Nghiên cứu khả năng ứng dụng Lectin và các chất có hoạt tính sinh học khác từ nguồn động vật trong chuẩn đoán một số bệnh ung thư và nhiễm trùng ở ngườ i

ĐẠI HỌC Q UỐ C GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC K H O A HỌ C T ự NHIÊN ĐỂ TÀI: NGHIÊN c ú u KHẢ NĂNG ÚNG DỤNG LECTIN VÀ CÁC CHẤT CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC KHÁC T Ừ N G U ổ N ĐỘNG VẬT TRONG CHẨN ĐOÁN MỘT s ố BỆNH UNG THƯ VÀ NHIỄM TRỪNG Ở NGƯỜI Mã sỏ: QT- 98- 10 Chù trì (lề tài: nùi Hiương Thuận Các rán hộ tliam iỊÍo: - Nguyễn Hạnh Phúc - Cung Thị Tý BÁO CÁO TÓM TÁT 1.Tên đề tài: Nghiên cứu khả ứng dụng lectin chất có hoạt tính sinh học khác từ nguồn động vật chẩn đoán số bệnh ung thư nhiễm trùng người Mã số: QT- 98- 10 CK1Í trì đề tài: PTS Bùi Phương Thuận 3.M ục tiêu nội dung nghiên cứu: -Tách tinh chế lectin, số chất có hoạt tính sinh học khác (proteinaz, chất ức chế proteinaz ) rừ động vật -Sử dụng chế phẩm thu vào nghiên cứu ứng dụng miễn dịch học, nhằm tiến tới cliỊẩn trị số bệnh hiểm nghèo người 4.Kết đạt được: -Đã thu thập mẫu sam Tưc.hypìeus trident atus từ vùng biển Sầm sơn (Thanh hoá) Từ huyết sam tinh chế lectin nhờ kỹ thuật sắc ký lực cột ỊgGsepharose 4B Chê phẩm kiểm tra độ tinh xác định khối lượng phân tử bãng polypeptit bàng kỹ thuật điện di gel polyacrylamit có SDS điều kiện có chất khử Các kết nhận cho thấy chế phẩm lectin giải phóng khỏi nhiều protein tạp đạt độ tinh cao, cấu tạo gồm ba phần đơn vị tương ứng khối lượng 27, 68 72 kDa -Đã sử dụng lectin sam làm kháng nguyên gắn thử nghiệm sở kỹ thuật ELLA (xét nghiêm miễn dịch liên kết enzym-lectin) mẫu huyết người Chế phẩm lectin sam (cũng lectin dạng thơ) biểu thị tính đạc hiệu tương tác vói globulin miễn dịch (kháng thể) lớp IgG không nhận biết IgA Đã tiến hành thứ nghiệm khả tiên lượng bệnh lectin sam dựa tính đặc hiệu tương tác Các xét nghiệm tiến hành theo nguyên tắc: thay đổi hàm lượng thành phẩn cua IgG huyết trạng thái sinh lý khác coi dấu hiệu cận lâm sàng sử dụng để chẩn đoán biểu bệnh i Đã cộng tác với sở y tê (các Bệnh viện Viện Nghiên cứu Trung ương) để thu thập xử lý mẫu huyết người khoẻ mạnh bìiứi thường (mẫu đối chứng) mẫu huyết bệnh nhân số bệnh thuộc loại nan y (mẫu bệnh phẩm), dùng cho xét nghiệm miễn dịch học Việc sử dụng chế phẩm lectin sam xét nghiệm huyết để nghiên cứu ung thư cho thấy: hàm lượng IgG ỏf người bị bệnh ung thư gan ung thư máu khơng có biến động khác thường, cịn người bị ung thư vú có giảm Khi sử đụng lectin sam thơ phát có giảm nhẹ hàm lượng IgG huyết bệnh nhân ung thư máu Trong xét nghiệm huyết để nghiên cứu bệnh nhiễm virut sở sử dụng chế phẩm lectin sam, kết cho thấy hàm lượng IgG bệnh Iihân bị viêm não giảm 18%, bệnh nhân bị sởi tãng 27% Triển vọng sử dụng lectin sam tliay cho kháng nguyên virut sởi dể gắn kỹ thuật xét nghiệm thường quy phịng thí nghiệm hoá siiih miễn địch Trong nghiên cứu bệnh tự miễn, việc sử dụng