II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Nội dung 1: Khảo sát quá trình thủy phân phụ phẩm cá Tra bằng enzym
Phụ phẩm cá Tra là sản phẩm sau khi chế biến phile tại công ty cổ phần Vĩnh Hoàn – Đồng Tháp, khi lấy về từ nhà máy phụ phẩm được xử lý ngay bằng cách phân loại mỡ, tạp chất rồi xay nhuyễn và tiến hành thí nghiệm.
Phân tích nguyên liệu đầu vào:
- Xác định N tổng số bằng phương pháp Kjeldhal - Protein tổng (NTS*6,25)
- Xác định hoạt tính của các enzym bằng phương pháp Anson
Xác định hoạt tính của các enzym dùng trong thí nghiệm:
Bảng 2.1. Hoạt tính enzym tiến hành thí nghiệm
Loại enzym Nguồn gốc Đơn vị tính Hoạt tính (UI) Giá thành
Alcalase Đan Mạch UI/ml 1131 ± 46 1 triệu/lít
Papain Đức UI/mg 2574 ± 63 660.000đ/25g
26
Hình 2.1. Phụ phẩm cá Tra sau khi xay nhuyễn
Thí nghiệm 1: Khảo sát hiệu quả thủy phân của một số loại enzym đến quá trình thủy
phân protein phụ phẩm cá Tra.
- Mục tiêu: Xác định được loại enzym thủy phân protein phụ phẩm cá Tra hiệu quả
nhất.
- Vật liệu: EnzymBromelin, Papain và Alcalase.
Chế phẩm enzym được sử dụng là Alcalase 2.4L do Novozymes (Đan Mạch)
sản xuất. Alcalase là một serine endoprotease sản xuất từ chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis. Chế phẩm enzym này có pH tối ưu là 8 ÷ 10, nhiệt độ tối ưu trong
khoảng 50 ÷ 700C. Enzym Bromelin và Papain do Đức sản xuất.
- Phương pháp thực hiện:
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với 3 nghiệm
thức và 3 lần lặp lại. Sử dụng enzym có hoạtđộ là 35 UI. Các nghiệm thức
Nghiệm thức Enzym
NT1 Alcalase
NT2 Bromelin
27
Cách tiến hành: Nguyên liệu phụ phẩm cá Tra được xử lý sơ bộ để loại bỏ các
tạp chất, xay nhuyễn, cân vào bình tam giác 10g phụ phẩm cá Tra, cho thêm 10ml
nước cất, lấy các loại enzym với hoạt tính 35UI (0,0309ml enzym Alcalase; 0,0137g enzym bromelin; 0,0136g enzym papain). Tiến hành thủy phân ở điều kiện 65oC và pH = 8 đối với enzym Alcalase; 60oC và pH = 5,5 đối với enzym Bromelin và 40oC; pH = 5,5 đối với enzym Papain. Thời gian thủy phân là 120 phút. Đến thời gian cố định, kết thúc quá trình thủy phân, bất hoạt enzym bằng cách đun cách thủy trong 15 phút, để nguội và lọc bỏ xác bã ở dưới và lớp mỡ ở trên. Sau cùng là hút dịch lỏng để
phân tích các chỉ tiêu.
Chỉ tiêu theo dõi:
- Xác định N tổng số bằng phương pháp Kjeldhal - Xác định đạm formol bằng phương pháp Sorensen
- Đạm ammoniac bằng phương pháp sử dụng MgO
Thí nghiệm 2: Khảo sát hoạtđộ của enzym alcalase thủy phânphụ phẩm cá Tra
- Mục tiêu: xác định hoạtđộ enzym Alcalase tối ưu nhất
- Phương pháp tiến hành: Kết quả thí nghiệm 1 đã chọn được enzym Alcalase hiệu quả nhất để tiến hành thí nghiệm 2. Thí nghiệm gồm 4 công thức và 3 lần lặp lại.
