BÁO cáo kết QUẢ KHẢO NGHIỆM ĐÁNH GIÁ rủi RO NGÔ bt11 đối với môi TRƯỜNG và đa DẠNG SINH học

Ngô có tên khoa học là Zea mays L., thuộc chi Maydeae, họ hoà thảo Poaceae hay gramineae, bộ hoà thảo Poales hay Graminales, lớp một lá mầm Monocotylens, ngành hạt kín Angiospermatophyta

BÁO CÁO KẾT QUẢ KHẢO NGHIỆM ĐÁNH GIÁ RỦI RO NGÔ Bt11 ĐỐI VỚI MÔI TRƯỜNG

VÀ ĐA DẠNG SINH HỌC

Số báo cáo: SYTVN-03-2012

Tên tổ chức đăng ký: Công ty TNHH Syngenta Việt Nam

Địa chỉ liên hệ: Số 16 đường 3A, Khu Công nghiệp Biên Hoà 2 Đồng Nai, Việt Nam

Website: www.syngenta.com

Biên Hòa, ngày 09 tháng 5 năm 2012

MỤC LỤC

Phần I THÔNG TIN CHUNG

1.2 Giống cây trồng biến đổi gen đăng ký khảo nghiệm 1

Phần II TỔNG QUAN VỀ GIỐNG CÂY TRỒNG BIẾN ĐỔI GEN

2.2.2 Kích thước, trình tự, chức năng của gen hoặc đoạn gen đưa vào 6

2.3.1 Mô tả về cây ngô/bắp (sinh vật nhận gen): 8

2.4.1 Tính trạng, điểm khác biệt giữa ngô Bt11 và ngô không chuyển

2.4.2 Biểu hiện tính trạng/protein của ngô Bt11 20 2.4.3 Tình hình cấp phép, sử dụng ngô Bt11 trên thế giới 26 Phần III XÁC ĐỊNH VẤN ĐỀ KHẢO NGHIỆM Ở VIỆT NAM

3.1 Kết quả khảo nghiệm đánh giá rủi ro trên thế giới đối với ngô chuyển

3.1.1 Các kết quả nghiên cứu về kiểu hình của ngô Bt11 30 3.1.2 Các nghiên cứu về khả năng trở thành cỏ dại trong môi trường nông

3.1.3 Khả năng trở thành cỏ dại của ngô Bt11 trong môi trường phi nông

3.2.1 Tính an toàn của ngô chuyển gen Bt11 hay protein Cry1Ab và

3.2.2 Nguyên lý chung đánh giá rủi ro đối với cây trồng chuyển gen 42 3.2.3 Cơ sở lý luận cho việc đề nghị các nghiên cứu đánh giá rủi ro cho

khảo nghiệm hạn chế và diện rộng của ngô Bt11 đối với môi tường và đa

dạng sinh học ở Việt Nam

44

Phần IV MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP KHẢO

NGHIỆM

4.1.4 Địa điểm và thời gian tiến hành khảo nghiệm 80

4.1.6 Chỉ tiêu theo dõi, phương pháp đánh giá và xử lý số liệu 84

4.2.4 Địa điểm và thời gian tiến hành khảo nghiệm 94 4.2.6 Chỉ tiêu theo dõi, phương pháp đánh giá và xử lý số liệu 104 PHẦN V: KẾT QUẢ KHẢO NGHIỆM

5.1.1.1 Đánh giá đặc điểm nông sinh học và kiểu hình của ngô Bt11

5.1.1.2 Đánh giá ảnh hưởng của ngô Bt11 tới sinh vật không chủ đích

5.1.1.3 Hiệu quả của ngô Bt11 trong việc kiểm soát sâu đục thân ngô

5.1.2.1 Nguy cơ trở thành cỏ dại, dịch hại xâm lấn môi trường tự

nhiên của ngô Bt11 và nguy cơ trôi gen, phát tán gen 129 5.1.2.2 Đánh giá nguy cơ ảnh hưởng bất lợi đến sinh vật không chủ

5.1.2.3 Đánh giá các nguy cơ khác gây ảnh hưởng đến môi trường và

5.2.1 Kết quả đánh giá nguy cơ trở thành cỏ dại, dịch hại của ngô Bt11

trong khảo nghiệm diện rộng thông qua so sánh các đặc điểm nông sinh

học, hình thái

141

5.2.2 Ảnh hưởng của ngô Bt11 đến các sinh vật không chủ đích 142 5.2.3 Đánh giá hiệu quả kiểm soát sâu đục thân của ngô Bt11 159 5.2.4 Năng suất và hiệu quả kinh tế của ngô Bt11 162

MỤC LỤC HÌNH

Hình I: Phản ứng được xúc tác bởi glutamine synthetase Phản ứng này nếu

ngăn chặn bởi glufosinate ammonium (phosphinothricin) sẽ gây ra sự tích luỹ ammonia đến nồng độ gây độc cho tế bào

4

Hình II Glufosinate ammonium (GA) và sản phẩm chuyển hoá của nó,

N-acetyl-glufosunate (NAG), Methylphosphinicopropionic acid (MPP)

và 3-methylphosphinicoacetic acid (MPA) (Huang và cs., 1995)

4

Hình III Sơ đồ plasmid map pZO1502 cho thấy những vị trí hạn chế chính, các

thành phần di truyền bao gồm các đoạn gen của cây có mang gen Bt và gen pat, và tổng thể plasmid, bao gồm vị trí của gen beta-lactamase (amp hay bla) và vùng khởi đầu sao chép (ORI)