lectin sam thô cho phép phát tăng mạnh hàm lượng IgG so với bình thường người bệnh lupus ban đỏ (30%) người bệnh viêm thận (26-28%) Kết thu phù hợp với chẩn đoán bệnh viện dựa xét nghiệm hoá sinh phức tạp tốn hơn, Các kết nghiên cứu cho thấy khả sử dụng lectin sam tinh chế định lượng IgG, phục vụ cho nghiên cứu liệu pháp miễn dịch, dùng để chẩn đoán tiến tới chữa trị sô bệnh hiểm nghèo người - Đã hoàn thành gửi báo để đãng tạp chí Di truyền học ứng dụng Bài nhận công bố số 4/1999 -Đã hướng dẫn ba sinh viên làm iuận án tốt nghiệp Hai số (Hồng Nhật Sơn Trần Quỳnh Hoa) bảo vệ đạt loại giỏi (9 điểm) Sinh viên thứ ba (Nguyễn Trọng Tuệ) có báo cáo đoạt giải ba Hội nghị Khoa học Sinh viên Khoa năm 1999, hoàn thành luận án bảo vệ vào năm 2000 S.Tình hình sử dụng kinh phí dề tài: Kinh phí cấp 000 000 đ Kiiih phí chi 000 000 đ Trong đó: 300 000 đ Cơng tác phí Thuê hợp 800 000 đ Chi phí hoạt động chuyên môn 400 000 đ Đánh máy, chụp tài liệu 180 000 đ Quản lý phí sở 320 000 đ Tổng cộng 000 000 đ Co' q u a n quiỉn lý (lề tài III OUTLINE REPORT Ỉ.Nam e o f subject: Study on the possible application of animal lectins and other biologically active substances in the diagnoses of some human cancers and infection diseases Code registered: QT- 98- 10 2.Subject manager: Dr Bui Phuong Thuan 3.()bjective and subject matters of study: -Isolating and purifying the lectins and other biologically active substances (proteases, proteinase inhibitors ) from animals -Using these substances in research for the diagnoses and treatment of some serious human diseases 4.Results -The achieved: lectin from Vietnam horseshoe crab ('Tơchypìeus h identatiis) hemolymph was purified by the affinity chromarography on IgG-sepharose column -The lectin purified (as raw lectin in native hemolymph) was shown to interact specifically with immunoglobulins (antibodies) of class IgG, while was not bound to those of class IgA For this specificity, the lectin was used as antigen ill the Enzyme- Linked Lectinosoi bent Assay (ELLA) ill Older to screening IgG ill human serum The change ill the content and composition of these antibodies in different physiological conditions can be used as clinical index for diagnosis of seases For the cancer study, the use of purified lectin in the assays showed rhat the IgG content in the liver cancer and leukemie serum was not changed, while that of breast cancer serum diminished The assays with raw lectin showed some IgG reduction in the leukemie serum For Ihe study on virulent diseases, the use of purified lectin revealed the 18% reduction of IgG content ill the cases of encephalitis and the 27% increase of that ill the cases of measles The study on autoimmune diseases with raw lectin showed that the content of IgG increased on 30% in the cases of Systemic Lupus Erythematosus and 26-28% in the cases of kidney inflamation The obtained results showed the