Các nghiệm thức:
Nghiệm thức Hoạt tính enzym (UI)
NT1 25
NT2 35
NT3 45
NT4 55
Cách tiến hành: cân vào bình tam giác 10g phụ phẩm cá Tra, cho thêm 10ml
nước cất, lấy enzym Alcalase với nồng độ 25 UI (0,0221 ml); 35 UI (0,0309 ml); 45 UI (0,0398 ml) và 55 UI (0,0486 ml). Tiến hành thủy phân ở điều kiện 65oC và pH = 8 trong 120 phút. Đến thời gian cố định kết thúc quá trình thủy phân, bất hoạt enzym
28
bằng cách đun cách thủy trong 15 phút, để nguội và lọc bỏ xác bã ở dưới và lớp mỡ ở
trên. Sau cùng là hút dịch lỏng để phân tích các chỉ tiêu.
Chỉ tiêu theo dõi:
- Xác định N tổng số bằng phương pháp Kjeldhal - Xác định đạm formol bằng phương pháp Sorensen.
- Đạm ammoniac bằng phương pháp sử dụng MgO.
Thí nghiệm 3: Xác định thời gian thủy phân protein cá Tra tối ưu nhất.
- Mục tiêu: xác định được thời gian thủy phân tối ưu nhất
- Phương pháp thực hiện:
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD với 4 nghiệm thức
và 3 lần lặp lại.
Các nghiệm thức:
Nghiệm thức Thời gian thủy phân(phút)
NT1 90
NT2 120
NT3 150
NT4 180
Cách tiến hành: cân vào bình tam giác 10g phụ phẩm cá Tra, cho thêm 10ml
nước cất, lấy enzym Alcalase với hoạt tính 35UI (0,0309 ml). Tiến hành thủy phân ở điều kiện 65oC và pH = 8. Đến thời gian cố định kết thúc quá trình thủy phân, bất hoạt
enzym bằng cách đun cách thủy trong 15 phút, để nguội và lọc bỏ xác bã ở dưới và lớp
mỡ ở trên. Sau cùng là hút dịch lỏng để phân tích các chỉ tiêu.
Chỉ tiêu theo dõi:
- Xác định N tổng số bằng phương pháp Kjeldhal - Xác định đạm formol bằng phương pháp Sorensen.
29
Thí nghiệm 4: Ổn định dung dịch thủy phân bằng Natribenzoat
- Mục tiêu: hạn chế sự hao hụt của đạm trong dịch thủy phân
- Phương pháp tiến hành: Dung dịch sau thuỷ phân được phối trộn Natribenzoat với
các liều lượng 0; 0,25; 0,5; 0,75 và 1,0%, sau một tháng tiến hành phân tích chỉ tiêu N.
Các nghiệm thức:
Nghiệm thức Natri benzoate (%)
NT1(đối chứng) 0
NT2 0,25
NT3 0, 5
NT4 0,75
NT5 1,0
Chỉ tiêu theo dõi:
- Xác định N tổng số bằng phương pháp Kjeldhal
Nội dung 2: Phối chế dịch thuỷ phân thành chế phẩm phân bón lá để dùng cho rau ăn lá và rau ăn quả
Việc bổ sung đa, vi lượng vào chế phẩm là cần thiết vì quá trình thủy phân
protein phụ phẩm cá chủ yếu chỉ cung cấp đạm dưới dạng dễ hấp thu, vẫn còn thiếu
nhiều nguyên tố đa vi lượng khác cần thiết cho sự sinh trưởng phát triển của cây trồng. Đối với các loại rau ăn lá thì trong các nguyên tố khoáng thì cây cần đạm nhiều nhất. Trong khi đó thì rau ăn quả có nhu cầu kali cao nhất tiếp đến là đạm và lân. Vì vậy, sau khi đã có kết quả phân tích thành phần dung dịch thủy phân và tham khảo thành phần
của một số loại phân bón lá, chúng tôi tiến hành phối trộn thêm những nguyên tố còn thiếu để sản phẩm cuối cùng đạt được chất lượng như sau:
- Chế phẩm 1: dùng cho rau ăn lá: 5% N; 1% P2O5; 1% K2O; 250 ppm Fe; 200 ppm Zn; 200 ppm Mn; 100 ppm Cu; 100 ppm Bo.
