Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số giống ngô

Nghiên cứu tính đa dạng di truyền, một số giống ngô

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM -

TRẦN THỊ NGỌC DIỆP

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN

CỦA MỘT SỐ GIỐNG NGÔ (ZEA MAYS L.)

luËn v¨n th¹c sÜ sinh häc

Thái Nguyên: 2009

Trang 2

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

-

TRẦN THỊ NGỌC DIỆP

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA

MỘT SỐ GIỐNG NGÔ (ZEA MAYS L.)

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60.42.70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Ng-êi h-íng dÉn khoa häc: PGS.TS CHU HOÀNG MẬU

Thái Nguyên: 2009

Trang 3

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số

liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực, chưa có ai công bố

Tác giả

Trần Thị Ngọc Diệp

Trang 4

Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái nguyên, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh – KTNN và các thầy cô giáo, cán

bộ trong khoa đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn sự động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện của Ban giám hiệu Trường Đại học Hùng Vương, Ban chủ nhiệm khoa Nông – Lâm – Ngư, cùng các đồng nghiệp, gia đình và bạn bè đã tạo mọi điều kiện

và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và làm luận văn

Tác giả

Trần Thị Ngọc Diệp

Trang 5

MỤC LỤC

Trang Lời cam đoan……… i

Lời cảm ơn……… ii

Mục lục……… iii

Những chữ viết tắt……… vi

Danh mục các bảng……… vii

Danh mục các hình……… viii

MỞ ĐẦU……… 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU……… 3

1.1.CÂY NGÔ……… 3

1.1.1.Nguồn gốc và phân loại cây ngô……… 3

1.1.2.Đặc điểm nông sinh học của cây ngô……… 3

1.1.3.Vai trò cây ngô trong nền kinh tế……… 5

1.1.4.Đặc điểm hóa sinh hạt ngô……… 7

1.1.5.Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và ở Việt Nam……… 8

1.1.5.1.Tình hình sản xuất ngô trên thế giới……… 8

1.1.5.2.Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam……… 12

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở THỰC VẬT……… 13

1.2.1.Một số phương pháp sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu

quan hệ di truyền thực vật……… 13

1.2.1.1.Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms –

đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn)……… 14

1.2.1.2 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – đa

Trang 6

hình độ dài các đoạn được nhân bản chọn lọc)……… 14

1.2.1.3 Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat – trình tự lặp lại đơn giản)……… 15

1.2.1.4.Bản đồ QTL (Quantiative Trait loci)……… 17

1.2.1.5 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)…… 17

1.2.2 Nghiên cứu sự đa dạng di truyền ở thực vật bằng kỹ thuật RAPD 20

1.2.3.Tình hình nghiên cứu sự đa dạng di truyền của ngô bằng kỹ thuật RAPD 22

1.3 NHẬN XÉT CHUNG……… 24

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP……… 25

2.1.VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU……… 25

2.1.1.Vật liệu thực vật……… 25

2.1.2.Hoá chất……… 25

2.1.3.Thiết bị……… 26

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 26

2.2.1.Phương pháp hóa sinh……… 26

2.2.1.1.Xác định hàm lượng lipid……… 26

2.2.1.2.Xác định hàm lượng protein……… 26

2.2.1.3.Xác định hàm lượng đường tan 27

2.2.2.Phương pháp sinh học phân tử 27

2.2.2.1.Phương pháp tách DNA từ lá non của ngô 27

2.2.2.2.Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch DNA tổng số 28

2.2.2.3.Phản ứng RAPD 29

2.2.2.4.Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu 30

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, HÓA SINH HẠT CỦA CÁC GIỐNG NGÔ NGHIÊN CỨU 31

Trang 7

3.1.1.Đặc điểm hình thái của 14 giống ngô nghiên cứu 31

3.1.2.Hàm lượng protein, lipid, đường của 14 giống ngô nghiên cứu 32

3 2 PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH DNA BẰNG KỸ THUẬT RAPD 35

3.2.1.Kết quả tách chiết DNA tổng số từ lá ngô 35

3.2.2.Kết quả nghiên cứu đa hình DNA bằng kỹ thuật RAPD 37

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

Trang 8

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

dài các phân đoạn được nhân bản) ASTT Áp suất thẩm thấu

dNTP Deoxyribonucleotit triphotphat

EDTA Ethylene Diamin Tetraaxetic Acid

LEA Late Embryogeneis Abundant protein (Protein tổng hợp với lượng

lớn ở giai đoạn cuối của quá trình phát triển phôi)

hình được nhân bản ngẫu nhiên)

các phân đoạn ADN cắt hạn chế) SDS Sodium Dodecyl Sulphat

SDS-PAGE Phương pháp điện di trên gel polyacrylamid có chứa SDS

Trang 9

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Thành phần hoá học của hạt ngô và gạo (Phân tích trên 100)… 8

1.3 Tình hình sản xuất ngô của một số khu vực trên thế giới

1.4 Tình hình sản xuất ngô của một số quốc gia trên thế giới

1.5 Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam từ năm 2004 đến năm 2006 13

2.2 Trình tự các nucleotide của 10 mồi RAPD sử dụng trong

3.2 Hàm lượng protein, lipid, đường trong hạt của 14 giống ngô 33

3.4 Số phân đoạn DNA xuất hiện ở từng giống ngô nghiên cứu… 38

Trang 10

DANH MỤC CÁC HÌNH

3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M1 của 14

Trang 11

1

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Cây ngô có tên khoa học là Zea mays L và có nguồn gốc từ Trung Mỹ

Ngô là cây lương thực quan trọng trong nền kinh tế toàn cầu Ở các nước thuộc Trung Mỹ, Nam Á và Châu Phi, người ta sử dụng ngô làm lương thực chính Không những thế, ngô còn là cây cung cấp thức ăn chăn nuôi quan trọng nhất hiện nay: 70% chất tinh trong thức ăn tổng hợp của gia súc là từ ngô (Ngô Hữu Tình, 2003) [18] Ngô không chỉ cung cấp lương thực cho con người, phát triển chăn nuôi, ngô còn là nguyên liệu cho ngành công nghiệp chế biến trên toàn thế giới Hiện nay, diện tích ngô trên thế giới vào khoảng

135 - 140 triệu ha, với sản lượng trung bình là 600 - 700 triệu tấn

Ở Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa của nông dân vùng trung du và miền núi phía Bắc nói chung và cây lương thực chính của đồng bào dân tộc thiểu số vùng cao nói riêng [1] Trong những năm gần đây sản xuất ngô ở Việt Nam tăng lên nhanh nhờ sự thúc đẩy của ngành chăn nuôi và công nghiệp chế biến Đặc biệt từ những năm 1990 trở lại đây, diện tích, năng suất và sản lượng ngô tăng liên tục là nhờ ứng dụng những tiến bộ khoa học kỹ thuật mới vào sản xuất mà tiêu biểu là đưa ngô lai vào trồng trên diện tích rộng Các giống ngô ở nước ta hiện nay rất phong phú gồm các giống ngô nhập nội, giống lai tạo, giống tổng hợp, giống đột biến và các giống ngô địa phương [20]

