Who 7 |
) 995 ÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO |
TRUONG DAI HOC TONG HOP HA NOI
THAM DO KHA NANG PHONG CHONG UNG THU"
- TRÊN MƠ HÌNH UNG THƯ THỰC NGHIỆM -
CỦA MỘT SỐ CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC Ở VIỆT NAM
(Mã số : B93.05.89)
Chủ trì : PTS sinh học TRẬÂN CÔNG VÊN
Trang 2Tên đề tài:
THĂM DÒ KHẢ NĂNG PHÒNG CHỐNG UNG THƯ
~ TRÊN MƠ HÌNH UNG THƯ THỰC NGHIỆM -
CUA MOT SO CHAT CO HOAT TINH SINH HOC © VIET NAM Số đăng ký: B93.65.89
Các cán bộ phối hợp nghiên cứu;
I— PTS sinh học Nguyễn Thị Qùy, Đại học Tổng Hợp Hà Nội 2— PTS héa học Trịnh Ngọc Châu, Đại học Tổng Hợp Hà Nội 3— PTS sinh học Ngô Thị Kim, TTKHTN và CN Quốc gia
4- PTS dược học Đào Kim Chỉ, Đại học Dược Hà Nội
5- Dược sỹ Lê Đình Bích, Đại học Dược Hà Nội
Trang 3MỤC LỤC
"Trang In nh _
2- Báo cáo tóm tắt kết qủa nghiên cứu 4
3~ Ảnh minh họa kết qủa thực nghiệm +
4~ Mẫu phiếu theo đối thí nghiệm -.- 40
5— Phụ lục 1 (Bai dang tạp chí) - - cài +4
6—Phụ lục 2 (Bài đăng tạp chí) ecceerierrrrrre 45
7—Phụ lục 3 (Bài đăng tạp chí) seeeeieeirrrrre on
8~Phụ lục 4, trang bià các luận án PTS và cử nhân sinh
Trang 4MỞ ĐẦU
= :
Chúng ta đang đứng trước ngưỡng cửa của thế kỷ XXI mà một trong những
nỗi đau nhức nhối của con người , qua hàng thiên niên kỷ, vẫn còn hiện diện như một
thách thức lớn của tự nhiên- đồ là bệnh ung thư Mặc đù trong những năm gần đây
SIDA đã nổi cộm lên như một bệnh dịch hiểm nghèo của thời dai, nhưng không phải vì
thế mà diện mạo của “tử thân „ng thư “ đã bị lu mờ
Mười năm trở lại đây, công cuộc tìm kiếm những chế phẩm tự nhiên từ nguồn
động thực vật rừng nhiệt đới và các đại dương để chống lại ung thư là sự quan tâm
hàng đầu của nhiều nhà khoa học Hiện nay trên thế giới đã có một nửa số dược phẩm
chống ung thư đo các nhà sinh-dược học lấy từ thiên nhiên theo các bài thuốc dân gian
cé truyén Tính đến thang 5 năm 1991, tại viện ung thư quốc gia Mỹ đã có tới 40.000
chế phẩm được khảo sắt hoạt tính kháng u trên chuột, nhưng trong đó chỉ có 36 dược
phẩm (0,1%) được cấp bằng sáng chế Chỉ phí cho các nghiên cứu này đã lên tới 4 triệu USD hàng năm
Đương nhiên, không phải một thuốc dùng tốt cho ung thư này thì cũng tốt cho ung thư khác, bởi vì tính dị biệt của ung thư là rất lớn Do vậy cần phải tìm những phương thuốc đặc trị cho từng loại ung thư của người Nhiệm vụ này thật không đơn giản
Dé tai “ Thăm đò khả năng phòng chống tung thư, trên mô hình ung thư thực nghiệm, của một số chất có hoạt tính sinh học ở Việt nam” trong 2 năm 1993-1994, đo
cấp Bộ quản lý là phân nối tiếp công trình nghiên cứu dài hạn của chúng tôi từ năm
1987 Trước đây chúng tôi đã thử được hoạt tính kháng u của 9 chế phẩm, còn trong 2
năm qua thử thêm được 6 chế phẩm Ở báo cáo này chúng tôi chỉ trình bày kết qua
khảo sát 6 chế phẩm đó cùng những kết qủa đào tạo NCS và cử nhân Sinh học mà để
tài đem lại
Hoàn thành được những nhiệm vụ này, chúng tôi chân thành cảm ơn Bộ giáo dục và đào tạo đã trợ cấp kinh phí, đặc biệt cảm ơn Phòng khoa học trường Đại học Téng hợp đã chăm lo, theo sát từng tiến độ của dé tài, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh học
đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về thời gian và cơ sở vật chất cho chúng tôi triển khai
nghiên cứu Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn tới các bạn đồng nghiệp gần xa luôn quan
tâm và cổ vũ chúng tơi hồn thành nhiệm vụ ,
Hà nội, ngày 15 tháng 3 năm 1995
Trang 5BẢO CÁO TÓM TẮT KẾT QUÁ VÀ TÌNH HÌNH THỰC HIỆN KẾ HOẠCH
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI CẤP BỘ NĂM 1993-1994
1— Mã số: B93.05.89 1.1- Tên đề tài:
THĂM DÒ KHẢ NĂNG PHÒNG CHỐNG UNG THƯ ~ TRÊN MÔ HÌNH UNG THƯ THỰC NGHIỆM - CUA MOT SO CHAT CO HOAT TÍNH SINH HỌC Ở
VIỆT NAM
1.2~ Chủ trì: PTS sinh hoc TRAN CONG YEN
2- Cấn bộ tham gia nghiên cứu:
2.1~ PTS sinh học Trần Công Yên ,Đại học Tổng Hợp Hà Nội 2.2— PTS sinh học Nguyễn Thị Qùy, Đại học Tổng Hợp Hà Nội 2.3~ PTS héa hoc Trinh Ngoc Chau, Dai hoc Téng Hợp Hà Nội 2.4— PTS sinh học Ngô Thị Kim, TTKHTNvà CN Quốc gia 2.5— PTS duge hoc Dao Kim Chi, Đại học Dược Hà Nội 2.6- Dượcsỹ Lê Đình Bích, Đại học Dược Hả Nội
3~ Mục tiêu và nội dung nghiên cứu:
3.1- Cay ghép đồng chủng (Homograft) u báng Sarcoma TG180 trên chuột nhất trắng
để làm mô hình ưng thư thực nghiệm
3.2- Thử hoạt tính kháng u của một số chế phẩm có nguồn gốc từ động, thực vật và
hóa chất điều chế từ các cơ sở ở Việt nam
3.3 Sưu tâm và thử sàng lọc một vài dược liệu và bài thuốc có tính kháng u theo y
_ học cổ truyền Việt nam
A— Tình hình thực hiện để tài trong 2 năm 1993-1994
4.1— Việc duy trì mô hình ung thư thực nghiệm:
~ Mô hình UTTN invivo : Sarcoma TG.180 trên chuột nhất trắng và chuột `
nhất đen thuẩn chủng C„.BL„ đã được chúng tôi gây tạo lần đầu ở Việt nam từ năm
1987 tại phòng thí nghiệm 'Tế bào—Lý sinh, khoa Sinh học, Đại học Tổng Hợp Hà Nội
Nhờ có kinh phí của để tài cấp Trường trước đây và cấp Bộ trong 2 năm qua mà đồng | tế bào ung thư nói trên vẫn được duy trì đến nay dui hai dang : tiém sinh trong nito
lang (—196°C) và khi cần thí nghiệm thì lại cấy vào xoang bụng của chuột nhắt trắng
hoặc đen _
- Dòng tế bào ung thư này, về hình thái hiển vi, siêu vi cũng như các đặc
điểm đi truyền, sinh lý, sinh hóa, lý sinh đã thể hiện đầy đủ các tính chất của một đồng
Trang 6~ Sau 7 năm giữ giống, phân lớn thời gian ở trong nitơ lỏng, đến nay dòng tế ' bào u báng nói trên vẫn còn đảm bảo đây đủ các yêu câu cho nghiên cứu ung thư bọc
cận lâm sàng :
: = “Trong 2 năm qua, chúng tôi đã sử dụng đòng tế bào u bắng Sarcoma
'TG.180 nói trên với bai loại thí nghiệm invivo va in vitro để kiểm tra hoạt tính kháng u
của 6 chế phẩm như sau:
+ MoHth,Cl, Khoa héa Dai hoc Téng hgp diéu chế
+ Cu HthisCl J
+Nọc rắn hổ mang toàn phan ˆ TTKHTN va CN Quốc gia tách chiết + Phân đoạn II nọc rắn hổ mang ]
+ Methionyl funtumin Hydrochlorid ] Đại học Dược Hà nội bào chế + Cao BYANKA
4.2— Tóm tắt kết quà thử hoạt tính kháng u của các chế phẩm: 4.2.1— Hai phức chất cuả các nguyên tố
Với thiosemicarbazon (MoHth,CI; CuHthisCl) đã được 'khảo sắt hoạt tính kháng u trên chuột nhất trắng Swiss mang u báng Sarcoma TG.180, với liễu tiêm (ip.)