- Chế phẩm 2: dùng cho rau ăn quả: 3% N; 2% P2O5; 4% K2O; 300 ppm Fe; 100 ppm Cu; 200 ppm Zn; 300 ppm Mn; 500 ppm Bo.
30
Phương pháp phối trộn các chế phẩm từ dịch thủy phân cá Tra (phụ lục 3)
Chỉ tiêu theo dõi:
- Xác định N tổng số bằng phương pháp TCVN 5815 - 2001 - Xác định P2O5 tổng số bằng phương pháp TCVN 8559 - 2010 - Xác định K2O tổng số bằng phương pháp TCVN 5815 - 2001
- Xác định hàm lượng axit amin bằng phương pháp CASE.SK.0013 (GC - EZ faast). - Xác định Zn bằng phương pháp TCVN 9289 – 2012
- Xác định Mn bằng phương pháp TCVN 9288 – 2012 - Xác định Cu bằng phương pháp TCVN 9286 – 2012 - Xác định Fe bằng phương pháp TCVN 9283 – 2012 - Xác định B bằng phương pháp AOAC 2007 (982.01)
- Xác định hàm lượng Pb bằng phương pháp AOAC 2007 (965.09) - Xác định hàm lượng As bằng phương pháp Ref. AOAC 957.02 - Xác định hàm lượng Cd bằng phương pháp AOAC 2007 (965.09) - Xác định hàm lượng Hg theo bằng phương pháp Ref. AOAC 971.21 - Xác định mật độ Salmonnella bằng phương pháp TCVN 4829 – 2005
Nội dung 3: Khảo nghiệm chế phẩm phân bón lá từ cá Tra cho một số loại rau trong nhà màng, ngoài đồng ruộng và công nhận phân bón mới.
Các chế phẩm phân bón sản xuất từ cá Tra được tạo ra ở nội dung 1 và 2 sẽ được sử dụng để làm công thức khảo nghiệm trong nội dung 3.
Thí nghiệm 1: Khảo nghiệm chế phẩm phân bón lá cho cải xanh trồng trong điều kiện
nhà màng.
- Mục tiêu: Đánh giá hiệu quả của phân bón lá được sản xuất từ phụ phẩm cá Tra trên đối tượng cải xanh trồng trong nhà màng.
- Vật liệu nghiên cứu: dịch thủy phân từ phụ phẩm cá Tra, chế phẩm phân bón
31
- Phương pháp nghiên cứu:
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD), gồm 5 nghiệm
thức, 3 lần lặp lại trên cây cải xanh trồng trong nhà màng. Diện tích mỗi ô thí nghiệm
là 5 m2. Số liệu thu thập được xử lý thống kê bằng phần mềm SAS 9.1.
Các nghiệm thức:
Nghiệm thức Loại phân
NT1 (đối chứng ) Phun nước lã
NT2 Dịch thủy phân chưa phối trộn (1%) NT3 Dịch thủy phân chưa phối trộn (5%)
NT4 Chế phẩm 1 pha loãng 0,5% NT5 Chế phẩm 1 pha loãng 1%
Cách tiến hành: Thời gian phun: 3 lần phun ở các thời điểm 6 ngày, 12 ngày và 18 ngày sau trồng. Với liều lượng NT2 (10 ml/ lít nước); NT3 (50 ml/ lít nước); NT4
(5 ml/ lít nước) và NT5 (10 ml/ lít nước). Lượng nước sử dụng 0,25 lít/ lần/ 5m2.