Bên cạnh các giống ngô lai có năng suất cao đang được trồng phổ biến ở nhiều vùng trong cả nước, thì các giống ngô địa phương tuy có năng suất thấp nhưng chất lượng hạt cao, chất lượng ngô dẻo, thơm, ngon và chống chịu sâu bệnh tốt

Hiện nay, có rất nhiều phương pháp để nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các giống cây trồng nói chung và cây ngô nói riêng như RFLP, AFLP,

Trang 12

2

SSR, STS, RAPD, Các phương pháp này khắc phục được nhược điểm của các phương pháp chọn giống truyền thống bởi đánh giá được hệ gen của cây trồng

Những năm gần đây, diện tích trồng các giống ngô địa phương ngày càng có xu hướng giảm, nhiều giống ngô nếp quý hiếm sẽ bị mất dần Như vậy, việc sưu tập và nghiên cứu các giống ngô nếp địa phương góp phần bảo tồn nguồn gen cây ngô là rất cần thiết

Nghiên cứu sự đa dạng di truyền ở mức DNA và đặc điểm hóa sinh ở giai đoạn hạt là cơ sở khoa học để đề xuất việc chọn những giống ngô có năng suất cao và chất lượng tốt góp phần bảo tồn, phát triển nguồn gen cây ngô Từ

đó tuyển chọn giống ngô thích hợp làm vật liệu chọn giống là những vấn đề rất được quan tâm nghiên cứu Xuất phát từ lý do trên, chúng tôi tiến hành thực

hiện đề tài: “Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số giống ngô (Zea

mays L.)”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Đánh giá chất lượng hạt của một số giống ngô nếp địa phương (Zea mays L.)

- Khảo sát sự đa dạng và mối quan hệ di truyền của 14 giống ngô bằng kỹ thuật RAPD

3 Nội dung nghiên cứu

- Phân tích đặc điểm hình thái, khối lượng và kích thước hạt của một số giống ngô nếp địa phương

- Xác định hàm lượng lipid, protein, đường trong hạt của các giống ngô nghiên cứu

- Phân tích sự đa hình DNA được nhân bản ngẫu nhiên, xác định mức sai khác trong cấu trúc DNA hệ gen của các giống ngô nghiên cứu

- Thiết lập mối quan hệ di truyền của 14 giống ngô

Trang 13

3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY NGÔ

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây ngô

Cây ngô (Zea mays L.) thuộc chi Maydeae, họ hòa thảo Gramineae,

có nguồn gốc từ Trung Mỹ Ngô có bộ nhiễm sắc thể (2n=20) Có nhiều cách để người ta phân loại ngô, một trong các cách đó là dựa vào cấu trúc nội nhũ của hạt và hình thái bên ngoài của hạt Ngô được phân thành các loài phụ: ngô đá rắn, ngô răng ngựa, ngô nếp, ngô đường, ngô nổ, ngô bột, ngô nửa răng ngựa Từ các loài phụ dựa vào màu hạt và màu lõi ngô được phân chia thành các thứ Ngoài ra ngô còn được phân loại theo sinh thái học, nông học, thời gian sinh trưởng và thương phẩm [12]

Có rất nhiều giả thuyết về nguồn gốc của ngô tại châu Mỹ như ngô là

sản phẩm thuần dưỡng trực tiếp từ cỏ ngô (Zea mays ssp parviglumis) một

năm ở Trung Mỹ, có nguồn gốc từ khu vực thung lũng sông Balsas ở miền nam Mexico Cũng có giả thuyết khác cho rằng ngô sinh ra từ quá trình lai ghép giữa ngô đã thuần hóa nhỏ (dạng thay đổi không đáng kể của ngô dại)

với cỏ ngô thuộc đoạn Luxuriantes Song điều quan trọng nhất nó đã hình

thành vô số loài phụ, các thứ và nguồn dị hợp thể của cây ngô, các dạng cây và biến dạng của chúng đã tạo cho nhân loại một loài ngũ cốc có giá trị đứng cạnh lúa mì và lúa nước [12]

1.1.2 Đặc điểm nông sinh học của cây ngô

Cơ quan sinh dưỡng của ngô gồm rễ, thân và lá làm nhiệm vụ duy trì đời sống cá thể Hạt được coi là cơ quan khởi đầu của cây

Sau khi gieo hạt, ngô phát triển thành mầm Cây mầm chủ yếu sử dụng nguồn dinh dưỡng chứa trong nội nhũ hạt Bộ phân phía trên hạt phát triển lên mặt đất gồm có trụ giữa lá mầm Phần đỉnh trụ lá mầm có mấu bao

Trang 14

4

lá mầm, từ đó phát sinh bao lá mầm và bên trong bao lá mầm là thân lá mầm Trên trục của cây mầm, một đầu hình thành rễ cây mầm, sau đó phát triển thành rễ chính, từ rễ chính hình thành các rễ phụ Ngô là cây có rễ chùm tiêu biểu cho bộ rễ cây hòa thảo Hệ rễ có ba loại: rễ mầm, rễ đốt và

rễ chân kiềng Rễ đốt giúp cho cây hút nước và các chất dinh dưỡng Rễ chân kiềng mọc xung quanh các đốt phần thân sát gốc trên mặt đất, rễ này giúp cây chống đổ, đồng thời cũng tham gia vào hút nước và thức ăn cho cây Số lượng rễ, số lông rễ và chiều dài rễ khác nhau ở mỗi giống

Thân ngô thường phát triển mạnh, thẳng cứng dạng bền chắc Thân chia làm nhiều gióng, các gióng nằm giữa các đốt, các gióng dài và to dần

từ dưới lên

Lá ngô mọc từ mắt trên đốt và mọc đối xứng xen kẽ nhau Độ lớn và

số lá ngô dao động từ 6 đến 22 là tùy thuộc vào giống và điều kiện tự nhiên Lá ngô trưởng thành bao gồm các bộ phận: bẹ lá, phiến lá và thìa lá Bắp ngô phát sinh từ mầm nách lá trên thân, số mầm nách lá trên cây ngô nhiều, nhưng chỉ 1-3 mầm nách trên cùng phát triển thành bắp Tuỳ thuộc vào giống, điều kiện sinh thái, chăm bón, mật độ, mùa vụ… mà tỷ lệ cây 2-3 bắp, số hạt trên bắp, vị trí đóng bắp, thời gian phun râu, trỗ cờ…có khác nhau

Hạt ngô thuộc loại quả dĩnh gồm 4 bộ phân chính: vỏ hạt, lớp alơron, phôi và nội nhũ Phía dưới hạt có gốc hạt gắn liền với lõi ngô Vỏ hạt bao bọc xung quanh, màu sắc vỏ hạt tùy thuộc vào từng giống, nằm sau lớp vỏ hạt là lớp alơron bao bọc lấy nội nhũ và phôi Nội nhũ là thành phần chính 70-78% trọng lượng hạt, thành phần chủ yếu là tinh bột, ngoài ra còn có protein, lipid, vitamin, khoáng và enzyme để nuôi phôi phát triển Phôi ngô lớn (chiếm 8-15%) nên cần chú trọng bảo quản [12]

