Cong nghe DNA tai to hop

công nghệ DNA tái tổ hợp

Lời nói đầu

Công nghệ DNA tái tổ hợp (còn gọi là kỹ thuật di truyền hay kỹ thuật gen) là một bộ phận quan trọng và là công nghệ chìa khóa (key technology) của lĩnh vực công nghệ sinh học Công nghệ DNA tái tổ hợp được ra đời trên

cơ sở các thành tựu của sinh học phân tử và hiện nay đang đóng vai trò cách mạng đối với sự phát triển của sinh học cũng như cải tạo sinh giới

Các kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã cho phép các nhà công nghệ sinh học phân lập và khuếch đại một gen đơn từ genome của một sinh vật để có thể nghiên cứu, biến đổi và chuyển nó vào trong một cơ thể sinh vật khác Các kỹ thuật này còn được gọi là tạo dòng gen do nó có thể sản xuất ra một số lượng lớn các gen xác định

Bên cạnh các giáo trình như: sinh học phân tử, nhập môn công nghệ sinh học, công nghệ tế bào, công nghệ chuyển gen… giáo trình công nghệ DNA tái tổ hợp sẽ giúp sinh viên tiếp cận thêm một lĩnh vực khác của công nghệ sinh học thông qua việc cung cấp những kiến thức cơ bản theo hướng tạo dòng và biểu hiện gen như sau:

- Các enzyme dùng trong tạo dòng phân tử

- Các hệ thống vector

- Một số kỹ thuật cơ bản trong tạo dòng gen: điện di, PCR…

- Tạo dòng và xây dựng các thư viện genomic DNA và cDNA

- Biểu hiện các gen được tạo dòng trong E coli

Do giáo trình này mới được xuất bản lần đầu tiên, hơn nữa lĩnh vực công nghệ DNA tái tổ hợp lại rất phức tạp, nên khó tránh khỏi thiếu sót hoặc chưa đáp ứng được yêu cầu bạn đọc Vì thế, chúng tôi rất mong nhận được nhiều ý kiến đóng góp để lần xuất bản sau được hoàn thiện hơn

Chúng tôi chân thành cảm ơn Quỹ Nâng cao chất lượng-Dự án Giáo dục đại học đã hỗ trợ chúng tôi biên soạn giáo trình này, PGS TS Lê Trần Bình đã đọc bản thảo và góp nhiều ý kiến quý báu

Các tác giả

Công ngh DNA tái t h.p - 2

Các enzyme hạn chế có ba loại (type): I, II và III Các enzyme được dùng phổ biến hiện nay thuộctype II, có cơ chế tác động đơn giản nhất Đây là các nuclease cắt ở một vị trí đặc hiệu nằm bên trong sợiDNA (chứ không phân hủy DNA từ hai đầu), nên được gọi là endonuclease Tên gọi đầy đủ của chúng làcác restriction endonuclease type II, hay được gọi đơn giản là enzyme hạn chế (restriction enzyme, RE).

1 Các enzyme hạn chế type II

Cách gọi tên các enzyme hạn chế dựa trên các qui ước quốc tế Tên chi và tên loài của sinh vật, mà

ở đó tìm thấy enzyme, được dùng để đặt cho phần đầu của tên enzyme (viết nghiêng) bao gồm: chữ thứ

nhất của tên chi và hai chữ đầu của tên loài Ví dụ: enzyme được tách chiết từ vi khuẩn Escherichia coli thì có tên là Eco, còn enzyme được tách chiết từ vi khuẩn Bacillus globigii thì viết là Bgl… Ngoài ra, tên

gọi enzyme hạn chế còn được bổ sung thêm phần sau (viết thẳng), tùy thuộc vào chủng vi khuẩn liên quan

và tùy thuộc vào sự có mặt hay không của các yếu tố ngoài nhiễm sắc thể Ví dụ: RI trong enzyme EcoRI

có nghĩa như sau: R là viết tắt của chủng RY13, I là bậc xác định đầu tiên trong vi khuẩn (first identifiedorder in bacterium)

Giá trị của enzyme hạn chế là ở tính đặc hiệu của chúng Các enzyme này cắt DNA ở các vị trí nhậnbiết riêng biệt bao gồm từ 4-6 cặp nucleotide có trình tự đối xứng đảo ngược nhau, các đoạn ngắn này gọi

là palindrome (đoạn đối xứng: là đoạn DNA có hai sợi hoàn toàn đối xứng giống hệt nhau nếu lật ngược

đầu đuôi) Ví dụ: enzyme EcoRI nhận biết chuỗi hexanucleotide (6 nucleotide):

Giống như EcoRI, nhiều enzyme hạn chế đã tạo ra các đoạn DNA với đầu lồi (protruding) 5’ Một

số enzyme hạn chế khác (ví dụ: PstI) tạo ra các đoạn DNA có đầu lồi 5’ Trong khi đó, một số enzyme hạn chế (ví dụ: SmaI) lại cắt ở trục đối xứng để tạo ra các đoạn DNA mang đầu bằng (DNA mạch đôi có

hai đầu sợi đơn bằng nhau) (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Trình tự nhận biết của một số enzyme hạn chế tiêu biểu

Với bốn loại nitrogen base trong phân tử DNA và giả thiết rằng trình tự sắp xếp của chúng là ngẫunhiên, thì tần số mong đợi (kỳ vọng) của bất kỳ đoạn trình tự xác định nào, theo tính toán sẽ là 4n , n ở đây

là chiều dài của đoạn nhận biết Từ đó, có thể thấy rằng với các đoạn có bốn nucleotide thì cứ cách 256cặp base chúng lặp lại một lần, các đoạn sáu nucleotide thì cách 4096 cặp base mới lặp lại Tất nhiên, cácgiá trị này có thể dao động rất lớn, nhưng nói chung chiều dài của các đoạn sinh ra đều gần với các giá trịtính toán Chẳng hạn, một enzyme nhận biết đoạn trình tự bốn nucleotide sẽ sản sinh ra các đoạn ngắnhơn so với đoạn sáu nucleotide

2 Gắn các đầu tận cùng được cắt bởi enzyme hạn chế

- Các đầu dính (cohesive ends) , còn gọi là đầu lồi hay đầu so le.

Ví dụ: đầu dính được tạo ra nhờ PstI

- Các đầu bằng (blunt ends) , còn gọi là đầu thô

Ví dụ: đầu bằng được tạo ra nhờ HaeIII

- Dùng enzyme DNA ligase của phage T4 có thể gắn lại các đầu dính hoặc đầu bằng Tuy nhiên,trường hợp đầu bằng thường cho hiệu quả thấp vì thế người ta có thể dùng các biện pháp khác như:

+ Gắn vào đầu bằng một đoạn bổ sung để tạo ra đầu dính Ví dụ: gắn đoạn linker (đoạn nối) bằng

Công ngh DNA tái t h.p - 4

cách tổng hợp những trình tự oligonucleotide nhân tạo có từ 10-20 nucleotide để làm linker như sau:

5' NN GAATTC NN 3'3' NN CTTAAG NN 5'

+ Dùng terminal transferase Enzyme này sẽ tạo ở đầu 3’ của DNA sợi đôi một homopolymer (xem

chương 6)

3 Isochizomer

Nói chung, các RE khác nhau nhận biết các trình tự khác nhau (Bảng 1.1), tuy nhiên cũng có một sốtrường hợp cho thấy có những enzyme được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau nhưng lại cắt trong mộttrình tự, các enzyme đó được gọi là isochizomer Hơn nữa, một vài enzyme nhận biết các chuỗitetranucleotide (4 nucleotide) mà trong một số trường hợp các tetranucleotide này lại xuất hiện trong cácchuỗi hexanucleotide của các enzyme khác

Ví dụ:

- MboI và Sau3AI cùng nhận biết trình tự:

- Trong khi đó BamHI nhận biết trình tự:

Trong một vài trường hợp khác các đoạn được tạo ra nhờ một enzyme hạn chế này khi gắn với cácđoạn được tạo ra nhờ một enzyme hạn chế khác đã hình thành các thể lai (hybrid) mà các enzyme bố mẹ

không thể nhận biết được Ví dụ: SalI cắt trình tự (G¯TCGAC) và XhoI cắt trình tự (C¯TCGAG), các trình tựđược sinh ra này đã gắn với nhau tạo thành thể lai mà các vị trí cắt hạn chế của chúng không thể nhận biết

bởi các enzyme SalI và XhoI:

Tất cả các chủng E coli đều chứa hai enzyme methyl hóa DNA là: dam và dcm.

- dam (DNA adenine methylase)

Enzyme methylase này gắn các nhóm methyl ở vị trí N6 của adenine trong chuỗi 5’…GmeATC…3’

Nhưng DNA của eukaryote không bị methyl hóa ở vị trí N6 của adenine.

- dcm (DNA cystosine methylase)

Enzyme methylase này gắn các nhóm methyl ở vị trí C5 của cytosine bên trong các chuỗi5’…CmeCAGG…3’ hoặc 5’…CmeCTGG…3’ Enzyme chủ yếu ảnh hưởng đến sự methyl hóa dcm là EcoRII, enzyme BstNI có thể nhận biết chính xác cùng một trình tự như EcoRII (mặc dù nó cắt DNA ở vị trí xác định khác trong chuỗi này) Nếu không thể thay BstNI cho EcoRII thì DNA phải được chuẩn bị từ các chủng E coli dcm.

5 Cắt DNA bằng enzyme hạn chế

5.1 Các loại đệm dùng trong phản ứng cắt DNA

Mỗi enzyme hạn chế có một điều kiện phản ứng tối ưu, nhiệt độ ủ và thành phần của dung dịch đệm

là những yếu tố quan trọng Nhiệt độ yêu cầu khá chính xác còn sự khác nhau giữa các dung dịch đệmthường là không đáng kể Để thuận tiện trong nghiên cứu người ta chia các enzyme ra làm ba nhóm:

- Nhóm đệm cao (H) Hoạt động tốt nhất ở các dung dịch đệm có hoạt độ ion cao.

- Nhóm đệm trung bình (M) Thích hợp với các dung dịch đệm có hoạt độ ion trung bình.

- Nhóm đệm thấp (L) Thích hợp với các dung dịch đệm có hoạt độ ion thấp.