Chỉ tiêu theo dõi:
- Thời gian gian thu hoạch: (ngày).
- Tốc độ tăng trưởng chiều cao cây: cm/7 ngày - Tốc độ gia tăng số lá: lá/7ngày
- Chiều cao cây cuối cùng: (cm/cây). - Số lá cuối cùng: (lá/cây).
- Trọng lượng trung bình cây: (g/cây). - Năng suất: (kg/m2)
- Hàm lượng nitrat bằng phương pháp AOAC 968.07
Rau cải được trồng trên giá thể 70% mụn dừa + 30% phân hữu cơ, nước và phân
bón được cung cấp qua hệ thống tưới nhỏ giọt với nồng độ các nguyên tố là : N = 200 ppm, P= 40 - 50 ppm, K = 70 – 100 ppm, Mg = 40ppm, Ca = 120 ppm, Cu = 0,1ppm, Zn = 0,3ppm, Mn = 0,3ppm, B = 0,3ppm, Fe = 2,2 ppm, Mo = 0,05 ppm.
32
Thí nghiệm 2: Khảo nghiệm chế phẩm phân bón lá cho dưa leo trồng trong điều kiện
nhà màng.
- Mục tiêu: Đánh giá hiệu quả của phân bón lá được sản xuất từ phụ phẩm cá Tra trên đối tượng dưa leo trồng trong nhà màng.
- Vật liệu nghiên cứu: dịch thủy phân từ phụ phẩm cá Tra, chế phẩm phân bón
lá làm từ phụ phẩm cá Tra. Giống dưa leo Tropica - L04.
- Phương pháp nghiên cứu:
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD), gồm 5 nghiệm
thức, 3 lần lặp lại trên giống dưa leo Tropica - L04 trồng trong nhà màng. Diện tích
mỗi ô thí nghiệm là 15m2. Số liệu thu thập xử lý thống kê bằng phần mềm SAS 9.1.
Các nghiệm thức:
Nghiệm thức Loại phân
NT1 (đối chứng ) Phun nước lã
NT2 Dịch thủy phân chưa phối trộn (1%) NT3 Dịch thủy phân chưa phối trộn (5%)
NT4 Chế phẩm 2 pha loãng 0,5% NT5 Chế phẩm 2 pha loãng 1%
Cách tiến hành: Thời gian phun: phun lần 1 sau trồng 5 ngày, mỗi lần phun cách
nhau 10 ngày. Với liều lượng NT2 (10 ml/ lít nước);NT3 (50 ml/ lít nước); NT4 (5 ml/
lít nước) và NT5 (10 ml/ lít nước). Lượng nước sử dụng 1,5 lít/ lần/ 15m2.
Chỉ tiêu theo dõi:
- Thời gian sinh trưởng: ngày ra hoa, ngày thu trái lần 1, ngày tận thu (ngày) - Các yếu tố cấu thành năng suất (số quả/cây, trọng lượng quả).
- Năng suất lý thuyết và năng suất thực thu (tấn/ha)
- Hàm lượng nitrat bằng phương pháp AOAC 968.07
Dưa leo được trồng bầu 10dm3 trên giá thể 70% mụn dừa + 30% phân hữu cơ,
33 Tên nguyên tố (ppm) Từ trồng – 10 ngày Sau trồng 10 ngày – ra hoa Ra hoa – tận thu N 150 220 180 P 50 60 60 K 120 200 300 Ca 135 180 185 Mg 40 45 50
Vi lượng: B: 0,5 ppm; Mn: 0,3 ppm; Fe: 2,5 ppm; Mo: 0,05; Cu: 0,1 ppm; Zn: 0,3ppm.
