1 Lý do chọn đề tài
Ung thư là căn bệnh nan y, một trong những gánh nặng của bệnh tật toàn cầu gây ra ti lệ tử vong cao Theo báo cáo mới nhất của Hiệp hội Quốc tế chống ung thư (UICC) cho thấy căn bệnh ung thư là nguyên nhân gây tử vong cho gần 7 triệu người chỉ trong năm 2004 chiếm 12,5% tổng số người chết do bệnh tật Con số người mắc bệnh ung thư sẽ tăng nhanh và đạt tới con số 16 triệu người vào năm 2020 như dự đoán của Tổ chức Y tế thế giới WHO [1] Do vậy, nhu cầu sử dụng thuốc để phòng ngừa và chữa trị những căn bệnh nan y đặc biệt bệnh ung thư là tất yếu và cần thiết, qua đó góp phần vào việc chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ cộng đồng của mọi quốc gia trên thế giới
Trang 2Vinblastine và Vincristine chiết xuất từ cây Dừa cạn (Catharan thus roseus L G.Don) [61], Taxol chiết xuất từ cây Thông đỏ ( Taxus brevifolia) [62], v.v Nồi bật là năm 2006, Đỗ thị Thảo - Viện Công nghệ sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã phát hiên ra hoạt chất Scuterbarbalactone VN (SBVN) một hoạt chất mới lần đầu tiên được phân lập, tách chiết từ cây Bán chi lién (Scutellaria barbata D.Don) đã chứng minh cấu trúc hoá học có khả
năng diệt và ức chế nhiều loại tế bào ung thư phát triển ở điều kiện #-vio,
hoạt chất này có hoạt tắnh mạnh diệt và ức chế tế bảo ung thư phát triển nhưng ắt gây độc với tế bảo thường Dù bất kỳ hoạt chất nào dé phát triển
thành thuốc chữa bệnh, sau khi được chứng minh ở điều kiện i-viro cũng
phải được thử nghiêm ở mức độ i-vivo để tạo cơ sở cho nghiên cứu tiền lâm sàng (Preclincal) và thử nghiệm lâm sàng (Clinical trial)
Vì thế, chúng tôi muốn tiếp tục nghiên cứu sâu hơn nữa khả năng phòng chữa ung thư của hoạt chất SBVN ở mức in-vivo Qua đó, sẽ tạo cơ sở cho các nghiên cứu khoa học thử nghiêm tiền lâm sàng và lâm sàng sau này, nhằm đi đến đắch cuối cùng làm ra thuốc phòng ngừa và chữa trị ung thư có hiệu quả kinh tế và an toàn cho nhân dân góp phần vào việc chăm sóc bảo vệ sức khoẻ cho cộng đông, chúng tôi tiến hành nghiên ctu dé tai "Tham do khả năng phòng và chữa ung thư của hoạt chất Scuterbarbalactone VN từ cây bản chỉ liên trên chuột gáy ung thư thực nghiệm"
2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
Ề Gây u thực nghiệm trên chuột BALB/c bằng tế bào LLC (Lewis Lung Carcinoma) để tạo mô hình cho nghiên cứu khả năng phòng và chữa ung thư
Trang 3ằ Thiét lập tiền đề cho các thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng đối với hoạt chất tiềm năng SBVN
3 Nội dung nghiên cứu của đề tài
Ề Gây ung thư thực nghiệm trên chuột nhất trắng dòng BALB/c bang hoa chat 7,12- dimethyl[a]Janthracene (DMBA) va bang dòng tế bào ung thư nudi cay in-vitro 1a LLC
ằ Kiém tra và xác định liều độc cấp tắnh gây chết 50% động vật thi
nghiệm LCso (lethal dose) của hoạt chất SBVN
ồ Dựa vào kết quả nghiên cứu độc tắnh iw-vio đã có và liều độc cấp LCao, tiến hành xác định nồng độ SBVN sử dụng cho bước thử nghiệm in- vivo trên chuột
ồÒ Thực hiện việc sử dụng hoạt chất SBVN làm chất bảo vệ để ngăn chặn sự phát triển và diệt các khối u ung thư thực nghiệm
Ề Thu nhận kết quả, tiễn hành xử lắ số liệu thống kê bằng hệ thống dé
phân tắch đữ liệu, thiết lập các hình và bảng minh hoạ, từ đó rút ra kết luận
Trang 41.1 TINH HINH UNG THU TREN THE GIOI VA VIET NAM
Ưng thư là căn bệnh nan y, gây ra tỉ lệ tử vong cao Theo báo cáo mới nhất của Tô chức Y tế thế giới (WHO) bệnh ung thư đang dân vượt qua bệnh tim mach để trở thành căn bệnh gây tử vong cao nhất trên thế giới Trong 5 năm từ 1998-2002, có 24,6 triệu người chết vì ung thư, riêng năm 2004 có 7 triệu bệnh nhân ung thư tử vong và thêm 11 triệu người mới mắc căn bệnh này [52], [53] Trong tông số 58 triệu người chết trên toàn thế giới năm 2005, bệnh ung thư là nguyên nhân gây tử vong cho 7,6 triệu (hay 13% trên tông số) người Các ca tử vong do ung thư sẽ không ngừng tăng, với mức ước tắnh khoảng 9 triệu người chết do ung thư vào năm 2015 và 11,4 triệu người chết vào năm 2030 (http://www.benhungthu.net.vn) Các loại bệnh ung thư chắnh
dẫn đến tỷ lên tử vong chung như:
Bệnh ung thư Phổi khiến 1,3 triệu người chết mỗi năm Bệnh ung thư Dạ Dày khiến l triệu người chết mỗi năm
Bệnh ung thư Gan khiến 662.000 người chết mỗi năm
Bệmh ung thư Đại Tràng khiến 655.000 người chết mỗi năm Bệnh ung thư Vú khiến 502.000 người chết mỗi năm
Số người chết do bệnh ung thư thường rơi vào các quốc gia có thu nhập bình quân trung bình và thấp (http://www.benhungthu.net.vn)
Trang 5lo ngại là số bệnh nhân mắc bệnh ngày càng trẻ hoá, tế bảo ung thư có xu hướng ác tắnh thường cao hơn và thời gian để khối u có kắch thước nhân 2 cũng ngắn hơn (http://www.ungthu.net.vn)
Như vậy, ung thư vẫn là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ở Việt Nam Ung thư xảy ra ở cả nam và nữ, đối với nam giới, các bệnh ung thư thường gặp như: phổi, gan, vòm họng còn ở nữ là ung thư vú, ung thư cô tư cung Đặc biệt, ung thư ở nữ thường xuất hiện ở độ tuôi 40-50, ngoài ra ung thư còn là mối đe dọa với mọi người già Ung thư có khả năng điều trị khỏi nếu phát hiện ở giai đoạn sớm Đề hạn chế sự gia tăng của căn bệnh này, việc tìm ra phương cách phòng và chữa trị ung thư là mối quan tâm thực sự là rất cấp thiết Phương hướng tìm kiếm các thảo được lấy từ tự nhiên, để phòng và chữa trị ung thư là một ưu sách
1.2 UNG THU HQC, DAC TÍNH CƠ BẢN, NGUYÊN NHÂN VÀ CÁC PHƯƠNHG
PHÁP PHÒNG TRÁNH, CHỮA TRỊ
Ủng thư là tên chung dùng dé gọi một nhóm bệnh trên 200 loại khác nhau về nguôn gốc tế bào phát sinh, khả năng di căn, tiên lượng và cách thức điều trị nhưng đều có chung một đặc điểm nỗi bật là sự tăng sinh vô hạn, vô tô chức không tuân theo cơ chế kiểm soát về phát triển của của cơ thê, có thể
di căn, tôn tại, xâm lắn và phát triển của tế bào ưng thư [3], [4], [32]
Trang 6tiếng Hy lạp có nghĩa là con cua bởi sự xâm lắn, phát triển của khối u ác tắnh nhắc ông nhớ tới hình ảnh "con cua có các càng tua tủa" Ngày nay ung thư học được thế giới biết đến với từ "cancer" theo tiếng anh và cũng có nghĩa là con cua trong tiếng la tinh [5], [17]
1.2.1 Các đặc tắnh của bệnh ung thư Ề _ Ứng thư là căn bệnh của tế bào
Ung thư bắt đầu từ một tế bào và phải mắt một thời gian nhiều năm khi
có một khắch thước đủ lớn mới xuất hiện các dấu hiệu nhận biết được Thông
thường, các tế bào có một tuôi thọ nhất định và tuân thủ chặt chẽ theo một qui
luật chung là "phát triển - già - chết" Các tế bào chết đi lại được thay thế băng
các tế bào mới Cơ thể có một cơ chế kiểm soát qui luật này rất nghiêm gặt và