Như vậy, theo cách phân chia này chỉ có ba loại đệm stock là cần chuẩn bị cho phản ứng cắt DNAbằng RE (Bảng 1.2) Thường các đệm stock trong bảng 1.2 được pha ở nồng độ ( ´ 10), và có thể giữ ởnhiệt độ 4oC/1-2 tuần hoặc -20oC/không hạn định

Bảng 1.2 Các loại dung dịch đệm cho phản ứng cắt DNA bằng RE

Chú ý

Riêng enzyme SmaI không thể sử dụng các loại đệm ở trên mà cần phải pha dung dịch đệm đặc biệt,

bao gồm: 20 mM KCl, 10 mM Tris.Cl (pH 8), 10 mM MgCl2, và 1 mM dithiothreitol

5.2 Phương pháp cắt DNA bằng enzyme hạn chế

Các phản ứng đặc trưng dùng khoảng 0,2-1 mg DNA/20 mL dung dịch phản ứng hoặc ít hơn Ví dụ:

a Pha dung dịch DNA bằng nước cất hai lần vô trùng trong eppendorf tube vô trùng tới dung tích 17 mL

b Bổ sung 2 mL đệm phản ứng ( ×10) thích hợp của RE và trộn đều (vortex) Ví dụ:

c Bổ sung 1 unit/mL RE và lắc đều nhẹ Một unit (đơn vị, ký hiệu là u) RE được xác định như là số lượngyêu cầu đủ để thủy phân hoàn toàn 1 mg DNA plasmid/1 giờ ở dung dịch đệm và nhiệt độ thích hợp trong

e Dừng phản ứng bằng cách bổ sung 0,5 M EDTA (pH 7,5) để đạt tới nồng độ cuối cùng là 10 mM

- Nếu DNA sau khi cắt bằng RE, được phân tích trực tiếp trên gel thì bổ sung 1 μ L ( × 10)gel-loading-dye I, trộn đều và chạy điện di

- Nếu DNA sau khi cắt bằng RE, cần được tinh sạch thì chiết một lần với phenol, một lần vớiphenol:chloroform (1:1), một lần với chloroform và kết tủa DNA bằng hai thể tích ethanol hoặc một thểtích isopropanol

1 DNA polymerase (DNA-dependent DNA polymerase)

DNA polymerase được dùng để tổng hợp DNA trong cơ thể hoặc trong điều kiện in vitro.

1.1 DNA polymerase I của E coli

Enzyme này dịch chuyển điểm đứt (nick) của DNA, nick là điểm đứt trên một sợi của DNA sợi đôi.Chức năng chính của enzyme là sửa sai dọc theo phân tử DNA Nếu gặp chỗ sai sót, nó sẽ đi ngược lại để

cắt bỏ sau đó mới tổng hợp DNA DNA polymerase I của E coli mang chuỗi polypeptide có khối lượng

phân tử (M) là 109.000 Da với ba hoạt tính riêng biệt:

- Hoạt tính polymerase 5’®3’ DNA polymerase I của E coli xúc tác cho sự tổng hợp DNA theo

chiều 5’®3’ bằng cách bổ sung các gốc nucleotide vào đầu tận cùng 3’-OH được tạo ra khi một sợi củaphân tử DNA sợi đôi bị đứt

- Hoạt tính exonuclease 3’®5’ DNA polymerase I của E coli cắt các chuỗi nucleotide ở các đầu

tự do của DNA, xúc tác cho sự thoái biến bậc thang từ đầu 3’ của cả DNA sợi đôi và sợi đơn khi không códNTPs Trong trường hợp có dNTPs, hoạt tính exonuclease trên sợi đôi sẽ bị ức chế bởi hoạt tínhpolymerase Trong quá trình tổng hợp DNA, hoạt tính exonuclease thực hiện chức năng đọc sửa(proofreading) bằng cách cắt bỏ những nucleotide lắp ráp sai

- Hoạt tính exonuclease 5’®3’ DNA polymerase I của E coli có thể chuyển chỗ các nucleotide từ

phía 5’ của điểm đứt và bổ sung tức thời các nucleotide từ phía 3’ tạo ra chuyển động của điểm đứt dọctheo DNA

- Ứng dụng chính

+ Đánh dấu đoạn DNA để làm mẫu dò bằng dịch chuyển điểm đứt

+ Khởi đầu cho sự tổng hợp sợi thứ hai trong tạo dòng cDNA

+ Xác định trình tự DNA bằng phương pháp dideoxynucleotide

1.2 Đoạn Klenow của DNA polymerase I của E coli

Enzyme này có tác dụng lấp đầy các đầu khuyết 3’ của DNA sợi đôi Do DNA polymerase I có bahoạt tính, nhưng hoạt tính exonuclease 5’®3’ ít sử dụng nên Klenow đã dùng protease để cắt bớt đoạn cóhoạt tính đó Vì vậy, khối lượng phân tử của enzyme chỉ còn lại 76.000 Da (được gọi là đoạn lớn củaDNA polymerase I)

- Ứng dụng chính

+ Làm đầy đầu khuyết 3’ do enzyme hạn chế tạo ra

+ Đánh dấu đầu tận cùng của các đoạn DNA bằng cách dùng [ a -32P]dNTPs để làm đầy đầu khuyết3’

+ Đánh dấu đầu tận cùng của các phân tử DNA mang đầu lồi 3’ Đầu tiên, hoạt tính exonuclease3’®5’ loại bỏ đầu lồi 3’ để tạo ra đầu khuyết 3’ Sau đó, nhờ sự có mặt ở nồng độ cao của một tiền chấtđược đánh dấu đồng vị phóng xạ, sự thoái biến bậc thang được cân bằng do sự hợp nhất của các dNTP ở

Công ngh DNA tái t h.p - 8

đầu 3’.

+ Tổng hợp sợi thứ hai của cDNA trong tạo dòng cDNA

+ Tổng hợp DNA sợi đôi từ các khuôn mẫu sợi đơn trong phát sinh đột biến in vitro.

1.3 DNA polymerase của bacteriophage T4

(T4-infected E coli)

Enzyme này giống đoạn Klenow của DNA polymerase I của E coli DNA polymerase của phage

T4 (M = 114.000 Da) có hoạt tính polymerase 5’®3’ và exonuclease 3’®5’ Tuy nhiên, hoạt tính

exonuclease của DNA polymerase phage T4 lớn hơn của DNA polymerase I đến 200 lần Đoạn Klenowphải cần có đoạn mồi (primer) mới tổng hợp DNA được, còn DNA polymerase phage T4 thì không cầnmồi cũng tổng hợp được DNA

- Ứng dụng chính

+ Làm đầy hoặc đánh dấu đầu khuyết 3’ do enzyme hạn chế tạo ra

+ Đánh dấu đầu tận cùng của các phân tử DNA mang đầu lồi 3’, tương tự như ứng dụng của đoạnKlenow

+ Đánh dấu các đoạn DNA để làm mẫu dò

+ Biến đổi đầu sole của DNA sợi đôi thành đầu bằng

1.4 Taq DNA polymerase

(Thermus aquaticus)

Taq DNA polymerase (Taq pol) là một loại DNA polymerase chịu nhiệt (M = 65.000 Da) của vi

khuẩn Thermus aquaticus Enzyme này được dùng để kiểm tra sự có mặt hoặc không của một gen bằng cách xúc tác cho sự tổng hợp gen đó ở điều kiện in vitro nhờ phản ứng chuỗi polymerase (PCR) (xem chương 3) Taq pol thay thế cho DNA polymerase I của E coli do có khả năng chịu nhiệt cao phù hợp với

điều kiện phản ứng của PCR, và nó có thể tổng hợp một sợi DNA dài 1 kb trong vòng 30 giây ở 72oC

- Một trong những hạn chế của Taq pol là sự chính xác không cao trong quá trình sao chép của nó

do bị mất cơ chế đọc sửa (hoạt tính exonuclease 3’®5’) Enzyme Taq pol thương mại có tỷ lệ sao chép lỗi1/10.000 nucleotide, và có thể tạo ra 16% sản phẩm PCR dài 1 kb bị đột biến trong phản ứng khuếch đại.Mặc dù có nhược điểm trên, Taq pol vẫn có thể được dùng trong các thí nghiệm đòi hỏi một trình tự ditruyền chính xác (như trong tạo dòng phân tử) Tuy nhiên, kết quả cho ra một vector mang đoạn chèn (sản

phẩm PCR) cần phải được kiểm tra bằng sequencing.

- Ưu điểm của Taq pol là sản xuất các đoạn gen mang hai đầu lồi A Điều này đặc biệt hữu ích trong

“TA cloning” là kỹ thuật mà vector (plasmid) được sử dụng đã có sẵn hai đầu lồi T bổ sung với hai đầu lồi

A của sản phẩm PCR, nhờ đó đã làm tăng hiệu quả của phản ứng gắn

Ngoài Taq pol, nhiều DNA polymerase chịu nhiệt khác đã được đưa ra thị trường với các chức năng

chuyên biệt hay hoàn thiện hơn Chẳng hạn: Pfu DNA polymerase (Pfu pol) được tách chiết từ Pyrococcus furiosus, thường được dùng thay cho, hoặc kết hợp, với Taq pol Enzyme này ổn nhiệt hơn và có khả

năng đọc sửa, vì thế cho tỷ lệ sao chép lỗi thấp Hoặc Tth DNA polymerase (Tth pol), được tách chiết từ

Thermus thermophilus, có khả năng hoạt động như một enzyme phiên mã ngược khi có mặt RNA khuôn mẫu

và ion Mn2+; nhưng nếu có sự hiện diện của DNA khuôn mẫu và ion Mg2+, thì Tth pol lại xúc tác phản ứngkhuếch đại DNA Enzyme này cho phép khuếch đại khuôn mẫu là RNA thông qua sự hình thành cDNA

2 RNA polymerase ( DNA-dependent RNA polymerase)

(Bacteriophage SP6-infected Salmonella typhimurium LT2, bacteriophage T7 hoặc T3-infected E coli)

Các bacteriophage SP6, T7 và T3 sản xuất enzyme RNA polymerase để khởi đầu tổng hợp RNAtrên khuôn mẫu DNA sợi đôi có mang promoter đặc trưng bacteriophage Quá trình tổng hợp này khôngcần mồi

- Ứng dụng chính

+ Sản xuất RNA để làm mẫu dò

+ Xác định trình tự của một phân tử DNA được tạo dòng trong một vector có mang promoter đặctrưng cho bacteriophage SP6, T7 hoặc T3

+ Sản xuất một lượng lớn RNA từ một phân tử DNA được tạo dòng để nghiên cứu về cấu trúc, điềuhòa và các mối tương tác của phiên bản RNA

3 Enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase, RNA-dependent DNA polymerase)

Đây là enzyme tổng hợp DNA từ khuôn mẫu RNA Enzyme này có ở trong các virus: AMV (avianmyeloblastosis virus), Mo-MLV (moloney murine leukemia virus) thuộc nhóm virus ngược (retrovirus:virus mang RNA) và có các hoạt tính sau:

Công ngh DNA tái t h.p - 10

- Hoạt tính polymerase 5’®3’ Tổng hợp DNA theo chiều 5’®3’ Cơ chất của nó là RNA hay DNA

(sợi đơn hoặc sợi đôi):

- Hoạt tính RNase H Bao gồm hai hoạt tính exoribonuclease 5’®3’ và 3’®5’ phân hủy các DNA

hoặc RNA trong tổ hợp lai

Enzyme này được dùng trong kỹ thuật di truyền là nhờ vào khả năng tổng hợp được cDNA củachúng (xem chương 6)

Người ta có thể tách chiết mRNA ở những tế bào tổng hợp protein mạnh, sau đó dùng enzymereverse transcriptase để tổng hợp cDNA Có thể tổng hợp nên oligonucleotide rồi dùng nó để xác địnhtrình tự của DNA

4 Terminal transferase

(Tuyến ức của bê)

Hoạt tính của enzyme này là xúc tác gắn các nucleotide vào đầu 3’-OH tự do của DNA sợi đôi làmlồi ra một đầu ở cuối sợi DNA Phản ứng gắn này là ngẫu nhiên, do đó thành phần nucleotide của đầu lồiphụ thuộc vào nồng độ của bốn loại nucleotide có trong phản ứng

- Ứng dụng chính

+ Thêm đuôi đồng trùng hợp (homopolymer) để tạo ra đầu so le cho phân tử DNA dùng trong tạo

dòng (xem chương 6).