possibility to use Tơchypìeus ti identatu.s lectin in the purification and the quantity determine of IgG for the reseach and immuno-therapy purposes, in which it will serve as a tool in diagnosis and treatment of diseases Subject M an a ger Bill P h ito n g T h u a n V MỤC LỤC Trang Mở đ ầ u í Nguyên liệu vàphương pháp '2 Kết thảo luận ổ Kết l u ậ n 2Ẵ Tài liệu tham khảo Phụ lục vi MỞ ĐẦU Việc nghiên cứu cấu trúc, chức vai trò chất liên kết đường màng đẩy mạnh Iiãm gổĩi nhờ sử dụng lectin [4J Lectin protein glycoprotein có hoạt tính sinh học, phân bô phổ biến sinh giới Tuy khơng có nguồn gốc miễn dịch, lectin lại có khả liên kết đặc hiệu với loại đường hợp chất chứa đường ln có bề mặt (ê bào, gây ngưng kết nhiều loại tế bào [3], Cho đến nay, chức sinh học lectin chưa làm sáng tỏ hoàn toàn, tiếp tục nghiên cứu Người ta thu nhiều chứng cho thấy lectin có vai trị hảo vệ, bảo đảm tính chống chịu bệnh truyền nhiễm nhiều loại thực vật, làm chất dự trữ có vai trị vân chuyến chất dự trữ, làm cầu nối vi khuẩn cố định nitơ với thực vật [5], đóng vai trị quan trọng hệ thống tiền miễn dịch, bảo vệ thể động vật [8], Lectin có lliể lliam gia điều chỉnh nhiều chức nâng nhận biết tế bào quan hệ tương tác sinh lý tế bào thể, tê bào vật vật ký sinh động vật thực vật [3], Những ứng dụng lectin (long nhiều lĩnh vực nghiên cứu sinh học V học ngày phong phú [5] Đề tài:” Nghiên cứu nâng ứng dụng lectin chất có hoạt lính sinh học khác từ nguồn dộng vật chẩn đoán số bệnh ung thư nhiễm trùng người” nhằm góp phần vào việc điều tra khai thác nguồn tài nguyên động (hực vật Việt nam Trong số lectin tách từ sam biển Tưvhypìeus tridentatus Lecỉdì nhận biết đặc hiệu axit sialic (là thành phần đường quan trọng phổ biến cùa màng tê bào) gamma globulin (kháng thể lớp IgCi, thành phẩn quan trọng cúa hệ thống miễn dịch clịcli thể người động vật bậc cao) [I 8], Đay tính chất q giá CỊI) nghiên cứu Mục tiêu đề thi tinh ch ế lectin sam nghiên cứu ứng dụng khả liên kết đặc hiệu với IgG biểu lam sàng số bệnh nghèo người, nhằm phát tiến lới chẩn trị bệnh N G UY Ê N LIỆU VẢ PHƯƠNG PH ÁP NG H IÊN c ú t i Nguyên liệu: -Sam 0Tachypìeus tridentưtus) đánh bắt vùng biển Sầm sơn- Thanh hoá Máu sam sau lấy để đơng nhiệt độ phịng, ly tâm 000 vòng/phút 20 phút, loại tế bào máu, thu huyết thanh, cho chất chống khuẩn bảo quản 4nc -Hồng cầu người thuộc nlióin A, B, o Viện huyết học truyền máu trung ương cung cấp -Huyết người bình thường (khoẻ mạnh, không mắc bệnh ung thư truyền nhiễm ), huyết người bệnh lupus ban đỏ, bệnh suy thận, ung thư máu ác tính Phịng Miễn dịch, Bệnh viện Bạch mai cung cấp -Huyết người bệnh ung thư vú ung thư máu Bộ môn Hoá sinh, Viện Quân y 108 cung cấp 2/rhiết bị hố chất: Đã sử dụng loại máy móc plụic vụ nghiên cứu hãng Mỹ, Pháp đảm bảo độ xác cao quang phổ, ly tãm, điện di, máy đọc ELISA Tất hoá chất sử dụng dạng tinh khiết hoá học hãng Sigma, BioRad (Mỹ), Pharmacia (Thuỵ điển) Phương pháp nghiên cứu ĩ.