tương ứng là 30mg/kg và 20mg/kg thể trọng, một lần, đã có hiệu quả như sau so với
đối chứng:
- Phức của Mo (II) làm giảm sinh khối u 37%
~ Phức của Cu (II) làm giảm sinh khối u 44%
Cả hai phức đều làm giảm thể tích dich báng ổ bụng 20% và làm giảm chỉ số
-_ phân bào ung thư từ 18 đến 30% (xem phụ lục 1)
'Tuy nhiên hai chế phẩm này đều không kéo đài thêm được tuổi thọ của chuột bị ung thư, mặt khác chúng gây môi mệt cho động vật thí nghiệm và chúng khó tan
trong nước
4.2.2- in hổ aja Naja) toàn phần :
Với liêu tiêm điều trị 0,3mg/kg x 2 lần, lúc u đang phát triển, tuy chỉ đạt hiệu lực ức chế sự phát triển của u 17,6% (tổng số tế bào ung thư) nhưng đã làm biến đổi sâu sắc các đặc điểm hình thái và tính chất điện động học của tế bào ung thư theo kiểu
tan rữa nhân, tan rữa tế bào chất, teo nhân và tan rữa các bào quan Làm giảm giá trị Š
điện thế tới 26% so với đối chứng (giảm nguy cơ di căn) (xem thêm phụ lục 2) NR toàn phần làm giảm khả năng phan bao ung thu 27%
Tuy nhién, phan ứng phụ của nọc rắn toàn phần b gây choáng và mệt mỏi cho
động vật thí nghiệm, nó ảnh hưởng đáng kể đến hệ thần kinh trung orig
Từ kết qủa trên, chúng tôi đã đi sâu khảo sát hoạt tính kháng u của phân đoạn
II từ nọc rắn toàn phần
4.2.3— Phân đoạn II của nọc rắn hổ
Từ nọc rắn hổ mang toàn phân tại TTKHTN và CN Quốc gia người ta đã tách
được phân đoạn I và II NRỊ chiếm tới 84% tổng số Protein của nọc rắn toàn phần,
trong đồ rất giàu Enzym Phospholipase A, gây độc cho tế bào nhiễu hơn so với NRI ; Trong các thí nghiệm invivo, chúng tôi đã thử 3 lều NRI nhưng 1 thấy liễu
Trang 7— Làm giảm sinh khối u 54%
~ Lầm giảm chỉ số phân bào ung thư 20%
Trong các thí nghiệm invitro (thực hiện tại viện vệ sinh địch tễ học trung
ương), chúng tôi đã chọn được liều 240ug NRII/1đt mơi trường ni cấy tế bào, đã làm
chết 94,3% số tế bào u báng 'TG.180 còn nằm trong địch báng, song với liều cao hơn - thì tỷ lệ tế bàoUT chết lại giảm đi một cách đột ngột Ngược lại, với tế bào ung thư đã loại bỏ địch báng (rửa— ly tâm) thì tỷ lệ chết của chúng tỷ lệ thuận với Hểu NRII tăng lên nhưng luôn thấp hơn trường hợp nói trên, không có đột biến
Về mặt hình thái học hiển vi, NRH đã phá hủy cấu trúc của bể mặt tế bio UT,
phần lớn tế bào bị trương phổng lên và đính kết với nhau thành từng cụm (xem ảnh) ' 'Trong tế bào chất xuất hiện nhiều thể mỡ (thoái hóa kiểu lipomatosis), nhân teo đặc lại
(thoái hóa kiểu karyopicnosis) (anh 2.),
4.2.4— Methionyl Funtumin Hydrochlorid_(Met-F-HCD
Met-T-HCIL là một được phẩm mới được tổng hợp tại phòng thí nghiệm Hóa sinh của trường Đại học Dược Hà nội Qua các thử nghiệm cận lâm sàng cho thấy nó
có tác dụng kích thích miễn dịch không đặc hiệu cùng một số tác đụng được lý khác Chúng tôi đã tiến hành hai thí nghiệm invivo trên mô hình u báng Sarcoma
TG 180
a- Chuột nhắt trắng Swiss mang u báng TG L80 tiêm ip cách nhật từ ngày đầu
cấy truyền u, với hai lều là 0,25 và 2,50mg/kg (xem phụ lục 3) Mổ chuột ở ngày thứ |
22
Kết qủa cho thấy ở lô chuột tiêm liều 2,50mg/kg có hiệu qủa tốt:
— Tỷ lệ chuột bị xuất huyết xoang bụng là 20% (đối chứng 50%)
— Lam giảm sinh khối u 323% so với đối chứng
~ Tăng số lượng bạch cầu/mmì gấp 3 lần so với đối chứng, trongđó tăng nhiều hơn cả là bạch câu trung tính
b— Chuột nhắt tring thudn ching BALB/C mang u bang TG.180 được chia
thanh 3 16: ‘
— Lô ï: cấy u bang, cho phát triển tự nhiên (đối chứng)
~ Lé II: cấy u bắng, ngày thứ 14 hút bỏ u, tiêm dung dich NaCl 0,9%
- Lô II: cấy u báng, ngày thứ 14 hút bổ u, tiêm Met-F-HCI với liễu
2,5mg/kg, cách nhật
Kết quả:
~ Tỷ lệ tái phát ở lô II và III là 100% (từ ngày 24 và ngày 27)
~ Lô II tái phát muộn hơn lô II 3 ngày
— Thời gian sống trung bình:
+ LồT: 19,33 ngày
+ Lô II: 32,80 ngày (tang 69,68%) + Lô III: 35,00 ngay (tăng 81,06%)
Nhu vậy, lô chuột ung thư được hút bỏ u và tiêm Met-F-HCI (lô HH) đã làm
Trang 8View 100%, re: 10%)
Ảnh 1: - Tế bao U bang Sarcoma TG-180 (đối chứng)
1 - Nhân tế bào; 2 - Giọt mỡ; 3 - Tế bào dang phan chia (Telophase)
Anli 2:- Té bao U bang Sarcoma TG-180 dudi téc dụng của NRỊI 1- Nhân tế bào bị teo; 2 - Màng tế bào biến đạng;
3 - Tế bào chất phồng rộp; 4 - Giọt ma tăng nhiều
3 ~- Tế bào đã bị chết:
Trang 94.2.5— Cao BYANKA
BYANKA là loại cao được chúng tôi chế biến từ một thảo mộc sẵn có của
nước ta, theo kinh nghiệm cổ truyền (xem 4.3), và cũng đã có phân được ghi trong bộ sách “Những cây thuốc và vị thuốc Việt nam” (Đỗ Tất Lợi, 986)
Theo kinh nghiệm cổ truyền thì bài thuốc này có công hiệu rất tốt trong việc
chữa xơ gan cổ trướng (sắc lấy nước uống)
Với mô hình u báng TG.180, chúng tôi hy vẹng bài thuốc này sẽ làm tiêu báng (am giảm, hoặc mất môi L trường sống đạng lông bình thường của tế bào ung thư
TG.180) để kéo đài thêm đời sống của động vật thí nghiệm
Cố hai mục tiêu được đặt ra:
a~ Khảo sát khả năng của cao BYANKA làm kéo dài thêm thời gian sống của chuột bị ung thư nguyên phát (đã được thực hiện)
b~ Tác dựng của cao chống tái phát u đốt với chuột bị ung thư đã được hút bỏ u (đang tiến hành)
Thí nghiệm khảo sát mục tiêu (a) được bố trí như sau: chuột nhất trắng thuần
ching BALB/C mang u bang Sarcoma TG1.80 chia thanh 3 16:
+ Lô I: Cấy u bang, cho phát triển tự nhiên (đối chứng)
+ Lô II: Cấy u báng, uống cao với liều 200mg/kg, cách nhật, uống ngay sau
khi chuột được cấy u (u tiên phát)
+ Lô IH: Cấy u báng, uống:cao với liều "200mg, cách nhật, uống từ ngày thứ 10 sau cấy u (u cường phát)
Kết qủa theo đõi thời gian sống thêm trung bình của chuột bị "nạ t thư nguyên phát thực nghiệm như sau:
+ Lô L 19,33 ngày
+ Lô H: 32,75 ngày (tăng 69,42%)
+ Lô II: 34,16 ngày ( tăng 78,22%) (thông sai khác rõ rệt.)