+ Đánh dấu đầu 3’-OH của DNA trong kỹ thuật xác định trình tự gen theo Maxam và Gilbert

III Các enzyme gắn

Enzyme ligase thường dùng là của phage T4 xâm nhiễm trong E coli Chức năng của enzyme này là

nối các đoạn hở bằng liên kết cộng hóa trị, sử dụng năng lượng ATP

1 Bacteriophage T4 DNA ligase

(Bacteriophage T4-infected E coli)

Enzyme này là một chuỗi polypeptide (M = 68.000 Da) xúc tác cho sự tạo thành liên kếtphosphodiester giữa đầu 3’-OH tự do của một phân tử DNA này với đầu cuối 5’-PO4 của một phân tửDNA khác DNA ligase có tác dụng cho cả trường hợp đầu so le lẫn đầu bằng, tuy nhiên đối với đầu bằngenzyme đòi hỏi nồng độ cao hơn và điều kiện phản ứng cũng khác

2 Bacteriophage T4 RNA ligase

(Bacteriophage T4-infected E coli)

Enzyme này xúc tác cho mối liên kết cộng hóa trị giữa nhóm 5’-PO4 của DNA sợi đơn hoặc RNAvới nhóm 3’-OH của DNA sợi đơn hoặc RNA Do cơ chất thích hợp cho enzyme này là các phân tử nhỏnên nó thường được dùng để đánh dấu đầu 3’ của các phân tử RNA sử dụng làm mẫu dò

Công ngh DNA tái t h.p - 12

3 Bacteriophage T4 polynucleotide kinase

(Bacteriophage T4-infected E coli)

Enzyme bacteriophage T4 polynucleotide kinase xúc tác chuyển nhóm γ-phosphate của ATP tới đầu5’ của DNA hoặc RNA Hai loại phản ứng thường có thể xảy ra là phản ứng thuận và phản ứng trao đổi.Trong phản ứng thuận, nhóm γ-phosphate được chuyển tới đầu 5’ của DNA đã được dephosphoryl hóa(mất nhóm phosphate) Trong phản ứng trao đổi, khi có một ADP thừa, enzyme sẽ chuyển nhóm 5’phosphate từ DNA đã được phosphoryl hóa tới ADP, DNA sau đó sẽ được phosphoryl hóa trở lại bằngcách nhận một nhóm γ-phosphate đã được đánh dấu đồng vị phóng xạ từ một phân tử [γ-32P]ATP

(E coli và ruột bê)

Cả hai enzyme alkaline của vi khuẩn (bacteria alkaline phosphatase, BAP) và ruột bê (calf intestinalalkaline phosphatase, CIP) đều xúc tác loại bỏ nhóm 5’ phosphate khỏi DNA và RNA

- Ứng dụng chính

+ Loại bỏ nhóm 5’ phosphate khỏi DNA hoặc RNA trước khi đánh dấu đầu 5’ bằng 32P

+ Loại bỏ nhóm 5’ phosphate khỏi các đoạn DNA để ngăn cản sự tự gắn Trong kỹ thuật tạo dòng,

khi một vector được mở vòng DNA bằng một RE rồi sau đó được loại bỏ nhóm 5’ phosphate thì nó khôngthể tự gắn lại (tự tái tạo lại vòng) Chỉ khi có đoạn DNA ngoại lai mang các đầu 5’ phosphate cần thiếtđược đưa vào thì phản ứng gắn giữa vector và DNA ngoại lai mới xảy ra.

IV Các enzyme phân cắt

Là nhóm các enzyme xúc tác thủy phân liên kết phosphodiester trong phân tử DNA hoặc RNA, baogồm các endonuclease (cắt bên trong phân tử nucleic acid) và exonuclease (cắt bên ngoài phân tử nucleicacid) Các RE cũng là các endonuclease, nhưng chúng có tính đặc hiệu rất cao cho từng trình tự 4 hoặc 6nucleotide Dưới đây là các nuclease chính thường được sử dụng:

1 Deoxyribonuclease I (DNase I)

(Tụy bò)

DNase I xúc tác thủy phân DNA sợi đơn hoặc sợi đôi ở các liên kết phosphodiester nằm bên cạnhcác pyrimidine nucleotide, tạo ra các oligonucleotide và các oligonucleotide có đầu tận cùng 5'monophosphate Khi có mặt Mg2+, DNase I tác dụng độc lập trên mỗi sợi DNA, và các vị trí cắt đượcphân bố ngẫu nhiên

Khi có mặt Mn2+, DNase I sẽ cắt cả hai sợi DNA gần như ở cùng một vị trí để tạo ra các đoạn DNAđầu bằng hoặc đầu lồi nhưng chỉ nhô ra một hoặc hai nucleotide

- Ứng dụng chính

+ Tạo ra các điểm đứt (nick) trên DNA sợi đôi để đánh dấu mẫu dò đồng vị phóng xạ bằng phươngpháp dịch chuyển điểm đứt

+ Tạo ra các dòng ngẫu nhiên để phân tích trình tự trong bacteriophage M13 vector

+ Phân tích phức hợp protein:DNA (DNase footprinting)

+ Loại bỏ DNA trong các phân đoạn RNA hay protein

2 Nuclease S1

(Aspergillus oryzae)

Enzyme nuclease S1 cắt DNA sợi đơn hoặc RNA để tạo ra đầu 5’ monophosphate hoặc cácoligonucleotide DNA sợi đôi và thể lai DNA:RNA ít chịu tác dụng của enzyme này Tuy nhiên, cácnucleic acid sợi đôi sẽ bị nuclease S1 cắt hoàn toàn nếu chúng bị xử lý với một lượng rất lớn enzyme Mộtlượng vừa đủ của enzyme sẽ tách các nucleic acid sợi đôi ở các điểm đứt hoặc các lỗ hổng nhỏ thành haihoặc nhiều đoạn.Công ngh DNA tái t h.p - 14

- Ứng dụng chính

+ Phân tích cấu trúc thể lai DNA:RNA

+ Loại bỏ các phần sợi đơn trên đầu sole ra khỏi đoạn DNA sợi đôi để tạo ra các đầu bằng

+ Mở vòng cặp tóc xuất hiện trong quá trình tổng hợp cDNA sợi đôi

Một enzyme có hoạt tính tương tự nuclease S1 là mung-bean nuclease (endonuclease) được tách

chiết từ mầm đậu xanh (Phaseolus aureus).

3 Exonuclease III (Exo III)

(E coli)

Exo III xúc tác loại bỏ các 5’ mononucleotide từ đầu 3’ OH của DNA sợi đôi (DNA mạch thẳnghoặc mạch vòng chứa các điểm đứt hoặc lỗ hổng) Hoạt tính enzyme cho kết quả tạo thành các vùng sợiđơn dài trong DNA sợi đôi Enzyme này có 3 hoạt tính khác nhau: endonuclease đặc hiệu cho apurinicDNA, RNase H và 3’ phosphatase (loại bỏ đầu 3’ phosphate nhưng không cắt các liên kết phosphodiesterbên trong) Exo III không cắt các DNA sợi đơn hoặc DNA sợi đôi có đầu lồi 3’

Enzyme xúc tác thủy phân RNA thành các đoạn nhỏ hơn RNase A có hoạt tính rất mạnh, hiện diện

ở mọi nơi và rất bền vững (không bị mất hoạt tính khi bị xử lý ở 90°C trong 1 giờ) RNase A cắt liên kếtphosphodiester nằm ngay sau một pyrimidine của một RNA sợi đơn

- Ứng dụng chính

+ Loại bỏ RNA trong các chế phẩm DNA hay protein

+ Loại bỏ các vùng không bắt cặp trên RNA trong thể lai RNA:DNA

5 RNase H

Enzyme RNase H là một loại ribonuclease có khả năng cắt liên kết 3’-O-P của RNA trong sợi đôicủa thể lai DNA:RNA để tạo ra các sản phẩm có đầu tận cùng 3’-OH và 5’-PO4 RNase H là mộtendonuclease không đặc hiệu, xúc tác cắt RNA thông qua cơ chế thủy phân nhờ một ion kim loại hóa trị 2liên kết với enzyme

Trong tạo dòng phân tử, RNase H xúc tác cắt đặc hiệu RNA trong thể lại RNA:DNA mà không cắtDNA hoặc RNA không ở trong thể lai, enzyme này thường được dùng để phá hủy khuôn mẫu RNA saukhi tổng hợp sợi cDNA thứ nhất bằng phiên mã ngược, để tiếp tục tổng hợp sợi cDNA thứ hai tạo thànhmột sợi đôi cDNA

V Các protein liên kết DNA sợi đơn

Các protein liên kết DNA sợi đơn (single stranded DNA-binding proteins, SSB) kết hợp với DNAsợi đơn nhưng không kết hợp với DNA sợi đôi Chúng được xem như là các chất phản ứng trong tạo dòngphân tử xuất phát từ chỗ chúng có khả năng phá vỡ sự ổn định của các cấu trúc thứ cấp bên trong sợinucleotide; tăng nhanh sự tái ủ của các polynucleotide bổ sung và tăng hoạt tính của các enzyme DNApolymerase bằng cách loại bỏ các cấu trúc thứ cấp bên trong sợi là những yếu tố ngăn cản sự tiến triểncủa các enzyme này Nhờ tính chất này, các protein SSB trở thành các chất phản ứng hữu ích trong xácđịnh trình tự DNA

- Ứng dụng chính

Công ngh DNA tái t h.p - 16

+ Phát sinh đột biến điểm trực tiếp bao gồm D-loops.

+ Tăng chiều dài chuỗi của sản phẩm trong mọi phản ứng được xúc tác bởi DNA polymerase trêncác khuôn mẫu dài Các protein SSB đặc biệt có thể kích thích các DNA polymerase đặc hiệu dùng trongcác phản ứng phân tích trình tự chuỗi DNA

Tài liệu tham khảo/đọc thêm

1 Hồ Huỳnh Thùy Dương 1998 Sinh học phân tử NXB Giáo dục, Hà Nội.

2 Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K 2002 Short

Protocol in Molecular Biology Vol 1 and 2 5th ed John Wiley & Sons, Inc USA.

3 Brown TA 2001 Gene Cloning-An Introduction 4th ed Blackwell Science, Oxford, UK.

4 Glick BR and Pasternak JJ 2003 Molecular Biotechnology: Principles and Applications of

Recombinant DNA 3rd ed ASM Press, USA.

5 Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J 1989 Molecular Cloning-A Laboratory Manual Cold Spring

Habor Laboratory Press, USA.

6 Ohman DE 1989 Experiments in Gene Manipulation Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey,

USA.

7 Primrose SB, Twyman R and Old RW 2001 Principles of Gene Manipulation 6th ed Blackwell

Science, Oxford, UK.

vì thế chỉ dịch chuyển hướng đến cực dương.