duy trì số lượng tế bào của mỗi cơ quan, mỗi tổ chức ở mức ổn định Bệnh
ung thư bắt đầu khi có một tế bào vượt qua cơ chế kiểm soát này của cơ thể, phát triển, sinh sôi không ngừng, hình thành một đám tế bao (khối u) có chung một đặc điểm là phát triển vô tổ chức, xâm lấn và chèn ép vào các cơ quan, tổ chức xung quanh gây tử vong cho người bệnh [12], [21]
-_ Bệnh ung thư gôm nhiễu giai đoạn
Quá trình phát triển từ một tế bào ung thư ban đầu thành một khối u
ung thư và đe dọa tắnh mạng người bệnh trải qua nhiều giai đoạn [32]
Trang 7di chuyến tới các tô chức và cơ quan mới, bám lại và tiếp tục tăng sinh vô tổ chitc Qua trinh nay goi la sy di cin (metastatic process) Cac té bao ung thu chèn ép hay di căn vào các cơ quan giữ chức năng sống trong cơ thể như não,
tim, phối, gan, thận v.v khiến bệnh nhân tử vong [1], [21], [57]
Như vậy, quá trình hình thành và phát triển căn bệmh ung thư được tóm tắt như hình 1
TẾ bào | Tác nhân nội bào Tế bào Quá trình tăng sinh
bình >| une thu | U ac tinh
thường | hoặc ngoại bào 5 và phát triển
Di căn xâm lần XS Chữa trị Ỏs Tu Sông vong sót
Hình 1 Sơ đồ hình thành và phát triển ung thư 1.2.2 Khái quát về tế bào ung thư
e _ Phân loại ung thư theo nguôn gốc tế bào
Theo nguén gốc phát sinh, ung thư được các nhà khoa học phân chia
gồm [27], [22], [57]
- Carcinoma (nguén géc biéu bi): đây là dạng ung thư phô biến nhất, phát sinh từ những tế bào có nguôồn gốc tử lá phôi trong và lá phơi ngồi Như ung thư phôi, ung thư vú, ung thư trực tràng, v.v
Trang 8Lymphoma Burkitt
- Leukemia (ung thu mau - bénh bach cau): 14 dang ung thu nguy hiém và biểu hiện bệnh rất sớm, cả ở trẻ em và người trẻ tuôi, phát sinh từ các mô tạo máu, các té bào máu non thuộc tuỷ xương có xu hướng tắch tụ thành số lượng lớn trong hệ máu như trường hợp ung thư bạch cầu cấp tắnh (Human Acute Leukemia)
ằ Cac dac tắnh của tế bào ung thư
Nhìn chung, tế bào ung thư kém biệt hoá hơn so với tế bào bình thường do sự phân chia của nó quá nhanh chóng và diễn ra liên tục [21] Trong quá trình phân chia, các đặc tắnh tiềm ấn của chúng cũng thay đôi bất thường và rất nhanh theo thời gian Vắ dụ, tế bào ung thư gan có thê mắt đi khả năng sản xuất một vài loại enzym đặc trưng so với tế bào gan bình thường khác và qua nhiều lần phân chia bắt thường, chúng thậm chắ mất hắn những chức năng đặc trưng của tế bào gan Kiểu bất thường này là do sự biến đổi nhanh chóng của hệ gien trong tế bào ung thư
Các tế bào ung thư thường có rất nhiều nhiễm sắc thể bất thường và không ôn định Hình thái, các tế bào ung thư có tỉ lệ nhân/tế bào chất cao, nhân to, bờ nét không rõ, xuất hiện nhiều sợi phân bào so với tế bào bình thường khác [17], [21], [32]
Do đó, tế bào ung thư có đặc tắnh riêng như: - Khả năng xâm lắn và di căn của tế bào ung thư
Trang 9nhân Hiện nay, đặc thù này của tế bào ung thư vẫn chưa hoàn toàn sáng tỏ trên cơ sở khoa học [17], [21], [Ế7]
Khá năng di căn của tế bào ung thư cũng phụ thuộc vào tiềm năng phát triển của chúng tại vị trắ mới khi bị bao quanh bởi những tế bào hoàn toàn khác biệt về mặt chức năng và hình thái Tiềm năng này có được là nhờ xuất hiện một số protein mới ở tế bào ung thư Vắ dụ, một số enzym được tế bào ung thư tiết ra sẽ làm thoái hoá phân tử collagen hay một số protêin màng đệm lót khác như proteolycan, glycosaminoglycan để chúng xâm nhập, tồn tại và phát triển ở các tô chức, cơ quan mới mà chúng vừa di chuyền tới [21], [50], [57]
- Khả năng sinh sản không thể kiểm soát của tế bào ung thư
Trong cơ thê con người, mỗi phút có tới 10 triệu tế bào sinh sôi Quá
trình phân chia này diễn ra theo một trình tự khuôn mẫu và được kiểm soát
chặt chẽ Khi một tế bào bình thường trở thành tế bào ung thư, nó sẽ phân chia bất thường Quá trình phân chia bất thường này diễn ra nhanh hơn bình thường và các tế bào con cháu được sinh ra sẽ không trưởng thành và chết đi như các tế bào bình thường khác Ngược lại, chúng tiếp tục quá trình phân chia vô tổ chức và ngày càng trở nên khác biệt di truyền với tế bào mẹ ban
đầu [11], [50], [57]
-Khả năng vượt qua sự kiểm soát của bệ miễn dịch của tế bào ung thư
Trang 10tế bào ung thư có những thay đối đáng kể khác lạ với tế bào bình thường nhưng lại thoát khỏi sự phát hiện và tiêu diệt của hệ miễn dịch [65]
Có lẽ các tế bảo ung thư đã che dấu được mình để vượt qua sự nhận biết của các tế bào Lympho Kết quả hệ miễn dịch của cơ thể không thể phát hiện được tế bào ung thư và tiêu diệt chúng Tế bào ung thư là tế bào của
chắnh cơ thê bệnh nhân nhưng bị biến chất, thoái hoá nguy hiếm làm hệ miễn dịch không nhận biết được [21]
1.2.3 Nguyên nhân gay bệnh ung thư
Đến nay, chưa thể xác định rõ một loại nguyên nhân chung nào cho các loại ung thư, mỗi loại ung thư có những nguyên nhân riêng biệt, tác động theo nhiều cơ chế khác nhau nhưng hiện tại có thê chia làm 2 nhóm tác nhân lớn: Tác nhân môi trường và tác nhân sinh học [3], [4]
e _ Tác nhân môi trường: gồm tác nhân hoá học, vật lý
Tác nhân hoá học gây ung thư như khói thuốc lá, các thành phần hoá học trong thuốc trừ sâu, các sản phẩm phụ gia dùng cho bảo quản thực phẩm, tạo mầu không đạt tiêu chuẩn, chất A-mi-ăng Trong đó khói thuốc lá được xem là mối nguy hại tiềm ấn lớn nhất cho sức khoẻ cộng đồng với hơn 20 chất hoá học có khả năng gây ra các bệnh ung thư như: ung thư phổi, thanh quản, thực quản, v.v Ngoài ra các khắ đốt xăng dầu, động cơ, khắ thải nhà máy công nghiệp, v.v cũng được xem là độc hại và gây ôi nhiễm môi trường là nguyên nhân gây bệnh ung thư cao cho con người [4|, [21], [36], [57]
Tac nhan hoa hoc gay ung thu theo 2 cach:
Trang 11Cơ chế hoạt động của nhóm hoá chất này là thông qua trung tâm ái lực điện tử electrophilics để phản ứng với các trung tâm mang điên tắch âm của các phân tử protein, ADN, ARN của tế bảo, từ đó gây ra những thay đỗi về
mặt cầu trúc của các phân tử này dẫn tới thay đối về mặt chức năng Do tác
động trực tiếp vào các phân tử ADN, nhóm hoá chất này đã làm biến đôi các gen tiền ung thư Proto-oncogene trở thành gen ung thu oncogene dén tới hình thành tế bào ung thư nguyên phát [4], [61], [62], [47]
* Nhóm hoá chất gây ung thư tác động gián tiếp gọi là các promoter, chúng cũng chứa đựng các trung tâm ái lực điện tử electrophilic nhưng không tác động trực tiếp đến phân tử ADN, ARN mà thông qua việc kắch hoạt các enzym kinase nội bào (nhóm enzyn này chịu trách nhiệm trong quá trình phân chia mitosis của tế bào), làm thay đổi cấu trúc và chức năng các phân tử ADN, ARN của tế bào, qua đó biến đồi gen tiền ung Proto-oncogene trở thành gen ung thư oncogene dẫn tới hình thành tế bào ung thư Đại diện điển hình của nhóm này là phorbol ester [2], [47]