Trang 15

5

Mỗi một giai đoạn sinh trưởng, cây ngô yêu cầu về điều kiện sinh thái khác nhau Trong điều kiện đảm bảo về ẩm độ, ôxy và nhiệt độ thích hợp cho ngô nảy mầm nhanh sau khi gieo Nhiệt độ tối thiểu cho hạt nảy mầm

từ 8 – 120C, nhiệt độ tối đa cho hạt nảy mầm từ 40 – 450C, nhiệt độ tối thích từ 25 – 280C Ở các thời kỳ sinh trưởng khác nhau thì sự hút chất dinh dưỡng cũng như yêu cầu về dinh dưỡng của ngô cũng khác nhau: Ở thời kỳ đầu cây ngô hút chất dinh dưỡng chậm, thời kỳ từ 7 - 8 lá đến sau trỗ 15 ngày toàn bộ các bộ phận trên mặt đất cũng như các bộ phận dưới mặt đất của cây ngô tăng trưởng nhanh, các cơ quan sinh trưởng phát triển mạnh, lượng tinh bột và chất khô tăng nhanh Đây là giai đoạn cây ngô hấp thu chất dinh dưỡng tối đa (bằng 70 - 90% dinh dưỡng cả vòng đời cây hút) Ở thời kỳ này nếu cây thiếu nước và chất dinh dưỡng sẽ làm giảm năng suất từ 10 - 20% Trong các yếu tố dinh dưỡng thì đạm là nguyên tố dinh dưỡng quan trọng bậc nhất của cây ngô (Lê Đức Biên,1986) [2]

1.1.3 Vai trò cây ngô trong nền kinh tế

Ngô làm lương thực cho con người: Ngô là cây lương thực nuôi sống gần 1/3 dân số trên toàn thế giới, tất cả các nước trồng ngô nói chung đều

ăn ngô ở mức độ khác nhau Toàn thế giới sử dụng 21% sản lượng ngô làm lương thực cho người Các nước ở Trung Mỹ, Nam Á và Châu Phi sử dụng ngô làm lương thực chính Các nước Đông Nam Phi sử dụng 85% sản lượng ngô làm lương thực cho người, Tây Trung Phi 80%, Bắc Phi 42%, Tây Á 27%, Nam Á 75%, Đông Nam Á và Thái Bình Dương 39%, Đông Á 30%, Trung Mỹ và các vùng Caribe 61% Nếu như ở Châu Âu khẩu phần

ăn cơ bản là: bánh mỳ, khoai tây, sữa; Châu Á: cơm (gạo), cá, rau xanh (canh) thì châu Mỹ La Tinh là bánh ngô, đậu đỗ và ớt Vì vậy, trên phạm vi thế giới, ngô vẫn còn là cây lương thực rất quan trọng, vì ngô rất phong phú các chất dinh dưỡng hơn lúa mỳ và gạo

Trang 16

6

Ngô làm thức ăn gia súc: Ngô là thức ăn gia súc quan trọng nhất hiện nay Hầu như 70% chất tinh trong thức ăn tổng hợp là từ ngô, điều đó phổ biến trên toàn thế giới Ngoài việc cung cấp chất tinh, cây ngô còn là thức

ăn xanh và ủ chua lí tưởng cho đại gia súc

Những năm gần đây cây ngô còn là cây thực phẩm, người ta dùng bắp ngô bao tử làm rau cao cấp Sở dĩ, ngô rau được dùng vì nó sạch và có hàm lượng dinh dưỡng cao Các thể loại ngô nếp, ngô đường (ngô ngọt) được dùng làm thức ăn tươi (luộc, nướng) hoặc đóng hộp làm thực phẩm xuất khẩu

Ngô là nguyên liệu chính cho các nhà máy thức ăn gia súc tổng hợp, ngô còn là nguyên liệu cho các nhà máy sản xuất rượu, tinh bột, bánh kẹo… Người ta đã sản xuất ra các mặt hàng khác nhau cho các ngành công nghiệp lương thực - thực phẩm, công nghiệp dược và công nghiệp nhẹ Ngô cũng là hàng hoá xuất khẩu Hàng năm lượng ngô xuất khẩu khoảng 70 triệu tấn Đó là nguồn lợi lớn của các nước xuất khẩu Các nước xuất khẩu chính là Mỹ, Pháp, Argentina, Trung Quốc, Thái Lan Các nước nhập chính là Nhật Bản, Hàn Quốc, Liên Xô cũ, Châu Phi, Mexico… [13]

Ngô vừa là cây lương thực, vừa là cây thức ăn cho gia súc Chính vì vậy diện tích trồng ngô trên thế giới tăng không ngừng Năm 1979 diện tích trồng ngô chỉ đạt khoảng 127 triệu ha với tổng sản lượng là 475,4 triệu tấn, đến năm 2007 diện tích trồng ngô đạt 145,1 triệu ha với sản lượng 705,3 triệu tấn (theo số liệu thống kê của FAO, 2008)

Ở Việt Nam, cây ngô đã được trồng cách đây khoảng 300 năm và được trồng trên những điều kiện sinh thái khác nhau của cả nước Hàm lượng chất dinh dưỡng của ngô tùy thuộc vào từng giống, đặc biệt là các giống ngô nếp địa phương tuy năng suất không cao nhưng chất lượng của hạt ngô tốt phù hợp với thị hiếu của người tiêu dùng Vì vậy, việc nghiên

Trang 17

7

cứu đặc điểm hình thái, hóa sinh của các giống ngô giúp chọn được các giống ngô có năng suất cao và chất lượng tốt đáp ứng cho công tác giống

và nhu cầu sử dụng của con người

1.1.4 Đặc điểm hóa sinh hạt ngô

Các chất trong hạt ngô dễ bị đồng hóa nên có giá trị dinh dưỡng cao Hạt ngô chứa tinh bột, lipid, protein, đường (chiếm khoảng 3,5%), chất khoáng (chiếm khoảng 1 – 2,4%), vitamin (gồm vitamin A, B1, B2, B6, C

và một lượng rất nhỏ xenlulo (2,2%)

Hạt ngô chứa phần lớn tinh bột, hàm lượng tinh bột trong hạt thay đổi trong giới hạn 60 - 70% Hàm lượng tinh bột ở ngô tẻ nhiều hơn ngô nếp (68% so với 65%) Tinh bột tập trung chủ yếu ở nội nhũ và được chia thành hai dạng tinh bột là tinh bột mềm (tinh bột bột) và tinh bột cứng (tinh bột sừng hay tinh bột phalê)

Hàm lượng lipid cao thứ hai trong các loại ngũ cốc sau lúa mạch, nó chiếm khoảng (3,5 – 7%) và phụ thuộc vào từng giống, điều kiện tự nhiên Lipid được tập trung nhiều ở phôi và màng alơron Dầu ngô chứa đến 50% acid linoleic liên kết với glyxerit, acid oleic, panmitic, ricinic Hàm lượng lipid là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng hạt [9]

Protein của ngô được chia thành 3 dạng chính: protein hoạt tính (chủ yếu là emzyme), protein cấu tạo và protein dự trữ, trong đó protein dự trữ chiếm tỉ lệ cao nhất Hàm lượng protein dao động từ 4,8 đến 16,6,% tùy vào mỗi giống Lợi dụng tính chất hòa tan của protein trong các dung môi, người ta có thể tách triết protein tan từ ngô phục vụ cho nhiều mục đích nghiên cứu như đánh giá chất lượng hạt, khả năng chịu hạn…