Các phân tử protein và nucleic acid có thể được chạy điện di trên một khuôn đỡ (support matrix)như giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc polyacrylamide gel Trong đó gel của agarose vàpolyacrylamide được sử dụng phổ biến nhất Thông thường, gel là một khuôn đúc dạng phiến mỏng có cácgiếng để nạp (loading) mẫu Gel được ngâm trong đệm điện di cung cấp các ion để dẫn truyền dòng điện

và một vài loại đệm để duy trì pH ở một giá trị không đổi tương đối

II Điện di agarose gel

Agarose (polysaccharide) có khối lượng phân tử xấp xỉ 120.000 Da (Hình 2.1) là một trong haithành phần chính của agar1 chiếm khoảng 70%, phần kia là agaropectin chiếm khoảng 30% Agarose làmột polymer mạch thẳng không bị sulphate hóa chứa hai gốc xen kẽ nhau là D-galactose và 3,6-anhydro-

L-galactose Agarose gel là một chất trong suốt (transparent) hoặc trong mờ (transluent) giống như agar,được tạo thành khi hỗn hợp agarose và nước (hoặc đệm điện di) được đun nóng tới >100oC và sau đóđược làm lạnh; dạng gel xuất hiện ở khoảng 40-45oC Agarose gel được ứng dụng rộng rãi để làm giá thểcho các nucleic acid trong kỹ thuật điện di ngang (horizontal electrophoresis) hoặc làm giá thể cho môitrường nuôi cấy bacteriophage (top agarose)

Hình 2.1 Cấu trúc phân tử của agarose Đơn vị agarobiose (ví dụ: hai phân tử đường) là một monomer trong

agarose polymer Có khoảng 400 monomer trên một chuỗi polymer.

Các phân tử nucleic acid có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi di chuyển từ cực âmsang cực dương của hệ điện di trong một điện trường có điện thế và cường độ thích hợp Kỹ thuật này đơngiản và thực hiện nhanh Hơn nữa, vị trí của DNA trong gel được xác định trực tiếp: các băng DNA tronggel được nhuộm ở nồng độ thấp của thuốc nhuộm huỳnh quang ethidium bromide (EtBr) và có thể pháthiện dưới ánh sáng tử ngoại (ultraviolet-UV)

Điện di agarose gel được sử dụng trong các trường hợp sau:

- Ước lượng kích thước của các phân tử DNA sau khi thực hiện phản ứng cắt hạn chế (ví dụ: lập

Công ngh DNA tái t h.p - 18

bản đồ hạn chế của DNA được tạo dòng…).

- Phân tích các sản phẩm PCR (ví dụ: trong chẩn đoán di truyền phân tử hoặc in dấu di truyền…)

- Phân tách DNA hệ gen đã được cắt hạn chế trước khi thẩm tích Southern, hoặc RNA trước khithẩm tích Northern

Ưu điểm của phương pháp này là gel được rót dễ dàng, không gây biến tính mẫu, và bền vững vật lýhơn polyacrylamide Mẫu cũng dễ thu hồi Nhược điểm là agarose gel có thể bị nóng chảy trong quá trìnhđiện di, đệm có thể bị tiêu hao, và các dạng khác nhau của nucleic acid có thể chạy không ổn định

1 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ dịch chuyển điện di trong agarose gel

1.1 Kích thước của phân tử

Các phân tử DNA mạch thẳng sợi đôi đi qua bản gel ở các tốc độ tỷ lệ nghịch với hàm log10 củakhối lượng phân tử của chúng (Hình 2.2) Do đó, các phân tử DNA có kích thước càng lớn (khối lượngphân tử lớn) thì tốc độ dịch chuyển càng chậm

Hình 2.2 Mối quan hệ giữa kích thước DNA và độ linh động điện di của nó

mo: độ linh động điện di tự do.

K r: hệ số trì hoãn điện di (retardation), được thiết lập thông qua mối liên quan giữa các tính chất của gel với hình dạng và kích thước của các phân tử dịch chuyển.

Như vậy, dùng gel ở các nồng độ khác nhau có thể phân tách được các đoạn DNA có kích thước

khác nhau (Bảng 2.1) Nồng độ agarose cao có khả năng phân tách các đoạn DNA nhỏ, trong khi đó nồng

độ agarose thấp lại cho phép phân tách các đoạn DNA lớn hơn

Bảng 2.1 Các thông số điện di DNA bằng agarose gel

Hình 2.3 minh họa sự dịch chuyển của tập hợp các đoạn DNA trong hai mẫu ở ba nồng độ khácnhau của agarose, tất cả chúng ở trong một khay gel và được điện di ở cùng một điện áp (voltage) trongmột thời gian xác định Kết quả cho thấy, các đoạn lớn được phân tách tốt hơn ở gel 1%, trong khi cácđoạn nhỏ thích hợp với gel 2%

Hình 2.3 Điện di các mẫu DNA giống nhau ở các nồng độ agarose khác nhau A: 1%, B: 1,5% và C: 2%.

1.3 Cấu hình của DNA

Các DNA dạng vòng đóng (form-I), vòng đứt (form-II) và mạch thẳng (form-III) có cùng một khốilượng phân tử sẽ dịch chuyển trên agarose gel ở các tốc độ khác nhau Nhìn chung, DNA của các plasmidmạch vòng dịch chuyển nhanh hơn DNA của plasmid cùng loại nhưng có dạng mạch thẳng Hầu hếtplasmid mạch vòng chứa ít nhất hai dạng DNA có cấu trúc không gian khác nhau là dạng vòng đóng (siêuxoắn) và vòng đứt Hình 2.4 minh họa kết quả điện di với plasmid mạch vòng bên trái và plasmid cùng loạimạch thẳng ở bên phải

Công ngh DNA tái t h.p - 20

Hình 2.4 Điện di các plasmid có cấu hình khác nhau

1.4 Thành phần base và nhiệt độ

Tập tính điện di của DNA trong agarose gel không bị ảnh hưởng rõ rệt bởi thành phần base củaDNA hoặc nhiệt độ mà ở đó gel được chạy Trong agarose gel, tính linh động điện di tương đối của cácđoạn DNA có kích thước khác nhau không thay đổi trong khoảng từ 4oC đến 30oC Nói chung, agarosegel thường được chạy ở nhiệt độ phòng

2 Phương pháp điện di agarose gel

2.1 Đệm pH

Một số đệm điện di thích hợp cho DNA sợi đôi thường được dùng là Tris-acetate-EDTA (TAE),Tris-borate-EDTA (TBE) và Tris-phosphate-EDTA (TPE) ở nồng độ khoảng 50 mM và pH 7,5-7,8 (Bảng2.2) Thường do thói quen, TAE được sử dụng nhiều nhất, nhưng khả năng đệm của nó lại thấp Đệm TBE

và TPE đều có khả năng hòa tan tốt các đoạn DNA và có khả năng đệm cao hơn một cách rõ rệt Cácđoạn DNA sẽ dịch chuyển với các tốc độ hơi khác nhau một chút trong ba loại đệm trên do sự khác nhau

về cường lực ion của đệm Đệm không những thiết lập một giá trị pH, mà còn cung cấp các ion để hỗ trợcho độ dẫn (conductivity) Nếu chúng ta dùng nước thay vì là đệm trong quá trình điện di, thì sẽ không có

sự dịch chuyển cần thiết của DNA trong gel Ngược lại, nếu sử dụng đệm nồng độ đậm đặc (ví dụ: dungdịch stock ×10), thì nhiệt độ trong gel có thể tăng cao và làm nóng chảy nó

2.2 Chuẩn bị agarose gel

Có nhiều loại agarose khác nhau thích hợp để chạy điện di, loại agarose dùng tốt nhất trong thínghiệm là type-II-agarose có nội thẩm thấu thấp (low-endo-osmotic) Nó dễ dàng chảy ra và tạo thànhmột dung dịch trong suốt, kết quả là gel đàn hồi thậm chí ở các nồng độ thấp Tuy nhiên, type-II-agarose

dễ bị bẩn bởi sulphate polysaccharides (SP), hơn nữa SP còn ức chế các enzyme như ligase, polymerase

và RE Vì thế, các đoạn DNA dung ly từ những gel như thế phải được làm sạch cẩn thận trước khi chúngđược dùng như là các khuôn mẫu hoặc cơ chất cho các enzyme này

Bảng 2.2 Các đệm sử dụng phổ biến trong điện di

2.3 Nhuộm DNA trong agarose gel

Phương pháp quan sát DNA trong agarose gel thuận lợi nhất là dùng thuốc nhuộm huỳnh quangEtBr EtBr được dùng để phát hiện DNA sợi đôi và RNA sợi đơn Tuy nhiên, ái lực (affinity) của thuốcnhuộm đối với nucleic acid sợi đơn là tương đối thấp và có hiệu suất huỳnh quang không cao Sau khinhuộm, EtBr sẽ xen vào giữa các base của nucleic acid và cho phép phát hiện dễ dàng chúng ở trong gel.Thường EtBr (0,5 mg/mL) được đưa vào trong agarose gel để phản ứng nhuộm xảy ra trong suốtquá trình điện di Mặc dù tính linh động điện di của DNA sợi đôi mạch thẳng giảm khi có mặt thuốcnhuộm (khoảng 15%), nhưng khả năng xác định gel trực tiếp dưới ánh sáng UV trong suốt quá trình điện

di hoặc ở giai đoạn cuối có ưu thế rõ rệt Tuy nhiên, nếu cần có thể chạy điện di gel không có EtBr và chỉnhuộm DNA hoặc RNA sau khi điện di xong Gel được ngâm trong đệm điện di hoặc H2O chứa EtBr (0,5mg/mL)/45 phút ở nhiệt độ phòng

Chú ý

Ethidium bromide là một tác nhân gây đột biến mạnh Vì thế, luôn luôn đeo găng tay khi cầm gel hoặc dung dịch chứa thuốc nhuộm.

2.4 Thu hồi DNA từ agarose gel

Nhiều phương pháp đã được xây dựng để thu hồi DNA từ agarose gel, nhưng không có phươngpháp nào là hoàn toàn tối ưu Có hai vấn đề chính: thứ nhất đa số các loại agarose đều bị nhiễm bẩnbởi sulphate polysaccharides, các sản phẩm sau đó được chiết từ gel cùng với DNA, chúng là nhân tố

ức chế có hoạt tính của nhiều loại enzyme (RE, ligase, kinase, polymerase) dùng trong các bước tạodòng tiếp theo sau; thứ hai hiệu suất chiết DNA từ agarose gel phụ thuộc vào khối lượng phân tử của

nó, các đoạn DNA có chiều dài <1 kb có thể được thu hồi hoàn toàn, khi khối lượng phân tử củaDNA tăng thì hiệu suất chiết giảm, các đoạn DNA có kích thước >20 kb được thu hồi kém (khoảnghơn 20% sản lượng) Có nhiều phương pháp thu hồi và tinh sạch DNA từ agarose gel, dưới đây là mộtvài phương pháp chính:

2.4.1 Dùng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp (low melting temperature)

Công ngh DNA tái t h.p - 22

Mẫu agarose gel có nhiệt độ nóng chảy thấp chứa đoạn DNA quan tâm được cắt ra khỏi bản gel và chovào trong đệm với tỷ lệ 1:1, bổ sung muối đến nồng độ 0,5 M, sau đó được nóng chảy ở 70oC để hòa tan hoàntoàn trong đệm Dung dịch gel có DNA được chiết bằng phenol/chloroform và kết tủa Lưu ý DNA được táchchiết bằng phương pháp này không thích hợp cho mọi phương thức thao tác tiếp theo, do sự hiện diện của cácnhân tố ức chế trong agarose.

2.4.2 Ly tâm

Mẫu agarose gel có chứa băng DNA quan tâm được cắt ra và cho vào đệm chiết, làm nóng để hòatan hoàn toàn, sau đó cho dung dịch gel lên trên một lớp (màng) bông thủy tinh đã silicon hóa đặt trongmột cột lọc nhỏ loại 0,5 mL (còn gọi là spin column) Cột này được cho vào một tube vi ly tâm loại 1,5

mL và được ly tâm ở tốc độ cao 10.000-15.000 rpm trong 10-15 phút DNA sẽ liên kết với màng còn dungdịch đệm sẽ đi qua lớp bông thủy tinh vào tube vi ly tâm Cho đệm rửa vào cột và rửa cột vài lần bằngcách ly tâm nhanh Thay tube vi ly tâm mới, cho đệm hòa tan DNA vào cột và ly tâm để dung ly (elution)DNA ra khỏi màng vào tube Dung dịch DNA thu được có thể được tinh sạch thêm nếu cần Cũng có thểđông lạnh mẫu gel trước khi dùng phương pháp ly tâm để cải thiện hiệu suất thu hồi DNA

2.4.3 Điện di vào bẫy

Một cái rãnh nhỏ được cắt trong agarose gel ngay phía trước của băng DNA quan tâm Rãnh nàyđược làm đầy bằng glycerol và gel được điện di nhanh trở lại để chuyển DNA từ gel vào trong dung dịchglycerol (quá trình điện di có thể được kiểm soát bằng UV) Dung dịch glycerol-DNA sau đó được chiếtbằng pipette

Hoặc sau khi điện di, một khe nhỏ được cắt trong gel ngay phía trước băng DNA quan tâm và đặttrong khe một mẫu giấy loại NA-45 Gel sau đó được điện di trở lại và băng DNA quan tâm sẽ dịchchuyển vào trong mẫu giấy Mẫu giấy sau đó được rửa và DNA được dung ly trong đệm bằng cách đunnóng mẫu giấy tới 70oC DNA sau đó có thể được tách chiết bằng phenol và kết tủa

2.4.4 Dùng hạt thủy tinh

Mẫu gel quan tâm được hòa tan trong dung dịch muối NaI (một loại chaotropic salt) ở nồng độkhoảng 4 M Các hạt thủy tinh sau đó được bổ sung vào dung dịch để liên kết hiệu quả với các đoạn DNAđược phóng thích ở nồng độ đã cho của NaI RNA, protein và các tạp chất khác không liên kết với các hạtthủy tinh Tiếp theo là các chu kỳ rửa và kết tủa tiểu thể, DNA tinh sạch được dung ly khỏi hạt thủy tinhtrong đệm muối thấp Tuy nhiên, phương pháp này mặc dù nhanh và hiệu quả nhưng lại có phạm vi tối ưuhẹp Thu hồi các đoạn DNA nhỏ (500-800 bp) là không hiệu quả lắm và các đoạn lớn (>15 kb) có thể liênkết với các hạt thủy tinh khác nhau và các sợi DNA có thể bị phá vỡ trong suốt các chu kỳ rửa

3 Quy trình điện di

3.1 Chuẩn bị agarose gel

Cho 1% type-II-agarose vào 100 mL đệm 0,5× TAE (nếu khuôn đổ gel lớn thì tăng theo tỷ lệ trên).Đun trong nồi khử trùng hoặc lò vi sóng cho đến khi agarose tan hoàn toàn Nếu quá trình đun mất nướcquá nhiều thì phải thêm nước cho đủ 100 mL Để nguội khoảng 60oC và đổ vào buồng điện di có cài sẵnlược Chiều dày gel khoảng 5 mm là thích hợp Sau 30-40 phút, khi gel đã đông cứng, có thể gỡ lược ra.3.2 Đặt mẫu DNA vào giếng

Tùy thuộc vào từng mục đích điện di khác nhau có thể sử dụng nồng độ DNA cao hoặc thấp Chẳng

3.3 Nhuộm DNA bằng EtBr

Sau khi chạy điện di xong lấy nhẹ bản gel ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 0,5mg/mL, trong thời gian 30-45 phút, tốt nhất trên một máy lắc nhẹ (độ 10 vòng/phút ) Đổ dịch nhuộm EtBrvào một bình riêng để xử lý và rửa bản gel bằng cách ngâm trong nước cất hai lần, mỗi lần 15-20 phút EtBrthường pha sẵn ở dạng đậm đặc 5 mg/mL và giữ ở 4oC trong tối

Hình 2.5 Sơ đồ minh họa các bước trong quá trình điện di agarose gel

Công ngh DNA tái t h.p - 24

3.4 Quan sát và chụp ảnh

Bản gel sau khi nhuộm EtBr được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại (l = 302 nm) (Hình 2.6) Dùngthiết bị chuyên dụng để phân tích và lưu trữ hình ảnh DNA (Gel Documentation System)

Chú ý

Không nhìn vào ánh sáng tử ngoại nếu không có kính lọc thích hợp.

Hình 2.6 Hình ảnh điện di DNA chạy trên agarose gel 1%, 3 Volts/cm và nhuộm bằng EtBr Các băng DNA

có màu sáng SM: Chuẩn kích thước của DNA (1 kb ladder) Các đường 1, 2 và 3: mẫu plasmid DNA được cắt bằng 3 enzyme hạn chế khác nhau.

III Điện di polyacrylamide gel

Acrylamide là một monomer có cấu trúc như sau:

Khi có mặt các gốc tự do, được cung cấp bởi ammonium persulphate và ổn định bởi TEMED

(N,N,N’,N’-tetramethylethylene-diamine), phản ứng chuỗi được bắt đầu trong đó các acrylamide monomer được polymer hóa (trùng hợp) thành một chuỗi dài Khi bisacrylamide (N,N’-

methylenebisacrylamide) được bổ sung trong phản ứng polymer hóa, các chuỗi sẽ liên kết chéo(cross-linking) để tạo thành dạng gel Độ xốp của gel được xác định bởi chiều dài của chuỗi và mức

độ liên kết chéo Chiều dài của chuỗi polyacrylamide được xác định bằng nồng độ acrylamide trong phảnứng polymer hóa (giữa 3,5% và 20%)

Ngoài protein, polyacrylamide gel cũng được dùng để điện di DNA (kể cả RNA và DNA/RNA) Gelphải được rót vào giữa hai tấm kính (gel plates) được ngăn cách bởi các miếng đệm (gel spacers) (Hình2.7) Hầu hết các dung dịch acrylamide được ngăn không tiếp xúc với không khí để hạn chế sự ức chếtrùng hợp gây ra bởi oxygen Gel có thể dài từ 10-100 cm tùy thuộc vào yêu cầu phân tích và chúngthường được chạy trong phương thẳng đứng

Hình 2.7 Sơ đồ và hình ảnh của buồng điện di polyacrylamide gel

Phạm vi kích thước phân tử và độ phân giải của quá trình phân tách tùy thuộc vào nồng độ củaacrylamide và bis-acrylamide (và tỷ lệ của chúng) do chúng tạo ra khuôn gel với các phần trăm khác nhaucủa acrylamide và bậc của liên kết chéo Nồng độ thấp tạo ra các lỗ có kích thước lớn hơn và vì thế có thểphân tách các phân tử lớn hơn Liên kết chéo của các monomer và các tác nhân liên kết có thể được điềuchỉnh để kiểm soát mức độ xốp của khuôn gel Điều này cho phép tối ưu hóa một khuôn gel để phân táchmột phạm vi kích thước đặc biệt của các phân tử protein

1 Điện di nucleic acid

Điện di polyacrylamide gel được dùng để phân tách và thu hồi các đoạn DNA có chiều dài từ5-2.000 bp Nồng độ polyacrylamide gel được sử dụng trong khoảng từ 3,5-20% tùy thuộc vào kíchthước của đoạn DNA quan tâm Hai loại polyacrylamide gel thường được sử dụng là:

- Polyacrylamide gel không biến tính dùng để phân tách và tinh sạch các đoạn DNA sợi đôi

- Polyacrylamide gel biến tính bằng urea và formamide (sequencing gel) dùng để phân tách và tinhsạch các đoạn DNA sợi đơn

Phần này chỉ giới thiệu polyacrylamide gel không biến tính là loại gel hay được sử dụng nhất Hiệuquả của sự phân tách DNA trong loại gel này phụ thuộc vào nồng độ của acrylamide (Bảng 2.3), kíchthước và điện tích của DNA

Bảng 2.3 Hiệu quả của sự phân tách DNA trong polyacrylamide gel không biến tính

Công ngh DNA tái t h.p - 26

1.1 Chuẩn bị polyacrylamide gel không biến tính

Kích thước phổ biến của tấm kính đổ gel thường là 20 cm´40 cm Miếng đệm dày khoảng 0,5mm-2,0 mm Các gel dày hơn thường nóng lên trong quá trình điện di nên sẽ làm nhòe các băng DNA,

vì thế người ta thường sử dụng các gel mỏng Tuy nhiên, khi khi chạy một lượng lớn DNA (>1mg/băng) thì cần chuẩn bị gel dày Dưới đây mô tả các bước chuẩn bị và sử dụng polyacrylamide gelkhông biến tính:

1.1.1 Chuẩn bị các dung dịch sau:

- 30% acrylamide (bao gồm bis-acrylamide)

- 1× TBE

- 10% ammonium persulphate

1.1.2 Lau sạch hai tấm kính dùng làm khuôn gel và miếng đệm bằng KOH/methanol hoặc ethanol Xử lý

bề mặt của hai tấm kính bằng dung dịch silicon để ngăn gel dính chặt vào hai tấm kính gây rách gel lúc lấy

nó ra khỏi khuôn sau khi điện di xong

1.1.3 Tính toán thể tích của các dung dịch dùng để tạo polyacrylamide gel trên cơ sở kích thước tấm kính,

độ dày của miếng đệm (xem bảng 2.4)

1.1.4 Bổ sung 35 mL TEMED vào mỗi 100 mL dung dịch tạo polyacrylamide gel, trộn hỗn hợp bằngcách vortex Rót dung dịch tạo gel vào giữa hai tấm kính Gắn nhanh lược vào, tránh bọt khí ở răng lược(giếng) Đỉnh của răng lược phải hơi cao hơn mép gel Nếu cần, bổ sung thêm một ít dung dịch tạo gel đểlàm đầy mép gel

Bảng 2.4 Dung tích của các chất dùng cho polyacrylamide gel

1.1.5 Cho phép acrylamide polymer hóa trong khoảng 60 phút ở nhiệt độ phòng, bổ sung thêm dung dịchtạo gel nếu thấy gel co vào nhiều

1.1.6 Sau khi polymer hóa hoàn toàn, rút lược cẩn thận, tháo băng dính ra khỏi đáy khuôn gel Gắn khuôngel vào buồng điện di và làm đầy buồng điện di bằng đệm 1× TBE, dùng Pasteur pipette để phá các bọtkhí ra khỏi đáy gel và các giếng bằng đệm 1× TBE

1.1.7 Trộn các mẫu DNA với một lượng thích hợp của đệm 6× gel-loading dye Đặt mẫu vào trong giếngbằng micropipette hoặc Hamilton syringe.

1.8 Nối buồng điện di với bộ nguồn Polyacrylamide gel không biến tính thường chạy điện di trongkhoảng 1 V/cm đến 8 V/cm Chạy gel cho đến khi thuốc nhuộm chỉ thị dịch chuyển đến vị trí mong muốn.Tắt nguồn, lấy khuôn gel ra và đặt lên bàn Tháo tấm kính nhỏ ở mặt trước ra, tấm kính lớn ở phía sauđược dùng làm giá đỡ, và chuẩn bị nhuộm gel

1.2 Phát hiện DNA trong polyacrylamide gel

1.2.1 Nhuộm bằng ethidium bromide

Polyacrylamide có thể làm mất huỳnh quang của EtBr, do đó không thể phát hiện các băng DNAbằng phương pháp này nếu hàm lượng của nó thấp hơn 10 ng Ngâm nhẹ gel cùng với tấm kính đỡ vàotrong dung dịch nhuộm (0,5 mg/mL EtBr trong 1× TBE) Cho vừa đủ dung dịch nhuộm phủ hoàn toàn lên

bề mặt gel Sau khi nhuộm 30-45 phút ở nhiệt độ phòng, lấy gel và tấm kính đỡ ra, cẩn thận thấm khô bềmặt gel bằng giấy thấm Kimwipe Phủ lên bề mặt gel bằng giấy nylon (Saran wrap), tránh tạo ra bọt khíhoặc nếp gấp của Saran wrap Sau đó lật ngược gel và đặt nó trên máy soi tử ngoại ultraviolettransilluminator (Gel Documentation System), lấy tấm kính đỡ ra để tiến hành chụp ảnh

1.2.2 Nhuộm bằng thuốc nhuộm bạc

Thuốc nhuộm bạc được sử dụng từ những năm 1980, cho phép phát hiện một lượng protein rất nhỏ

ở dạng vết trong polyacrylamide gel Sau đó, loại thuốc nhuộm này được hoàn thiện và mở rộng phạm viứng dụng cho các phân tử nucleic acid Hai phương pháp nhuộm bạc thường được sử dụng là: 1) Dùng cácdung dịch diamine silver hoặc ammonical silver cho thấm vào gel và pha loãng các dung dịch acid củaformaldehyde để phát triển hình ảnh 2) Thấm dung dịch silver nitrate vào gel trong môi trường acid yếu

và dùng formaldehyde khử có chọn lọc các ion bạc thành bạc kim loại dưới điều kiện kiềm Nhìn chung,phương pháp diamine kiềm kém nhạy hơn nhưng thích hợp đối với các gel dày, trong khi phương phápacid nhanh và bắt màu tốt hơn đối với các gel mỏng

Thuốc nhuộm bạc được sử dụng hiệu quả để phát hiện một lượng nhỏ (picogram, pg) nucleic acid.Giới hạn phát hiện DNA sợi đôi khi quan sát bằng mắt thường là vào khoảng 1 pg/mm2 mặt cắt ngang củabăng DNA, nhạy gấp 1.000-10.000 lần phương pháp nhuộm bằng EtBr Mức độ phát hiện này có thể sosánh với phương pháp đánh dấu đồng vị phóng xạ hoặc huỳnh quang Quá trình nhuộm bao gồm các bướcsau:

- Cố định nucleic acid trong acetic acid 7,5% tối thiểu 5 phút để ngăn cản sự khuếch tán của cácphân tử nucleic acid đã được phân tách trong gel, loại bỏ và trung hòa các hóa chất không mong muốn(urea và đệm)

- Rửa gel trong nước khử ion tối thiểu 2 phút để loại bỏ acetic acid, các chất bẩn dạng vết và phầnthừa của các thành phần gel hòa tan sau khi cố định

- Nhuộm gel trong dung dịch bạc với sự có mặt của formaldehyde để cải thiện độ nhạy và độ tươngphản Thời gian nhuộm tối ưu khoảng 20 phút Tuy nhiên, đối với loại gel có tấm đỡ polyester (8×10 cm)thì chỉ cần 10 phút là đủ để có chất lượng hình ảnh cao mà không làm giảm độ nhạy

- Rửa gel sau khi nhuộm bạc để loại bỏ thuốc nhuộm thừa có thể gây ra kết tủa màu nâu trong quátrình phát triển màu Thông thường, có thể dùng dung dịch phát triển màu để rửa gel

- Phát triển màu của gel bằng hỗn hợp dung dịch sodium carbonate (4 g/L), sodium thiosulfate (4mM) và formaldehyde (khoảng 0,028-0,111%) để giảm các background không đặc hiệu một cách hiệu

Công ngh DNA tái t h.p - 28

quả Nhiệt độ rửa thích hợp từ 8-10oC, thời gian rửa thay đổi tùy thuộc vào thành phần của dung dịchphát triển màu trong khoảng từ vài giây đến vài phút.

- Dừng phản ứng phát triển màu khi thu được hình ảnh tối ưu càng nhanh càng tốt bằng cách dùngacetic acid lạnh (4oC) 7,5%

b yếu như 35S hoặc một lượng nhỏ 32P (cần phải ủ phim 24 giờ hoặc lâu hơn) (Hình 2.8)

1.3 Phân lập các đoạn DNA từ polyacrylamide gel

Phương pháp tốt nhất để phân lập DNA từ polyacrylamide gel là kỹ thuật “ép và ngâm” (crush andsoak) của Maxam và Gilbert (1977) DNA thu được có độ tinh sạch cao và không chứa các chất nhiễmbẩn ức chế enzyme Mặc dù phương pháp này phải tiến hành qua nhiều bước và không hiệu quả (ít hơn30% sản lượng các đoạn DNA >3 kb), nhưng nó có thể được dùng để phân lập cả hai loại DNA sợi đôi vàsợi đơn từ các polyacrylamide gel không biến tính và biến tính, tương ứng Phương thức sau đây được cảitiến từ kỹ thuật của Maxam và Gilbert (1977):

- Chạy điện di polyacrylamide gel Xác định vị trí của DNA quan tâm bằng phóng xạ tự ghi hoặcbằng EtBr quan sát dưới ánh sáng UV

- Dùng dao cắt mảnh gel chứa băng DNA quan tâm Không loại bỏ Saran wrap khỏi gel trước khicắt, cắt cả gel lẫn Saran wrap, sau đó bóc mảnh gel nhỏ có chứa DNA quan tâm ra khỏi Saran wrap

- Chuyển mảnh gel vào trong E-tube (eppendorf tube), dùng tip của micropipette để ép mảnh geltheo thành của tube

- Tính toán thể tích thích hợp của mảnh gel và bổ sung 1-2 thể tích của đệm chiết (0,5 M ammoniumacetate, 10 mM magnesium acetate, 1 mM EDTA pH 8 và 0,1% SDS) vào E-tube

- Đóng tube và ủ ở 37oC kèm theo lắc vòng nhẹ Đoạn DNA nhỏ (<500 bp) được dung ly trongkhoảng 3-4 giờ, đoạn lớn hơn mất khoảng 12-16 giờ

- Ly tâm 12.000 g trong 1 phút ở 4oC Chuyển thể nổi vào E-tube sạch.

- Bổ sung thêm 0,5 thể tích đệm chiết vào E-tube cũ có mảnh polyacrylamide gel, vortex nhanh và

ly tâm Trộn hai thể nổi lại với nhau

- Bổ sung hai thể tích ethanol ở 4oC, bảo quản dung dịch trên đá tuyết 30 phút Thu hồi DNA bằngcách ly tâm 12.000 g trong 10 phút ở 4oC

- Hòa tan trở lại DNA trong 200 mL đệm TE (pH 7,6) và bổ sung 25 mL của 3 M sodium acetate (pH5,2) và kết tủa DNA với hai thể tích ethanol như bước trên

- Rửa cẩn thận tiểu thể với ethanol 70% và hòa tan trở lại DNA trong đệm TE (pH 7,6) tới thể tíchcuối cùng là 10 mL

- Kiểm tra số lượng và chất lượng của đoạn DNA bằng điện di polyacrylamide gel Lấy một thể tíchnhỏ tối thiểu (được ước lượng khoảng 50 ng DNA) trộn với 10 mL TE (pH 7,6), bổ sung thêm 2 mLgel-loading dye Nạp mẫu và chạy điện di polyacrylamide gel ở nồng độ thích hợp bằng cách dùng cácDNA marker chuẩn đã biết số lượng Các đoạn DNA phân lập sẽ cùng dịch chuyển với DNA marker trongquá trình điện di

Điện SDS cho phép phân ly các phân tử protein có khối lượng khác nhau SDS có điện tích âm rấtlớn và có khả năng liên kết với mạch peptide để biến tính các cấu trúc bậc hai và bậc ba (không liên kếtbằng cầu disulfide) của protein bằng cách bọc xung quanh khung polypeptide Như vậy, số lượng SDStương tác với protein tỷ lệ với khối lượng/kích thước phân tử protein và điện tích của SDS bám vào có thểlàm bất cứ phân tử protein nào cũng chuyển động trong điện trường từ cực âm (-) sang cực dương (+) Do

Công ngh DNA tái t h.p - 30

đó, bằng phương pháp điện di, có thể phân tách riêng biệt các phân tử protein có khối lượng phân tử khácnhau.

Không có SDS, các protein khác nhau có khối lượng phân tử tương tự sẽ dịch chuyển khác nhau do

sự khác nhau về cuộn xoắn, bởi vì những khác nhau trong các kiểu cuộn xoắn sẽ làm cho một vài phân tửprotein thích hợp tốt hơn với khuôn gel so với những phân tử protein khác Bổ sung SDS giúp giải quyếtvấn đề này, vì nó làm cho các phân tử protein trở thành mạch thẳng sao cho chúng có thể phân tách hoàntoàn theo khối lượng phân tử (cấu trúc sơ cấp, hoặc số lượng (và kích thước) của các amino acid) SDSliên kết với protein theo tỷ lệ khoảng 1,4 g SDS trên 1,0 g protein (mặc dù tỷ lệ liên kết có thể thay đổi từ1,1-2,2 g/SDS/g protein) tạo ra một tỷ lệ khối lượng/điện tích thống nhất cho mọi phân tử protein để sựdịch chuyển qua gel chỉ liên quan đến kích thước của protein Một loại thuốc nhuộm vết có thể được bổsung vào dung dịch protein cho phép theo dõi tiến độ của dịch chuyển protein qua gel trong suốt quá trìnhđiện di

Hình 2.9 Điện di protein bằng kỹ thuật SDS-PAGE và nhuộm bằng Coomassie blue WM: Chuẩn khối lượng

phân tử của protein Các đường 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 và 8: Mẫu protein.

2.1.2 Khử SDS-PAGE

Bên cạnh việc bổ sung SDS, protein có thể được đun nóng nhanh gần đến sôi với sự có mặt của mộttác nhân khử, ví dụ như dithiothreitol (DTT) hoặc 2-mercaptoethanol (BME), để biến tính thêm proteinbằng cách khử các liên kết disulfide, vì thế khắc phục được một vài dạng cuộn xoắn bậc ba của protein,

và bẻ gãy cấu trúc bậc bốn của protein (các tiểu đơn vị oligomer) Phương thức này được xem như là khửSDS-PAGE, và được sử dụng phổ biến nhất Trường hợp không khử SDS-PAGE (không đun sôi và không

có tác nhân khử) có thể được dùng khi cấu trúc nguyên thể là quan trọng trong phân tích về sau (chẳnghạn như hoạt tính enzyme, được trình bày bằng việc sử dụng zymogram) Điện di polyacrylamide gel liêntục nguyên thể pha chế định lượng (quantitative preparative native continuous polyacrylamide gelelectrophoresis, QPNC-PAGE) là một phương pháp mới để phân tách các metalloprotein nguyên thể trongcác khuôn sinh học phức tạp

2.1.3 Điện di và nhuộm

Các protein biến tính sau đó được nạp vào một đầu của khuôn polyacrylamide gel đặt trong đệmthích hợp Dòng điện được sử dụng từ đầu này đến đầu kia của gel, sẽ làm cho các protein tích điện âmdịch chuyển qua gel Tùy thuộc vào kích thước của chúng, mỗi protein sẽ dịch chuyển với các tốc độ khácnhau qua khuôn gel: protein ngắn dễ dàng đi qua các lỗ của gel, trong khi protein lớn hơn sẽ gặp khó khănhơn Sau một vài giờ (tùy thuộc điện áp sử dụng trên gel, nếu điện áp cao protein chạy nhanh hơn nhưng

sẽ cho độ phân giải kém hơn), các protein sẽ có sự dịch chuyển khác nhau dựa trên kích thước của chúng,các protein nhỏ hơn sẽ đi nhanh hơn xuống phía dưới của gel, trong khi các phân tử lớn vẫn còn ở vị trí

gần với điểm xuất phát Vì thế, protein có thể được phân tách theo kích thước (và vì thế, theo khối lượngphân tử) Sau điện di, gel được nhuộm (phổ biến nhất là Coomassie Brilliant Blue hoặc thuốc nhuộm bạc),cho phép quan sát các protein được phân tách, hoặc những tiến trình xa hơn (ví dụ: Western blot, xemchương 7) Sau khi nhuộm, các protein khác nhau sẽ xuất hiện ở các băng phân biệt trong gel Quá trìnhđiện di thường được chạy kèm với protein marker của các khối lượng phân tử đã biết ở một đường riêngbiệt trong gel, để canh chỉnh gel và xác định khối lượng của protein chưa biết bằng cách so sánh vớikhoảng cách dịch chuyển liên quan với marker.

Điện di polyacrylamide gel thường là chọn lựa đầu tiên khi thử nghiệm sự tinh sạch protein do tínhđáng tin cậy và dễ dàng của nó Sự có mặt của SDS và bước gây biến tính làm cho các protein được phântách đơn độc dựa trên kích thước Các tác nhân bẩn cũng có thể cùng dịch chuyển và xuất hiện một băngkhông mong muốn tương tự protein Sự đồng dịch chuyển này cũng có thể làm cho một protein sẽ chạy ởmột vị trí khác hoặc không thể xâm nhập vào gel Đây là điều quan trọng để nhuộm gel hoàn toàn baogồm phần stacking Coomassie blue có ái lực liên kết yếu với glycoprotein và các protein dạng sợi, đã làmcản trở chất lượng điện di

2.1.4 Hệ thống đệm

Hầu hết điện di phân tách protein được thực hiện với một hệ thống đệm không liên tục tăng cườngmột cách ý nghĩa hình dạng của băng trong gel Trong suốt quá trình điện di ở hệ thống gel không liên tục,một gradient ion được tạo thành trong giai đoạn sớm của điện di làm cho tất cả protein tập trung trong mộtbăng dạng đơn

Nhiều người sử dụng liên tục đệm Tris-glycine hoặc Laemmli tập trung và phân giải ở pH 8,3-9,0.Các pH này khởi động sự tạo thành cầu nối disulfide giữa các gốc cysteine trong protein, đặc biệt khichúng hiện diện ở nồng độ cao do pKa của cysteine nằm trong phạm vi từ 8-9 và bởi vì tác nhân khử hiệndiện trong đệm nạp (loading buffer) không đồng dịch chuyển với các protein Những tiến bộ gần đây trongcông nghệ đệm đã làm nhẹ bớt vấn đề này bằng cách hòa tan protein ở pH tốt dưới pKa của cysteine (vídụ: bis-Tris, pH 6,5) và bao gồm các tác nhân khử (ví dụ: sodium bisulfite) là yếu tố di chuyển vào gelphía trước các protein để duy trì một môi trường khử Một lợi ích nữa của đệm được sử dụng với các pHthấp là acrylamide gel ổn định hơn vì thế gel có thể được bảo quản trong một thời gian dài trước khi sửdụng

2.2 Điện di 2D-PAGE

Ngoài điện di SDS, có thể điện di các protein tùy theo điểm đẳng điện (isoelectric point, IEP) củachúng Phương pháp này được gọi là điện di tập trung đẳng điện (isoelectric focusing, IEF) Trong dungdịch đệm có pH biến thiên liên tục (gradient pH), các protein sẽ phân ly đến vị trí tương thích với điểmđẳng điện của mình

Một hỗn hợp protein phức tạp được nạp vào ở giữa của mặt trái, ở đó pH là trung tính và một điện

áp được sử dụng trên khuôn gel Các protein sau đó dịch chuyển thông qua gel cho đến khi chúng hướngtới điểm đẳng điện của mình, là điểm mà ở đó điện tích của chúng tương tự như pH ở vùng chung quanh.Gel sau đó được ngâm trong dung dịch biến tính (để làm cho các protein không cuộn xoắn) chứa chất tẩy

là SDS Phân tử này tích điện âm rất mạnh và liên kết với tất cả protein, làm cho tất cả chúng đều mangđiện âm Một điện áp sau đó được sử dụng trên khuôn gel từ đầu này đến đầu kia để tất cả protein sẽchuyển động hướng tới anode, nhưng những protein nhỏ hơn sẽ chuyển động qua gel nhanh hơn, vì thếcác protein được phân tách theo kích thước của chúng

Kỹ thuật điện di 2 chiều (2D-PAGE, 2 dimension polyacryamide gel electrophoesis) được dùng đểphân tách hỗn hợp protein, và đặc biệt hữu ích cho việc so sánh các mẫu liên quan như mẫu mô bìnhthường và mẫu mô đột biến Comparative 2D-PAGE cũng có thể được dùng để tìm kiếm các protein mà

sự biểu hiện của chúng rất tương đồng dưới cùng một tập hợp các điều kiện (những yếu tố này có các

Công ngh DNA tái t h.p - 32

chức năng liên quan) và nhận dạng các protein được sản xuất trong phản ứng với liệu pháp thuốc.

Hình 2.10 Điện di protein hai chiều

Có khoảng 10.000 protein khác nhau trong tế bào, tập trung trong hơn sáu loại quan trọng Kỹ thuật2D-PAGE không đủ nhạy để phát hiện các protein hiếm và nhiều protein sẽ không được phân giải Vì thế,cần phải phân cắt mẫu trong các phần khác nhau để làm giảm sự phức tạp của hỗn hợp protein trước khithực hiện 2D-PAGE

Hai phương pháp điện di theo khối lượng phân tử và điểm đẳng điện có thể kết hợp với nhau tạo nên

kỹ thuật điện di 2 chiều Điện di protein trên polyacrylamide gel cho phép phân đoạn, xác định khối lượngphân tử và phân lập protein Ngoài ra, khối lượng protein còn được xác định chính xác bằng phương phápsắc ký khối phổ

Tài liệu tham khảo/đọc thêm

1 Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K 2002 Short

Protocol in Molecular Biology Vol 1 and 2 5th ed John Wiley & Sons, Inc USA.

2 Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J 2000 Molecular Cloning-A Laboratory Manual Cold Spring

Habor Laboratory Press, USA.

3 Rapley R and Walker JM 1998 Molecular Biomethods Handbook Humana Press Inc New Jersey,

USA.

4 Rickwood D and Hames BD 1984 Gel Electrophoresis of Nucleic Acids IRL Press Ltd Oxford, UK.

5 Surzycki S 2000 Basic Techniques in Molecular Biology Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, Germany.

6 Westermeier R 2005 Electrophoresis in Practice 4th ed Wiley-VCH Verlag GmbH & Co KgaA.

Weinheim, Germany.

1Agar: một galactan phức hợp tách chiết từ một số loài tảo đỏ như Gelidium và Gracilaria spp., được sử

dụng rộng rãi ở dạng gel làm giá thể rắn hoặc bán rắn cho môi trường nuôi cấy vi sinh vật và thực vật

PCR dựa trên cơ sở phản ứng kéo dài primer nhờ enzyme Taq polymerase để khuếch đại in vitro

các nucleic acid đặc hiệu trong thiết bị điều nhiệt tuần hoàn (thermocycler) còn gọi là máy PCR (Hình3.1) PCR cho phép khuếch đại theo hàm mũ lên đến hàng triệu lần các đoạn DNA có chiều dài từ200-3.000 bp Đoạn DNA được khuếch đại (DNA đích) được nhận dạng nhờ cặp primer đặc hiệu(oligonucleotide) thường có chiều dài khoảng 20 nucleotide

Hình 3.1 Thiết bị điều nhiệt tuần hoàn

I Nguyên tắc của PCR

Taq polymerase (xem chương 1) là một loại enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (có ở vi khuẩn chịu

nhiệt độ cao Thermus aquaticus) được dùng để tổng hợp các đoạn DNA mới trong môi trường có bốn loại

deoxyribonucleotide (dATP, dCTP, dGTP và dTTP) và hai primer, trên cơ sở khuôn mẫu của một đoạnDNA nhất định đã biết hoặc chưa biết trình tự Các đoạn DNA mới hình thành lại được sử dụng làmkhuôn mẫu Sau nhiều chu kỳ, số lượng đoạn DNA nói trên được nhân lên gấp nhiều lần, nhờ vậy có thể

đủ số lượng để tách ra, phân tích trình tự hoặc tạo dòng Primer ở bên trái tác động trên sợi DNA 3’-5’được gọi là primer thuận (forward primer, ký hiệu là F) Primer ở bên phải tác động trên sợi DNA 5’-3’được gọi là primer ngược (reverse primer, ký hiệu là R)

Nguyên tắc của PCR được trình bày trong hình 3.2 và 3.3 Theo đó, từ chu kỳ thứ hai Taq DNApolymerase (gọi tắt là Taq pol) bắt đầu tạo ra các đoạn DNA có chiều dài xác định Các primer thường làmột oligonucleotide tổng hợp (synthetic oligonucleotide) có khoảng 10-20 nucleotide hoặc hơn Nếu biếttrình tự của đoạn gen cần khuếch đại thì có thể tổng hợp nhân tạo các primer tương ứng để thực hiện PCR

và tách chúng ra bằng kỹ thuật điện di PCR thường tiến hành khoảng 25-35 chu kỳ, qua đó từ 10-6 mgDNA ban đầu có thể khuếch đại (amplification) lên tới trên 1 mg (khoảng 2 kb) Mỗi chu kỳ PCR baogồm ba giai đoạn có nhiệt độ khác nhau:

- Gây biến tính (denaturation) ở 90-95oC

Trong giai đoạn biến tính, phân tử DNA khuôn mẫu ở dạng xoắn kép được tách thành hai sợi đơn

Công ngh DNA tái t h.p - 34

(single strands) Tất cả các phản ứng enzyme trong giai đoạn này đều bị dừng lại (ví dụ: phản ứng tổnghợp DNA từ chu kỳ trước đó).

