2.2.1. Phƣơng pháp hóa sinh
2.2.1.1 Xác định hàm lƣợng lipid
Hàm lượng lipid được xác định trên hệ thống bán tự động Soxhlet của hãng Gerhardt, gồm có: bình cầu, trụ chiết, ống sinh hàn.
Dựa vào tính chất hoà tan của dung môi hữu cơ để chiết lipid, dung môi hữu cơ được sử dụng là petroleum ether.
2.2.1.2 Xác định hàm lƣợng protein
Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Kjeldahl.
Nguyên lý: mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 98% kết hợp với chất xúc tác để chuyển nitơ hữu cơ thành (NH4)2SO4 rồi dùng NaOH để đẩy NH3 ra khỏi muối amoni. NH3 sau khi được giải phóng ra sẽ được cuốn đi bằng dòng hơi nước nóng. Sau khi được làm nguội sẽ hấp thụ vào dung dịch H3BO3 ở trong bình hứng tạo ra muối borat amon có màu xanh trong. Để xác định được lượng amoniac giải phóng ra trong quá trình chưng cất ta đem đi chuẩn độ bằng dung dịch H2SO4 0,1N đến khi dung dịch chuyển sang màu tím nhạt. Từ lượng H2SO4 0,1N tiêu tốn trong quá trình chuẩn độ sẽ tính được lượng protein có trong mẫu.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
27
2.2.1.3. Xác định hàm lƣợng đƣờng tan
- Xác định hàm lượng đường theo phương pháp Bertrand được mô tả trong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu và cs [4].
- Nguyên tắc: Đường trực tiếp khử oxi của hydroxit đồng ở môi trường kiềm mạnh làm cho nó bị kết tủa dưới dạng đồng hóa trị 1 (Cu2O) có màu đỏ gạch. Số lượng đồng hóa trị 1 tương ứng với số lượng đường khử theo phương trình phản ứng:
RCHO + 2Cu(OH)2 → RCOOH + Cu2O + 2H2O Cu+1 + Fe3+ + H2SO4 → 2CuSO4 + H2O + 2FeSO4
FeSO4 có tính khử oxi tác dụng với KMnO4 do đó dùng KMnO4 để chuẩn độ. Từ số ml KMnO4 0,1N dùng để chuẩn độ sẽ xác định được hàm lượng đường khử.
2.2.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử
2.2.2.1. Phƣơng pháp tách DNA từ lá non của ngô
- Quy trình tách chiết và làm sạch DNA tổng số từ lá ngô theo phương pháp của Gawel và cs [31].
Quy trình tách chiết DNA tổng số đƣợc thực hiện theo các bƣớc sau:
- Lấy khoảng 200g lá ngô non đã để lạnh ở -850C ở nghiền nhanh trong cối chày sứ có chứa nitơ lỏng.
- Bổ sung 0,8ml đệm rửa, li tâm 15 phút, 12000 vòng/ phút, loại bỏ dịch nổi. Bước này làm 2 lần.
- Thêm 700µl đệm tách, mix nhẹ, ủ 650C trong 2h, sau đó lấy ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút.
- Thêm 600µl cloroform:isoamyl alcohol (24:1 ), trộn đều 20 phút - Li tâm 15 phút, 12000 vòng/phút. Hút cẩn thận 500µl dịch trong sang ống eppendorf 1,5 ml mới ( bỏ tủa).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
28
- Thêm 600µl isopropanol, lắc nhẹ, đặt lên đá (để tủ lạnh qua đêm), chờ có dịch tủa trắng.
- Li tâm 5 phút, 13000 vòng/ phút, bỏ dịch, úp xuống giấy cho khô. - Bổ sung 300µl cồn 70%, búng nhẹ. Li tâm 5 phút, 13000 vòng/ phút, loại bỏ cồn (thực hiện 2 lần).
- Làm khô DNA.
- Hòa tan DNA trong 50 µl nước khử ion.
- Kiểm tra chất lượng DNA thu được thông qua điện di trên gel agarose 0,8%.
- Xác định hàm lượng và độ tinh sạch của DNA trên máy quang phổ và pha loãng về nồng độ sử dụng 10ng/µl.
2.2.2.2. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng và độ tinh sạch DNA tổng số (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Phương pháp quang phổ hấp thụ
Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA trên máy quang phổ ở bước sóng = 260 nm và = 280 nm. Hàm lượng và độ sạch của DNA trong dung dịch tách chiết được tính theo công thức:
Hàm lượng DNA (ng/l) = OD260×50× hệ số pha loãng. Độ sạch DNA = OD260/OD280.