Như vậy, cao BYANKA đã có tác dụng làm chậm qúa trình phát triển u va
kéo đài thêm thời gian sống của chuột bị ung thư được điều trị gần gấp 2 lânso với đối
chứng (hin 1g ca «
Kết qủa này rất đáng được ghi nhận và cần phải tiếp tục khảo sát thêm các
Trang 10BANG TOM TAT KET QUA THU HOAT TINH KHANG U CUA CAC CHE PHAM CHỈ TIÊU CHẾ PHẨM |
MoHth,CI, | CuHthisc1 | NR NRII Met-F~HCI BYANKA Chuột thí nghiệm | Swiss Swiss Swiss Swiss Swiss,
BALB/C BALB/C
Loai ung thr bang | TG.180 TG.180 TG.180 TG.180 TG.180
TG.180
Liêu thuốc đàng | 30mg/kg (tiêm ip 20mg/kg | 0.3mg/kg | 750ug/kg | 2,5mg/kg 200mg/kg
(tiêm ip (tiêm ip 2 | (iêm ip 1 | (iêm ip cách |(uống cách 1 lần) 1 lần) lần) lần) nhật nhật) Mức độ giảm 37 44 17,6 54 32 - sinh khối u So với đối chứng (%) Khả năng 18 30 27 20 -_ "w
giảm phân bào ung thư so, với đối chứng (%)
Thời gian ; - - - ~ Tang 81% Tang 78%
sống thêm của (kết hợp cất | (không cắt
chuột được
bo u) bỏ u) điều trị so
Trang 114.3- Sưu tầm và áp dụng kinh nghiệm y học cổ truyền Việt nam
Trong kinh nghiệm dân gian và y học cổ truyền có nhiễu bài thuốc và dược
liệu có khả năng chống ung bướu, song chúng tôi đã định hướng đi tìm một bài thuốc phù hợp với mô hình u báng thực nghiệm Sarcorma 'TG.180 mà chúng tôi đã gây tạo
Trong các chuyến đi công tác điều tra cây thuốc tại Thanh hóa và Hòa bình,
dưới sự chỉ đạo của dược sỹ Lê Đình Bích (Bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà nội), chúng tôi đã sưu tầm được từ các lương y địa phương một bài thuốc có hiệu qủa
tốt trong việc chữa bệnh xơ gan cổ trướng
Trong bộ sách “Những cây thuốc và vị thuốc Việt nam” (Đỗ Tất Lợi,1986) đã mơ tả lồi thảo mộc này và cho biết các bộ phận của cây đều có thể làm thuốc với công
dụng khác nhau, ví dụ: có thể làm thuốc tẩy, thuốc gây sẩy thai, bôi vết thương để sát trùng, chữa ghẻ lở, thấp khớp, tê liệt Tuy nhiễn cần chú ý hạt của loài cây này, nếu
dùng với liều cao, có thể gây ngộ độc chết người
Chúng tôi dùng vỏ của cây này để chế biến thành cao BYANKA để thử
nghiệm hoạt tính kháng u báng của nó(xem 4.2.5)
Loài thực vật nối trên phân bố rất rộng rãi ở nước ta Khi chế biến: cứ 1800g
vỏ tươi sẽ được 310g khô và sau đó sắc cô đặc sẽ được 31g cao,
Những kết qủa thử nghiệm bước đẩutên mô hình u báng thực nghiệm
Sarcoma TG 180 cho thấy cao BY ANKA đã có khả năng làm chậm qúa trình phát triển u va kéo dai thém thời gian sống của chuột bị ung thư lên 78% so với đối chứng không
được điều trị (từ 19 lên 34 ngày)
Nếu được đầu tư nghiên cứu sâu hơn thì cao này sẽ là loại thuốc có nhiều hứa
hẹn đối với các bệnh nhân ung thư phát sinh cổ trướng
5- Những sản phẩm và công trình đã được công bố
3.1~ Sân phẩm:
— Mô hình ung thư thực nghiệm vẫn được đuy trì dưới hai dang: tiém sinh trong nitơ lông và trong xoang bụng chuột Đó là đồng tế bào u báng TG.180 được gây
tạo từ năm 1987
~ Cao BYANKA ở dạng chế biến thử, chưa thành thương phẩm 3.2~ Các công trình đã công bố:
Xuất bản:
— Ảnh hưởng của nọc rắn hổ mang (Naja Naja) đến một số đặc điểm của tế
bào ung thư báng nước Sarcoma TG180 :
(Tạp chí Sinh học tháng 12/1993, trang 36-39)
— Hiệu ứng ức chế sự phát triển của một số phức chất đối với vi khuẩn và tế
bào ung thư
(Tạp chí Di truyền học và ứng dụng số 2/1993, trang 46-48)
— Khả năng phòng chống ung thư của Methyonyl Funtamin Hydrochlorid trên mô hình ung thư thực nghiệm invivo
Trang 12Đào tạo:
— Gây tạo mô hình u báng thực nghiệm và thử tác dụng phòng chống ung thư
của một số chế phẩm tự nhiên và tổng hợp -
(Luận ấn PTS thứ 300 Đại học Tổng hợp của Nguyễn Thị Quỳ,1993)
~ Thăm dò khả năng kháng u của phân đoạn II nọc rắn hổ mang đối với u
bang Sarcoma TG.180 trên chuột nhắt trắng Swiss
(Luận văn cử nhân sinh học của Vũ Khánh Vân,1993) _
— Tác động của phân đoạn Ïï nọc rắn hổ mang lên tế bào u bang Sarcoma TG.180 invitro va invivo ; ,
(Luận văn cử nhân sinh học của Phạm Anh Thu,1994)
6— Nhdng muc tiéu chua thuc hiện được không, 7— Tình hình sử: dụng kinh phí trong 2 năm:
—.Năm 1993: được duyệt 3,64 triệu đồng, được cấp : đủ
— Năm 1994: được duyệt 5,00 triệu đồng, được cấp : đủ 8— Tình hình sử- dụng trang thiết bị ,
Dé tài chỉ sử dụng phòng nuôi động vật của khoa Sinh (có phần đồng góp
kinh phí xây dựng của đề tài) và kính hiển vi hai mắt của phòng thí nghiệm Tế bào —
Mô phôi, khoa Sinh học ,
Ngoài ra có mua một số dụng cự nhỏ và thuê một số xét nghiệm
9¬ Hợp tác quốc tế không
10- Thuận lợi, khó khăn, kiến nghị: ˆ
+ Thuận lợi:
— Cố kinh nghiệm quản lý và thực hiện để tài,
— Phối hợp nghiên cứu được với các cá nhân và các cơ quan khoa học có đủ tư
cách pháp nhân và có năng lực triển khai nghiên cứu
— Mô hình nghiên cứu ung thư thực nghiệm Sarcoma TG.180 đã ổn định và được sự tin cậy của các nhà chuyên môn bào chế thuốc kháng u
~ Kết hợp được nghiên cứu khoa học với đào tạo phó tiến sỹ và cử nhân khoa
học
+ Khó khăn: kinh phí của để tài còn hạn hẹp và cấp nhỏ giọt nên chưa triển
khai được nhiều thí nghiệm hơn
11- Dự kiến kế hoạch nghiên cứu tiếp:
~ Thử tác dụng kháng u phối hợp giữa Met-F-HCI và cao BYANKA (đặc
biệt là trên mô hình chống tái phát sau phẫu thuật cắt u)
Trang 13XÁC NHẬN VÀ NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA BAN CHỦ NHIỆM KHOA SINH HỌC Hà nội, ngày 15/3/1995 Chủ trì để tài — _ Cy yy
có - PTS Sinh học Trần Công Yên
XÁC NHẬN CỦA TRƯỜNG ĐHTH HÀ NỘI
Stem
Trang 14TRUONG DUTH HA NOI PHIEU THEO DOI THÍ NGHIỆM -10-
KHOA SINH HOC SốTN tù ngày dén Nhóm nghiên cúu ung thư Động vật "
Số /,UTTN Dòng ung thư Chế phẩm thử Số TT CÁC CHỈ TIÊU Lô 0 Lô l LON | Lom Ghi chu Đối chúng : 1 Số lượng động vật, Giói tính |_ _ _ " Joo a - 2 Trọng lượng trung bình (Gr.) ¬ - -
3 Ngày cấy truyền ỰT ee eee epee LJ ne - 4 Số tế bào ỨT cấy vào (x10) | | ¬ 5 Tinh trang TBUT lúc cấy | cm
6 Ngay thay r6u 2.2.20, vee - - -
1 Ngày, gio bất đầu điều ưị |._ | |
8 Phương thức đưa thuốc vào | _ _ |_-_ - -| - 9, Số động vật còn Sống ~ e 10 ' Ngày, giò mổ xét nghiệm cee ¬ - - 11 Tỷ lệ động vật có u(%) | - 12 Tình trạng tr _— we ee fol e 13 Khối lưọng u/con(ml) - 14 Chỉ số phát triển u(%) _ e - - 15 Mật dộ TBUT/ml(x109) | | -]- - - 16 Tổng số TBUT/u (xI109) | ~ ee -
17 Duong kinh T.binh TBUT (+) "—— 18.- Chỉ số mitose (MT %.) woe ee Pee web LLL fe ` Prophasce (%) | - | a e à - Metaphase Ca cac ke me me ==kE E - 8 AAnapnhase (9% ¬aa4 ~- - Telophase (2), _ TK - 19, Chỉ số phân bào khác (%) oe _ - 20 Ty lé TBUT bị chết (%),_ _„ _ ¬
21 Điểm đẳng điện TBUT _ -
22 Thé dién dong TBUT _ 23 Hàm lưỡng ADN (ng/10%T B) 24 Ham lượng ATRN (g/105TB), 25 Mật độ hồng cầu Aum} 26 Mật đô bạch cầu /mm3 : Neufrophyh (95) FEosmoplhw (%2) .] Tà Sa Basophyš (%) | -.| Limphosytes (%)_ 2 | | wee be - l Monocwes C%®%) | 21 Thể trạng động vat TN Jo -
28 Thi gian sống trung bình |
CHU TRÌ ĐỀ TÀI Handi nga thang nam 199
Trang 16-39 ~
46 ‘ , DTH & UD 86 2/1993
" Genetics and its applications No 2/1993 HIEU UNG ÚC CHE SY PHAT TRIEN CUA MOT SO PHUC CHAT
DOI VOI VI KHUAN VA TE BAO UNG THU