- Gắn mồi (annealing) ở 40-65oC

Trong giai đoạn này các primer gắn vào các vị trí có trình tự tương đồng ở DNA khuôn mẫu Cácprimer bị lắc nhẹ chung quanh do chuyển động Brown vì thế các liên kết ion được tạo thành và bị đứt gãyliên tục giữa primer sợi đơn và DNA khuôn mẫu sợi đơn Các liên kết ion ổn định hơn tạo thành một đoạnnhỏ (các primer đã lắp ráp chính xác) và trên các đoạn nhỏ DNA sợi đôi đó (khuôn mẫu và primer) Taqpol có thể bắt đầu quá trình sao chép khuôn mẫu Ở giai đoạn này phạm vi nhiệt độ được sử dụng có thểrất rộng tùy thuộc vào trình tự nucleotide của primer, thông thường khoảng 55oC, nhưng có khi chỉ 35oChoặc đôi lúc lên đến 68oC

- Kéo dài phân tử (extension) ở nhiệt độ 70-72oC

Đây là khoảng nhiệt độ tối thích cho Taq pol tiến hành tổng hợp DNA bằng cách bổ sung các dNTPbắt đầu từ các vị trí có primer theo chiều 5’®3’ Các primer có một vài base gắn vào khuôn mẫu có mốiliên kết ion mạnh hơn lực phá vỡ các liên kết này sẽ không bị đứt gãy Các primer ở các vị trí không bắtcặp chính xác lại bị rời ra (do nhiệt độ cao) khỏi khuôn mẫu đã không tổng hợp được DNA

Hình 3.2 Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase

Hình 3.3 Các chu kỳ của kỹ thuật PCR

Có ba kỹ thuật PCR thông dụng: PCR chuẩn, PCR mỏ neo và PCR đảo ngược Trong PCR chuẩn (standard PCR), DNA khuôn mẫu được mở xoắn kép, sau đó hai primer tác động ở hai đầu sợi đơn, rồi

DNA mới được tổng hợp nhờ Taq pol với 4 loại deoxyribonucleotide (Hình 3.4).

Hình 3.4 Sơ đồ kỹ thuật PCR chuẩn

PCR mỏ neo (anchored PCR), kỹ thuật này yêu cầu chỉ cần biết trình tự nucleotide ở một đầu của

khuôn mẫu và gắn một đuôi đồng trùng hợp nhân tạo (ví dụ: dA) vào đầu kia (chưa biết trình tự) Sau đóđoạn DNA được khuếch đại nhiều lần nhờ một primer có trình tự đã biết trước và một primer thứ hai cóoligo(dT) (Hình 3.5)

PCR đảo ngược (inverse PCR), được dùng để khuếch đại các đoạn phân tử kế cận với đoạn có

trình tự DNA đã biết trước, phân tử DNA này được cắt hạn chế và nối lại nhờ enzyme DNA ligase để tạothành một vòng tròn có tính chất monomer, sau đó đoạn DNA được khuếch đại nhờ hai primer tươngđồng với đầu của trình tự đã biết trước (Hình 3.6)

Hình 3.5 Sơ đồ kỹ thuật PCR mỏ neo

2 Thực hiện phản ứng

Dưới đây là ví dụ minh họa cho một phản ứng khuếch đại:

2.1 Chuẩn bị dung dịch master mix và cho vào eppendorf tube (E-tube) loại 0,5 mL, trộn đều các thànhphần sau:

Hình 3.6 Sơ đồ kỹ thuật PCR đảo ngược

2.3 Bổ sung 5 mL DNA khuôn mẫu (100 ng) vào 40 mL dung dịch của master mix tube

2.4 Bổ sung 2 mL/1 tube dung dịch pha loãng của Taq pol

2.5 Đặt E-tube đựng dung dịch phản ứng vào heating block của máy PCR để thực hiện chế độ nhiệt theochu kỳ như sau:

- Chạy điện di để kiểm tra kết qủa PCR (Hình 3.7)

- Nếu chưa chạy điện di thì bảo quản sản phẩm PCR ở -20oC

- Thao tác trong tủ cấy vô trùng (hoặc không).

Công ngh DNA tái t h.p - 38

Hình 3.7 Điện di các sản phẩm PCR SM: Chuẩn kích thước DNA Các đường số 1, 2, 3, 4 và 5: Các sản phẩm

là một trình tự ngẫu nhiên mà nó còn mang đặc tính của các họ gen, những nhân tố có tính lặp lại (sự lặpđoạn đơn giản hay phức tạp) Tùy theo loài sinh vật và tùy theo cách thể hiện của trình tự DNA khuônmẫu, người ta sẽ thiết kế trình tự của primer và đối chiếu cẩn thận nó với số liệu lưu trữ trước đây nhằmloại trừ các sai sót về kỹ thuật Gần đây, người ta thường sử dụng phần mềm trong computer để thiết kếcác primer thích hợp cho từng mục tiêu nghiên cứu và có thể giúp loại bỏ các cặp primer được thiết kếkhông tối ưu

Khi thiết kế primer cần chú ý một số điểm như sau: Cố gắng chọn trình tự primer có khoảng 50%

GC Tránh G và C ở đầu 3’ của primer vì nó có thể làm tăng cơ hội tạo ra hiện tượng primer-dimers (haiprimer bắt cặp với nhau) Tránh chọn các vùng có trình tự tương đồng để hạn chế các primer tự gắn với

nhau Tính toán nhiệt độ nóng chảy (Tm) của primer với tổng số 4oC cho GC và 2oC cho AT, sau đó trừ đi

5oC từ giá trị này và đây chính là nhiệt độ ủ (Ta) của primer Nói chung, nhiệt độ ủ có giá trị thấp hơnnhiệt độ nóng chảy của primer Sự khác nhau từ 4-6oC giữa Tm primer và Ta dường như không ảnh hưởngđến hiệu suất của PCR

2 Nhiệt độ của quá trình ủ

Nhiệt độ ủ thích hợp là nhiệt độ sao cho ở đó đó 1/2 số primer sẽ gắn với DNA khuôn mẫu Côngthức dưới đây ứng dụng trong trường hợp primer có khoảng 20 oligonucleotide:

Ta = 4 (G + C) + 2 (A + T) – 5oC (1)Tuy nhiên, công thức này chỉ có tính tương đối, bằng kinh nghiệm nghiên cứu chúng ta mới có thể

có số liệu đúng về nhiệt độ cho quá trình ủ Số base của primer càng ít thì nhiệt độ này càng thấp và ngượclại

3 Magnesium

Nồng độ của Mg2+ (được cung cấp dưới dạng MgCl2) có thể ảnh hưởng đến nhiệt độ biến tính DNAkhuôn mẫu, quá trình ủ của primer, tính đặc hiệu của sản phẩm PCR, hoạt tính của Taq pol và độ chínhxác của kết quả Nồng độ thích hợp của Mg2+ là từ 0,5-2,5 mM ứng với nồng độ dNTP tổng số đã cho

Nồng độ Mg2+ cao sẽ làm cho phân tử DNA sợi đôi ổn định hơn và ngăn ngừa được sự biến chất hoàntoàn (mở xoắn để giải phóng sợi đơn của sản phẩm PCR trong mỗi chu kỳ) làm cho kết quả PCR nghèo đi.Mặt khác, nó còn làm cho hiện tượng bắt cặp giả (tại những vị trí không tương đồng) ổn định hơn dẫn đếnxuất hiện những sản phẩm PCR không đặc hiệu với số lượng khá lớn Ngược lại, nếu nồng độ Mg2+ quáthấp sẽ ảnh hưởng xấu đến quá trình tổng hợp DNA (Mg2+ đóng vai trò là một co-factor của Taq pol) Do

đó, cần phải xác định nồng độ tối ưu của Mg2+ nhằm đảm bảo hiệu suất khuếch đại và tính đặc hiệu củasản phẩm PCR

4 Các deoxyribonucleotide triphosphate (dNTPs)

Dung dịch stock của các dNTP phải có pH 7, nồng độ thường dùng là 10 mM (2,5 mM mỗi loại)được bảo quản ở -20oC Hàm lượng của các dNTP trong khoảng 20-200 mM cho kết quả ổn định, chínhxác và đặc hiệu Bốn loại dNTP được sử dụng cần có nồng độ tương đương nhau để giảm thiểu tối đa hiệntượng sai biệt do kết hợp sai (misincorporation) mã di truyền nào đó

5 Enzyme Taq pol

Nồng độ Taq pol thích hợp là từ 1-2,5 unit cho 100 mL dung dịch phản ứng Thông thường có thể sửdụng 0,5 unit/25 mL Nếu nồng độ Taq pol quá cao, có thể xuất hiện các sản phẩm PCR không đặc hiệu

và làm sai lệch kết quả Nếu nồng độ Taq pol quá thấp, sẽ không đủ lượng enzyme để xúc tác tạo ra sảnphẩm PCR mong muốn

6 Đệm ổn định hoạt động của Taq pol

Những chất ổn định Taq pol được sử dụng là gelatin và Triston X-100 trong đệm bảo quản enzyme.Nồng độ thường dùng là 0,01% gelatin và 0,1% (v/v) Triston X-100

7 Nồng độ các primer

Trong hầu hết các ứng dụng của PCR, hai primer F và R đều phải có nồng độ bằng nhau Nồng độcuối cùng của mỗi primer là 0,1 mM, tương đương với 2,5 pmol (16,25 ng của 20-mer) trong 25 mL dungdịch phản ứng Sử dụng nồng độ primer cao không cần thiết và thường tạo ra bất lợi, vì quá thừa primer sẽ

có hiện tượng primer-dimers và hiện tượng gắn primer nhầm vị trí trên khuôn mẫu

8 Nồng độ DNA khuôn mẫu

PCR bao gồm hai giai đoạn: giai đoạn sàng lọc và giai đoạn khuếch đại Nếu các chất trong thànhphần phản ứng (bao gồm primer) có nồng độ cao trong khi DNA khuôn mẫu lại có nồng độ thấp thì giaiđoạn sàng lọc của PCR sẽ trở nên khó khăn hơn, vì tần suất để primer và DNA khuôn mẫu gặp nhau giảm

rõ rệt, trong khi sự tiếp xúc giữa primer và primer lại tăng lên gây ra hiện tương primer-dimers trong giaiđoạn khuếch đại Thông thường, nồng độ DNA khuôn mẫu được sử dụng trong khoảng từ 10-100 ng/25

mL dung dịch phản ứng

9 Tỷ lệ giữa primer và DNA khuôn mẫu

Một trong những yếu tố quan trọng nhất của PCR là tỷ lệ tối ưu giữa primer và DNA khuôn mẫu.Nếu tỷ lệ này quá cao thì hiện tượng primer-dimers sẽ xuất hiện, giống như trường hợp mẫu DNA quáloãng Nếu tỷ lệ này quá thấp kết quả sản phẩm PCR sẽ không nhiều Trong hầu hết các trường hợp ápdụng PCR, người ta đều dùng nồng độ primer không quá 0,5 mM (12,5 pmol/25 mL) và tính toán nồng độDNA khuôn mẫu để tránh hiện tượng primer-dimers

Công ngh DNA tái t h.p - 40