Trong đó:
OD260: chỉ số đo được ở bước sóng 260 nm OD280: chỉ số đo được ở bước sóng 280 nm
Nếu độ sạch DNA = 1,8 - 2,0 thì mẫu được coi là sạch.
* Phương pháp điện di DNA tổng số trên gel agarose
- Pha agarose 0,8% trong TAE 1X, đun nóng cho tan agarose trong lò vi sóng, để nguội khoảng 60oC; Đổ bản gel và đợi cho khô (khoảng 1 giờ) sau đó tháo lược. - Lấy 5 µl mẫu DNA tách được trộn với 2 µl dye 6X, tra mẫu vào giếng điện di. - Chạy điện di với điện thế 80V trong 30 phút.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
29
- Lấy bản gel nhuộm ethidium bromide 0,5 µl/ml trong 10 phút, rửa lại bằng nước.
- Soi bản gel trên máy soi gen tia UV, chụp ảnh.
2.2.2.3. Phản ứng RAPD
Phản ứng RAPD được tiến hành với các mồi ngẫu nhiên theo phương pháp của Foolad và cs (1990) [29].
- Sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên được tổng hợp tại hãng Invitrogen, mỗi mồi dài 10 nucleotide, thông tin về trình tự các mồi sử dụng được trình bày trong bảng 2.2
Phản ứng RAPD được thực hiện trong 20 µl dung dịch với thành phần trong bảng 2.3. Tiến hành nhân bản DNA trong máy PCR với chu trình nhiệt của phản ứng RAPD là 1 chu kì 94oC trong 3 phút; 45 chu kì với nhiệt độ (92oC trong 30 giây, 36oC trong 45 giây, 72oC trong 1 phút); 1 chu kì 72oC trong 10 phút; lưu giữ ở 4o
C.
Bảng 2.2. Trình tự các nucleotide của 10 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên mồi Trình tự nucleotide
1 M1 5’ AACCGACGGG 3’ 2 M2 5’ GGGGGTCGTT 3’ 3 M3 5’ TACCACCCCG 3’ 4 M4 5’ GGCGGACTGT 3’ 5 M5 5’ TCGGCGATAG 3’ 6 M6 5’ GTGTCTCAGG 3’ 7 M8 5’ GGAAGTCGCC 3’ 8 M9 5’ CCTCCAGTGT 3’ 9 RA159 5’ GTCCACACGG 3’ 10 UBC23 5’ CCCGCCTTCC 3’
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 30 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng RAPD STT Thành phần Thể tích (l) 1 H2O khử ion 11,7 2 Buffer PCR 2,0 3 MgCl2 (25 mM) 2,0 4 dNTP (2,5 mM) 1,2 5 Primer (10 mM) 1,6 6 DNA (10 ng/µl ) 1,0 7 Taq-polymerase 0,5 Tổng 20,0 Điện di sản phẩm RAPD
Pha agarose 2% trong TAE 1X. Chạy điện di với hiệu điện thế 100V trong 90 phút. Nhuộm bản gel bằng ethidium bromide 0,5 µg/ml trong 15 phút, rửa sạch bằng nước, soi gel trên đèn UV và chụp ảnh.
Phân tích số liệu RAPD
Dựa trên sự xuất hiện hay không xuất hiện của các phân đoạn DNA khi điện di sản phẩm RAPD của các giống ngô nếp với các đoạn mồi ngẫu nhiên để làm cơ sở cho sự phân tích số liệu theo quy ước: Số 1: xuất hiện phân đoạn DNA, số 0: không xuất hiện các phân đoạn DNA.
Các số liệu này được xử lý trên máy vi tính theo chương trình NTSYSpc version 2.0 để xác định quan hệ di truyền của các giống ngô ở mức độ phân tử.
2.2.2.4. Phƣơng pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu
Mỗi thí nghiệm được nhắc lại 3 lần. Sử dụng toán thống kê để xác định trị số thống kê như trung bình mẫu (x), phương sai (2), độ lệch chuẩn (), và sai số trung bình mẫu (
x
S ), với n ≤ 30, α = 0,05. Các số liệu được xử lý trên máy vi tính bằng chương trình Excel [21].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
31
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN