase, axit phosphatase và chất cản protease

+ Cấu trúc không gian của Bromelin

Bromelin là một protease trong tâm hoạt động có chứa cysreine và hai sợi

polypeptide lien kết với nhau bằng cầu nối –S – S- Phân tử có dạng hình cầu do có cách sắp xếp phức tạp

+ Hoạt tính phân giải của Bromelin

Bromelin có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase và esterase Bromelin

thân có nhiều cơ chất tự nhiên và có thể thủy phân cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp Đối với cơ chất là casein, hoạt tính phân giải của Bromelin thân cao hơn Bromelin quả xanh và Bromelin quả chín

Việc sử dụng các enzym protease để thủy phân protein phụ phẩm cá đã được ứng dụng rất phổ biến trên thế giới do những ưu điểm là rút ngắn được thời gian cho quá trình sản xuất, tăng lượng protein không hòa tan chuyển thành protein hòa tan và tận dụng được các nguồn phụ phế phẩm của cá Trong điều kiện thủy phân thích hợp, các mô cá được biến đổi nhanh chóng thành chất lỏng Phản ứng thủy phân thường bao gồm 2 bước: bước đầu là những phân tử enzym kết hợp với protein của cơ chất và bước 2 là sự thủy phân xảy ra dẫn tới sự phóng thích các polypeptid và axit amin tự do

Nhiều loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease Protease phân bố

chủ yếu ở vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn… Bao gồm nhiều loài thuộc Aspergillus,

Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số loại nấm men Các enzym

này có thể ở trong tế bào (Protein nội bào) hoặc được tiết vào trong môi trường nuôi cấy (Protease ngoại bào) Cho đến nay các protease ngoại bào được nghiên cứu kỹ hơn các protease nội bào Một số protease ngoại bào đã sản xuất trong quy mô công nghiệp

và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kỹ nghệ khác nhau trong nông nghiệp và trong y học Có thể thu nhận protease từ nhiều loài vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc Hiện nay trên thế giới sản xuất khoảng trên 600 tấn protease tinh khiết từ vi sinh vật, trong

đó có 500 tấn từ vi khuẩn và 100 tấn từ nấm mốc Nhịp độ sản xuất enzym vi sinh vật ở qui mô công nghiệp ở các nước phát triển tăng trung bình hàng năm từ 5% - 15% và doanh thu sản xuất hàng năm ở các nước này khoảng 1,5 tỉ USD Những nước có công nghệ sản xuất và ứng dụng protease tiên tiến nhất trên thế giới hiện nay là: Nhật Bản,

Mỹ, Anh, Pháp, Hà Lan, Trung quốc, Đan Mạch, Đức, Áo…Các nước này đầu tư thích đáng cho công tác nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng các chế phẩm protease của vi sinh vật Nguồn nguyên liệu rất dồi dào để sản xuất enzym nói chung và protease nói riêng

Người ta sử dụng protease để sản xuất các dịch đạm thủy phân từ các phế liệu giàu protein như thịt vụn, đầu cá, da … Dùng protease để thủy phân protein thường ít bị hao hụt acidamin như khi dùng phương pháp hóa học Thủy phân protein bằng acid thường mất 10-25% các acidamin như tryptophan, tyrosin, cystein, arginin, histidin, serin, treonin Vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại enzym endopeptidase và exopeptidase, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein Các chủng vi khuẩn có

khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Bacillus

thermorpoteoliticus và một số loài thuộc Clostridium Trong đó, B subtilis có khả năng

tổng hợp protease mạnh nhất Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5 - 8) và có khả năng chịu nhiệt thấp Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được

ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm như các chủng Aspergillus oryzae, A terricola,

A fumigatus, A satoi, Penicillium chysogenum… Các loại nấm mốc này có khả năng

tổng hợp cả ba loại protease acid, kiềm và trung tính Nấm mốc có bào tử đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5 - 3

Theo Diniz (1998), khi sử dụng enzym endopeptidase từ vi khuẩn để thủy phân

mô thịt cá mập (Squalus acanthias) trong 2 giờ thì lượng nitơ thu được 76,2% Điều

kiện để thủy phân tốt nhất là nhiệt độ 550C, pH = 8 với tỷ lệ enzym là 40 mg/ g cơ chất

và hiệu suất thủy phân 18,6%

Dong (2005), khi sử dụng enzym papain để thủy phân cá mối dài thì sản phẩm thủy phân chứa 84,7% protein thô, 7,1% tro và 3,5% mỡ Sản phẩm thủy phân chứa 20 loại axit amin, trong đó tỷ lệ của 8 loại axit amin thiết yếu chứa 41,5% lượng axit amin

Theo Min-Tian Gao (2005), thủy phân phụ phẩm cá gồm đầu và xương cá đã được xử lí sơ bộ với nước ở 121 0C trong 20 phút bằng dung dịch acid được pha loãng

và pH dịch thủy phân được điều chỉnh về 1,0 Bằng cách này, thu được nguồn đạm dùng cho lên men sản xuất acid lactic với giá thành thấp và làm tăng hiệu suất sản xuất acid lactic gần 22 % so với việc dùng dịch chiết nấm men

Theo Mahmoudreza và ctv (2009), khi sử dụng enzym Alcalase để thủy phân protein của nội tạng cá tầm trắng ở điều kiện nhiệt độ 500C trong thời gian 120 phút thì sản phẩm thủy phân có hàm lượng protein khá cao (66,43%), lipit thấp (1,34%) và hàm lượng amino axit cao

Theo See (2011), khi dùng enzym Alcalase với hàm lượng 2,5% để thủy phân

da cá hồi trong điều kiện nhiệt độ 55,30C, pH = 8,39 cho hiệu suất thủy phân cao nhất (77,03%) Sản phẩm thủy phân chứa hàm lượng protein cao (89,53%)

Theo Muzaifa và ctv (2012), khi sử dụng enzym Alcalase và Flavourzyme thủy phân phụ phẩm cá thì kết quả cho thấy: sử dụng Alcalase tạo ra lượng protein nhiều hơn (82,66%) so với 73,5% khi dùng Flavourzyme Bên cạnh đó thì độ tan, độ tạo bọt của sản phẩm thủy phân khi dùng Alcalase cũng tốt hơn khi dùng Flavourzyme

1.2.2 Nghiên cứu trong nước

Theo Nguyễn Thị Nếp (2005), tỷ lệ enzym protease từ B subtilis S5 sử dụng để

thủy phân với cơ chất là phụ phẩm đầu xương cá tra đạt hiệu quả cao là 2,5 ÷ 3 %, nhiệt độ thủy phân thích hợp là 50 0C, pH = 8,0 và trong thời gian là 10 giờ, hiệu suất thủy phân cao nhất là 25,68 %

Theo Đặng Thị Mộng Quyên (2006) và Trần Thị Xô (2006), để thủy phân cá phèn, cá ngân dạng cá phế liệu thu được sau công đoạn fillet bằng phương pháp thủy phân kết hợp, thủy phân bằng enzym trước, thủy phân bằng acid sau Trong đó, sử

dụng chế phẩm enzym protease từ vi khuẩn B subtilis C10 Kết quả với điều kiện thủy phân bằng enzym: tỷ lệ muối 3%, tỷ lệ dịch chiết enzym 20 % (dạng lỏng), tỷ lệ nước

30 %, nhiệt độ 50 0C, điều kiện thủy phân bằng acid: tỷ lệ muối 3 %, nhiệt độ thủy phân 90 0C, thể tích HCl 7N là 20 %, trung hòa bằng Na2CO3 20 % cho hiệu quả thủy phân cao Dịch đạm thu được có hàm lượng đạm tổng số 39 g/l, đạm amin 21,6 g/l, đạm amoniac 3,95 g/l

Dương Thị Hương Giang (2006), sử dụng enzym papain thô ly trích trực tiếp từ

mủ đu đủ để thủy phân bánh dầu đậu nành tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao ứng dụng trong chăn nuôi Kết quả thí nghiệm cho thấy điều kiện tối ưu cho enzym papain trên cơ chất bánh dầu đậu nành là nhiệt độ 55oC và pH 7,0 Với tỉ lệ enzym:cơ chất là 0,75:100 (w:w), hoạt tính đặc hiệu của enzim là 91,12 TU/mg, thời gian thủy phân là

24 giờ cho hiệu suất thủy phân cao nhất 11,8%

Lê Công Toàn (2007), phối trộn phế phẩm cá và mùn cưa theo các tỷ lệ 4 cá : 1 mùn cưa; 3 cá : 1 mùn cưa và 9 cá : 4 mùn cưa sau đó phun chế phẩm PMET vào các mẫu đã phối trộn với liều lượng 1 lít/m3 và đem ủ kị khí Trong quá trình ủ có đảo trộn

và phun PMET định kỳ Kết quả cho thấy các mẫu phân phối rộng theo tỷ lệ 3 : 1 và 9 :

4 đều đạt tiêu chuẩn quy định trong sản xuất phân bón về hàm lượng chất hữu cơ và axit humic Tuy nhiên cũng có một vài chất không đạt như hàm lượng kali vì vậy các tác giả khuyến cáo cần bổ sung thêm chất này trong quá trình ủ phân

Võ Thị Hạnh đã nghiên cứu chế phẩm sinh học từ trùn quế để làm thức ăn cho gia súc, gia cầm, làm phân bón cho cây Một ưu điểm nổi trội của các chế phẩm này là vẫn giữ nguyên mùi trùn tươi, các chất dinh dưỡng không bị mất đi hoặc biến chất theo thời gian Chế phẩm BIO-BL, đã được dùng để bón cho cây trà ô long và một số cây hoa màu, cây kiểng Kết quả sau khi sử dụng cho thấy búp trà tươi, màu sắc đẹp hơn, mùi hương của trà cũng thơm hơn BIO-BL được tạo thành từ trùn quế tươi phối trộn với hỗn hợp vi sinh vật hữu ích và enzym dùng trong trồng trọt, lên men tạo sản phẩm có mùi trùn, giàu đạm protein và amin cao, enzym tiêu hóa có hoạt lực cao, vi khuẩn có lợi

Nhóm tác giả cho biết ưu điểm của phương pháp chế biến trùn quế bằng công nghệ

vi sinh là không cần dùng thiết bị đông lạnh hay thiết bị sấy nên không tốn chi phí điện, năng lượng, đem lại hiệu quả kinh tế cao Với công nghệ đơn giản, các hộ nông dân ở các

vùng xa xôi có thể áp dụng dễ dàng Việc có thêm các chế phẩm sinh học mới có giá thành

rẻ góp phần làm cho ngành chăn nuôi, nuôi trồng thủy sản và trồng trọt phát triển tốt hơn

Hiện nay, để xử lý các loại phế phẩm nông nghiệp, rác thải sinh hoạt thì có các

chế phẩm như BIMA (Trichoderma), Active cleaner (xạ khuẩn Streptomyces sp., nấm

Trichoderma sp., vi khuẩn Bacillus sp.) được sử dụng để ủ phân gia súc, chất thải hũu

cơ như rơm, rạ, rác thải sinh hoạt hữu cơ (đã tách riêng rác vô cơ) Việc sử dụng chế phẩm có thể giúp rút ngắn thời gian ủ hoai phân chuồng, phân xanh, rác từ 2 - 3 lần so với cách ủ thông thường

Trung tâm công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh đã tạo 4 loại phân bón: Bio trùn quế 01; Bio trùn quế 02; Bio trùn quế 03 và Bio trùn quế 04 có thành phần chủ yếu là dịch chiết từ trùn quế tươi với hàm lượng axit amin cao (Aspartic acid – 2.000 ppm; Leucine – 1.200 ppm; Alanine – 1.000 ppm; Glutamic acid – 1.000 ppm; Valine – 800 ppm) Ngoài ra còn chứa một số nguyên tố đa lượng và vi lượng cần thiết Đa lượng: N – 5.0 %; P – 1.0 %; K – 3.0 % Vi lượng: B – 200 ppm; Zn – 200 ppm; Mg –

120 ppm; Ca – 120 ppm; Fe – 100 ppm Chúng có tác dụng kích thích tăng trưởng, ra hoa và tăng tỷ lệ đậu trái

Nguyễn Xuân Trình (2008), khi nghiên cứu công nghệ sản xuất bột cá, dịch đạm

từ phụ phẩm cá Da trơn và cá Basa Kết quả cho thấy các tác giả đã xác định được 180 phút là thời gian thủy phân để lượng protein hòa tan và acid amin tạo thành đạt cao nhất Tỷ lệ enzym trên cơ chất cũng có ảnh hưởng quan trọng đến hiệu suất thủy phân,

tỷ lệ enzym : cơ chất 0,2% ở nhiệt độ 600C và pH = 5 cho hiệu quả thủy phân cao nhất Khi so sánh hoạt tính giữa enzym dịch dứa, enzym tủa từ dịch dứa và enzym Alcalase

(là enzym thủy phân có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus lischenifermic), kết quả cho

thấy mẫu thủy phân bằng Alcalase có hàm lượng protein hòa tan và acid amin cao nhất,

kế đến là enzym dịch dứa, mẫu có enzym tủa có hàm lượng protein và acid amin thấp nhất có thể là do hoạt tính enzym bị mất đi trong quá trình tủa

Trần Thanh Nhãn (2009), khi sử dụng alcalase để sản xuất Gelatin từ da cá basa thì kết quả cho thấy nồng độ enzym là 0,05%; thời gian thủy phân 25 phút, nhiệt độ thủy phân 430C và pH môi trường thủy phân tốt nhất là 8

Theo Trần Thanh Nhãn và Trần Nguyễn Tú Oanh (2009), khi xử lý máu cá basa bằng enzym alcalase thì các thông số tối ưu của quy trình là: pH = 7,05; thời gian thủy phân 2,81 giờ, nồng độ enzym là 1,5% và cho hiệu suất thủy phân là 5,91%

Theo Mạc Xuân Hòa và Trần Bích Lam, khi thủy phân phế phẩm từ quá trình sản xuất fillet cá tra bằng enzym Alcalase 2.4L nhằm thu nhận protein hydrolysate thì kết quả cho thấy điều kiện thủy phân tối ưu là: hàm lượng enzym 0,3% (v/w), nhiệt độ

670C, và thời gian 130 phút

1.3 Quá trình thủy phân của cá

Là quá trình tác dụng của hệ enzym protease trong bản thân cá hoặc bên ngoài tác động vào thủy phân thịt cá từ dạng protein qua các dạng trung gian như pepton, polypeptid, peptid và cuối cùng là acid amin

Bên cạnh quá trình thủy phân protein là chủ yếu còn có sự thủy phân của đường và chất béo…thành các acid hữu cơ, rượu…

Quá trình thủy phân protein trong thịt cá chủ yếu là do enzym tác dụng nhưng cũng có thể có sự tham gia của vi sinh vật Những vi sinh vật hữu ích tiết ra protease thúc đẩy cho quá trình thủy phân nhưng các vi sinh vật gây thối thì có tác dụng làm rữa nát thịt cá có khi ở ngay giai đoạn đầu hay trong quá trình chế biến Quá trình thủy phân tiếp tục là quá trình thối rữa do vi sinh vật gây thối thủy phân acid amin thành các chất cấp thấp như: indol, phenol và các loại acid có đạm và acid béo thủy phân thành

H2S, NH3, CO2, ….(Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng,1990)

1.3.1 Các hệ enzym tham gia phân giải

Hệ enzym Metalo-protease còn gọi là aminopeptidase hay apase tồn tại nhiều trong nội tạng cá, chịu được nồng độ muối cao nên ngay từ đầu đã hoạt động rất mạnh, sau tháng thứ hai thì giảm dần cho tới tháng thứ ba, sau đó tác dụng kém dần đến cuối quá trình Apase có hoạt tính khá mạnh, có khả năng thủy phân rộng rãi đối với các loại peptid, loại này đại diện cho nhóm enzym thủy phân trung tính, môi trường tối thích khoảng pH = 5,0 ÷ 7,0

Hệ enzym Serin – protease điển hình là trypsin tồn tại nhiều trong nội tạng cá, nhất

là trong tụy Môi trường hoạt động của Serin – protease trong khoảng pH = 5,0 ÷ 10

Hệ enzym axit protease được tìm thấy nhiều trong thịt cá và nội tạng cá, đại diện cho

hệ này là Cathepsin D Hệ enzym này tồn tại ngắn trong giai đoạn đầu thời kỳ thủy phân, khoảng 24 giờ sau thì hoạt tính của chúng mất dần vì không chịu nổi nồng độ muối cao Hệ enzym này thủy phân protein rất mạnh nhưng bị ức chế bởi nồng độ muối cao, chỉ 5 % muối sau 12 giờ là có thể mất hoạt lực (Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng, 1990)

1.3.2 Sự tham gia của vi sinh vật trong quá trình phân giải

Vi sinh vật có mặt ngay từ đầu quá trình chế biến do nguyên liệu, dụng cụ mang theo từ ngoài môi trường nhiễm vào, nhưng do nồng độ muối quá cao nên chúng không hoạt động được Ngay trong giai đoạn ngắn đầu tiên khi muối chưa kịp tác dụng có một

số vi sinh vật gây thối hoạt động Khi độ mặn tăng dần lên đạt từ 12 % trở lên thì các vi khuẩn gây thối hầu như ngừng hoạt động và các vi khuẩn khác bị ức chế cao độ (Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng, 1990)

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân cá

* Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ dưới 30C làm ngừng quá trình sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật (Nguyễn Xuân Thành và cs, 2005) Ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp thì vi sinh vật bị kiềm chế mạnh hơn ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ thích hợp, trừ loại hiếu nhiệt còn đại bộ phận trên 600C đều bị chết Nhiệt độ hoạt động mạnh nhất của enzym trong

cá là từ 36 ÷ 400C Dưới 00C các enzym và vi sinh vật bị kìm hãm không thể phát triển nhưng không chết Từ 0 ÷ 40 0C tác dụng phân giải của enzym và vi sinh vật tăng tỉ lệ thuận với sự gia tăng của nhiệt độ Nhưng enzym mang bản chất protein nên chúng không chịu được nhiệt độ cao Đa số enzym ở trong cá đều mất hoạt tính ở nhiệt độ từ