Thí nghiệm 3: Khảo nghiệm chế phẩm phân bón lá (chế phẩm 1) cho cải xanh
và rau dền ngoài đồng ruộng
Phân bón lá Sinh học cá (chế phẩm 1) là sản phẩm khoa học của đề tài cấp thành phố Hồ Chí Minh. Do Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Nông nghiệp Công nghệ
cao thành phố Hồ Chí Minh thực hiện.
Sản phẩm được khảo nghiệm theo Giấy chứng nhận đăng ký khảo nghiệm số
1847/ CNKN-TT-ĐPB, do Cục trưởng Cục Trồng trọt ký ngày 29 tháng 7 năm 2013. Đơn vị thực hiện khảo nghiệm: Phòng Nghiên cứu Khoa học đất, Viện Khoa
34
Bảng 2.2. Kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng trong phân sinh học cá
Thành phần Đơn vị Hàm lượng đăng ký Kết quả phân tích Phương pháp phân tích Nts % 5 5,06 TCVN 5815 - 2001 P2O5hh % 1 1,13 TCVN 8559 - 2010 K2Ohh % 1 1,10 TCVN 5815 - 2001 Fe ppm 250 252 TCVN 9283 – 2012 Zn ppm 200 209 TCVN 9289 – 2012 Mn ppm 200 206 TCVN 9288 – 2012 Cu ppm 100 107 TCVN 9286 – 2012 B ppm 100 110 AOAC 2007 (982.01)
Axit amin % 3 3,19 CASE. SK. 0013 (GC-EZ faast)
Nguồn: Phân tích tại Viện KHKTNNMN
Bảng 2.3. Kết quả phân tích kim loại nặng và vi sinh vật hại trong phân sinh học cá
Các nguyên tố Đơn vị tính Kết quả PP phân tích
Thuỷ ngân (Mercury, Hg) ppm Không phát hiện
MLOD = 0,003 Ref. AOAC 971.21
Chì (Lead, Pb) ppm Không phát hiện
MLOD = 5 AOAC 965.09
Asen (As) ppm Không phát hiện
MLOD = 1 Ref. AOAC 957.02
Cadimi (Cd) ppm Không phát hiện
MLOD = 0,05 AOAC 2007 (965.09)
Salmonella CFU/25ml Không phát hiện TCVN 4829 – 2005
35
SƠ ĐỒ QUY TRÌNH SẢN XUẤT PHÂN SINH HỌC CÁ
Thủy phân Phụ phẩm cá Loại bỏ các vật rắn lẫn tạp Xay nhuyễn Bổ sung enzym Dịch thủy phân Lọc bỏ cặn Phối trộn Đóng chai thành phẩm Bổ sung nước Kiểm tra chất lượng
36
Thời gian khảo nghiệm từ tháng 7/2013 – 10/2013.
Đối tượng khảo nghiệm: Rau cải và rau dền
Đất và địa điểm khảo nghiệm: Đất xám trên phù sa cổ tại Củ Chi, TP. Hồ Chí Minh, đất phù sa cổ tại Trảng Bàng, Tây Ninh.
* Nội dung khảo nghiệm:
Phân sinh học cá (chế phẩm 1) được khảo nghiệm trên 2 loại rau trong 2 vụ
- Rau cải: 2 thí nghiệm và 2 thử nghiệm
- Rau dền: 2 thí nghiệm và 2 thử nghiệm
* Phương pháp khảo nghiệm
- Các thí nghiệm chính quy: bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, lặp lại 4
lần. Diện tích ô thí nghiệm: 20 m2/ô * Công thức thí nghiệm:
Công thức 1: Bón theo khuyến cáo tại địa phương (ĐC)
Công thức 2: ĐC + bổ sung Phân Sinh học cá liều lương 5ml/lit nước (phun 3 lần)
Công thức 3: ĐC + bổ sung Phân Sinh học cá liều lương 10 ml/lit nước (phun 3 lần)
Chỉ tiêu theo dõi: Năng suất của rau cải và rau dền (tấn/ha)
* Phương pháp xử lý số liệu:
37