Các yếu tố phóng xạ như tia X, tia gamma, các đồng vị phóng xa ồH, '*C, 'ỘP dùng trong quân sự, y học, nghiên cứu khoa học hay nguồn phóng xạ tự nhiên từ vũ trụ, từ các đồng vị phóng xạ trong không khắ, đất, nước như: các hạt anpha và proton cũng là một trong số những tác nhân gây ung thư cao cho con người trên toàn cầu [3], [4], [17], [21]
Trang 12Ngoài ra, một số tác nhân cũng có là nguyên nhân gây ung thư như tia tử ngoại mặt trời, tia cực tắm UV, sóng điện từ, chế độ ăn uống giau lipit, dam [3], [4], [5]
e Tac nhan sinh học
Tác nhân sinh học chủ yếu là một số loại virus và vi khuẩn có khả năng khởi động châm ngòi cho sự phát triển ung thư khi nó lây nhiễm sang tế bào bình thường [4], [21], [49] [63]
Virus gây ung thư gồm 2 loại: virus ADN và virus ARN Cơ chế gây ung thư của các virus này tương đối phức tạp và chưa được hiểu hết Tuy nhiên, có thể xem như chúng làm biến đổi các tắnh đặc thù của tế bào chủ (hình thái, sinh lý, sinh hoá) bằng cách hợp nhất một số gen của mình vào hệ
gien của tế bào bị chúng lây nhiễm khiến cho một số gien hoạt động bất
thường, các proto - oncogene biến đôi thành oncogen mở đầu cho sự hình thành căn bệnh ung thu [21], [64] Oncogene chắnh là gen dẫn đến sinh ung thư mới (neoplasma), nó đóng vai trò chủ yếu trong sinh ung thư [4] Oncogene được thừa nhận đầu tiên ở virus ung thư gây ra biến hình tế bào viral oncogene [4]
* Virus ADN gây ung thư có nhiều loại, đặc trưng nhất là các papovavirus với hai đại điện thường gặp là SV40 và polyma Trên lý thuyết, ADN của virus có thể hợp nhất vào ADN của tế bào chủ tại vị trắ đặc trưng hoặc những vị trắ ngẫu
nhiên khác Do vậy, sau khi bị lây nhiễm, tế bào chủ thường bị kắch hoạt đề đi vào quá trình sinh sôi vô tổ chức không thể kiểm soát hình thành bệnh ung thư [21]
Trang 13a Trong phương thức hoạt động thứ nhất, các Retrovirus chứa phân tử ARN như vật liệu di truyền và sử dụng enzyme sao chép ngược (reverse trascriptase) để tạo ra một phiên bản ADN nội bào mới có khả năng gắn kết và sát nhập vào hệ ADN của tế bào chủ Các gien của virus gắn kết trực tiếp vào các proto - oncogene của tế bào chủ nên đã biến chúng thành dạng oncogene gay ung thu
Thông thường một tế bảo bình thường để chuyển sang tế bào ung thu phải trải qua một hoặc một vài đột biến ở gen nhất định Quá trình này liên quan đến hệ thống gien tiền ung thư (proto - oncogene) và gen át chế ung thư (tumor - suppressor gene), gen tiền ung thư mã hoá cho nhóm protein tham gia vào quá trình hình thành những chất truyền tin (messennger) trong quá trình dẫn truyền tắn hiệu tế bào Các chất truyền tin này sẽ truyền tắn hiệu
"tiến hành phân bào" tới chắnh tế bào đó hay những tế bào khác Do vậy khi bị
đột biến, các gen tiền ung thư sẽ biểu hiện quá mức (overexpression) các tắn hiệu phân chia tế bào và làm các tế bào tăng sinh thừa thải, lúc này trở thành các gen ung thư (oncogene) Tuy nhiên, những các gen ung thư thực chất là các gen cần thiết đối với quá trình phát triển, sửa chữa và hằng định nội môi của cơ thê Do đó, kháng thể loại bỏ những gen này khỏi hệ gen tế bào chủ nhằm làm giảm khả năng ung thư
b Trong phương thức hoạt động thứ 2, thì vị trắ gắn kết và hợp nhất không phải trực tiếp vào các proto - oncogene ma chi ở gần đó nhưng cũng kắch hoạt chúng hoạt động như một oncogene thực sự [2T]
Trong các Retrovirus phải kế đến virus HIV, nó không trực tiếp gây ra bệnh ung thư nhưng chúng làm suy giảm va mất khả năng miễn dịch của cơ thê
khiến hệ miễn dịch mất khả năng diệt tế bào ung thư nguyên phát, dẫn tới cơ thê
Trang 14Ngoài ra, virus viêm gan B được xem là một trong những nguyên nhân chắnh gây ung thư gan
1.2.4 Khả năng phòng và chữa bệnh ung thư
Ung thư là căn bệnh tiến triển trong thời gian tương đối dài kế từ khi khởi phát một tế bào ban đầu, nên việc phòng và trị bệnh ung thư mang lại sức khoẻ cho cộng đồng là hoàn toàn có thể Tuy nhiên, khi các khối u đó di căn thì việc chữa trị trở nên khó khăn, tỉ lệ tử vong của người bệnh là rất cao Vì vậy, việc phòng hay chữa trị bệnh nên được thực hiện càng sớm càng tốt [28], [57]
Việc phòng bệnh có hiệu quả là tránh tiếp xúc với các tác nhân gây bệnh và thực hiện lối sống lành mạnh, có chế độ ăn uống, làm việc hợp lý và khoa học, nên thường xuyên tập luyện thê thao
Việc chữa trị bệnh ung thư tùy thuộc từng loại ung thư, từng giai đoạn khác nhau, vào tắnh chất của tế bào ung thư mà áp dụng một hay nhiều phương pháp điều trị khác nhau như liệu pháp sinh học, hoá trị, xạ trị, phẫu thuật hay kết hợp cả bốn liệu pháp này Gần đây, xuất hiện khái niệm mới về Ộhoá học phòng chống ung thư-Cancer chemopreventionỢ là việc sử dụng các hoạt chất có khả năng chống oxy hoá, kắch hoạt hệ enzyme khử độc, v.v dé loại bó các tác nhân gây ung thư cho cơ thê hoặc sử dụng các hoạt chất có khả năng tác động tới các yếu tố truyền tắn hiệu thứ cấp như NfkB (nuclear factor kappa binding), cAMP (3'-5'-cyclic adenosine monophosphate), v.v liên quan đến quá trình phát triển ung thư để ngăn cản bệnh phát triển Hoá học phòng chống ung thư đang được xem là rất có triển vọng trong phòng và chữa trị bệnh ung thu [4], [27], [29], [30], [37], [51]
e Liéu phap sinh hoc (Biological therapy)
Liệu pháp sinh học là sử dụng hệ miễn dịch của cơ thể một cách trực
Trang 15thiểu các tác dụng phụ của các liệu pháp chữa trị ung thư khác Liệu pháp này bao gồm viéc st dung cac interferon, interleukin, khang thé don dong, vaccine, can thiệp vào hệ gen va các chất tăng cường miễn dịch không đặc trưng để chống lại tế bào ung thư [21], [57]
Liệu pháp sinh học được sử dụng để:
+ Giám sát ngăn chặn hoặc chấm dứt các phản ứng sinh học cho phép tế
bào ung thư phát triển [34], [57]
+ Làm cho tế bào ung thư được nhận dạng nhờ đó hệ miễn dịch nhận biết
và tiêu diệt tế bào ung thư [57]
+ Tăng cường sức mạnh tiêu diệt của các tế bào trong hệ miễn dịch như té bao lympho T, NK va macrophages [57]
+ Chuyén dang phát triển của tế bào ung thư để hướng những tế bào đột biến này đi vào quá trình tự chết [57]
+ Tăng cường khả năng sửa chữa hoặc thay thế những tế bào bình thường bị tồn thương trong quá trình chữa trị ung thư bằng xạ trị hay hoá trị [57]
+ Ngăn chặn hoặc đảo ngược quá trình chuyển đạng từ tế bào bình thường hay tế bảo tiền ung thư thành tế bào ung thư
+ Phòng chống tế bào ung thư di chuyển tới các bộ phận khác của cơ thé [57] e Liéu phap hoa tri