Thành phần hoá học của hạt ngô vàng đều cao hơn so với gạo trắng Ngoài thành phần tinh bột, protein, lipid, ở ngô còn chứa nhiều loại vitamin, trong đó vitamin C cao nhất Về nhiệt lượng của ngô cao hơn gạo

Trang 18

1.1.5 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và ở Việt Nam

1.1.5.1 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới

Trong những năm gần đây diện tích ngô trên toàn thế giới đã tăng lên gấp rưỡi, năng suất tăng gấp 2,5 lần Diện tích ngô hàng năm khoảng 139 triệu ha, năng suất bình quân khoảng 3,8 triệu tấn/ha, tổng sản lượng ngô trên 525 triệu tấn/ ha Ngô là cây có địa bàn phân bố vào loại rộng nhất thế giới, trải rộng hơn 90 vĩ tuyến: Từ 400N lên gần đến 550B, từ độ cao 1 - 2

m đến 400 m so với mực nước biển [13] Do đó, ngô được trồng ở hầu hết các nơi trên thế giới như Châu Mỹ, Châu Âu, Châu Úc, Châu Phi

Theo dự báo của Viện nghiên cứu chương trình lương thực thế giới (IPRI, 2003), vào năm 2020 tổng nhu cầu ngô thế giới là 852 triệu tấn, trong đó 15% dùng làm lương thực, 69% dùng làm thức ăn chăn nuôi, 16% dùng làm nguyên liệu cho công nghiệp Ở các nước phát triển chỉ dùng 5% ngô làm lương thực nhưng ở các nước đang phát triển sử dụng 22% ngô làm lương thực (IPRI, 2003) Đến năm 2020, nhu cầu ngô thế giới tăng 45%

so với nhu cầu năm 1997, chủ yếu tăng cao ở các nước đang phát triển

Trang 19

9

(72%), riêng Đông Nam Á nhu cầu tăng 70% so với năm 1997 (Bảng 1.2),

sở dĩ nhu cầu ngô tăng mạnh là do dân số thế giới tăng, thu nhập bình quân đầu người tăng, nên nhu cầu thịt, cá, trứng, sữa tăng mạnh, dẫn đến đòi hỏi lượng ngô dùng cho chăn nuôi tăng Nhưng thách thức lớn nhất là 80% nhu cầu ngô thế giới tăng (266 triệu tấn), lại tập trung ở các nước đang phát triển Hơn nữa chỉ khoảng 10% sản lượng ngô từ các nước công nghiệp có thể xuất sang các nước đang phát triển Vì vậy, các nước đang phát triển phải tự đáp ứng nhu cầu của mình (IPRI, 2003)

Bảng 1.2 Dự báo nhu cầu ngô thế giới đến năm 2020

(Triệu tấn)

Năm 2020 ( Triệu tấn)

(Nguồn: Viện nghiên cứu chương trình lương thực thế giới IPRI, 2003)

Theo Đại học Tổng hợp Iowa (2006), trong những năm gần đây khi thế giới cảnh báo nguồn dầu mỏ đang cạn kiệt, thì ngô đã và đang được chế biến ethanol, thay thế một phần nhiên liệu xăng dầu chạy ô tô tại Mỹ, Braxin, Trung Quốc, Riêng ở Mỹ, năm 2002 - 2003 đã dùng 25,2 triệu tấn ngô để chế biến ethanol, năm 2005 - 2006 dùng 40,6 triệu tấn và dự kiến năm 2012 dùng 190,5 triệu tấn ngô (Oxfarm, 2004) Diện tích, năng suất, sản lượng ngô giữa các châu lục trên thế giới có sự chênh lệch tương đối lớn được thể hiện bảng 1.3

Trang 20

Năng suất (Tạ/ha)

Sản lƣợng (Triệu tấn)

(Nguồn: Số liệu thống kê của FAOSTAT, 2008)

Qua bảng 1.3 cho thấy: Diện tích trồng ngô giữa các Châu lục có sự chênh lệch nhau trong đó Châu Á là khu vực có diện tích trồng ngô lớn nhất, năm 2005 là 43,7 triệu ha đến năm 2007 là 46,4 triệu ha, chiếm khoảng 31,6% diện tích ngô toàn thế giới Đứng ở vị trí thứ hai là khu vực Bắc và Trung Mỹ chiếm khoảng 28% diện tích trồng ngô thế giới Châu Âu là khu vực có diện tích trồng ngô thấp, chiếm khoảng 9,5% diện tích trồng ngô thế giới Nhìn chung diện tích trồng ngô của các khu vực trên thế giới biến động giữa các năm không đáng kể, nếu lấy 2007 làm mốc so sánh thì Châu Âu có giảm về mặt diện tích, còn Châu Á cùng với Bắc và Trung Mỹ thì diện tích tăng Bắc và Trung Mỹ là khu vực có năng suất cao nhất đạt 75,70 tạ/ha, đứng thứ hai là khu vực Châu Âu: 59,10 tạ/ha, và thấp nhất là Châu Á 39,91 tạ/ha (năm 2007) Sở dĩ Châu

Á có năng suất thấp chủ yếu là do khu vực này có điều kiện thời tiết bất thuận như: hạn hán, lũ lụt, đất canh tác chưa thuận lợi Giai đoạn 2005 -

2007, Châu Á và khu vực Bắc và Trung Mỹ năng suất tăng mạnh, Châu

Trang 21

11

Á tăng 2,4 tạ/ha, Bắc và Trung Mỹ tăng 9 tạ/ha, đến năm 2007 do nhiều lý do khác nhau hai khu vực này đều có năng suất giảm Bắc và Trung Mỹ là khu vực dẫn đầu về sản lượng ngô trên toàn thế giới, năm 2005 đạt 289,6 triệu tấn, chiếm 44,45% tổng sản lượng ngô toàn thế giới Đứng thứ hai là khu vực Châu

Á đạt 167,3 triệu tấn, chiếm 25,87%% tổng sản lượng ngô toàn thế giới Năm

2007 khu vực Bắc và Trung Mỹ đạt 312,0 triệu tấn, chiếm 45,08% tổng sản lượng ngô toàn thế giới, Khu vực Châu Á đạt 185,43 triệu tấn, chiếm 26,79% tổng sản lượng ngô toàn thế giới

Như vậy, trong giai đoạn từ năm 2005 đến 2007 diện tích trồng ngô trên thế giới tăng không đáng kể, nhưng do áp dụng các thành tựu khoa học kỹ thuật tiên tiến đặc biệt là việc mở rộng diện tích trồng ngô lai nên thế giới có sự nhảy vọt về năng suất và sản lượng ngô, nhất là các nước có nền kinh tế phát triển có điều kiện thâm canh cao và sử dụng 100% giống ngô lai trong sản xuất Trên thế giới có một số nước như Trung Quốc, Mỹ, Braxin chủ yếu là sử dụng ngô lai trong gieo trồng và cũng là những nước có diện tích trồng ngô lớn Tình hình sản xuất ngô của một số quốc gia trên thế giới được thể hiện qua bảng 1.4

Bảng 1.4 Tình hình sản xuất ngô của một số quốc gia trên thế giới năm 2007 Tên nước Diện tích

(Triệu ha)

Sản lượng (triệu tấn)