70 0C trở đi (Nguyễn Trọng Cẩn, Đỗ Minh Phụng, 1990)

* Ảnh hưởng của pH

Các giá trị pH cần cho sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật tương ứng với các giá trị pH cần cho hoạt động của nhiều enzym Giới hạn pH hoạt động của vi sinh vật nằm trong khoảng 4,0 ÷ 10pH của môi trường còn tác động sâu sắc lên các quá

trình trao đổi chất Màng tế bào chất của vi sinh vật tương đối ít thấm đối với các ion

H+ và OH-, vì vậy dù pH của môi trường ngoài dao động trong giới hạn rộng, nồng độ của chúng trong tế bào chất vẫn ổn định Ảnh hưởng của pH môi trường lên hoạt động của vi sinh vật phần lớn là do tác động qua lại giữa ion H+ và các enzym chứa trong màng tế bào chất và tế bào (Bộ thủy sản, 2004).

pH ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của vi khuẩn, do nó liên quan đến tương tác giữa enzym và cơ chất Vi khuẩn rất nhạy cảm với sự thay đổi pH của môi trường Mỗi

vi sinh vật chỉ có thể hoạt động được trong môi trường có pH giới hạn bởi pH thấp nhất

và pH cao nhất Đồng thời vi sinh vật hoạt động mạnh nhất trong môi trường có pH tối hảo Phần lớn môi trường bên ngoài thiên nhiên có pH = 2,5 ÷ 9,0, và phần lớn vi sinh vật có pH tối hảo trong khoảng này Có rất ít vi sinh vật có thể sống trong môi trường

có pH nhỏ hơn 2,0 hoặc lớn hơn 10 (Nguyễn Hữu Thanh và Nguyễn Thị Thanh Xuân,

2003 trích bởi Phan Thiên Tùng, 2006)

* Ảnh hưởng của diện tích tiếp xúc

Trong quá trình thủy phân yếu tố quan trọng thúc đẩy quá trình thủy phân là diện tích tiếp xúc Để tạo điều kiện tốt hơn cho sự thủy phân của enzym làm tăng khả năng tiếp xúc giữa enzym và cơ chất, muốn vậy phải làm nhỏ kích thước cơ chất trước khi thủy phân (Phan Thiên Tùng, 2006 trích trong Nguyễn Thị Xuân Dung, 2005)

* Ảnh hưởng của thời gian thủy phân

Theo một số nghiên cứu thì mức độ thủy phân tăng vọt trong thời gian đầu của phản ứng, sau đó tốc độ phản ứng chậm lại Thời gian dài hơn và sử dụng lượng vi khuẩn lớn hơn thì mức độ thủy phân cao hơn (Phan Thiên Tùng, 2006 trích trong Nguyễn Thị Xuân Dung, 2005)

* Ảnh hưởng của bản thân nguyên liệu

Thủy phân hai loại cá gồm cá béo và cá không béo có nhiều mỡ và không mỡ bằng enzym thủy phân là papain được bổ sung 5% so với lượng cá Kết quả là các loại

cá không hoặc ít béo đã cho hàm lượng protein trong nước bổi cao hơn so với cá có mỡ

và khi chế biến thì mỡ thường nổi lên trên nên làm cho sản phẩm có mùi ôi khét (Nguyễn Đình Khôi, 2003 trích trong Mackie, 1982)

1.4 Tình hình xuất khẩu rau quả của Việt Nam

Theo hiệp hội rau quả Việt Nam, năm 2012 kim ngạch xuất khẩu rau quả đạt

829 triệu USD tăng 33,1% so với năm 2011 với một số thì trường lớn chủ yếu

Bảng 1.2 Tình hình xuất khẩu rau quả của Việt Nam

Thị trường Năm 2011 (triệu USD) Năm 2012 (triệu USD)

1.5 Giới thiệu về cây dưa leo

1.5.1 Nguồn gốc và lịch sử phát triển cây dưa leo

Dưa leo (Cucumis sativus L.) là loại rau ăn quả có từ lâu đời Theo Swiader

(1996), cây dưa leo có nguồn gốc từ Ấn Độ cách đây khoảng 3000 năm Từ Ấn Độ nó được mang đến Italia, Hy lạp… và mãi về sau nó mới được đưa đến Trung Quốc Nhiều nhà nghiên cứu đã thống nhất với ý kiến đầu tiên của Decadole (1912) rằng dưa leo có nguồn gốc từ Tây Bắc Ấn Độ Các tác giả đó chứng minh sự tồn tại hơn hai nghìn năm của dưa leo ở vùng này và cho rằng từ đây chúng lan dần sang phía Tây và phía Đông

1.5.2 Phản ứng của cây dưa leo với điều kiện sinh thái

Nghiên cứu quan hệ của cây với điều kiện ngoại cảnh là hết sức quan trọng Bởi năng suất của cây là dựa trên sự thống nhất của cây trồng, ngoại cảnh và phương pháp canh tác Mục đích nhằm thiết lập điều kiện ngoại cảnh tối ưu cho cây trồng để đạt năng suất cao, chọn được các dòng, giống lai có khả năng chống chịu tốt với điều kiện bất thuận của ngoại cảnh và phát huy hết tác dụng trong điều kiện thuận lợi

* Yêu cầu về nhiệt độ

Nói tới chế độ nhiệt của cây dưa leo, không chỉ giới hạn ở nhiệt độ tối thích, thấp nhất, cao nhất, để cây sinh trưởng, phát triển mà không kém phần quan trọng là phản ứng của cây với nhiệt độ trong suốt quá trình phát sinh cá thể hay ở các giai đoạn phát triển khác nhau

Dưa leo thuộc nhóm cây trồng ưa nhiệt Theo số liệu của nhiều nhà nghiên cứu, nhiệt độ bắt đầu cho cây sinh trưởng ở khoảng 12 - 150C, nhiệt độ tối thích 25 - 30oC Theo Benett (2001), nhiệt độ thích hợp cho dưa leo sinh trưởng phát triển là 18,3 - 23,90C, nhiệt độ tối thấp là 15,60C và tối cao là 32,20C

Theo Mai Thị Phương Anh (1996), thì nhiệt độ thích hợp cho dưa leo sinh trưởng phát triển là 25 - 300C, nhiệt độ cao từ 35 - 400C kéo dài cây sẽ chết Nhiệt độ dưới 150C cây sẽ bị rối loạn đồng hóa và dị hóa, các giống sinh trưởng khó khăn, đốt ngắn, lá nhỏ, hoa đực màu vàng nhạt (Tạ Thu Cúc, 2000)

Trồng dưa leo ngoài đồng nếu gặp nhiệt độ 12,80C kéo dài sẽ gây hại cho cây (Wayne và ctv, 2002) Nhiệt độ quá cao sẽ gây hiện tượng quả có màu nhạt, quả có thể

bị đắng (More, 2001)

Dưa leo là cây rất mẫn cảm với nhiệt độ thấp, do đó không thể bảo quản dưa leo trong thời gian dài ở nhiệt độ 7 - 100C (Jennifer và ctv., 2000) Nghiên cứu của Helmy (1999), cho thấy khi huấn luyện cây con từ chế độ nhiệt 250C xuống 120C trong 2 - 3 ngày và chuyển trực tiếp từ 250C xuống nhiệt độ xử lý 60C thì cây sẽ ra hoa sớm hơn 5 ngày và năng suất cao hơn đối chứng Như vậy, nếu huấn luyện cây con ở nhiệt độ thấp sẽ tăng tính chịu rét ở dưa leo

Tổng số nhiệt độ không khí trung bình ngày đêm cần thiết cho sinh trưởng, phát triển dưa leo vào khoảng 1.500 - 2.500oC, còn để cho quá trình tạo quả thương phẩm là

800 - 1000oC (Kulturnaya và ctv,1994)

* Phản ứng với ánh sáng

Một trong những yếu tố của môi trường bên ngoài tác động trực tiếp đến sinh trưởng phát triển và chuyển tiếp sang giai đoạn phát dục của cây là độ dài chiếu sáng trong ngày

Dưa leo là cây ưa ánh sáng ngày ngắn Các kết quả nghiên cứu cho thấy các giống chín sớm có nguồn gốc phiá Bắc cũng như phía Nam, các bộ phận dinh dưỡng có khối lượng lớn ở điều kiện chiếu sáng 15 - 16 giờ, còn các giống trung bình và muộn thì trong điều kiện 12 giờ Taracanov (1975) nhận thấy các giống dưa leo ở gần các trung tâm phát sinh thứ nhất (Việt Nam và Ấn Độ) trồng trong điều kiện mùa hè ở Maxcova hầu như không ra hoa và hoàn toàn không tạo quả

Cường độ ánh sáng 15.000 - 17.000 lux thích hợp cho dưa leo sinh trưởng, phát triển giúp cho cây tăng hiệu suất quang hợp, tăng năng suất, chất lượng quả và rút ngắn thời gian lớn của quả (Mai Thị Phương Anh, 1996 và Trần Khắc Thi, 2003) Trong điều kiện cường độ ánh sáng thấp cây sinh trưởng yếu, thậm chí rất khó hồi phục mặc

dù sau đó được cung cấp đầy đủ ánh sáng (Lin và ctv., 2000) Theo Jolliefe và Lin (1997), hiệu quả của việc tỉa thưa cành và che bóng cho quả đã cải thiện được tốc độ tăng trưởng quả, màu sắc quả và diệp lục của vỏ quả

Chất lượng ánh sáng có tác dụng làm tăng hoặc giảm màu sắc quả và ảnh hưởng tới thời gian bảo quản quả sau thu hoạch Nghiên cứu của Lin (2000), với giống dưa leo quả dài trồng trong nhà kính cho thấy: vào mùa hè dùng lớp lọc để giảm cường độ ánh sáng hoặc biến đổi quang phổ ánh sáng ảnh hưởng tới thời gian bảo quản quả dưa leo

* Phản ứng với ẩm độ

Trong quả dưa leo chứa hơn 90% nước Tuy lượng nước chứa trong cây có thấp hơn nhưng lượng nước thoát hơi của nó là vô cùng lớn Hệ số thoát hơi nước, một chỉ tiêu xác định hiệu quả sử dụng nước của cây thông qua lượng nước mà cây hút từ đất đối với dưa leo dao động trong khoảng từ 450 - 700 (Suin, 1979) Yêu cầu của dưa leo với

độ ẩm của không khí do hàng loạt đặc điểm sinh vật học của nó quyết định

Nguyên nhân chính sự mẫn cảm cao ở dưa leo tới độ ẩm không khí và đất; theo

ý kiến của nhiều nhà nghiên cứu là do bộ rễ của cây yếu (Rukovodstvo, 1939) Ngoài

ra, ở các loại cây này lượng nước chứa trong tế bào lớn do cấu tạo tế bào lớn và động thái sinh trưởng của cây rất cao (Ivanov, 1983)

Ngoài ra, các nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm không khí tới dưa leo còn được thấy trong các báo cáo của Boos (1990) Các thí nghiệm này đã chứng minh rằng, giảm

độ ẩm không khí có tác động nghịch, trước tiên tới chiều dài thân, cành, nhất là trong trường hợp độ ẩm của đất cũng giảm

1.5.3 Nhu cầu dinh dưỡng của cây dưa leo

Theo Tạ Thu Cúc (2000), dưa leo là cây lấy dinh dưỡng từ đất ít hơn rất nhiều những cây rau khác Ví dụ tăng năng suất dưa leo lên 30 tấn/ha thì lượng N, P, K cây lấy đi từ đất là 170 kg/ha, trong khi đó nếu tăng năng suất cải bắp lên 70 tấn/ha thì nó phải lấy đi 630 kg N, P, K

Qua nghiên cứu về hiệu suất sử dụng phân khoáng chủ yếu của dưa leo các tác giả rút ra nhận xét: dưa leo sử dụng Kali lớn nhất sau đó đến đạm và cuối cùng tới Lân Khi bón 60N: 60P205 : 60K20 thì dưa leo sử dụng được 92%N : 33% P205 : 100% K20 Dưa leo không chịu được nồng độ phân cao nhưng lại phản ứng rõ rệt với hiện tượng thiếu dinh dưỡng (Trần Khắc Thi và Nguyễn Văn Thắng, 2006)