ỉ.X c định hoạt độ lectin Hoạt độ lectin xác định kỹ thuật miễn dịch qua gây Iigung kêt hổng cầu Iheo phương pháp Roche Monsigny [8] Dịch lectin pha lỗng gấp đơi liên liếp đệm tris 0,05 M pH 8,3 có chứa NaCI 0,15 M (TBS) giêng thử chất dẻo đáy nhọn (Microíitei system Anh) Tiếp theo cho vào giếng hổng cầu 2% rửa nhiều lẩn dung dịch muối sinh lý (NaCI 0,9 %) Kết phản ứng ngưng kếí ghi nhộn sau 60- 90 plt nhiệt độ phịng Hoại độ Iigiíng kết (hiệu giá, viết lát HAA) giá trị nghịch đảo độ pha loãng ỈỚI1 mà dịch lectin khả gây ngưng kết hồng cầu Hoạt động riêng chế phẩm lectin số đơn vị ngưng kết HAA có m g protein 3.2 Xác định hàm lượng protein Hàm lượng protein huyết sam chế phẩm lectin xác định theo phương pháp Lowry, dùng huyết bò làm chuẩn, đo bước sóng 280 nm máy quang phổ, mô tả trước [8] 3.3.Tinh chê lectin sam cột sắc ký lực ìgG-Sepharose 4B Cột sắc ký lực dùng IgG tách từ huyết người làm phối tử gắn lên sepharose 4B hoạt hoá chuẩn bị theo phương pháp chuẩn hãng Pharmacia (Thuỵ điển) [8] Huyết sam ly tẳm loại tế bào máu plia loãng đệm tri.s chuẩn (TBS) Dung dịch cho chảy qua cột sắc ký cân trước TBS với tốc độ 10 ml/giờ Quá trình lặp lại nhiều lần Rửa lại cột TBS hết protein khơng gắn với ígG cột Phản hấp phu lectin đệm có pH thấp, tốc độ rửa chiết 20 inl/giờ, thu phân đoạn I ml Xác định hoạt độ hàm lượng protein phân đoạn Thu chê phẩm, thẩm tích loại muối bảo quản 0nc 3.4 P hương pháp điện di theo Laem m li: Đã tiến hành điện di gel polyacrylamit có SDS (SDS-PAGE) có sử dung chất khử (cịn gọi điện di biến tính) để xác định độ tinh khối lượng phân tử băng polypeptit chê phẩm sở kỹ thuật mô tả trước [8] Đúc gel với nồng độ 12 %, cho dung dịch mẫu xử lý vào giếng, điện di gel với dòng điện ban đầu 12 mA, sau tăng lên 16 111A/ gel Điện di chất màu đánh dấu mẫu chạy tới đáy bán gel Nhuộm gel, sau rửa tẩy màu phần 3.5.Xác dinh kháng thé IgG huyết ngĩiòi theo kỹ thuật E LL A : Dã sử dụng xét nghiệm miễn dịch liên kểt enzym-lectin (ELLA: EnzymeLinked Lectinosorbent Assay) để phát biếu kháng thể ỊgG huyết người [2,7] Đây kỹ thuật dùng enzym để đánh dấu kháng nguyên kháng thể, với mục đích làm tăng độ nhạy phản ứng Kỹ thuật cho phép xác định lượng kháng thể có huyết (như globulin miễn dịch ... 1.Tên đề t? ?i: Nghiên cứu khả ứng dụng lectin chất có hoạt tính sinh học khác từ nguồn động vật chẩn đoán số bệnh ung thư nhiễm trùng ngư? ?i Mã số: QT- 98- 10 CK1Í trì đề t? ?i: PTS B? ?i Phương Thuận... ục tiêu n? ?i dung nghiên cứu: -Tách tinh chế lectin, số chất có hoạt tính sinh học khác (proteinaz, chất ức chế proteinaz ) rừ động vật -Sử dụng chế phẩm thu vào nghiên cứu ứng dụng miễn dịch học, ... học V học ngày phong phú [5] Đề t? ?i: ” Nghiên cứu nâng ứng dụng lectin chất có hoạt lính sinh học khác từ nguồn dộng vật chẩn đoán số bệnh ung thư nhiễm trùng ngư? ?i? ?? nhằm góp phần vào việc ? ?i? ??u