Trang 22

12

Qua bảng 1.4 cho thấy, Mỹ là nước có diện tích, năng suất, sản lượng lớn nhất đạt 30,08 triệu ha, với tổng sản lượng đạt 280,22 triệu tấn, năng suất bình quân đạt 100,64 tạ/ha Có thể nói, Mỹ và Trung Quốc là hai cường quốc

có diện tích trồng ngô lớn nhất và cao gấp nhiều lần so với các quốc gia khác Theo số liệu của tổ chức Nông nghiệp và Lương thực Liên hợp quốc (FAO) việc sản xuất và tiêu thụ ngô trên thế giới đang có sự mất cân đối giữa cung

và cầu dẫn đến tình trạng các nước nhập khẩu ngô tăng dần, còn các nước xuất khẩu ngô thì lại có xu hướng giảm Nước xuất khẩu ngô nhiều là Mỹ, Trung Quốc, Braxin, các nước nhập khẩu ngô chính là Nhật Bản, Nam Triều Tiên, Malayxia, Đối với các nước chậm phát triển, do điều kiện kinh

tế còn gặp nhiều khó khăn, đầu tư thấp, sử dụng các giống ngô địa phương, ngô thụ phấn tự do là chính, cho nên mặc dù trồng với diện tích lớn (trên 93,5 triệu ha) gấp 2 lần các nước phát triển nhưng sản lượng lại thấp hơn nhiều, hiện nay chỉ có 20 nước năng suất ngô vượt mức bình quân của thế giới Sản lượng ngô trên thế giới trong những năm gần đây có chiều hướng giảm nhẹ,

do diện tích ngô có phần bị thu hẹp nhưng sản lượng chỉ giảm ở những nước phát triển, còn đối với những nước đang phát triển sản lượng ngô lại tăng

Như vậy, trên thế giới trong những năm qua về năng suất ngô đã tăng nhanh ở một số nước phát triển và các nước đang phát triển Hiện nay, thị trường ngô trên thế giới được đánh giá là một thị trường tương đối khả quan Chính vì vậy mà sản xuất ngô trên toàn cầu sẽ tăng trưởng mạnh trong những năm tới (theo USDA 1/2003)

1.1.5.2 Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam

Ở Việt Nam, cây ngô đã được trồng cách đây khoảng 300 năm và được trồng trên những điều kiện sinh thái khác nhau của cả nước Là cây lương thực quan trọng thứ hai sau cây lúa, là cây trồng chính để phát triển ngành chăn nuôi Năng suất ngô ở nước ta trước đây rất thấp so với năng suất ngô

Trang 23

13

thế giới, do sử dụng giống ngô địa phương và áp dụng khoa học kỹ thuật vào sản xuất còn hạn chế Phải tới năm 1991 cây ngô lai mới bắt đầu được đưa vào sản xuất ở nước ta, tỷ lệ trồng giống lai từ 0,1% năm 1990, năm 2006 đã tăng lên 80% và đưa Việt Nam trở thành nước sử dụng giống lai nhiều và có năng suất cao của khu vực Đông Nam Á

Bảng 1.5 Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam từ năm 2004 đến năm 2006 Năm Diện tích

(1000 ha)

Sản lượng (1000 tấn)

đó, khu vực miền núi phía Bắc trồng chủ yếu là các giống ngô địa phương Năng suất của các giống ngô địa phương thường thấp, tuy nhiên các giống ngô địa phương vẫn tiếp tục được quan tâm nghiên cứu vì các ưu điểm như khả năng chịu hạn, kháng sâu bệnh tốt và có thể gieo trồng trên nhiều loại đất khác nhau Đặc biệt, những năm gần đây do kỹ thuật canh tác, do môi trường,

do sự xuất hiện các giống ngô lai và nhiều nguyên nhân khác dẫn đến sự cạn kiệt về nguồn gen giống ngô địa phương Vì vậy việc sưu tập, nghiên cứu và đánh giá nguồn gen các giống ngô địa phương là hết sức cần thiết

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở THỰC VẬT 1.2.1 Một số phương pháp sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu quan hệ di truyền thực vật

Trang 24

14

1.2.1.1 Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms –

đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn)

Kỹ thuật RFLP là kỹ thuật sử dụng các endonuclease giới hạn cắt DNA

hệ gen ở trình tự nhận biết đặc trưng tạo ra hàng loạt đoạn DNA có độ dài xác định, số lượng các đoạn này phụ thuộc vào số điểm nhận biết trong hệ gen

Đa hình độ dài này được phát hiện bởi đánh dấu phóng xạ các mẫu dò DNA

bổ sung tạo ra từ cùng một locus RFLP là chỉ thị đồng trội Ưu điểm của RFLP là: chỉ thị tin cậy trong phân tích liên kết và chọn giống vì chúng có thể xác định được một tính trạng ở trạng thái đồng hợp hoặc dị hợp trong một cá thể, tận dụng được biến dị tự nhiên, phát hiện tính biến dị của DNA trong các giai đoạn phát triển ở cơ quan khác nhau và xây dựng quan hệ di truyền, nghiên cứu quan hệ họ hàng Nhược điểm của RFLP là kỹ thuật phức tạp, tốn kém và mất thời gian Phương pháp này đòi hỏi một lượng DNA lớn (50 – 200ng từ mỗi cá thể) [6]

Ignjatovic-Micic D và cs (2003) đã sử dụng kỹ thuật RFLP kết hợp với

kỹ thuật RAPD để xác định quan hệ di truyền của 2178 giống ngô địa phương Kết quả xác định khoảng cách di truyền dao động từ 0,1311 đến 0,5075 Tác giả kết luận, dữ liệu phân tích RAPD và RFLP đều cho kết quả giống nhau nên có thể dùng cả hai phương pháp này để xác định đa hình di truyền [33]

Moretti A và cs (2008) đã sử dụng RFLP để xác định quan hệ di truyền

của Fusarium subglutinans gây bệnh ở ngô [37]

1.2.1.2 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – đa hình độ dài các đoạn đƣợc nhân bản chọn lọc)

Kỹ thuật AFLP là kỹ thuật kết hợp của RFLP và PCR AFLP phát hiện

một cách có chọn lọc các đoạn DNA hệ gen được cắt bởi enzyme giới hạn và

gắn với adaptor (đoạn tiếp hợp) AFLP hoạt động dựa trên nhiều nguyên tắc

Trang 25

15

tương tự như RAPD, tuy nhiên có điểm khác biệt là mồi bao gồm hai phần: phần cố định dài khoảng 15 bp chứa điểm nhận biết của enzyme giới hạn, phần thay đổi dài khoảng 2-4 bp Phân tích sản phẩm PCR được điện di trên gel polyacryamide có độ phân giải cao Sự đa hình được xác định bởi sự có mặt hay không có mặt của một phân đoạn DNA AFLP rất có hiệu quả trong xác định quan hệ di truyền và lập bản đồ Hiện nay, phân tích AFLP sử dụng phương pháp nhuộm bạc nên dễ áp dụng, tuy giá thành cao hơn với phương pháp RAPD Kỹ thuật AFLP có ưu điểm là phân tích đa hình trong khoảng thời gian ngắn, đòi hỏi lượng DNA ít, cho sự đa hình cao, tuy nhiên việc thiết

96 dòng ngô nghiên cứu thành 17 nhóm [36]