Trịnh Ngọc Châu, Trần Công Yên,
Thiosemicacbazit và dẫn xuất của nó là những
hợp chất có hoạt tính sinh học Một số chất đã được
dùng làm dược phẩm như thiosemicacbazon
axetylamino benzandehit dùng để chứa bệnh lao, thiosemicacbazon isatin chữa bệnh cúm, bệnh đậu ,
mùa và làm thuốc sát trùng /1/ Thiosemicacbazon
của quinon monoguanyl-hydrazon có tác dụng điệt
vi khuẩn gram dương /2/ Gần đây người ta còn thấy một số thiosemicacbazonat đồng có khả năng ức chế Sự phát triển của ung thư /3/ Dể đóng góp thêm vào
quá trình ủ”m kiếm các chất có hoạt tính sinh học,
đồng thoi để tiếp tục nghiên cứu một cách hệ thống các phức chất của kim loại chuyển tiếp với các phối tử trên có số thiosemicacbazit /4,5/ trong bài báo này Chúng tôi thông báo một số kết quả thăm dò khả nang
kháng khuẩn và khả năng ức chế sự phát triển của ung
thư đối với các phức chất của Cu và Mo 1 ~ Khả năng kháng khuẩn
i
Công trình này dước thực hiện tại phòng thí nghiệm
kháng sinh trường Đại học Dược khoa Hà nội
Chúng tồi đã tiến hành thử khả năng kháng khuẩn
Nguyễn Thị Quỷ, Vũ Dang Độ, Lê Chí Kiên
salicylandehit (Hzthsa thiosemicacbazon isatin ‘(Hathis), thiosemicacbazon axetylaxeton (Hathac) và 3 phức chất của Cu, 3 phức chất của Mo đối với 9 chủng loại vi khuẩn, trong đó có 4 chủng vi khuẩn gram dương, 5 chủng vi khuẩn gram âm Các dung dịch Mo (II) và Mo (V) không bền như các phức chất của chúng do vậy chúng tôi chỉ thừ đối chứng với dung môi và dung dịch CuCla ö cùng nồng độ Mẫu đối chứng với dung môi cho thấy dung môi
đinetylfocmamit không có khả năng kháng khuẩn
đối với tất cả các chủng loại khuẩn đem thủ do vậy
không ảnh hưởng tới hoại lực kháng khuẩn của các chế phẩm Việc thử nghiệm được tiến hành theo ` phướng pháp ghi trọng dược điển Việt nam /6/, Chất ˆ nghiên ˆ cứu ` được hoà tan trong
dimetylfocmamit rồi tẩm lên giấy ENs Giấy đã
tầm chất nghiên cứu được sấy khô, sau đó đặt trong môi trường dinh dưỡng thạch đã chữa vi khuẩn
trong hộp Petri Hộp được giữ trong tủ ấm liên tục
24” Cuối cùng lấy ra để đánh giá hoại lực khán £
khuẩn dựa vào bán kính vòng tròn kháng khuẩn Múc độ kháng khuẩn được đánh giá tưởng đối bằng số lưộng các dấu (+), chất không kháng khuẩn dấu (-) Kết quả thừ nghiệm được dẫn ra trên bảng 1
của thiosemicacbazi (HHh), thiosemicacbazon
Bang 1: Hoạt lực kháng khuẩn của các chế phẩm đã nghiên cứu
TT khuân BP BS SL Sta Ec Shi Ty Pro Pscu Chất J Hih - - 2 H2thsa +t ++ + + ++ 4 ++ + 3 Hathis oe + - A H2thác ++ < + - - i) Cu Hthsa.Cl +++ +44 ttt +++ + + + +++t ++ +++ +++ | a 7 Cu Hthac.Cl Cu Hth2 Cl2 $44 tự + : - 1 + c “ + + +44 + - @® % Mo204th2.2H20 Mo(Hth)3 C13 - + - ¬= + + + + + ++ of + + + 10 MoO2thsasa +44 +44 +++ +++ +++ +++ +++ ++ ++ 1 CuCI2 +++ ++ ‘ : - + he + -
BP: Bacillus pumillus (gram +) BS: Bacillus subtilis (gram +) SL: Sarcina lutea (gram +) Sta: Staphylococcus aurews (gram +) Ec: Escherichia coli (gram -) Shi: Shigella flexneri (gram -) Ty: Samonela typhi (gram -) Pro: Proteus anirabiris (gram -) Pseu:
Trang 17
DTH & UD số 2/1993
Genetics and its ap plications No 2/1993
Từ kết quả trên cho thấy các thiosemicacbazon và các phức chất được thử đều có khả năng kháng khuẩn
ö các mức độ khác nhau đối với các loại khuẩn đem
thử Dáng chú ý nhất là
gây mủ xanh) điều mà y học đang rất quản tam ,
Mức độ kháng khuẩn của thiosemicacbazit gan
như bằng không ð nồng độ đem thử, khi ngưng tụ với các họp chất cacbonyl, đặc biệt đối với các họp chất có vòng thöm hoại lực kháng khuẩn tăng lên rõ rệt Mức
độ kháng khuẩn của các phức chất cao hón hẳn của các
phối tử cũng như của dung địch muối kim loại Có ý kiến cho rang khả năng diệt khuẩn của thiosemicacbazon là do chúng tạo phức bền với các
kim loại cần thiết cho sự sống và phát triển của vĩ
khuẩn, từ đó làm suy yếu rồi đi đến tiêu diệt chúng f7! Cũng có ý kiến cho rằng các thiosemicacbazon có khả năng chữa bệnh vì chúng trung hoà các độc tố do ví khuẩn tiết ra /8/ Khi nghiên cứu khả năng
diệt khuẩn của các phức chất của Hth vôi Zn, Mn,
Ni các tác giả /9/ nhận thấy rằng hoạt tính kháng khuẩn của các phức chất lồn hon của các chất đầu Những kết quả thu được đối với việc thử nghiệm
trên phúc chất của Cu, Mo mà chúng tôi thu được
phù họp với tài liệu /9/ Điều đó cho thấy các giả
thiết về khả năng diệt khuẩn của thiosemicacbazon
cần phải có thêm đữ kiện thực nghiệm, :
Trong thực tế việc sử dụng trực tiếp các thiosemicacbazon để chữa bệnh bị hạn chế vì chúng
thíosemiCacbazoh salicylandehit và các phức chất của nó với Cu! và Mo ° đều có khả năng kháng loại khuẩn Pseu (irực tring
“139 ~-
47
thường độc và gay các phản ứng phụ không có lọi /S/ nếu các phức chất của chúng với các nguyên tố vi lượng cũng có khả năng kháng khuẩn ở mức độ
_ a0 hon thi phạm vì sử dụng các thiosemicacbazon để chữa) bệnh sẽ được mỏ rộng Các phức chất bền ạn chế độc hại của các thiosemicacbazon es 2> Thăm dỏ khả năng ức chế sự phát triển của ưng thư
Công trình này được tiến hành tại phòng thí
nghiệm Tế bào và Lý sinh, khoa Sinh học, trường Đại học Tổng hop Hà nội
Chúng tôi thăm đò khả năng ức chế sự phái triển các tế bào ung thư của hai phức chất đại điện la CuHthis.Cl va MoHth3.Cl Dong ung thư được
chọn là U-báng Sarcoma-TG 180 vì các tế bào ung thư này tồn tại tự do trong thể dịch như tế bào máu, do đó để theo dõi, đo đếm, v.v Thí nghiệm được
tiến hành trên chuột nhất trắng Swiss, có trọng lượng trung bình 20-220/coa do Viện VỆ sinh dich tế học cung cấp
Việc thử liều độc (LD/50) được tiến hành tren 8
lô chuột, mỗi lô 6 con với liều tiêm khác nhau Kết
quả 'cho thấy liều LD/50 đối với CuHth;s.Cl là
30™8/kg va MoHths.Cls £4 38,5™8/ke Tu do chon liều điều trị an toàn tướng ứng là 20”3/kg và 30”8/ks, Những kết quả chính lấy trung bình của 4
1ô thí nghiệm (mỗi Wo 40 con chu6t) dược trình bày trén bang 2
Bang 2: Kết quả thăm dd khả năng kháng u báng Sarcoma TG180 trên chuột nhất trắng Swiss
của phức Chất Mö(II]) và Cu(1I) L6 TN Đối chúng MolHth3Cl3 CuHithis.Cl Chỉ tiếu Số chuột thí nghiệm 40 40 40 Gidi tinh Duc Dye Duc “Trọng lượng trung bình 22 22z 22: Liều LD/30 + 38.58 kg 30ms/kg
Liều tiêm (ip) Dung dịch sinh lý 30™ 8 kg 20 Ekg
Trang 18-14-
Các kết quả thu được cho thấy rằng các chế phẩm đều có tác dụng ức chế đáng kể đối với sự phát triển
của khối u như làm giảm thể tích khối u, giảm mật độ
tế bào ung thư, từ đó làm giảm tổng số tế bào ung thư và chỉ số phát triển của u Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy chỉ số nguyên phân của các lô điều trị đều thấp hon các lô đối chứng, diều đó chứng tỏ các chế phẩm dã ức chế quá trình phân bào của u,
Tác dụng của các chế phẩm làm giảm chỉ số nguyên phân, nghĩa là làm giảm tổng số tế bào ung thu dang phan chia, đã làm giảm chỉ số phát triển của u so với đối chứng,
Đối với các pha phân chia của tế bào ung thư cả
hai chế phẩm dều làm tăng Anaphase so với đối chứng Điều đó chứng tỏ các phức chất đã ức chế giai đoạn này của quá trình phân bào Đây là giai đoạn chuẩn bị tách đôi tế bào có lẽ ö đây các chế phẩm đã làm cho các băng co rút 6 vùng xích đạo của tế bào không đạt tối sự phát triển hoàn thiện, gay khó khăn cho quá trình phân đôi tế bào