Trang 16e Liéu phap xa tri
La liéu phap str dung nguén nang luc cao ti tia X, tia gamma, neutron và các nguồn phóng xạ khác để tiêu diệt tế bào ung thư và các khối u Liệu khác này sử dụng máy chiếu phóng xạ từ ngoài cơ thể hoặc thông qua một số nguồn vật liệu phóng xạ được chuyển vào cơ thể ở vị trắ gần khối u ung thư Ngoài ra, còn sử dụng các chất đồng vị phóng xạ gắn với kháng thê đơn dòng để tăng cường tắnh hiệu quả và đặc hiệu, tránh làm tôn thương các tế bào lành khác trong quá trình điều trị bệnh ung thư [11], [57]
Ề _ Liệu pháp phẫu thuật
Sử dụng phẫu thuật để cắt bỏ khối u ung thư Liệu pháp này thực sự đem lại hiệu quả chữa tri cao, nếu đây là giai đoạn đầu của bệnh ung thư,
chưa có di căn, khối u vẫn còn khu trú tại chỗ Trong trường hợp bệnh đã di
căn đến các khu vực khác trong cơ thê thì liệu pháp này cần kết hợp với các liệu pháp khác để điều trị tắch cực và triệt để [3], [17]
ề Liéu phdp hod hoc phòng chống ung thư (HHPCUT)
Mục đắch của liệu pháp hoá trị liệu ung thư (cancer chemotherspy) nhằm tiêu diệt tế bào ung thư để ngăn ngừa sự tiến triển của căn bệnh , thì liệu pháp HHPCUT nhằm ngăn chặn bệnh hình thành và phát triển [39], [40], [57]
Các nhóm hoạt chất phòng chất ung thư hoạt động theo 2 cách:
- Phòng chống hoặc ngăn chặn những đột biến gen có khả năng dẫn tới bénh ung thu [57]
- Phòng chống hoặc ngăn chặn quá trình tăng sinh liên tục của các tế
bào bệnh dẫn tới hình thành một khối u [57]
Trang 17nhiều nhà khoa học quan tâm Viên nghiên cứu ung thu của Hoa Ky - NCI da đưa HHPCUT thành một trong những vẫn đề được ưu tiên hàng đầu
ề Phong chống chữa trị ung thư ngay ở các giai đoạn phát triển ung thư Một tế bào bình thường khi chịu tác động của các tác nhân gây ung thư sẽ có sự biến đổi bất thường về mặt di truyền, các gen Proto - oncogene biến d6i thanh cdc oncogene gây ung thư và hình thành ở giai đoạn khởi phát của bệnh ung thư Quá trình này có thể phòng chống bằng nhiều phương cách khác nhau như dùng hoạt chất cảm ứng các enzyme khử độc của cơ thê như Glutathione - S -transferase (GST), Quinone reductase (QR) nham loại bỏ các yếu tố gây ung thư [38], hay sử dụng các được chất chống oxi hoá nhằm loại bỏ các gốc tự do gây đột biến gen, [37] Ngoài việc giúp cơ thê tránh ảnh hưởng hoặc loại bỏ tác nhân ung thư, các hoạt chất phòng chống ung thư còn kắch hoạt hệ gen sửa chữa đột biến hay kắch hoạt tế bào chuyên dạng đi vào quá trình tự chết Nhờ vậy, sự hình thành ung thư sẽ được loại bỏ Các hoạt chất có khả năng phòng chống ung thư ở giai đoạn này gọi là các dược chất phòng ung thư tiền phát (anti - intiation agents) [36]
Trong giai đoạn ung thư phát triển, việc phòng chống ung thư tập trung vào các được chất có khả năng kìm hãm, ức chế sự phát triển, trì hoãn hay dừng sự tăng sinh của tế bào ung thư, từ đó ngăn chặn sự phát triển của khối u
đã có, phòng chống sự hình thành các khối u mới sinh [35]
1.3 MOT SO HOP CHAT TU NHIEN CO TAC DUNG PHONG CHONG VA CHUA TRI BENH UNG THU
Sử dụng các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên trong phòng ngừa và chữa trị bệnh ung thư đang là hướng đi chắnh của nhiều nhà nghiên cứu khoa học
Đây là một hướng đi có hiệu quả vì tắnh an toàn và tắnh kinh tế
Trang 18Phương pháp chữa trị ung thư bang hoá chất này mang tắnh độc cao đôi với tế bào ung thư, tiêu diệt hoặc ngăn chặn tê bào ung thư phát triển song cũng độc với tế bào bình thường, gây ra những tác dụng phụ không mong muốn Vì vậy, các nhà khoa học luôn nỗ lực tìm kiếm những hoạt chất đặc hiệu hơn trong việc tiêu diệt hoặc ức chế tế bào ung thư phát triển mà ắt ảnh hưởng tới
tế bào bình thường khác [35]
Đến nay đã chắnh thức có 15 hoạt chất được sử dụng trên toàn thế giới
đề điều trị một số bệnh ung thư (bảng 1) [8], 23], [26], [33], [41]
Bảng 1 Danh mục 15 hoạt chất từ thực vật và sử dụng để điều trị ung thư
STT Tên hoạt chât Từ loại thực vật
1 | Betulinic acid Betula alba
2 | Camptothecin Camptotheca acuminata
3 | Colchiceine amide Colchcum autumnale
4 | Colchicine Colchcum autumnale
5 | Demecolcine Colchcum autumnale
6 | Etoposide Podophylum peltatum
7 | Irintecan Camptotheca acuminata
8 | lapachol Tababuia sp
9 | Monocrotaline Crotalaria sessiliflorra 10 | Podophyllotoxin Podophyllum peltatum
11 | Taxol Taxus brevifolia
12 | Teniposide Podophyllum peltatum
13 | Topotecan Camptotheca acuminata
14 | Vinblastine Catharanthus roseus
15 | Vincristine Catharanthus roseus
Trang 19Hiện nay, nhiêu nghiên cứu đã chứng minh rất nhiều hop chat trong tự nhiên có hoạt tắnh phòng chống ung thư cao ở điều kiện iz-vifro, in-vivo đã cho những kết quả khả quan khi được thử nghiệm tiên lâm sàng cũng như ở mức lâm sàng trên cơ thể người như Polyphenol của chè xanh, Piroxicam, Oltipraz Vitamin Bìa, Folate v.v [4], [40]
Đến nay, được biết có 12 hợp chat và nhóm hoạt chat được sử dụng đề phòng chỗng ung thư trong những điều kiện nhất định đem lại một số hiệu quả khả quan trong việc phòng chống và cứu chữa cho bệnh nhân ung thư [3], [27], [51] Một số hoạt chất phòng, chéng ung thư đã và đang được sử dụng phô biến được thê hiện ở bảng 2
Bảng 2 Các hợp chất phòng, chỗng ung thư phô biến
STT Tên hoạt chât Loại hợp chất
1 | Vitamin A và các Retinoid khác | Vitamin
2 | Vitamin C Vitamin
3 | Vitamin D Vitamin
4 | Vitamin E Vitamin
5 | Acid Folic Vitamin
6 | Hop chat Selenium Chat khoang (Mineral)
7 | Calcium Chat khoang (Mineral)
8 | Beta-Carotene Hoa thuc vat (Phytochemical)
9 | Monoterpene Hoa thuc vat (Phytochemical)
10 | Tamoxifen Hố tơng hop (Drug)
11 | Finasteride Hố tơng hop (Drug)
12 | Oltipaz Hoá tong hop (Drug)
Trang 20
nhưng không ảnh hưởng đến tế bào bình thường khác Vậy việc kiêm nghiệm ở mức -vivo và kiểm nghiệm lâm sàng ở động vật và người để phát triển thành thuốc phòng ngừa và chữa trị bệnh ung thư đang cần được tiếp tục
Bên cạnh việc chữa trị, phòng ngửa ung thư cũng đóng vai trò quan trọng Đa phần việc phòng chống nhiều bệnh nguy hiểm là thông qua vaccine Tuy nhiên, việc sử dụng vaccine phòng tất cả các loại ung thư cho đến nay là chưa thể thực hiện được do đặc tắnh của căn bệnh ung thư là đa dạng, đa nguyên nhân Hiện nay đã chế xuất ra loại vacxin phòng chống ung thư cô tử cung cho phự nữ đã được bán rộng rãi trên thị trường Vì thế, việc tiếp tục hi vọng một liệu pháp vaccIne cho các loại bệnh ung thư trong tương lai đang là hướng nghiên cứu chung của các nhà nghiên cứu khoa học và là hướng di chắnh của thời đại
1.4 TINH HINH NGHIEN CUU TiM KIEM THUOC PHÒNG CHÓNG VÀ CHỮA TRI UNG THU TRONG NUOC
Nam trong khu vực nhiệt đới gió mùa, Việt Nam có thảm thực vật phong phú và đa dạng Theo số liệu thống kê của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Thế giới (IUCN) thì Việt Nam có trên 12.000 loài thực vật và khoảng 4.000 loài được sử dụng trong dân gian làm thuốc chữa bệnh Đây chắnh là nguyên liệu quý giá cung cấp cho nền công nghiệp dược phẩm nước nhà Từ xa xưa ông cha ta đã tận dụng nguồn tài nguyên này để cứu chữa bệnh tật cho
nhân dân Các kinh nghiện thực tế đã được đúc kết thành rất nhiều sách quý
và lưu truyền cho đến tận ngày nay Với căn bệnh ung thư đã có nhiều tài liệu ghi lại khả năng chữa trị u bướu của một số loại thực vat [6], [15]
Trang 21Trinh nữ hoàng cung [5], [16], cây Bồ béo đen, cây Diếp cá [14], cây Hà thủ
ô trắng, cây Bắ kỳ nam [43] và một số loại cây khác [42]
Tuy nhiên, còn nhiều loài thực vật được ghi nhận là có khả năng chữa trị ung thư, chống viêm hay tăng cường hệ miễn dịch chống ung thư, đã và đang tiếp tục được nghiên cứu sâu ở mức độ phân tử nhằm tìm ra hoạt chất có hoạt tắnh phòng chống ung thư Đây là hướng đi tắch cực, khả quan của ngành y tế với mục tiêu bảo vệ sức khoẻ cộng đồng
1.4.1 Tổng quan về cây Ban chi lién (Scutellariabarbata D Don)
NS
Hinh 2 Cay Ban chi lién (Scutellaria barbata D Don)
Trang 22phân bố nhiều ở các ruộng khơ thuộc Hồ Bình, Hà Tây, Bắc Thái, Hà Giang, Hoà Bình, Hải Dương, Ninh Bình, Thanh Hố Tồn cây được thu hái vào mùa xuân, mùa hè lúc cây ra hoa, rửa sạch, phơi khô, bó lại dé dung Theo dan gian, cay co vi dang, tắnh mát, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc lợi tiểu, tiêu sưng, giảm đau, chống khối u tân sinh, áp xe phổi, viêm ruột thừa, viêm gan, xơ gan cô trướng [7], [8], [9], [25], [44]
Trong y học Trung Quốc toà cây khô được dùng làm thuốc hạ sốt, lợi tiêu, điều trị khối u tân sinh, ung thư phổi, ung thư gan, ung thư trực tràng Ngoài ra, dùng cây tươi giã đắp, nấu nước rửa, trị mụn nhọt, sưng đau, viêm vú, dùng thay ắch mẫu chữa bệnh phụ khoa Bán chi liên có trong đơn thuốc chữa, ung thư phổi, ung thư gan, ung thu truc trang [9],[26], [65],[66 ],
Trong thời gian gần đây, các nhà khoa học trên thế giới rất quan tâm tới cây Bán chi liên của Trung Quốc vì khả năng chống ung thư của nó Nhiều nghiên cứu Ư-viro đã chứng minh răng một số thành phan hoá học của cây Bán chỉ liên có khả năng diệt và ức chế tế bào ung thư phát triển [20], có khả năng tác động đến quá trình tự chết apoptosis của tế bào [63], [64], kắch hoạt hệ enzyme caspase [59], tác động và ức chế nhiều yếu tố liên quan quá trình tăng sinh, phát triển và bất tử của tế bào ung thư như Cyclooxygenase-2 (COX-2), extracellular signal-regulated kinase (ERK)/ Akt, v.v [63]
Trang 23bệnh nhân ung thư vú, duy trì và thậm chắ làm giảm kắch thước khối u (theo
tiêu chuân RECIST) ở 16 bệnh nhân và cho thấy có độ an toàn nhất định, hầu như không có tác dụng phụ [67]
Năm 2007, công ty được phẩm Bionovo đã đăng ký một sáng chế phát triển chế phẩm BZL101 từ dịch chiết nước của cây Bán chỉ liên trong điều trị ung thư, đặc biệt là ung thư vú Theo các nhà nghiên cứu, hiệu qua cua BZL 101 là ngăn chặn các tế tào ung thư phát triển 6 pha G1 trong chu ky tế bao va hướng những tế bào này đi đến quá trình tự chết (apoptosis) mà không ảnh hưởng đến tế bào thường Do vậy, nó ắt khả năng gây tác dụng phụ Đây thực sự là phát hiện quan trọng và tạo động lực để phát triển Bán chi liên làm thuốc hoá dự phòng ung thư, đặc biệt là bệnh ung thư phụ thuộc hoocmon [22], [63], [64], [67]
Trang 24của tế bào ung thu LLC [63] Tiép đó, Chen LG và cộng sự trường đại học Quốc gia Đài loan đã phân lập được Wogonin từ thảo được này Kết quả cho thấy, Wogonin có khả năng chống ung thư và điều tiết tác dụng kháng viêm thông qua việc kìm hãm hoạt động của enzyme COX-2 là enzym làm tiến triển quá trình ung thư trong cơ thê [63]
Năm 2006, Dai SĨ cùng cộng sự của trường Đại học Quảng Tây Trung Quốc đã phân lập được các neo-clerodanes là barbatin A, barbatin C Các chất này thể hiện hoạt tắnh độc tế bào kháng lại các dòng tế bào gây ung thư ở người là HONE-1 (ung thư vòm hong) KB (ung thu biểu bì miệng) và HT-29 (ung thư thanh quản) với giá tri ICs) nam tromg khoảng 3,5-8,1uM [68]
Cũng trong năm 2006, nhóm nghiên cứu của Sheng Jun Dai, trường Đại học Quảng Tây Trung Quốc đã phân lập được thêm 5 neo-clerodane điterpenoid alkloid là scutebarbatins B-F Các chất này cũng thể hiện hoạt tắnh độc tế bào kháng lại các dòng tế bào gây ung thư ở người là HONE-1 (ung thư vòm họng) KB (ung thư biểu bì miệng) và HT-29 (ung thư thanh quản) với giá trị ICso nằm trong khoáng 3,9-7,8uM [68]
Năm 2007, nhóm nghiên cứu trên lập được thêm 9 alkloid mới là scutebarbatins G, 6-7-di-O-nicotynoylscutebarbatin G, 6-nicotynoyl-7-O- acetyl scutebarbatins G, scutebarbatine H va 7-O-nicotynoylscutebarbatin H và các scutebarbatins I-L, có hoạt tinh chống lại các dòng tế bảo gây ung thư ở trên với giá trị ICso năm trong khoảng 3,5-8,5 uM [66]
Trang 25tế bào kém biệt hoá do sự phân chia quá nhanh chóng và diễn ra liên tục Chúng có khả năng vượt qua sự kiểm soát của hệ miễn dịch của cơ thể và tăng cường xâm lấn vào các tô chức sống lân cận Vì vậy những chất có khả năng phòng chống và điều trị ung thư là những chất được đánh giá có hoạt tắnh gây
độc cho tế bào ung thư, do đó có khả năng ức chế sự phát triển và điệt tế bào ung thư Kết quả cho thấy, chất barbatine C có khả năng gây độc cho tế bào ung thư biểu mô -KB với gia tri ICs la 19,78 pM/ml, chat barbatine D cé hoat tắnh độc trên 2 dòng tế bào là ung thư biểu mô-KB và ung thu gan Hep-G2 với giá trị ICso là 28,32 uM/ml và 24,97 uM/ml, chất Scutebarbatine A có hoạt
tắnh độc với tế bào ung thư phôi với giá tri ICs) 14 10,86 uM/ml [19]
Tuy nhiên, đa phần các nghiên cứu đã công bố về khả năng phòng chữa ung thư của cây Bán chi liên đều tập trung vào chất chiết thô hoặc chỉ một số phân đoạn hoá học nhất định như phân đoạn Chloroform v.v
Đỗ thị Thảo (2006) đã phân lập được một số hợp chất từ cây Bán chỉ liên, trong đó có một hoạt chất mới được đặt tên là Scuterbarbalactone VN
Qua khảo sát hoạt tắnh độc tế bào ở điều kiện i-vio đã chứng minh khả
năng diệt và ức chế của hoạt chất này trên nhiều dòng tế bào ung thư như dòng tế bào ung thư biểu mô-KB, tế bào ung thư phối LU, tế bào ung thư gan Hepalclc7, té bao ung thư tiền liệt tuyến LNCaP, tế bào ung thư máu cấp tắnh HL-60, v.v hoạt chất này thể hiện hoạt tắnh rất tốt với giả trị lCso năm trong khoảng từ 2,2 - 8,3 uM và thể hiện hoạt tắnh mạnh nhất trên dòng tế bào ung