Hartings H và cs (2008) cũng sử dụng kỹ thuật này để xác định khoảng cách di truyền của 54 giống ngô Italy [32]

Garcia và cs (2004) đã kết hợp các kỹ thuật RAPD, RFLP, AFLP và SSR

để nghiên cứu đa dạng di truyền của 18 dòng ngô lai Sử dụng kỹ thuật AFLP thu được 774 băng đa hình, kỹ thuật RAPD khuếch đại được 262 băng DNA,

kỹ thuật RFLP thu được 185 băng và SSR nhận được 68 băng đa hình [30] Thomas Lübberstedt và cs (2000) đã xác định quan hệ di truyền của một

số giống ngô lai bằng kỹ thuật AFLP với việc sử dụng 8 mồi AFLP thu được

462 băng DNA đa hình [48]

1.2.1.3 Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat – trình tự lặp lại đơn giản)

Kỹ thuật SSR còn được gọi là kỹ thuật microsatellies (vi vệ tinh) Kỹ thuật này được Litt và Luty phát triển năm 1989 dựa trên nguyên tắc của PCR [36]

Trang 26

16

Trong cấu trúc hệ gen của sinh vật nhân chuẩn tồn tại một loạt các trình

tự nucleotide lặp lại, chúng đặc trưng cho loài SSR gồm 2 - 5 nucleotide lặp lại nhiều lần Ví dụ: (AT)n, (AG)n, (AGTC)n SSR nằm rải rác trong hệ gen của thực vật bậc cao Đoạn mồi được thiết kế dựa trên vùng bảo thủ ở hai đầu của đoạn SSR Số lần lặp lại nhiều lần làm cho các phân đoạn DNA được nhân có độ dài ngắn khác nhau Các trình tự lặp lại thường có ở vùng dị nhiễm sắc trên mỗi nhiễm sắc thể Chúng có vai trò điều hoà hoạt động của các gen, góp phần làm tăng tính ổn định cơ học của nhiễm sắc thể trong phân bào, nó có thể mang thông tin di truyền liên quan đến sự xác định giới tính ở

cả động vật và thực vật Do sự khác nhau về số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại mà số đơn vị lặp lại xuất hiện sự đa hình về độ dài của SSR được nhân bản Mức độ đa hình được xác định sau khi điện di sản phẩm trên gel agarose và gel polyacrylamide SSR được phân tích trên nhờ PCR nên chỉ cần đòi hỏi một lượng mẫu DNA rất nhỏ SSR là công cụ hữu ích trong phân tích hệ gen và chọn giống cây trồng vì đây là chỉ thị đồng trội có khả năng phát hiện tính đa hình rất cao Trong thực tế chỉ thị này đã được sử dụng nghiên cứu một số tính trạng liên quan đến năng suất, bệnh dại, xác định giới tính, phân tích quan hệ di truyền, lập bản đồ gen…Song nhược điểm của chỉ thị này là sự phức tạp trong thiết kế mồi và đánh giá thiết kế mồi cao

Kỹ thuật SSR được Qi-lun Yao và cs (2007) sử dụng để xác định khoảng cách di truyền của 54 giống ngô từ Tây Nam Trung Quốc dựa trên 42 cặp mồi SSR, tổng số alelle thu được là 256, trung bình mỗi locus có 6,1 alelle [44] Legesse B.W và cs (2007) cũng sử kỹ thuật này để nghiên cứu mức độ

đa dạng di truyền và đánh giá cấu trúc gen của các dòng ngô lai cận huyết Kết quả thu được 104 alelle với khoảng cách di truyền xác định được từ 0,28 đến 0,73, giá trị PIC là 0,58 [35]

Trang 27

17

Sharopova N và cs (2002) đã sử dụng kỹ thuật SSR để lập bản đồ di truyền đối với các giống ngô nhằm phân lập, chỉ rõ các đặc điểm của chúng [46]

1.2.1.4 Bản đồ QTL (Quantiative Trait loci)

Bản đồ các locut tính trạng số lượng (QTL) xác định mối liên kết giữa các phân tử với một tính trạng hình thái đang được quan tâm Qua biểu đồ QTL có thể xác định được những vùng nhiễm sắc thể có liên quan đến một trạng thái Để lập bản đồ QTL, cần tiến hành: (1) Xác định cặp lai; (2) Lai và tạo quần thể cho bản đồ; (3) Theo dõi sự phân ly của các chỉ thị trong quần thể; (4) Xử lý thống kê và lập bản đồ Lập bản đồ QTL nhằm xác định vị trí, hiệu quả gen và hoạt động của các locus liên quan trong tương tác gen và tương tác QTL với môi trường, từ đó chọn lọc nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử (MAS-Marker Assisted Selection)

Kỹ thuật QTL cũng được Zhu J và cs (2005) sử dụng để lập bản đồ cho cây ngô với mục đích nhận dạng, định lượng trạng thái locus, điều hoà độ dài của rễ phụ, xác định mức độ mềm dẻo của rễ nguyên thuỷ, xác định 6 bản đồ QTL có liên quan tới 53,1% các biến đổi phospho ở hạt [53]

1.2.1 5 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Kỹ thuật RAPD là kỹ thuật phân tích sự đa hình các phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên, do hai nhóm nghiên cứu của Williams và CS (1990) [52] và Welsh và McClelland (1991) đồng thời xây dựng [51] Đây là một kỹ thuật phát hiện chỉ thị di truyền dựa trên phản ứng chuỗi polymerase (PCR) [27] PCR là một công cụ hữu hiệu cho việc phân tích hệ gen thực vật,

vì nó có khả năng tạo ra một lượng lớn các trình tự DNA đặc hiệu từ bất kỳ

cơ thể nào Hiện nay PCR được xem là phương pháp nhanh, chính xác, tương đối đơn giản để đánh giá sinh vật chuyển gen, phân tích nhanh chóng sự biến

dị di truyền ở phạm vi quần thể và giữa các cá thể

Trang 28

18

Sự hạn chế lớn nhất của kỹ thuật này là phải dựa trên một trình tự DNA đặc hiệu Tuy nhiên, hạn chế này đã được các nhà sinh học phân tử cải tiến, khắc phục đó là kỹ thuật PCR sử dụng đoạn mồi ngẫu nhiên hay còn gọi là kỹ thuật RAPD [34]

Các thành phần cần thiết để tiến hành phản ứng RAPD bao gồm:

- DNA khuôn (DNA template) với nồng độ 5 - 50 ng trong 25µl

- Đoạn mồi (primer): Chỉ sử dụng một mồi đó là một oligonucleotide có trật tự nucleotide ngẫu nhiên và có chiều dài khoảng 10 nucleotide

- DNA polymerase: Hoạt động của DNA-polymerase phụ thuộc vào

Mg2+, nồng độ dNTP, pH, nhiệt độ biến tính DNA DNA-polymerase thường dùng là Taq-polymerase

- Bốn loại deoxyribonucleotide triphotphat (dNTP)

- Ion Mg2+ và dung dịch đệm

Phản ứng RAPD được tiến hành qua các giai đoạn giống như PCR:

- Giai đoạn biến tính DNA: Ở nhiệt độ 950 C trong 30 - 60 giây làm cho hai mạch khuôn tách nhau

- Giai đoạn tiếp mồi: Khi hạ nhiệt độ xuống 32 - 400 C, mồi tiếp hợp và bám vào sợi DNA khuôn

- Giai đoạn tổng hợp: Nhiệt độ được nâng lên 720 C thì các đoạn mồi đã

bắt cặp với các mạch đơn sẽ được kéo dài với sự tham gia của

Taq-polymerase

được nhân lên thành hai, các đoạn DNA được nhân bản trong mỗi chu kỳ lại được coi là DNA khuôn cho mỗi chu kỳ nhân bản tiếp theo Vậy sau k chu kỳ nhân bản sẽ tạo ra 2k

các đoạn DNA giống đoạn DNA khuôn ban đầu RAPD

có thể thực hiện từ 40 - 45 chu kỳ

Trang 29

19

Kỹ thuật RAPD có ưu điểm ở chỗ sử dụng các mồi ngẫu nhiên dài 10 nucleotide, quá trình nhân bản DNA là ngẫu nhiên Đoạn mồi này có thể bám vào bất kỳ vị trí nào có trình tự nucleotide bổ sung trên phân tử DNA

hệ gen Với đặc điểm là ngắn nên xác suất đoạn mồi có được điểm gắn trên phân tử DNA khuôn là rất lớn Tùy vào nhóm, loài thực vật hay vi sinh vật

mà các đoạn mồi ngẫu nhiên được thiết kế chuyên dụng Theo lý thuyết, số lượng các đoạn DNA được nhân bản phụ thuộc vào độ dài, vị trí của các đoạn mồi, kích thước và cấu trúc DNA genome Thông thường mỗi đoạn mồi ngẫu nhiên sẽ tạo ra từ 2 - 10 sản phẩm nhân bản Kết quả là sau khi điện di sản phẩm RAPD sẽ phát hiện được sự khác nhau trong phổ các phân đoạn DNA được nhân bản Sự khác nhau đó gọi là tính đa hình Hiện tượng

đa hình các đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên xuất hiện là do có sự biến đổi trình tự nucleotide tại vị trí các đoạn mồi liên kết Sản phẩm khuếch đại được phân tích bằng điện di trên gel agarose hoặc polyacrylamide và có thể quan sát được sau khi gel được nhuộm bằng hoá chất đặc trưng Vì vậy, tính

đa hình thường được nhận ra do sự có mặt hay vắng mặt của một sản phẩm nhân bản [49]

Trong những năm gần đây, kỹ thuật RAPD được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền Nhiều nghiên cứu đã cho thấy, RAPD là một phương pháp có hiệu quả trong việc xác định kiểu gen, phân tích quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền và lập bản đồ di truyền [3] Phương pháp này còn được ứng dụng trong việc đánh giá bộ gen của giống và khả năng phân tích

Kỹ thuật RAPD còn dùng để nhận biết, phân loại các giống cây trồng khác nhau như chuối, lúa mì, đu đủ, đậu tương và phát hiện, bảo tồn sự đa dạng di truyền đặc biệt là các loài quí hiếm hay một số giống thực vật địa phương

Trang 30

20

1.2.2 Nghiên cứu sự đa dạng di truyền ở thực vật bằng kỹ thuật RAPD

Hiện nay, kỹ thuật RAPD đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu và xác định quan hệ di truyền ở thực vật Kỹ thuật RAPD cũng được ứng dụng trong việc đánh giá đa dạng di truyền giữa các loài và trong phạm vi một loài phân tích và đánh giá hệ gen thực vật nhằm xác định những thay đổi của các dòng chọn lọc ở mức độ phân tử [40], [41].Phương pháp này còn được ứng dụng trong việc đánh giá bộ gen của giống và khả năng phân tích mối quan hệ di truyền giữa các loài, nhóm các cá thể cùng một loài[11]

Muthusamy S và cs (2008) sử dụng kỹ thuật RAPD với 74 mồi ngẫu nhiên và kỹ thuật ISSR với 37 cặp mồi để nghiên cứu quan hệ di truyền của

10 giống đậu gạo thu được 987 băng DNA (trong đó có 719 băng đa hình) từ

kỹ thuật RAPD và 479 băng DNA (trong đó có 296 băng đa hình) từ kỹ thuật ISSR, mức độ đa hình RAPD là 70,3%, mức độ đa hình ISSR là 60,79% [39] Afzal và cs (2004) nghiên cứu tính đa hình của tập đoàn giống đậu xanh nhằm chọn tạo giống đậu xanh có năng suất cao và chịu bệnh đốm vòng do virus Các tác giả đã sử dụng 21 giống đậu xanh với 34 mồi ngẫu nhiên và thu được tổng số 204 phân đoạn DNA được nhân bản [23] Moretzohn và CS đã nghiên cứu sự đa dạng di truyền của lạc và mối quan hệ với dạng dại của chúng trên cơ sở phân tích các vùng siêu biến của hệ gen [38]

Đánh giá tính đa dạng của một số giống lạc trong tập đoàn giống chống chịu bệnh gỉ sắt Yiwu Chen và cs (2006) đã sử dụng 11 mồi ngẫu nhiên, tác giả đã nhận được 109 phân đoạn DNA, trong đó có 66 phân đoạn đa hình, chiếm 60,6% Điều này cho thấy, trong phạm vi của mỗi phản ứng RAPD giữa 33 giống lạc nghiên cứu khác nhau về cấu trúc DNA, mức sai khác từ 4% đến 18% Kết quả phân tích DNA cho thấy các giống lạc ở cùng một vùng địa lý, sinh thái được tập trung thành từng nhóm, giữa các giống chống chịu bệnh gỉ sắt của tập đoàn giống ICRISAT và các giống năng suất trong

Trang 31

21

nước không nằm trong cùng một nhánh Vì thế có thể lựa chọn các cặp bố

mẹ mong muốn để phục vụ cho công tác lai giống [28]

Chu Hoàng Mậu và cs (2002) đã sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên để so sánh hệ gen của các đậu tương đột biến bằng kỹ thuật RAPD cho thấy ba đoạn mồi có biểu hiện

đa hình và 6 dòng đậu tương đột biến có mức độ sai khác về bộ gen [14]

Võ Thị Thương Lan và cs (1999), nghiên cứu tính đa dạng di truyền của

loài rong câu biển đã cho thấy tổng số có 46 băng rõ nét được nhân ngẫu nhiên với 3 mồi (OPA4, PA10, OPL12) và đã phát hiện được sự sai khác về mặt di truyền ngay trong một loài rong câu sinh trưởng trong các điều kiện khác nhau [10]

Để đánh giá sự thay đổi di truyền của các dòng lúa tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước, Đinh Thị Phòng và cs (2001) đã sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên

để chỉ ra sự sai khác ở mức độ phân tử giữa các đối tượng này [15]

Nguyễn Thị Tâm (2003) sử dụng 5 mồi ngẫu nhiên để phân tích tính đa hình DNA trong bộ gen của dòng lúa được chọn lọc kết quả các dòng có sự sai khác ở mức độ phân tử, trong đó dòng HR128 có hệ số sai khác với giống gốc là lớn nhất [16]

Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003) nghiên cứu đa dạng di truyền của một số giống đậu xanh cho thấy trong 5 mồi ngẫu nhiên chỉ có 3 mồi RA31, RA45, RA46 cho kết quả đa hình, hệ số tương đồng giữa các giống dao động từ 0,41- 0,80 [17]

Kỹ thuật RAPD còn là một công cụ rất có hiệu quả trong việc tìm ra các chỉ thị phân tử để phân biệt các giống hay các loài khác nhau Raina và cs (2001) đã sử dụng chỉ thị RAPD – SSR để phân tích sự đa dạng hệ gen và xác định mối quan hệ họ hàng giữa các giống lạc trồng và lạc dại [45]

Kỹ thuật RAPD được sử dụng rộng rãi trong những năm gần đây để phân tích di truyền hệ thống sinh học Nó là phương pháp hiệu quả trong việc

Trang 32

Souza S.G.H.D và cs (2008) xác định quan hệ di truyền của 16 dòng ngô lai với sử dụng 22 mồi RAPD khuếch đại được 265 băng DNA và 16 cặp mồi SSR khuếch đại được 75 băng DNA, 16 dòng ngô được chia thành 3 nhóm [47]

Okumus A (2007), 17 giống ngô của Turkey được sử dụng nghiên cứu với 14 mồi RAPD thu được 125 băng đa hình (chiếm 89%), hệ số sai khác giữa các giống ngô từ 0,08-0,2 [42]

Abdel - Mawgood A.L và cs (2006) đã sử dụng một số các chỉ thị phân

tử RAPD, SSR, 18S rRNA gen …để kiểm tra các dòng ngô, trong đó có ba giống ngô tự nhiên (L1, L2, L3) và hai giống lai F1 bắt nguồn từ họ H1 và H2 Hai trong 5 mồi RAPD sử dụng nghiên cứu biểu hiện tính đa hình, một trong những mồi cho đa hình đã xác định được con lai H2 từ hai dòng thuần Đối với 18S rRNA thì không phát hiện được các băng đa hình [22]

Asif M và cs (2006) đã tiến hành phân tích DNA cho 6 giống ngô lai bằng cách sử dụng các mồi ngẫu nhiên để khuếch đại đa hình DNA bằng kỹ thuật RAPD Tác giả đã sử dụng 40 mồi ngẫu nhiên, trong đó có OPR – 03, OPR – 11 và OPR- 06 đã cho đa hình Kết quả đã kiểm tra được 3 trong rất nhiều giống ngô lai và cũng phân biệt được nguồn gốc của một số giống ngô lai Tác giả đã kết luận RAPD là một công cụ hữu hiệu để phát hiện sự tinh khiết của giống lai nhằm nâng cao hiệu quả trong trồng trọt và chăn nuôi [25]

Trang 33

23

Valdemar P C và cs (2004) nghiên cứu khoảng cách di truyền của 81 giống ngô trong đó có 79 thuộc vùng bắc Châu Âu và 2 giống cải tiến Sử dụng kỹ thuật RAPD với 32 mồi được khuếch đại, cao nhất là 255 chỉ thị mà

có 184 băng DNA (chiếm khoảng 72,2%) là đa hình Dựa trên những chỉ thị RAPD, việc lập một phả hệ sử dụng phương pháp UPGMA Tỷ lệ kiểu di truyền tương tự nhau từ 0,78 đến 0,91 Nhóm số liệu phân tử tập hợp thành 2 nhóm chính, mà màu sắc hạt có tương quan với nhau [40]

Naureen Z và cs (2005) nghiên cứu đa hình của 30 chủng vi khuẩn ở rễ

ngô nhằm chọn tạo giống ngô cho năng suất cao và tách dòng vi khuẩn rhizo

rễ ngô Các tác giả đã sử dụng 30 mồi oligonucleotide, kết quả sự đa dạng di truyền đạt mức đáng kể với khoảng cách di truyền 2 – 16% [41]

Amorime P và cs (2003) đã sử dụng các chỉ thị phân tử RAPD và SSR để chọn lọc 13 giống ngô đường Trong đó, sử dụng 50 mồi RAPD tạo được 104 băng (chiếm 72,2%), còn sự phân tích SSR đánh giá 7 locus với 42 alen đạt giá trị PEC từ 0,5 đến 0,89 Ước tính sự tương đồng di truyền đối với mồi RAPD là 0,79, còn chỉ thị SSR là 0,49 [24]

Osipova E.S và cs (2001) nghiên cứu sự khác nhau di truyền học giữa dòng ngô A188 và dòng soma bắt nguồn từ A188, được đánh giá qua sự phân tích của kỹ thuật RAPD Sử dụng 15 mồi trong số 17 mồi decanucleotie, từng mồi cho sự khuếch đại đạt từ 2 – 17 phân đoạn dài 200 – 2000 bp Mô hình RAPD không khác giữa những các cá thể của dòng A188, biểu hiện tính đồng nhất về di truyền học cao Sự khác nhau giữa dòng ban đầu và dòng soma cao

từ 64 – 72% Căn cứ vào sự phân ly di truyền dòng soma chia làm 2 nhóm Sự phân biệt những nhóm dòng soma này phù hợp với nguồn gốc của chúng [43] Bauer I (2005) nghiên cứu đặc tính trưởng thành sớm của ngô lai thu được bằng cách đánh dấu protein và RAPD Khi sử dụng mồi RAPD cho thấy tỉ lệ đa hình cao hơn đánh dấu protein [26]

Trang 34

24

Ở Việt Nam, Bùi Mạnh Cường và cs (2002) đã tiến hành nghiên cứu sự

đa hình di truyền của một số giống ngô và xác định được một số cặp lai ưu tú

có khả năng cho ưu thế lai cao [5] Ngô Hữu Tình và cs (2002), nghiên cứu khoảng cách di truyền của các cặp lai và nhóm ưu thế lai ở một giống ngô, kết quả tuyển được 7/28 cặp lai cho năng suất cao[19]

Ngô Việt Anh (2005) đã sử dụng kỹ thuật RAPD với 5 mồi ngẫu nhiên đã nhận được 150 phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên từ hệ gen của 7 giống ngô nếp địa phương Cả 5 mồi sử dụng trong nghiên cứu đều biểu hiện tính đa dạng và có 16 phân đoạn DNA đa hình chiếm 51,6% [1]

1.3 NHẬN XÉT CHUNG

Trong những năm gần đây phương hướng sản xuất ngô ở nước ta là cần tăng cường diện tích trồng ngô lai năng xuất cao trên cơ sở ứng dụng các thành tựu khoa học kỹ thuật nhằm tăng năng suất để đạt và vượt mức trung bình của thế giới Tuy nhiên, trong thực tế sản xuất ngô Việt Nam vẫn phải nhập nội rất nhiều các giống ngô mà vẫn có những mùa bị thất thu do giống không đảm bảo chất lượng Vì vậy, việc nghiên cứu hóa sinh hạt ngô nhằm tìm ra các giống ngô có năng suất cao, chất lượng tốt và ổn định là góp phần chọn được các giống có năng suất và chất lượng ổn định

Những công trình đánh giá sự di truyền của cây ngô ở nước ta còn ít

Sự đa dạng di truyền sẽ chỉ ra được mức độ sai khác giữa các giống ngô nghiên cứu ở mức độ phân tử đồng thời giải thích được tính đa dạng nguồn gen của cây ngô