Trong 3 yếu tố chính N, P, K, cây dưa leo cần nhiều nhất là kali, rồi đến đạm và

ít nhất là lân Để tạo được 20 tấn quả cùng với thân lá, cây dưa leo cần khoảng 39 kg N,

27 kg P2O5, 70 kg K2O, 10 kg MgO và 35 kg CaO cho 1 ha

Theo Nguyễn Như Hà (2006), sau khi nảy mầm 10 - 15 ngày (thời kỳ cây con) cây còn hút đạm rất ít Nhưng sau đó cây có tốc độ hút đạm mạnh để phát triển thân lá (từ 16 -30 ngày sau khi nảy mầm) và hút đạm nhiều nhất ở giai đoạn trước khi có hoa cái đầu tiên (từ 30 - 44 ngày sau khi nảy mầm) Ở giai đoạn quả (khoảng 45-60 ngày sau nảy mầm) cây còn có nhu cầu đạm khá cao nhưng đã giảm dần cho đến giai đoạn cây già

Ở giai đoạn cây con trong các yếu tố dinh dưỡng chính, cây dưa leo còn có nhu cầu lân cao nhất, dù cũng chỉ chiếm phần nhỏ trong tổng nhu cầu lân của cây Nhu cầu lân của cây dưa leo lớn nhất trong thời gian ra hoa và quả (30 – 60 ngày sau nảy mầm)

Ở thời kỳ cây con cần rất ít kali, cây hút kali tăng nhưng còn chưa mạnh so với đạm và lân cho đến khi ra hoa Cây hút kali nhiều nhất (hơn 50% tổng lượng hút) ở giai đoạn quả và đến khi kết thúc giai đoạn già cỗi

1.6 Giới thiệu về cây cải xanh

Cải bẹ xanh Brassica juncea (L.) Cây thảo hằng năm, cao 40 - 60cm hay hơn, rễ

trụ ít phân nhánh Lá mọc từ gốc, hình trái xoan, tù, có cuống lá có cánh với 1 - 2 cặp tai lá; có răng không đều; các lá ở thân tiêu giảm hơn; các lá phía trên hình dải Hoa vàng nhạt, khá lớn, cao 1,5cm, xếp thành chùm dạng ngủ Quả cải 35mm, tận cùng bởi một mũi nhọn, dài 4 - 5mm, mở thành các van lồi, có đường gân giữa rõ Hạt hình cầu,

có mạng màu đen đen, dài 2mm Loài của miền nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á, có nhiều ở vùng Trung Á Ở nước ta, cải xanh được trồng phổ biến khắp cả nước

Theo Đông y cải bẹ xanh có vị cay, tính ôn, có tác dụng giải cảm hàn, thông đàm, lợi khí… Thành phần dinh dưỡng trong cải bẹ xanh gồm có: vitamin A, B, C, K, axit nicotic, catoten, abumin… Cải bẹ xanh được các chuyên gia dinh dưỡng khuyên dùng vì có nhiều lợi ích đối với sức khỏe cũng như có tác dụng phòng chống bệnh tật

Theo Trần Thị Ba, cải xanh trồng được trên nhiều loại đất Tuy nhiên đất nhiều cát, trồng mùa mưa nên dùng giống chịu mưa và nếu có thể được, nên dùng rơm phủ hoặc lưới nylon che để hạn chế đất cát bắn lên lá và hạn chế sâu bệnh cỏ dại Chuẩn bị đất kỹ tơi xốp, nhặt sạch cỏ dại tàn dư cây trồng vụ trước, phơi khô khoảng một tuần và đảo lớp mặt xuống dưới để thoáng khí cho cây trồng sinh trưởng tốt đồng thời hạn chế các sâu bệnh cư trú trong đất Khoảng 5-6 tháng một lần nên xử lý đất chống sâu bệnh bằng cách bón 50-60 kg vôi/1.000m2 đất Lên líp cao 20-30cm trong mùa mưa để chống rễ không bị úng Mùa khô lên líp cạn để giữ ẩm cho cây

Tổng lượng phân bón cho 1.000 m2 ruộng trồng: 500-1.000 kg phân chuồng , 10

kg Urea, 10 kg super lân, 5 kg KCl, 10 kg hỗn hợp 16-16-8 và 10 kg DAP

* Bón lót: Vườn ươm: lót 2-3 kg phân chuồng hoai mục + 15g phân lân/1m2 Ruộng trồng: Toàn bộ phân chuồng + super lân + 2 kg KCl Rãi trên mặt liếp và xới trộn đều

* Bón thúc:

Vườn ươm: Không cần thiết cung cấp phân, nếu cây con phát triển hơi kém có thể tưới thúc nhẹ 1 lần khỏang 10-15 ngày sau khi gieo bằng nước phân hỗn hợp NPK 16-16-8 pha loãng (20-30g/10 lít nước) Cây con 18-20 ngày tuổi có thể cấy, cấy từng đợt riêng cây tốt và xấu để tiện chăm sóc

Ruộng trồng: Bón phân dựa theo sự sinh trưởng của cây, do Cải Xanh rất ngắn ngày nên chia phân ra nhiều lần tưới sẽ có hiệu quả hơn Có thể dung phân cá ủ pha loãng tưới thêm trong thời gian gần thu họach

Bảng 1.3 Lượng phân bón cho cải xanh

Ngày sau khi

Nguồn: Trần Thị Ba, Đại học Cần Thơ

1.7 Một số nghiên cứu về sử dụng phân bón trên cây trồng

Theo Neri (2002), phun phân bón lá có các thành phần hữu cơ hoặc axit humic giúp duy trì khả năng phát triển của cây ở giai đoạn cuối của quá trình sinh trưởng Axit humic thể hiện vai trò quan trọng trong việc kích thích sự hình thành và tích lũy các sắc tố trong lá, tích lũy lượng diệp lục tố cao hơn và làm lá xanh hơn (Hancock, 1999) Nghiên cứu sử dụng phân bón lá chiết xuất từ rong biển (seaweed) của nhiều tác giả cho thấy: phun seaweed làm tăng năng suất thực thu của đậu đỗ lên trung bình khoảng 24% (Temple, 1989), cho thời gian thu trái sớm hơn ở dưa leo trồng trong nhà

kính (Passam và ctv, 1995), tăng tổng khối lượng tươi của trái cà chua trồng trong nhà kính lên 17% (Crouch và Van Staden, 1992) Nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả Chen và Aviad, 1990; Fagbenro và Agboole, 1993 đều cho thấy phun các chế phẩm chứa axit humic giúp cây tăng khả năng hấp thu các nguyên tố đa và vi lượng