thư vú (ICso = 2,2 uM), yếu nhất trên dòng tế bào ung thu biéu mé KB (ICs =
Trang 26tố điều hoà phiên mã và được xem là gen quan trọng giám sát quá trình sinh sản và biệt hoá của tế bào gốc, cũng như đối với tế bào ung thư Ngoài ra, hoạt chất này còn ức chế duoc hoat déng cla enzyme aromatase (CYP19) Aromatase 1a enzyme bién d6i androgen thanh steroid C18 estrogen vong, bước quan trọng nhất trong quá trình tổng hop hoocmon estrogen Déi véi một số loại ung thư như ung thư vú, ung thư tiền liệt tuyến thì hoạt động của enzyme này sẽ là yếu tố kắch thắch khối ung thư phát triển Do vậy, hợp chất nào có khả năng ức chế hoạt động của enzyme này sẽ được xem là có hoạt tắnh phòng chống ung thư ở giai đoạn tiến triển bệnh lý Mặt khác, hoạt chất nghiên cứu này có thể có tắnh độc tế bào với các tế bào bình thường nhưng không đáng kể nhưng tác động mạnh tới các tế bào ung thư [10]
Như vậy, hoạt chất SBVN tách chiết từ cây bán chi liên đã được chứng
minh có hoạt tắnh mạnh diệt và ức chế tế bào ung thư phát triển ở điều kiên in-vitro Đây là cơ sở để chúng tôi tiếp tục nghiên cứu sâu hơn nữa về khả năng phòng và chữa trị ung thư của hoạt chất tiềm năng nay 6 mtr in-vivo, góp phân nhằm làm sáng tỏ vai trò của hoạt chất SBVN trong phòng ngừa và chữa trị bệnh ung thư của cây Bán chỉ liên Dưới đây là quy trình tách chiết và phân lập tìm ra hoạt chất SBVN của nhóm tác giả Đỗ Thị Thảo và chúng tôi dựa trên quy trình này để tách chiết ra hoạt chất SBVN với một lượng là 8,2 gram, lượng cần thiết để phục vụ cho nghiên cứu của i vivo của chúng tôi
1.4.2 Quy trình tách chiết, phân lập và cấu trúc hóa học của SBVN
Cây Bán chi liên được rửa sạch bụi đất, thái nhỏ và hong ngoài không
khắ ở nhiệt độ phòng đến khi khô, bảo quản trong kho có điều hoà nhiệt độ rồi
Trang 27quay chân không cho đến khi thể tắch của dịch methanol/nước còn lại bằng khoảng 1/10 thể tắch ban đầu Dịch methanol/nước này được chiết lần lượt với n-hexan (3 lần) và CH2C12 (4 lần) Sơ đồ qui trình tách chiết và phân lập hoạt chất SBVN BCL (toàn bộ cây) Methanol (3x), nhiệt độ phòng Cô trong chân không đến còn 1/10 thể tắch ban đâu | methanol / nước (R1)
Chiết lần lượt với n-hexan (3x) và CHỈ;C]; (4x)
Cát loại dung môi trong chân không
Can CH,C], (R3)
Ỷ
Loại các chất điệp lục trên cột Sephadex LH-20 (dung môi rứa giải: methanol) Phân đoạn trên cột silica gel (dung môi rửa giỏi: n-hexan/acetone 53-304) hn Ne< Cét Sephadex LH-20 (methanol) Silica gel (n-hexan/acetone) SBVN (3) C34H3s03 (MW= 574)
Các sản phẩm thu được sau khi cất loại hết dung môi trong chân không là cặn n-hexan (ký hiệu là R2), cặn CH;Cl; (ký hiệu là R3) Một phần của cặn
Trang 28ngoại của SBVN có các đải hấp thụ đặc trưng ở 3440 (nhóm chức OH), 1787 (nhóm y-lacton), 1714 (nhóm este), và 1639 (vòng benzen) Phân tắch các phố 13C NMR và DEPT cho thấy phân tử có 34 nguyên tử carbon bao gồm 4 nhóm CH3, 5 nhóm CH2, 15 nhóm CH, 3 nhóm C=O (đỏC 166,44; 167,32; 174,01) cùng 7 carbon bậc bốn khác Phố khối lượng EIMS cho pic có số khối cao nhất tại m/z 574, ứng với ion phân tử MỢ Các đữ kiện này dẫn đến công thức phân tử là C34H38ậOậ Phố HMQC cho phép ta gán mỗi nguyên tử carbon với các nguyên tử hiđro gắn trực tiếp với nó
Phân tắch các dữ liệu phổ cho phép dự đoán một cấu trúc khung diecpen tương tựnhưkhung của các hop chat scutebarbatine A và scuterivulactone C¡ được phân lập trước đây từ các cây Bán chi liên của Trung Quốc Việc phân tắch các chuỗi gắn kết nguyên tử dựa trên các phô COSY va HMBC cho phép ta thay phân tử có một mảng decalin gắn với một mang spirolacton (B) it _ .iểi Hình 3 (A) Cấu trúc hóa học của hoạt chất SBVN; (B) Hình ảnh tinh thê hoạt chất SBVN
Phổ khối lượng EIMS của chất này cung cấp các chứng minh bô sung cho các kết quả trình bày ở trên với các mảnh đặc trưng ở 7⁄2 574 (MỈ), m⁄z
452 (MỢ - C;ƯH;COORN), 7⁄2 105 (CƯH;COỢ), và 7⁄2 77 (CạH;Ợ) Các căn cứ
Trang 29chiều, cho phép chúng tôi tìm được cấu trúc của hợp chất SBVN 1a 6,11- dibenzoyloxy-8,13-epoxy-7-hydroxy-3(4)-clerođen-15,16-oliđe và có cấu trúc hóa học như hình 3
- Nhiệt độ nóng chảy
Sau khi được tách chiết, một số tắnh chất cơ bản của hoạt chất SBVN đã được xác định như sau: Hợp chất SBVN kết tinh trong hexan/acetone cho các tinh thê không màu, có điểm nóng cháy là 218 - 219C, trọng lượng phân tử là 574
- Khả năng hoà tan của SBVN trong nước và trong PBS
Hoat chat nay tan t6t trong Dimethyl Sulfoxide (DMSO), rat kém tan trong nuéc va trong Phosphate Buffer Saline (PBS)
- Nông độ bão hoà của SBVN trong nước và trong PBS
Không xác định được vì SBVN hầu như không tan trong nước và trong PBS Việc làm tan SBVN chỉ có thể thực hiện khi sử dụng máy khuấy
siêu âm
- Diểu kiện tối ưu để lưu giữ SBVN
Hoạt chất SBVN tôn tại bình thường trong điều kiện nhiệt độ phòng,
vì vậy có thể cất giữ ở điều kiện bình thường, không cần giữ ở 4ồC hoặc ở nhiệt độ thấp hơn
1.5 MƠ HÌNH GAY UNG THU THUC NGHIEM TREN DONG VAT
Mô hình này nhằm kiểm tra, đánh giá tác dụng phòng và chữa trị ung thư của hoạt chất tiềm năng trên động vật được gây ung thư thực nghiệm
Để nghiên cứu bệnh học cũng như tìm ra phương thức điều trị hiệu quả bệnh ung thư, việc tạo ra mô hình ung thư thực nghiệm trên động vật như chuột, thỏ, v.v là rất cần thiết để thực hiện những nghiên cứu in-vivo
Trang 30+ Mô hình gây u bằng tế bào; + Mô hình gây u băng hố chất
Mơ hình gây u bằng hoá chất: Hiện tại, có thể gây ung thư thực nghiệm trên động vật bằng hoá chất như 7,12-đimethylbenz[a]anthracene (DMBA) Ở gây ung thư vú (Whitsett và cộng sự, 2006), DMBA là một trong những hoá chất gây ung thư được sử dụng phổ biến trong các phòng thắ nghiệm nghiên cứu về ung thư DMBA gây u bằng cách tạo nên những đột biến gen và làm tăng kắnh thước khối u với sự có mặt của chất 12-O-tetradecanoylphorbol- 13acetate (TPA), nhờ vậy mà khối u sẽ phát triển với tốc độ rất nhanh Đã có một số công trình gây ung thư thực nghiệm bằng hố chất DMBA thành cơng như Nicolas Currier và cộng sự đã tiến hành gây u thực nghiệm trên dòng chuột FVB/N băng cách cho chuột uống DMBA trong 6 tuần liên tiếp, kết quả thu được rất khả quan với 100% chuột xuất hiện u ở những bộ phận khác nhau như phối, tuyến vu, tuy, da (Currier và cộng sự, 2005) Russo và cộng sự đã kết hợp 2 chất DMBA và hCG (human chorionic gonadotropin) gây u trên dòng chuột cống nhằm khảo sát, đánh giá khả năng gây ung thư cho chuột
Kết quả sau 24 tuần gây u ở thắ nghiệm với 100% DMBA thì 61,3% chuột đã xuất hiện các khôi u và vẫn đang tăng trưởng về kắch thước