Kết luận
1 - Đã thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của thiosemicacbazit, thiosemicacbazon salicylandehit,
thiosemicacbazon isatin, thiosemicacbazon
axetylaxeton và 6 phức chất của chúng với Cu và Mo Trong đó có 10 chất tỏ ra có hoạt tính kháng
khuẩn ö mức độ khác nhau đếi với 9 chủng loại
khuẩn đem thử,
2 - Các phức chất đều có hoạt tính kháng khuẩn
cao hon so vói các phối tử tự do
‘ 3 - Khả năng ức chế sự phát triển tế bào u báng ) Sarcoma TG180 trén chuột nhất trắng Swiss của ) CuHithis.CI là 43,99%, của MoHth‡Ca là 36,8%,
`
: DTH & UD số 2/1993
Genetics and its applications No 2/1993 4- Kha nang dc chế phân bào ung thu Sarcoma
TG 180 của phức chất CuHithis CI là 18,2%, của
phức chất MoHitha.Clạ là 30,3% Các phức chất đã
kìm hãm phân bào ở pha Anaphase nhiều hón so
với các pha khác
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Ullmanns Encyklopadie der technischen
chemie 5 band “ Urban and schwarrenberg munchen-berlin ” 1954, p 241-242 2 ` Petorsen, G Naturwissenschaften, 41; 10 (1954) 3 Vũ Đăng Độ, Nguyễn Việt Huyến Tạp chí khoa học, Đại học Tổng họp Hà nội No 4, tr 1~L (1940)
4 Trịnh Ngọc Châu, Nguyễn Trần Tuấn, Vũ Đăng Độ Tạp chí khoa học, Đại học Tổng họp Hà
nội, No 1, tr 13-17 (1991)
5 Trịnh Ngọc Châu, Vũ Đăng Độ Hoá học và
cơng nghiệp hố chất, No 2, tr 15-18 (1992),
6 Dược điển Việt nam, Tap 1, tr 754 (1 971)
7 M.J Camphell Codrchems Rev., V15, No 213,279(1975) “` § Pr.H Kaufmann Medicamets de synthesea, Massonetcie 1957, p 728-729, 9 B Murzubraimob Koop Khimia T I, No 2, 1587 (1985) Domagk SUMMARY
Inhibitive effect of some complex compounds on the growth of the bacteria and tumor cells
Trinh Ngoc Chau, Tran Cong Yen,
Nguyen Thi Quy, Vu Dang Do, Le Chi Kien
The complex compounds of Cu and Mo with Hth, Hethsa; Hothis, Hathac have antibacterial activity on the
RP, BS, SL, Sta, Shi, Ty, Pre and Pseu with higher effect than free ligands
The complex compound of Cu (II) and Mo(III) expressed inhibit possibility on the growth of sarcoma TG180
cells to 43,99% and 36,8%
Người duyệt nội dung khoa học: PGS PTS, Nguyễn Kim Ngân
Trang 20
-16 ~
15 (4) : 36 - 39 Tạp chí SINH HỌC 12-1993
ANH HƯỚNG CỦA NỌC RẮN HỒ MANG (NAJA NAJA) DEN MOT S6 ĐẶC ĐIỀM CỦA TẾ BÀO UNG THƯ BẰNG NƯỚC SARCOMA TG-180
Từ năm 1947, khi nghiên cứu tác dụng của nọc
rắn, Tagvet nhận thấy rằng nó có khả năng làm chậm
lại sự phát triền của khối u, làm giảm hoặc mất hẳn khả năng di căn của ung thư, Braganca (1971) đã tách được từ nọc rắn hồ mang một số protein có tác dụng đặc hiệu lên mang tế bào ung thư và làm chết tế bào này nhưng không gây tồn thương cho các tế bào bình
thường khác [2] Đỗ Tất Lợi khi viết về công dụng của
noe rén cũng đã nêu rõ tác dụng chống ung thư của được phầm này [1]
Nhằm góp phần tìm hiều khả năng sử dụng nọc rắn hồ mang của Việt Nam vào việc điều trị
ung thư, bước đầu chúng tôi nghiên cứu ảnh
hưởng của nó đến một số đặc điềm của tế bào ung thy Sarcoma TG-180 trên mô hình u báng ở chuột
nhất trắng,
1 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chuột nhất trắng đòng Swiss 6 + 8 tuần, trọng
lượng trung bình 20 - 22 gam được gây ung thư bang nước Sarcoma TG-180 Phương pháp gây ung
thư cho chuột bằng cách cấy truyền (tranh
plantation) đã được miêu tả trong các công trình nghiên cứu trước đây của chúng tôi [3, 5}
Noc độc toàn phần của rấn hồ mang (Naja Naja) dạng tỉnh thề màu vàng nhạt do Trung tâm
Sinh lý - Hóa sinh người và động vật thuộc Viện
Khoa học Việt Nam sản xuất và cung cấp
Thử độc tính của nọc rắn lên tế bào ung thư
(TBUT) được tiến hành trong thí nghiệm in vitro như sau: TBƯT được lấy từ xoang bụng chuột
mang u báng 7 ngày sau cấy truyền Ly tâm loại bỏ dịch báng, pha loãng đề có mật độ 5 19 TB/mi
trong dung dịch PBS, ủ ở nhiệt độ 372C trong 30
phút Sau đó thêm đung địch nọc rắn toàn phần 36
NGUYÊN THỊ QUỲ, TRẦN CÔNG YÊN, NGÔ THỊ KIM, NGUYỄN THỊ KIM NGÂN
Trường đại học Téng hợp Hà Nội
pha trong nước muối sinh lý với các liều khác
nhau Ù tiếp 20 phút rồi nhỏ xanh tripan vào, soi
tươi đưới kính hiền vị đề xác định tỷ lệ tế bào chết (K%) theo công thức:
Số TB chết K %) _ TôngsốTB
Chúng tôi cũng đã xác định tỷ số K(%) đối với các TBUT không ly tâm loại bỏ dịch báng đề tìm hiều vat trò của nó trong quá trình gây tồn thương
cho TBUT bởi nọc rắn toàn phần
Xác định điện tích bề mặt TBUT, giá trị thế điện
động (Œ) và điềm đẳng điện của TBUT bằng phương
pháp vị điện di [4] Làm tiêu bản đấu quét và nhuộm
tế bào bằng hematoxyln - Eozin đề nghiên cứu sự
biến đồi hình thái cấu trúc bề mặt tế bào dưới tác
dung của nọc rắn trong thí nghiệm in vivo bằng
cách: tiêm trực tiếp nọc rắn vào xoang bụng chuột ( p) đã mang u báng 5 ngày, Hai ngày sau khi tiêm
rủồ chuột lấy tế bào nghiên cứu các chỉ tiêu đã
niêu trên, : “ 100%
11 - KẾT QUA VA THAO LUAN
1, Higu tng gay doc cua noc rin len TBUT bang
sarcoma TG-180:
Tìm hiều tác dụng trực tiếp của nọc rắn toàn phần đến TBUT trong các thí nghiệm invitro chúng tôi nhận được kết quả trình bày ở bảng 1
Kết quả chỉ rõ càng tăng liều nọc độc tỷ lệ TBUT
chết càng cao Có khoảng 50% TBUT bị chết ở nồng
độ 7,92 mg/mi, vA 100% tế bào bị chết ở nồng độ 14,52 mg/ml Khi bị chết 60 - 70% thì dung địch
trong ống nghiệm trở nên nhầy và đính Điều đó chứng tỏ trong nọc rắn có những tiều phần trực tiếp tác dụng gây tồn thương và làm vỡ các tế bào
Trang 21Bảng ! Sự phụ thuộc của tỷ lệ K {%) vào nồng độ của nọc rắn toàn phần STT Tỷ lệ tế bào chất K1) thí Liều nọc rắn / 7 nghiệm| (mg/ml) | Té bao dé | TE bao chua ly tam ly tam 0 0 3 4 1 132 4 “5 2 264 7 7 3 3,96 1%5 1# 4 528 22 24- s 6,60 38 46 6 7,92 41 “49 7 924 52 53 8 10,56 68 91 9 1188 89 100 10 1320 96 100 1L 1452 10 100 ˆ 12 1584 100 100
Khi ủ TBUT chưa ly tâm (còn có cả địch
báng) với nọc rắn chúng tôi thấy Hầu gây,
chết hoàn toàn (100%) thấp hơn (1188 g/ml)
so với thí nghiệm với tế bào đã ly tâm (4,52 g/ml) Từ những kết quả trên cho
chúng tôi có suy nghĩ rằng ngoài các tiều
phần có tác dụng trực tiếp gây tồn thương tế bào, trong nọc rắn còn có các thành phần
khác, khi kết hợp với dịch báng đã tạo ra
sản phầm trung gian thúc đầy nhanh quá
trình Cytolyse Nhận định “trên đây của
chúng tôi phù hợp với kết quả của Sachtbov D.N (1972), Lukelxon 1 I (1973) va Condrea (974), khi nghiên cứu cơ chế huyết tiên (Hemolyse) của nọc rắn (2) ˆ 2 Ảnh hưởng của nọc rắn đến hình thái, điềm đẳng điện và giá trị điện thế của TBUT : Điện tích bề mặt là một trong những
đặc điềm quan trọng của TBUT Bằng
phương pháp vi điện đi chúng tôi đã xác
định được bề mặt màng tế bào ung thư
Sarcoma TC-180 tích điện Âm trong môi
-47~
trường thề dịch của nó
_ Nguồn gốc điện tích bề mặt là do quá trình