Theo Gopi (2005), việc xử lý Triazole đã làm tăng sự phát triển của bộ rễ ở dưa leo và từ đó làm tăng lượng Cytokinin nội sinh Lượng Cytokinin nội sinh tăng đã dẫn đến làm tăng quá trình phân chia tế bào từ đó làm tăng khối lượng chất khô

Theo Cồ Khắc Sơn việc bổ sung phân bón lá hữu cơ sinh học (K-humate và Fish emulsion) có chiều hướng làm tăng trọng lượng trái, năng suất trái thương phẩm đối với một số loại rau Sử dụng phối hợp giữa các loại phân hữu cơ sinh học bón gốc (Biorganic, Fish fertilizer) và phân bón lá (Fish emulsion và K-Humate) có tác dụng làm tăng năng suất trái từ 11,2 đến 11,3% đối với cây cà tím; 15 đến 18,7 % với dưa leo; 15,5 đến 15,9% với khổ qua và 14,3 đến 14,9% đối với đậu đũa

Công ty Hưng Trung đã sản xuất và đưa ra thị trường chế phẩm phân bón lá chiết xuất từ Trùn quế (HT5) Chế phẩm HT5 hiệu quả cao trên nhiều loại cây trồng, phù hợp với sản xuất nông nghiệp an toàn Ngoài ra công ty còn sản xuất ra nhiều sản phẩm khác như phân hữu cơ vi sinh, hữu cơ khoáng…

Sở khoa học và công nghệ Đăklăk đã nghiên cứu và sản xuất phân bón lá từ trùn quế và than bùn Sản xuất phân bón lá theo các công thức phối trộn N, P, K vi lượng, kích thích sinh trưởng cho cây lúa (5:10:5), cây ngô (8:3:3; 3:5:7) và rau (7:1:1)

Phân bón lá BM05 do công ty Ban Mai sản xuất được chiết xuất từ phế thải chế biến thực phẩm động vật, có hàm lượng NPK: 4:4:3 ; Mg : 0,5%; Cu: 0,07; Zn: 0,05; Mn; 0,02; B: 0,05 và axit amin 1500 ppm Công ty Ni Việt có nhiều sản phẩm phân bón lá cho rau, cây ăn quả và cây công nghiệp như: Gugo-L: 3 – 0 – 10 + 10% hữu cơ

và một số vi lượng B: 100ppm; Mn: 330 ppm; Cu: 1 ppm GRO: 30 – 10 – 10; B 100ppm; Mn: 330ppm; Zn: 200ppm; Cu: 1ppm; Mo: 12 ppm và Fe: 500ppm TC-MOBI: 18 – 2 – 20; B 250ppm; Mn 250 ppm; Zn 28 ppm; Cu 12 ppm; Fe 120ppm

Trần Thanh Dũng đã nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi khuẩn Bacillus subtilis

thủy phân phụ phẩm cá da trơn tạo ra dịch đạm cao làm phân bón sinh học phục vụ sản

xuất rau sạch và an toàn Sử dụng dịch đạm thủy phân làm phân bón lá và phân bón

viên bón cho cây hẹ, đánh giá năng suất và hàm lượng nitrat so với kiểu bón phân của

nông dân và một số phân bón khác Kết quả tỷ lệ tối ưu giữa các thành phần bổ sung

chế phẩm vi khuẩn Bacillus subtilis là 1,4%, muối 7% và pH = 5,2 cho thấy mật số vi

khuẩn thủy phân protein cao và hàm lượng lượng đạm amin đạt cao nhất (49,88 g/kg chất khô), đạm amoniac thấp nhất (5,0 g/kg chất khô) vào ngày thủy phân thứ 10 Dịch đạm thủy phân này phù hợp để làm phân bón Khi sử dụng phân bón này cho cây hẹ đã cho năng suất cao (2,61 kg/m2) và hàm lượng nitrat thấp (281,95mg/kg rau tươi) ở nghiệm thức phân bón lá của dịch đạm thủy phân, (2,54 kg rau tươi/m2) và hàm lượng nitrat (268,36 mg/kg rau tươi) ở nghiệm thức phân bón viên của dịch đạm thủy phân, đạt tiêu chuẩn rau an toàn

II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 03/ 2011 – 11/ 2013 tại Trung tâm Nghiên cứu

và Phát triển nông nghiệp Công nghệ cao TP Hồ Chí Minh

2.2 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Khảo sát quá trình thủy phân phụ phẩm cá Tra bằng enzym

Nội dung 2: Phối chế dung dịch thuỷ phân thành phân bón lá để dùng cho rau

ăn lá và rau ăn quả

Nội dung 3: Khảo nghiệm chế phẩm phân bón lá từ cá Tra cho một số loại rau

trong nhà màng, ngoài đồng ruộng và công nhận phân bón mới

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Nội dung 1: Khảo sát quá trình thủy phân phụ phẩm cá Tra bằng enzym

Phụ phẩm cá Tra là sản phẩm sau khi chế biến phile tại công ty cổ phần Vĩnh Hoàn – Đồng Tháp, khi lấy về từ nhà máy phụ phẩm được xử lý ngay bằng cách phân loại mỡ, tạp chất rồi xay nhuyễn và tiến hành thí nghiệm

Phân tích nguyên liệu đầu vào:

- Xác định N tổng số bằng phương pháp Kjeldhal

- Protein tổng (NTS*6,25)

- Xác định hoạt tính của các enzym bằng phương pháp Anson

Xác định hoạt tính của các enzym dùng trong thí nghiệm:

Bảng 2.1 Hoạt tính enzym tiến hành thí nghiệm

Loại enzym Nguồn gốc Đơn vị tính Hoạt tính (UI) Giá thành

Hình 2.1 Phụ phẩm cá Tra sau khi xay nhuyễn Thí nghiệm 1: Khảo sát hiệu quả thủy phân của một số loại enzym đến quá trình thủy

phân protein phụ phẩm cá Tra

- Mục tiêu: Xác định được loại enzym thủy phân protein phụ phẩm cá Tra hiệu quả

nhất

- Vật liệu: Enzym Bromelin, Papain và Alcalase

Chế phẩm enzym được sử dụng là Alcalase 2.4L do Novozymes (Đan Mạch)

sản xuất Alcalase là một serine endoprotease sản xuất từ chủng vi khuẩn Bacillus

licheniformis Chế phẩm enzym này có pH tối ưu là 8 ÷ 10, nhiệt độ tối ưu trong

khoảng 50 ÷ 700C Enzym Bromelin và Papain do Đức sản xuất

Cách tiến hành: Nguyên liệu phụ phẩm cá Tra được xử lý sơ bộ để loại bỏ các tạp chất, xay nhuyễn, cân vào bình tam giác 10g phụ phẩm cá Tra, cho thêm 10ml

nước cất, lấy các loại enzym với hoạt tính 35UI (0,0309ml enzym Alcalase; 0,0137g enzym bromelin; 0,0136g enzym papain) Tiến hành thủy phân ở điều kiện 65oC và

pH = 8 đối với enzym Alcalase; 60oC và pH = 5,5 đối với enzym Bromelin và 40oC;

pH = 5,5 đối với enzym Papain Thời gian thủy phân là 120 phút Đến thời gian cố định, kết thúc quá trình thủy phân, bất hoạt enzym bằng cách đun cách thủy trong 15 phút, để nguội và lọc bỏ xác bã ở dưới và lớp mỡ ở trên Sau cùng là hút dịch lỏng để

phân tích các chỉ tiêu

Chỉ tiêu theo dõi:

- Xác định N tổng số bằng phương pháp Kjeldhal

- Xác định đạm formol bằng phương pháp Sorensen

- Đạm ammoniac bằng phương pháp sử dụng MgO

Thí nghiệm 2: Khảo sát hoạt độ của enzym alcalase thủy phân phụ phẩm cá Tra

- Mục tiêu: xác định hoạt độ enzym Alcalase tối ưu nhất

- Phương pháp tiến hành: Kết quả thí nghiệm 1 đã chọn được enzym Alcalase

hiệu quả nhất để tiến hành thí nghiệm 2 Thí nghiệm gồm 4 công thức và 3 lần lặp lại

Cách tiến hành: cân vào bình tam giác 10g phụ phẩm cá Tra, cho thêm 10ml

nước cất, lấy enzym Alcalase với nồng độ 25 UI (0,0221 ml); 35 UI (0,0309 ml); 45 UI (0,0398 ml) và 55 UI (0,0486 ml) Tiến hành thủy phân ở điều kiện 65oC và pH = 8 trong 120 phút Đến thời gian cố định kết thúc quá trình thủy phân, bất hoạt enzym

bằng cách đun cách thủy trong 15 phút, để nguội và lọc bỏ xác bã ở dưới và lớp mỡ ở trên Sau cùng là hút dịch lỏng để phân tích các chỉ tiêu

Chỉ tiêu theo dõi:

- Xác định N tổng số bằng phương pháp Kjeldhal

- Xác định đạm formol bằng phương pháp Sorensen

- Đạm ammoniac bằng phương pháp sử dụng MgO

Thí nghiệm 3: Xác định thời gian thủy phân protein cá Tra tối ưu nhất

- Mục tiêu: xác định được thời gian thủy phân tối ưu nhất

Cách tiến hành: cân vào bình tam giác 10g phụ phẩm cá Tra, cho thêm 10ml

nước cất, lấy enzym Alcalase với hoạt tính 35UI (0,0309 ml) Tiến hành thủy phân ở điều kiện 65oC và pH = 8 Đến thời gian cố định kết thúc quá trình thủy phân, bất hoạt enzym bằng cách đun cách thủy trong 15 phút, để nguội và lọc bỏ xác bã ở dưới và lớp

mỡ ở trên Sau cùng là hút dịch lỏng để phân tích các chỉ tiêu

Chỉ tiêu theo dõi:

- Xác định N tổng số bằng phương pháp Kjeldhal

- Xác định đạm formol bằng phương pháp Sorensen

- Đạm ammoniac bằng phương pháp sử dụng MgO

Thí nghiệm 4: Ổn định dung dịch thủy phân bằng Natribenzoat

- Mục tiêu: hạn chế sự hao hụt của đạm trong dịch thủy phân

- Phương pháp tiến hành: Dung dịch sau thuỷ phân được phối trộn Natribenzoat với

các liều lượng 0; 0,25; 0,5; 0,75 và 1,0%, sau một tháng tiến hành phân tích chỉ tiêu N

Nội dung 2: Phối chế dịch thuỷ phân thành chế phẩm phân bón lá để dùng cho rau

ăn lá và rau ăn quả

Việc bổ sung đa, vi lượng vào chế phẩm là cần thiết vì quá trình thủy phân protein phụ phẩm cá chủ yếu chỉ cung cấp đạm dưới dạng dễ hấp thu, vẫn còn thiếu nhiều nguyên tố đa vi lượng khác cần thiết cho sự sinh trưởng phát triển của cây trồng Đối với các loại rau ăn lá thì trong các nguyên tố khoáng thì cây cần đạm nhiều nhất Trong khi đó thì rau ăn quả có nhu cầu kali cao nhất tiếp đến là đạm và lân Vì vậy, sau khi đã có kết quả phân tích thành phần dung dịch thủy phân và tham khảo thành phần của một số loại phân bón lá, chúng tôi tiến hành phối trộn thêm những nguyên tố còn thiếu để sản phẩm cuối cùng đạt được chất lượng như sau:

- Chế phẩm 1: dùng cho rau ăn lá: 5% N; 1% P2O5; 1% K2O; 250 ppm Fe; 200 ppm Zn; 200 ppm Mn; 100 ppm Cu; 100 ppm Bo

- Chế phẩm 2: dùng cho rau ăn quả: 3% N; 2% P2O5; 4% K2O; 300 ppm Fe; 100 ppm Cu; 200 ppm Zn; 300 ppm Mn; 500 ppm Bo