Mô hình gây u bằng tế bào: có thể gây ung thư cho động vật nghiên cứu bằng các dòng tế bào ung thư như Sarcom - 180 gây u báng trên chuột (Hà Việt Hải và cộng sự, 2000; Đỗ Thị Tháo, 2006; Graft và cộng sự, 1952) hoặc dòng tế bào LLC Trong đó, gây u báng là phép thử sinh học nhằm xác định khả năng kháng tế bào ung thư của hoạt chất nghiên cứu ở điều kiện i-vivo Trong đó, tế bào u báng Sarcom -180 được cây vào xoang bụng chuột nhắt trắng dòng tế bào Swiss để xác định khả năng sinh khối u, khối lượng u báng,
Trang 31đối chứng, từ đó xác định hoạt tắnh ức chế sự phát triển ung thư ở điều kiện in vivo của hoạt chất cần nghiên cứu
Cho đến nay, tại nhiều viện nghiên cứu trên thế giới, dòng tế bào LLC với khả năng gây u và di căn mạnh đã được sử dụng như dòng chuẩn để đánh giá hiệu quá thử nghiệm in-vivo cua thuốc phòng chống ung thu mdi LLC được tiễn sĩ Lewis phát hiện vào năm 1951 Sau đó, nó tiếp tục được các nhà khoa học khác nghiên cứu Các nghiên cứu của Sugiura và Stock đã phát hiện ra các khối u hình thành ở 100% chuột thắ nghiệm sau khi tiêm LLC mét thoi gian và phát triển rất ác tắnh Sau này, DeWys đã đưa ra tiêu chuẩn để xác định sự phát triển của khối u sơ cấp băng cách đo thể tắch khối u [69], [70]
LLC là dòng tế bào di căn và gây u mạnh, có thé gay u thực nghiệm cho chuột bằng cách tiêm tế bào LLC vào bắp đùi hoặc dưới da lưng và chuột
bị tiêm ở bắp đùi sẽ có khả năng hình thành khối u cao hơn và khối u cũng
Trang 32Chương 2
ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐÓI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
- Động vật thắ nghiệm
Chuột BALB/c 6 tuần tuổi, khoẻ mạnh được nuôi với mật độ 10
con/lông tại chuồng nuôi động vật của Viện công nghệ sinh học, Viện Khoa học - Công nghệ Việt Nam, số 18 đường Hoàng Quốc Việt, Hà Nội Chuột được cung cấp thức ăn tiêu chuẩn, nước uống tự do
- Hoạt chất nghiên cứu
8,2 gram hoat chất SBVN được tách chiết từ cây Bán chi liên, lượng cần thiết để phục vụ cho quá trình nghiên cứu
Ề Một số vật liệu khác phục vụ cho nghiên cứu của chung tôi: - Tế bào
Dòng tế bào ung thư LLUC (Lewis Lung Carcinoma) đo trường Đại học Universit degli Studi di Milano của Italia cung cấp Tế bào được nuôi trong môi trường DMEM (Gibco, USA) với 10% huyết thanh phôi bò (FBS), 1% Penicilline-Streptomycine, ở điều kiện 37ồC và 5% COƯ
- Mẫu thực vật
Cây Bán chi liên rửa sạch, phơi khô, xay nhỏ thành dạng bột khô để tách chiết ra hoạt chất bảo vệ phòng, chữa trị ung thư SBVN
- Hoá chất nghiên cứu
- Các loại hố chất, mơi trường nuôi cây tế bào: MEME, DMEM, RPMI 1640, v.v (Gibco, Hoa Kỳ ), huyết thanh FBS (Atlanta Biological, Hoa Ky), khang sinh, trypsin, cồn 70ồ và các hố chất thơng thường khác
Trang 33- Thiết bị nghiên cứu
- Máy lọc không khắ National (Nhật Bản)
- Tủ cấy vô trùng Safety Laminar Level II Microflow (Anh) - Tủ nuôi tế bào National (Nhật Bản)
- Kắnh hiễn vi soi ngược (Olympus, Nhật Bản) - Máy li tâm lạnh (Đức)
- Máy khuấy từ nhiệt (Đức), thiết bị làm khô tuyệt đối và các dụng cụ
thắ nghiệm thông thường khác như kim uống, kim tiêm, dao, kéo, thước, compa; bình nitơ lỏng bảo quản tế bào, tủ sấy vô trùng, nồi hấp diệt trùng
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào in-vitro
Phương pháp nuôi cấy tế bào ung thư được tiến hành theo phương pháp đang lưu hành tại Viện ung thư Quốc gia Hoa Kì NCI (National Cancer Institute) đã được WHO công nhận
Các dòng tế bảo ung thư do ngân hàng tế bào ATCC (American Type Culture Collection) cung cấp ở dạng bảo quản trong nitơ long (-196ồC), vi vay các dòng tế bào này trước khi sử dụng gây ung thư cho động vật nghiên cứu để thử thuốc phải được đánh thức (phục hồi tế bào) Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng dong té bao ung thư LLC do trường Đại hoc Universit degli Studi di Milano của Italia cung cấp Tế bào được nuôi ở điều kiện 37C và 5% CO; trong môi trường Dulbeco Modifie (DMEM) (Gibco, USA) voi 10% huyết thanh phôi bò Fetal Bovine Serum (FBS), có bỗổ sung Penicilline, Streptomycine, Pyruvat, Glucosa
Quy trình đánh thức tế bào như sau:
Trang 34- Chuyến tế bào sang ống li tâm quay với tốc độ 300 vòng/phút trong 5
phút Sau đó, hút bỏ dịch nồi để loại DMSO (Dimethyl Sulfoxide)
- Chuyển tế bào sang chai nuôi, nhỏ từ từ từng giọt môi trường nuôi cấy
thắch hợp vào chai nuôi để tế bào bám thành một lớp dưới đáy chai nuôi Tế
bào mới đánh thức rất nhạy cảm, dễ bị chết nếu đưa vào môi trường mới quá nhanh
- Dé chai nuôi vào tủ ấm ở điều kiện 37 C và 5% COƯ
2.2.2 Phương pháp gây ung thư thực nghiệm trên chuột dòng BALB/c ề Phuong pháp gây ung thư bằng hoá chất
Hoá chất DMBA: Phương pháp gây u bằng hoá chất DMBA dựa trên phuong phap cua Boston University Institutional Animal Care and US Committee [30] 40 chuét BALB/c được chia làm 4 lô thắ nghiệm (mỗi lô 10 chuột)
Lô 1: Chuột uống 0,1 ml DMBA/con/lầntuần (tương ứng 0,5 mg/con/lần/tuần) bằng ống thông dạ dày trong 6 tuần liên tục
Lô 2: Chuột uỗng 0,2 ml DMBA/con/lần/tuần (tương ứng 1 mg/con/ lần/tuần) bằng ống thông đạ dày trong 6 tuần liên tục
Lô 3: Chuột uống 0,4 ml DMBA/con/lần/tuần (tương ứng 2 mg/con/ lần/tuần) bằng ống thông đạ dày trong 6 tuần liên tục
Lô 4 (lô đối chứng): Chuột uống dung dịch sinh lý bằng ống thông dạ đày
- Đề kiểm tra tốc độ tăng trọng, toàn bộ chuột thắ nghiệm được kiểm tra trọng lượng vào tuần thứ 6, 12, 18, 24, 30 cố định, liên tục trong 30 tuần kế từ khi bắt đầu thắ nghiệm
- Sau khi cho chuột uống DMBA lần cuối cùng, mỗi tuần kiểm tra
chuột 2 lần bằng cách xờ nắn hai bên bụng chuột để xác định ngày đầu tiên
Trang 35ề Phuong pháp gây ung thư bằng dòng tế bào ung thư (LLC)
Dòng tế bào ung thư LLC, được nuôi trong môi trường DMEM (có bố
sung 10% huyết thanh phôi bò, 1% kháng sinh) ủ ở 37ồC, 5% CO, khi tế bào
mọc tốt tiễn hành thu hoạch tế bào và tiêm vào bắp đủi chuột với nồng độ 2x10Ợ tế bào/con
Mô hình gây u trên chuột:
50 chuột BALB/c được chia làm 5 lô, mỗi lô 10 con
- Lô 1: Tiêm 1x10Ợ tế bào LLC (trong 0,1ml dung dịch sinh lý)/con vào bắp đùi - Lô 2: Tiêm 1x10Ợ tế bào LLC (trong 0,1ml dung dịch sinh lý)/con vào dưới da lưng - Lô 3: Tiêm 2x10Ợ tế bào LLC (trong 0,1ml dung dịch sinh lý)/con vào bắp đùi - Lô 4: Tiêm 2x10Ợ tế bào LLC (trong 0,1ml dung dịch sinh lý)/con vào đa lưng
- Lô 5: Lô đối chứng, chuột được tiêm 0,1 ml dung dịch sinh lý/con Theo dõi chuột băng mắt thường hàng ngày, xác định trọng lượng chuột và thể tắch khối u sơ cấp (khối u tại vị trắ tiêm) băng thước đo compa vào các