phân ly các nhóm có cực nằm trong thành phần cấu trúc màng, bởi vì điện tích này phụ thuộc vào giá trị pH của môi trường Sự phụ thuộc này : được thề hiện ở kết quả trình bay trong bang 2 và đồ thị Khi giá trị pH môi trường <4,2 tế bào
ung thư tích điện đương, ngược lại khi giá trị pH > 4,2 TBUT tích điện âm Dịch báng trong xoang bụng chuột bị ung thư thưởng có pH trung tính đo đó TBUT tích điện âm Tại pH =
42 - 44 TBUT không chuyền động dưới tác
dụng của điện trường, chứng tỏ bề mặt TBUT
trung hòa về diện, Giá trị pH = 4,2 là điềm đẳng
điện của TBUT Sererma TG-180
Quan sát các tiêu bản tế bào đưới kính hiền vi quang học thấy nọc rắn đã làm biến đồi rõ rệt
hình thái tế bào Ảnh 1 và 2 cho thấy nọc rắn đã
làm biến đồi cấu trúc bề mặt tế bào Qua các
Trang 2238 “Ảnh 2: Dưới tác dụng của nọc rấn màng TBUT bị phồng lên và tách ra tạo
Trang 23-319~
Bdng 2 Ảnh hưởng của nọc rắn đến giá trị điện thế
(ảnh 3) có thề đó chính là kết quả của quá
trình nêu trên Hiện tượng này cũng là một trong nhiều kiều chết của tế bào ung thư, có
, thề gặp trong điều kiện bình thường, nhưng
ˆ rất hiếm Còn ở đây nọc rắn đã thúc thấy quá trình này tăng lên mạnh mẽ pH môi Giá trị - điện thế (mV) trường Đối chứng - Nọc rắn @00 g/kg) 22 462 + 13 40,6 + 2,6 32 35,6 + 2,1 33,9 + 19 42 0 -10,7 + 12 52 -33 5+ 2/1 210 + 2,0 62 416 + 2,2 -30,9 + 2,3 72 57,5 +12 462 16
Cấu trúc bề mặt tế bào thay đồi đã làm
thay đồi diện tích bề mặt tế bào Kết quả xác định sự phụ thuộc của giá trị điện thế vào pH môi trường dưới tác dụng của nọc rắn toàn
phần (đồ thị 1, đường số 2) cho thấy nọc rắn
đã làm xê dịch điềm đẳng điện của TBUT về phía axít (từ pH = 4,2 xuống pH = 3,6) Còn giá trị tuyệt đối của điện thế tại pH = 7,2
Cuối cùng tạo các "bóng" dạng mixen H] ở các tiêu
bản khác, chúng tôi quan sát thấy các nhân tế bào trần
dưới tác dụng của nọc rắn (à 46,2 mV} giảm đi so với đối chứng đà 57,50 raV)
Anh 3: whan TBUT đang trần 12 (VK 100% TK 10%)
Giá trị điện thế giảm chứng tô lượng các lên lạo thế (tạo diện tích} tìm bề mặt tế bào giảm đi, `
Sự giảm điện tích trên Đề mặt tế bào có một ý nghĩa sinh học quan trọng Theo, Trần Công Yên
1984 sự giảm này sẽ làm giảm khuynh hướng di tản
TB về phía không gian tự do, mà khuynh hướng đó lại có thề là một trong những nguyên nhân gây nên
sự di căn của ung thư :
Mặc đù nọc rắn toàn phan làm biến đồi rõ nét hình thái và một số đặc điềm lý sinh của tế bào sarcoma TG-180, nhưng không làm giảm chỉ số phát triền u một cách đáng kề (chỉ giảm 19,2%), đồng thời sây choáng và mệt mỏi cho động vật thí nghiệm Đó 1à đo nọc rắn không những ảnh hưởng đến tế bào
ƯT mà còn ảnh hưởng cả đến hệ thần kinh trung
ương của động vật thí nghiệm
(ÄX em tiếp trang 44)
Trang 24~ 2O ~ een
ANH HUONG CUA NOC RAN HO MANG
(Tiếp theo trang 39) - :
Vi vậy phân đoạn nọc rắn toàn phần, lựa chọn
các tiều phần có tác dụng chống UT mà không gay
độc hại cho cơ thề động vật thí nghiệm đang là hướng nghiên cứu được các tác giả quan tâm
TÀI LIỆU THAM KHẢO
L DS T&t Loi, 1991: "Những cây thuốc và vị
thuốc Việt Nam" Nhà XB KH và KT
2 Orlov M N., 1977: Yady zmet Medicina,
Moskva, 1977
3 Nguyễn Thị Quy, Trin Công Yên, 1992: Tác dụng của chế phầm HG75 lên sự phát triền u
báng ở chuột nhất trắng, Tạp chí DI truyền học và
ứng dụng, No 1,
4 Taricov B N., 1968: Biofizika Moskva,
5 Trần Công Yên, Nguyễn Thị Quy, 1992:
Một mô hình ung thư thực nghiệm Tạp chí DI
truyền học và ứng dung, No L
EFFECT OF THE SNAKE RENOM (NAJA NAJA) ON SOME CHARACTERISTICS OF | THE MALIGNANT TUMOR CELLS SARCOMA -TG 180
44
|
Trang 25¬29~
nước cần cung cấp dủ (lượng trò hôi mất trong một ca làm việc trung bình khoảng 3 - 4 lít) Có sự tăng
thoái hoá protein thổ hiện ở sự tang ham lugng Ure huy&téhanh, sự tăng này càng rõ nên không có sự mất
một lượng lớn mồ hôi như đã nói ở trên Hai chỉ tiêu Ure tăng và Creatinin giảm còn thổ hiện sự suy giảm chức năng hoá sinh của Thận Cũng như vây với chức năng gan, sự tang nhe AST va ALT ching t6 sy thoát khỏi màng tố bào gan một lượng nhỏ của 2 enzym này ra huyết thanh, sự tăng này lì không lớn nên không thể coi là viêm gan cấp nhưng rõ ràng là có tổn thương ở mức độ nhẹ
Các tổn thương và biến đổi hoá sinh thường là rất phức tạp , vấn đô này cần được nghiên cứu trong những nghiên cứu tiếp theo
KHẢ NĂNG PHONG CHONG UNG THU CUA METHIONYL - FUNTUMIN
HYDROCHLORID TREN MO HINH UNG THU THUC NGHIEM IN VI'V O
DAO KIM CHI-NGUYEN TH] HONG VAN(1)
TRAN CONG YEN-NGUYEN TH] QUY(2)
(1) Đại Học Dược Hà Nội
(2) Dại Học Tống hợp Hà Nội
MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, hướng sử dụng các chất điều hoà miễn dịch I#W kết hợp với các liệu
ˆ pháp khác đổ diều trị ung thu đã được nhiều nhà khoa Học quan tâm và đang có nhiều triển vọng Chế
phẩm ASLEM (Glycyl Funtumin hydrochloric) dã và dang dược nghiên cứu sử dụng trong diều trị ung thư
gan tiền phát, ung thư phổi và một số trường hợp nhiễm trùng sau mổ (1) Methionyl - Futumin (Met-F} là
dẫn xuất thứ 2 trong dẫy aminoacyl Funtưmin đã được tổng hợp và thử sơ bộ tác dụng kích thích miễn dịch không dặc hiệu (2) cùng với một số tác dụng dược lý khác
Trong thông báo này chúng tôi thăm dò khả năng phòng chống ung thư của Met-F - Hydrochlonla (Met-F,HCL) trên mô hình gây u báng Sarcoma TG.180
, ‘ NGUYEN LIEU VA PHUONG PHAP
- Nguyên liệu : Met-F.HCI do bộ mơn Hố sinh trường Đại học Dược Hà Nội tổng hợp, dược pha, thành các dung dịch có rồng độ 25 mg% va 2,5mg% trong dung dich sinh ly NaCl 0,9% :
¬ Phương pháp nghiên cut: Dựa theo mô hình gây ung thư thực nghiệm in viWo trên chuột trắng
Swiss mang u bang Sarcoma TG.180 dể theö dõi khả năäg phòng chống ưng thư của chế phẩm :
Chuột nhất trắng Swiss dực khỏe mạnh do Viện Vệ sinh dich t& học (VSDT) trung ương cung cấp, trọng lượng 23 - 25g dược phân chia theo bảng † gồm 5 lô, mỗi lô 6 con, được nuôi theo chế độ của Viện `
Trang 26-23- > “ , THU’ TAC DUNG DUDE LY CUA ME Hee ˆ ˆ «., sr brén Chuot nhat trang Swiss mang U bang T€.180
4 Mé hinh Thi’ nghiem:
Tey ME aa Cấy Ú - Trên MP Tiên 4E_.M¿ Chuột củ c pi
Coop, Sngay) Com Ong dy)
Cet U bang to) | oe
Pugay 14 ngay « 4.4 Khao sat —> # ch: tieu ; (mue 3) | 1 ' | s\ 4.2- % | 7 thé gean t ey S1 them - Lich trinh Tem thuse va Can: \ * 4⁄gấy ! “San 2 3 4 5€ 7 4 0 (0M Œ3 i5 (6 tý tổ tệ £t 2t ĐT, + + † +—+ ¬—+—t+—t qe tháng 6/94 ` 1 1 i > 3 › ach ẩ P, e@.-L.- e& e_pứđôe — is to Tia dae 16 a Tem M - '- đ ô ed , ° Sm +! il 16s + Can TL e _— 1 @— -e —— Of ee eee ee i sự i 1 a ed Ỷ a Bất đáuTN Cay u- Mã chuốt 5 Chia Lễ Chỉ nghiệm :
Mue ^ So’ | Sẽ T8uUT Lida bit MF TH, trợ 2c ⁄ Z v2 te ach Le chugt| ti cay cach mhat Mp ae” te Khao sat cae chi tea , L by Le phat aint u ? mẹ? | Chững1 | 6 | 108 o 9 ˆ xe$ 3- đnÀ kh§t H (Š.TBMT/4) Ÿ
‘ Bal bade oy eal 3
an| TH Te [6 | 10% [oes | 295° +~ 6 liều hỘy cán (ơm
nghtéin | Aig fn, JÍ § Sẽ “dàn back edit /ynm3? ——— LÝ (I) ly N.T 2 6 10 Ban bu 2,56 % 2750 tụ my Ky] g TAD bang “i8 vật Tw? 6 ~ Cong thite bach edi ? Ther ; 4 — Sion ching IT 6 4ô 0 0 Song ~ - eH ep
them TNID, 6 40§ 2.50" ? ẩ Jo hả gian ong Wein (1) 2 cud chest co” titin thuot ?