ngày thứ 5, 10, 15, 20, 30 kể từ khi tiêm Thể tắch khối u được xác định theo
công thức: V= 1⁄2 x a x bỲ (a: chiều đài khối u, b: chiều rộng khối u tắnh bằng mm) (Masaaki ligo va cong su, 1991)
Trang 36bào ung thư phỗi nên việc xuất hiện u phối là hoàn toàn bình thường và không được xem 1a di can
2.2.3 Phương pháp thứ độc tắnh cấp của hoat chat SBVN
Trong nghiên cứu này, 60 chuột BALB/c khoẻ mạnh, đồng đều về tuôi, khối lượng và được chia thành 6 lô (10 chuột/1lô) Bỏ đói 16 giờ trước khi cho uống hoạt chất SBVN Hoạt chất SBVN được cho uống một lần duy nhất ở các nồng độ: 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 va 100000 mg/kg thé trong (kgP) tương ứng với 6 lô thắ nghiệm Lô đối chứng (5con/lô) cho uống dung dịch dùng để pha loãng SBVN nông độ Iml/con/1 lần duy nhất Sau khi cho uéng hoạt chất 1-2 giờ, chuột được nuôi dưỡng bình thường trở lại (cho ăn, uống nước tự do), và theo dõi liên tục trong 72 giờ để xác định số con chết của từng
lô và xác định tắnh độc cấp của hoạt chất SBVN băng cách tắnh giá trị LDso
theo phướng pháp của Abrham (1978) và Turner (1965) LDso= X, - d/2 - d/n xXm;
Trong đó: LDso: liéu gay chét 50% déng vat thi nghiém n: số động vật sử dụng trong từng lô thắ nghiệm k: số lô động vật
m;: số động chết đếm theo từng lô trong 72 giờ d: khoảng cách giữa các mức liều
Xx: liéu 6 mirc d6 cao nhất
2.2.4 Phương pháp thử độc tắnh bán trường diễn
Nghiên cứu độc tắnh bán trường diễn được tiễn hành theo phương pháp của Abrham (1978), theo quy định của WHO và của Bộ Y tế Việt Nam về hiệu lực an toàn của hoạt chất có nguồn sốc tự nhiên
Trang 37e_ Nghiên cứu ảnh hưởng của hoạt chất đối với chỉ tiêu huyết học mắu của chuột khi cho uống bản trường diễn
30 Chuột khoẻ mạnh, đồng đều về tuổi và khối lượng được chia thành 3
lô, mỗi lô gdm 10 con Chuột được cho ăn và uống nước tự đo
+ Lô đối chứng: Cho uống dung môi 0,2 ml/con/24giờ là dung mơi hồ tan SBVN; + Lô thứ 1: Cho uống SBVN mức liều 500 mg/kgP liên tục trong 30 ngày; + Lô thứ 2: Cho uống SBVN mức liều 1000 mg/kgP liên tục trong 30 ngày;
Trước khi thắ nghiệm 2 ngày và sau khi kết thúc thắ nghiệm 30 ngày theo đỏi, mỗi lô chọn ra 1 con lay máu để xác định: Số lượng hồng cầu, bạch cau, tiéu cầu, lượng Hemoglobin, creatin và xác định hoạt độ của các enzyme transamiase (SGOT, SGPT) để đánh giá chức năng thận, gan theo phương pháp của Bermeyer (1974)
e_ Nghiên cứu ảnh hưởng của hoạt chất khi cho uống bản trường diễn đến sự tăng trọng lượng cơ thể của chuột
Số lô thắ nghiệm và mức liều dùng được bố trắ tương tự như ở thi nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của hoạt chất đối với chỉ tiêu huyết học máu khi cho uống bán trường diễn Chuột cho uống liên tục trong 30 ngày
Theo doi biéu hiện của chuột hàng ngày
Sáu ngày cân trọng lượng chuột một lần, để đánh giá khả năng tăng trọng lượng cơ thể chuột theo phương pháp của Abrham (1978)
e_ Nghiên cứu ảnh hưởng của SBVN khi cho uống bán trường diễn đối với các biến đổi giải phẫu ở gan, thận, chuột thắ nghiệm
Trang 382.2.5 Phương pháp xác định khả năng phòng và chữa ung thư của SBVN trên chuột được u thực nghiệm
Đề xác định một hoạt chất có khả năng phòng, chống ung thư, phải xác định 3 tiêu chắ sau:
1 Khả năng ức chế sự phát triển của khối u sơ cấp của hoạt chất; 2 Mức độ di căn của khối u khi được uống hoạt chất;
3 Khả năng kéo dài tuổi thọ động vật khi được uống phòng trước và uống sau khi đã có u sơ cấp so với đối chứng không được uống hoạt chất
Liều lượng SBVN sử dụng cho thắ nghiệm được xác định sau khi có được
liều độc cấp LDso (liều gây chết 50% động vật thắ nghiệm), theo đó liều sử dụng
sẽ thấp hơn liều độc cấp 10 lần Trong trường hợp không xác định được liều độc cấp thì liều SBVN sử dụng sẽ được tham khảo từ giá trị độc tế bào ICao (Inhibition concentration) kiém tra in-vitro trén té bao LLC Gia tri ICzso (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) Chất thử nào có ICzo < 20uM (với chất chiết thô, hoặc với phân đoạn hoá học) hoặc ICzo < 20uM với hoạt chất tinh khiết sẽ được xem là có hoạt tắnh gây độc tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư [71] Như vậy liều gây chết động vật là 20 lần so với liều gây chết tế bào
Sau khi chúng tôi thu được kết quả từ phương pháp gây u ung thư cho chuột bằng dòng té bao LLC nhận thấy; Khi str dung té bao LLC để gây ung thư trên chuột, các khối u xuất hiện sớm và đi căn đa dạng tới nhiều cơ quan nội tạng trong cơ thể với hiệu quả cao hơn so với gây u ung thư bằng hóa chất Vì thế, chúng tôi chọn dòng tế bào này cho các thắ nghiệm kiểm chứng khả năng phòng chống ung thư của hoạt chất SBVN
Chuột thắ nghiệm được gây u băng dòng tế bào ung thư LLC
Trang 39- Lô 1: uống SBVN liều 500mg/kgP/ngày trước 4 tuần sau đó tiêm té bao LLC
để gây u và vẫn tiếp tục cho uống SBVN thêm 6 tuần nữa
- Lô 2: uống SBVN liều 1000mg/kgP/ngày trước 4 tuần sau đó tiêm tế bào LUC
để gây u và vẫn tiếp tục cho uống SBVN thêm 6 tuần nữa
- Lô 3 : Tiêm tế bào LLC để gây u, sau khi có u sơ cấp, uống ngay SBVN liều 500mg/kgP/ngày liên tục trong 6 tuân tiếp theo
- Lô 4: Tiêm tế bào LLC để gây u, sau khi có u sơ cấp, uống ngay SBVN liều 1000mg/kgP/ngày liên tục trong 6 tuân tiếp theo
- Lô 5 : Tiêm tế bào LLC để gây u, sau khi có u sơ cấp, uống ngay SBVN liều 1500mg/kgP/ngày liên tục trong 6 tuân tiếp theo
- Lô 6: Tiêm tế bào LLC để gây u, sau khi có u sơ cấp, uống ngay SBVN liều 2000mg/kgP/ngày liên tục trong 6 tuân tiếp theo
- Lô 7: Tiêm tế bào LLC để gây u, sau khi có u sơ cấp, uống ngay SBVN liều 2500mg/kgP/ngày liên tục trong 6 tuần tiếp theo
- Lô 8: Tiêm tế bào LLC để gây u, sau khi có u sơ cấp, uống ngay SBVN liều 3000mg/kgP/ngày liên tục trong 6 tuân tiếp theo
- Lô 9: (đối chứng dương): chỉ tiêm tế bào LLC và cho uống dung dịch sinh ly là dung môi được sử dụng để pha SBVN trong suốt thời gian thực hiện thắ nghiệm
Như vậy, với thiết kế thắ nghiệm như trên, chúng tôi sẽ kiểm tra được khả
năng bảo vệ cơ thê của SBVN trước khi gây u bằng tế bào ung thu LLC ở các liều lượng khác nhau (lô 1, 2) Đồng thời, sau khi chuột đã xuất hiện u do bị tiêm
tế bào ung thư LUỤC, chuột được dùng SBVN như chất chữa trị hay ức chế khối u
ở các liều lượng khác nhau (lô 3, 4, 5, 6, 7, 8) Lô 9, sử dụng như là đối chứng dương cửa thắ nghiệm
Trang 40cộng sự (1991) đề xác định khá năng ức chế khối u của SBVN Thể tắch khối u được tắnh như sau:
V=ax/2
Trong đó: V: thể tắch khối u; a: chiều dài khối u; b: đường kắnh khối u 2.2.6 Phương pháp sử lý số liệu