Trang 27
` -~84- Bằng † : Chia lô thí nghiệm
Muc dich ~~ LôTN Số chuột Cay u Liều tiêm ME Tổng liều MF
cach nhat dã tiêm Mổ xét nghiệm Ching | 6 106 0 — 0 TN ly 6 106 0,25mg/kg 2,75mg/kg TN 6 106 2,50 mg/kg 27,50,g/kg Kiểm tra thời Chứng II 6 106 0 0 : gian sống thêm TN.; 6 106 2,50mg/kg 27,50mg/kg
Chuột thí nghiệm được tiêm bắp vào 16h (thời điểm mà có giá trị chỉ số nguyên phân (MI) của tế bào u báng Sarcoma TG.180 đạt giá trị thấp nhất (4), tiêm cách nhật kể từ ngày thí nghiệm thứ nhất cho dấn khi kết thúc thí nghiệm Ở ngày thí nghiệm thứ 8, Chuột được cấy truyền tố bào u báng Sarcoma T.180 với liều 106 TB/1 chuột
® tiêu sau ; Sau 15 ngày cấy truyền, chuột ở các lô chung |, TN it va [2 được mổ để xét nghiệm các chỉ
:
8) Chỉ số phat trién cua u : (Growth Ratio - GR) & một chỉ tiêu quan trọng nhất để đánh giá hiệu lực kháng u của thuốc, Chỉ số này dược tính theo công thức sau : L
- GR= TT 100% T = Tổng số tố bào ung thư có trong 1 u ở chuột được
dự phòng hoặc diều trị bằng thuốc (Treatment),
c C = Tổng số tế bào ung thư có trong 1 u ở chuột dối chứng (Controi) Tổng số tố bào ung thư = số tế bào ung
thư /1ml x số ml dịch báng /1ư
b) Công thức máu : Xác dịnh số lượng hồng cầu, bạch cầu và côngthức bạch cầu : Các chỉ tiêu này cho phép đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm dối với máu đồng thời thăm dò sơ bộ Cơ chế tác dụng của chế phẩm lên cơ thể Chuột bị ung thư
Lô chúng II và lô TN.I!2 được nuôi tiếp tục dể theo dõi thời gian sống sót (thời gian Sống dược
tính kể từ khi thuổ‡ đuợc cấy truyền tế bào ung thư cho dến khi chuột chết) ’
Các thí nghiệm trên dược tiến hành tại phòng tthí nghiệm Tế bào và Lý sinh, khoa Sinh học -
Trường Dại học Tổng hợp Hà Nội
KẾT QỦA NGHIÊN CỨU
Các kết qủa nghiên cứu đã dược sử lý theo thán học thống kê và cónham khảo thêm một số kết
qủa nghiên cúu về lô trắng và lô dối chứng dã dược công bố trên thế giới cũng như trong nước (6,4) Kết
Trang 2844 -25- 3 Số động vat md XN 6 5 5 4 Tỷ lệ động vật có u 100% 100% 1005 5 Tỉnh trạng u 50% 40% 20% xuất huyết xuất huyết xuất huyết 6 Tổng số TB 975=46- 769 + 224,8 666,6 + 202,1 ung thư có trong ‘ n=6 n=5 n=5 tu (x10%) P**<0,001 P**<0,001 7 Chỉ số phát triển U (GR) 1005 78,9% 68,4% 8 SỐ lượng hồng cầu 9,754 5,70 + 2,06 6,05 + 0,65 6,68 + 0,62 trong 1mm® 1,1 n=5 n=5 n=5 (x10) P*>0,05 P*>0,01 P*<0,01 P**>0,05 P**>0,05 9 Số lượng bạch cầu 11,50 9,16 + 2,7 15,88 + 3,15 33,9 + 14,0 trong 1mm? 0,75 n=5 n=5 n=5 (x10 P*>0,05 P*<0,05 P*<0,05 P**<0,01 P**>0,01 Ty 8 100% 79,6% 138,1% 294,8% 10 Công thức bạch cầu Neutrophiles% 66 71256 74,8 + 5,6 75,5 + 3,2 n=4 n=5 n=5 P*>0,05 P*<0,05 P* <0,001 P**>0,05 P** >0,05 ~ Eosinphiles % 2 3,25 + 1,5 2,8 + 2,1 1,724 1,2 n=4 n=5 | n=5 P**>0,05 P* P**>0,05 P*,P**>0,05 - Lymphocytes % 27 19,25 + 3,8 19,8 + 8,9 20 + 1,6 n=4, n=5 n=5 P* <0,05 P* <0,05 P* <0,05 P**>0,05 P**>0,05 - Monocyres % 4 4+16 1,6 + 14,1 1,8 + 1,8 ` n=4 n=5 n=5 P*>0,05 P*<0,01 P*>0,05 P**<0,05 P**>0,05
11, Thé trang DV thi nghiém Suy sụt dần Suy sụt dần Suy sụt dần
12 Thời gian sống trung bình 19,2 ngày 19,8 ngày
(con cuối cùng của cả 2 lô
chết vào ngày thứ 22 sau
cấy truyền tế bào ung thư)
Ghi chú : P* - So sánh với lô trắng O (tiêu chuẩn quốc tế)
Trang 2926 — GR (%\ 100 100 +t it + 0
Lo thu lieu 2 Lo thu lieu 1 Lo doi chung
_Biéu dé 1: Chi s6 phat triénu bang TG.180
ở các lô chuột thí nghiệm - (P** - so sánh với lô chứng) 300 — 294.8 250 200 150 100 50
Lotrang Lo chung Lo thu lieu 1 Lo thu lieu 2
Biểu đồ 2: Tỏ lệ mật độ bạch cầu của các lộ chuột thí nghiệm so với lô trắng (qui ước giá trị lô trắng là 100%)
Trang 30-27-
BAN LUAN
Các kết quả nghiên cứu cho thấy Met - F,HOI, ở cả 2 mức liêu sử dụng ch chuột, đều có tác dụng
Úc chế sự phát triển của tế bào u, thể hiện ở GR = 78,9% và 68,4% (tương ứng với liều 0,25mg/kg và
2,5mg/kg P <0,001 so với đối chứng) Theo thang đánh giá hoạt tính kháng u (H.liokawa, 1989) (6) thì
Met-F.HCI liều 2,5mg/kg chuột đã có tác dựng kháng u với hoạt tính (+)
- Met-F.HCI ảnh hưởng không đáng kể dến số lượng hồng cầu (P** >0,05 - ở cả hai lô so với đối chứng), cũng như đến công thức bạch cầu (P** >0,05) nhưng dặc biệt Met-F.HCI đã là tăng số lượngbạch cầu trong cả 2 lô thử so với dối chứng (P** <0,01) thậm chí đã tăng gấp hơn 3 lần (ở lô dược tiêm liều cao) Diều đó chứng tỏ có mối liên quan ¡ö rệt giữa hoạt tính kích thích miễn dịch với khả năng
phòng chống ung thư của chế phẩm
So sánh thời gian sống trung bình của chuột dược điều trị bằng Met-F.HCI liều 2,5mg/kg với chuột
không được diều trị, chưa thấy có sự khác biệt rõ rệt giữa hai lò Có thể là do tốc độ phát triển quá mạnh của tố bào u báng Sarcoma TG.180 (sau 15 ngày cấy truyền từ 106 TB ban dầu đã phát triển thành
995.106 TB), Met-F.HƠI với tác dụng kích thích miễn dịch, chí có thể hạn chế mội phần tốc dộ phát triển
của u, trong khi đó sự tăng sinh mạnh mẽ của u đã làm Suy yếu nhanh cơ thể chuột và dẫn ciến cái chết
VI vậy, để có tác dụng lâm sàng thực sự kéo dài thời gian sống của những cá thể mắc ung thư , Met-F.HCI
cần dược diều trị kết hợp với các thuốc diệt tế bao ung thu, hoặc phối hợp với các biện pháp diều trị khác
(ngoại khoa, vật lý trị liệu ) hoặc có thể phối hợp cả hai Diêu này có lẽ phù hợp hơn với nguyên lý sử
dụng các chất kích thích miễn dịch trong thực tế lâm sàng
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Vũ Ngọc Thuý, Tào Duy Cân
Sử dụng thuốc và biệt dược, NXB Y học Hà Nội 1993, 167
2 Dào Kim Chỉ có
Tổng hợp Funtumin một số peptidyl Funtimin và thăm dò tác dụng kích thích miễn dịch không
dặc hiệu của chứng : ‘
Luận án phó tiến sĩ Dược học, Hà Nội 1994 3 Tian Công Yên, Nguyễn Thị Quỳ
M$‡Mô hình ung thư thực nghiệm
Tạp chí Di truyền học và ứng dụng, số 1 - 1992 4 Nguyễn Thị Quy
Gây tạo mô hình M bắng thực nghiệm và thử tác dụng phòng chống ung thư của một số chế
phẩm tự nhiên và tổng hợp
Luận án phó tiến sĩ khoa học Sinh học, HÀ Nội 1993
5 Dobresco D., Farmacodinamie, Budarest 1967 ,
6 lokawa H øl al
An antitumor principle from Euphorbia lathyris,Planta Medica (1989) 55
Trang 31BO GIAO DUC VA DAO TAO
Trang 32Công trình này được hoàn thành tại phòng thí nghiệm Lý sinh - Tế bào,
tổ bộ môn Động vật Thực nghiệm, Khoa Sinh học, trưởng Dại học Tổng
hợp Hà nội
Tập thể hướng dẫn khoa học:
PGS PTS Nguyễn thị Kim Ngân
PTS Trần Công Yên : her kg ` : = ag Hoy Chutich Hiidéig: Gs Dham Thuy Liéw ( Hong Thue ) ~ 2 Lá Người nhận xét1 Œ€ BC Berk van Wao uP! nas ( 1” 9z kec v Hann’) `
Người nhận xét 2 Gs PR: Le 2uang Long)
| - ( Tabdy Bas re Su phary T tense
Cơ quan nhận xét /2# PYS Mes “Chee bhoa >
( Bent linn kk)
Luận án được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án nhà nước
vào hồi đ giả 30 ngày 2€ tháng đỊ năm 199ÉƑ,
Địa điểm: Trưởng Dại học Tổng hợp Hà nội
Có thể tìm hiểu luận án tại:
* Thư viện Quốc gia
* Thư viện Trường Dại học Tổng hợp Hà nội
* Thư viên Khoa Sinh học Trưởng Dại học Tổng hợp Hà nội
Trang 33-29~ TRƯỜNG ĐẠI HỌC TỔNG HỢP HÀ NỘI KHOA SINH HỌC Pi Khanh Van
THAM DO KHA NANG KHANG U CUA
PHAN DOAN II NOC RAN HO MANG ĐỐI VỚI U BÁNG SARCOMA TG - 180 TREN
CHUỘT NHẮT TRẮNG SWISS
(Luận văn cử nhân sinh học)
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số | 04.01.11.11
Người hướng dẫn: PTS Trần Công Yên
KS.Neuyén Thi Quy
Trang 34
- 80—
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TỔNG HỢP HÀ NỘI
KHOA SINH HỌC
PHẠM ANH THƯ
TAC DONG CUA PHAN DOAN II NỌC RẮN _
HO MANG (NAJA NAJA) LEN Te BAO U BANG
SARCOMA TG-180 INVITRO VA INVIVO
LUAN VAN CU NHAN SINH HOC
Chuyén nganh :Céng nghé sinh hoc
Mã số : 04 - 01 -11-11 Người hướng dẫn : PTS Trần Công Yên
PTS Nguyễn Thị Quỳ
Trang 35- 31—
SUMMARY
STUDY ON THE ANTICANCER POSSIBILITY OF SOME VIETNAMESE BIO- ACTIVE PRODUCTS
TranCong Yen, Nguyen Thi Quy, Trinh Ngoc Chau,
Ngo Thi Kim, Dao Kim Chi, Le Dinh Bich
Ha noi University, 1995
The Swiss white mice and BALB/C mice carring TG.180 ascitic tumor were
used for this aim ‘ ; ‘ ‘
The curative value of six bioactive products were estimated In comparison
with untreated mice, the treated mice have shown following results:
The complex compounds of Mo(III) and Cu(II) reduced 37% and 44% the, Growth Ratio of tumor Similarly, snake venom: 17.6% ( include a heavy toxicity and cytolyse on the tumor cells, reduced 20% electrokynetic potential of the tumor cells); - second fragment of snake venom: 54%; Methionyl— EFuntumin- Hydrochlorid (Met+—
HCL):32%
In the other hand, survive of animals treated with Met-F-HCI was increased to’
81% (post—surgical), similarly BY ANKA balsam ( an extract from plant): 78% (without
Trang 36
PHIẾU ĐĂNG KỶ KẾT QUÁ N GHIẾN CỨU KH- CN
| " mei “ZZZ2x5y ác 442 phony “26772 the tis imo
\ Ainth tre 0? Viitaam - Mã số: s B93.05.89 I ' a C6 quan chủ tì đề tải Khoa Sank Tabi Bar Ady đứa xu Dia chi Sỏ diện thoại 584 73 CÓ quan quản lý đề tái | Bec Gun clue va Bao tae ! Địz chỉ ' : Số diện thoựi ‘Vong kinb phí thực chí x 1000 d hoac , usr
Troug do: : “ul ngân sách nhá nưọc - ¬ x 1000 đ hoặc Usp - kinh phicue Be (Tins; ` ŸêOO
xiv hoặc ( *% 7-80 UuSb ~ vây tin dụng / i x 1000 d hoặc Usfa ~ vỐn tự có » 1000 ở hoạc USD > thu hoi : x 1000 4 hoac Usb Thoi gian Lar dau ,, ‘Thoi gian nghiên cứu oe 4 thang ony „hoi gian kết thúc
“Tên các cản bộ phối hợp nghiên cứu:
—-ằ-= ig Yen, Bahr Toig Ady Handy | thd Ke” +- Prs Sth toe WV gry Goa 22622 05 ?
8 LIS Hod hie ee «226 0a 2S SO dang ky đè Weis
ngây
* PH tu? dựa Ag tea Kin, 5 TT MATIN “e 7 phe ta
5 £m Delt tone Os Kew tbs , Det dire Dude 22221
6 PF ke Bas Z4, Bas der Dilte Ha Handi nn a
Trang 37
Tốm tối kết qửa nghiển cứu ` 744492 kẹ« tae tips 2 6n a behaty a _
A Ate pled tals og ine Sarcome Te 49.0 2 Hep rai A989 3
wee ahah (ny EB hat EMail tha Ka
2 Plad ching Mo Ht 3 Cbs vB! hats Hite ip am PHLaS 20°9 flcg thet “Win 22145 21 Ard debe! 0 Be 37 Avis Li AB ehabey , "— Lap te hy te 1h
?- phad bs Cue H thin CE h7 ° bis đề e tp mgt tas 8G the ‘beng Aa hain, gird, peep lebih OE #7 te MAR obatl pi BI yliins boo tury Und 2/1 be Nex nn dea” many hij Majo tone ps ti gp Stato nig twig
fees Li odin gainin Din beh? A 49,6 fo e2, 2Á hing Mes Ba? Ades dae ene stad
UT ey hn Đế ae ig the girs pbrins tops £720 p phat Min tiy mig THUT 267
5 Gedy Aris EL ted ne 2d 2 penag (WRIT), Titre Ny, mot LAS FSO /Ky tains gincs
rood bebint WA SYD y giants he 25 ypteaiy done tong ha? 20 Je - +
“- Af<engr€ Funtiaminn Hy dro thdanid (Mote Ha)» OL EES 2, 7/42 ae
‘5
tates pinks Died dheid u 9220 Taky def edit (4£ ip 24a 90 wh A Heda seat, wig
hat this the De dots Mbit wae eo WEE we RY 1621 3/27 2 2/2 015.2 xo Cas BYANKA 47 chide Gà 260% hi Ui! 23 4 dehy Thee led ry S tay Xổ” Z4
ch ệt se Ul uring carp MGA 20 BY 7 ate has has’ tod 24v HÀ cọ Hết ty, Ud Lee 782 Ba IAS bg HIBS Tek (L849, a apiy Hi 3, 16 gig) (eddy ct
i
i
Kién nghị về quy mê vũ dói tưởng áp đụng l:ết quả nghiên cửu
Qua vide tod? teint 2 lho «6-4 hi phi 2 hie,
te dụ kủy aP 461 duc Ra 4a? “#2 re O Met FHA tas BYANKA
ate? Hhus hn* Lit y.4 uy ván là, ty VI My vg tis pg nage OE
ta Mids gun BS, the Wishes aig cay cé 4y sư 4,442 xted Co? kuMý « Fba noe, Mga 15 tesa 3 Main 49957
Chức vụ Chu nhiém dé tai ¡ Tha trưởng co quan Chủ tịch Hội Thủ trưởng có quar
v Lo chủ trì để tài đồng đảnh giả chỉnh thức tuân lự đề lài
_— “ ˆ =- Ệ e ¬ 2 ^
Hệ về tên Chin (2 Yen dag Ura V2- | LàVx già
Học vị PIS Simh hoe Pas roi
Ký tên