7

Hình IV Quy trình đánh giá rủi ro của cây trồng chuyển gen đối với môi trường

theo quyết định 2001/18/EC

Hình 5 Diễn biến chỉ số gây hại của Rệp ngô trong thí nghiệm ngô Bt11 tại

Hưng Yên (A), Sơn La (B), BRVT (C) và Đăk Lăk (D)

145

Hình 6 Diễn biến mật độ bọ rùa BMAT trong thí nghiệm ngô Bt11 tại Hưng

Yên (A), Sơn La (B), BRVT (C) và Đăk Lăk (D)

148

Hình 7 Diễn biến mật độ nhện lớn BMAT trong thí nghiệm ngô Bt11 tại Hưng

Yên (A), Sơn La (B), BRVT (C), Đăk Lăk (D)

150

Hình 8 Diễn biến mật độ CCCN trong thí nghiệm ngô Bt11 tại Hưng Yên (A),

Sơn La (B), BRVT (C), Đăk Lăk (D)

152

MỤC LỤC BẢNG

Bảng 2 Hàm lượng riêng của protein CryIAb trong mô ngô chuyển gen Bt11

trong chu trình sống của cây ngô (cây trồng trong nhà kính)

Bảng 5 Danh sách các nước được phép canh tác ngô Bt11 và được phép sử

dụng làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi trên thế giới

25

Bảng 7 Tỉ lệ thụ phấn chéo ở các khoảng cách khác nhau so với nguồn cho

phấn ở cây ngô

48

Bảng 8 Tác động của ngô Bt đến sinh vật không chủ đích 52 Bảng 9 Sự tồn tại của protein BT và những tác động đến hệ sinh thái đất 70 Bảng 10 So sánh các đặc điểm nông sinh học và hình thái của ngô Bt11 với

giống nền NK66 và giống thương mại C919 trong khảo nghiệm hạn chế

114

Bảng 11a Thành phần loài côn trùng và nhện trong khảo nghiệm ngô Bt11 theo

hệ thống phân loại (Hưng Yên và Bà Rịa Vũng Tàu 2010, 2011)

116

Bảng 11b Số lượng các loài côn trùng và nhện trong khảo nghiệm ngô Bt11

theo nhóm đối tượng ( Hưng Yên, Bà Rịa Vũng Tàu, 2010 và 2011)

Bảng 14 Thành phần bệnh hại và tần suất bắt gặp trong thí nghiệm ngô Bt11

(Văn Giang- Hưng Yên và Tân Thành -Bà Rịa, 2010)

125

Bảng 15 Mức độ gây hại của một số bệnh hại chính trong thí nghiệm ngô Bt11

(điều tra tại 75 NSG)

126

Bảng 16 Mức độ gây hại của sâu đục thân ngô trong thí nghiệm ngô Bt11 và

giống nền NK66 (Hưng Yên và BRVT, 2010 và 2011)

128

Bảng 17 Một số đặc tính nông học của ngô Bt11 và giống nền NK66 khảo

nghiệm diện rộng tại Hưng Yên, Sơn La, Bà Rịa Vũng Tàu, và Đăk Lăk

141

Bảng 18 Một số đặc điểm hình thái của các ngô Bt11 và NK66 khảo nghiệm

diện rộng tại Hưng Yên, Sơn La, Bà Rịa Vũng Tàu, Đăk Lăk

142

Bảng 19 Số lượng các loài côn trùng và nhện trong khảo nghiệm diện rộng

ngô Bt11 theo hệ thống phân loại

143

Bảng 20 Số lượng các loài côn trùng và nhện trong khảo nghiệm diện rộng

ngô Bt11 theo nhóm đối tượng

144

Bảng 21 So sánh một số chỉ số định lượng của Collembola giữa đất trồng

Bt11và NK66 Hưng Yên, Sơn La, Bà Rịa Vũng Tàu, Đăk Lăk

154

Bảng 22 Thành phần loài Collembola ưu thế trên đất trồng ngô Bt11 và NK66

tại Hưng Yên, Sơn La, Bà Rịa Vũng Tàu, Đăk Lăk

155

Bảng 23a Mức độ gây hại của một số bệnh hại chính trong thí nghiệm ngô Bt11

tại Hưng Yên và Sơn La

157

Bảng23b Mức độ gây hại của một số bệnh hại chính trong thí nghiệm ngô Bt11

tại BRVT và Đăk Lăk

158

Bảng 24 Mức độ gây hại trên lá của sâu đục thân ngô trong khảo nghiệm diện

rộng ngô Bt11 tại Hưng Yên, Sơn La, BRVT và Đăk Lăk

160

Bảng 25 Mức độ gây hại của sâu đục thân ngô trên thân, cờ và bắp trong khảo

nghiệm diện rộng năm 2011

161

Bảng 26 Năng suất của ngô chuyển gen NK66Bt11 và giống nền NK66 trong

khảo nghiệm rộng năm 2011

162

Phần I THÔNG TIN CHUNG

1.1 Tổ chức đăng ký khảo nghiệm

Tên Tổ chức đăng ký: Công ty TNHH Syngenta Việt Nam

Địa chỉ liên hệ: Số 16 đường 3A, khu Công nghiệp Biên Hòa 2, Đồng Nai, Việt Nam

Điện thoại: 0618826026 Fax: 0618826015

E-mail: Website: www.syngenta.com

Người và địa chỉ liên lạc tại Việt Nam:

Đại diện: Ông Shane Emms

Chức vụ: Tổng Giám đốc

Địa chỉ liên hệ: Văn phòng đại diện Công ty TNHH Syngenta tại TP Hồ Chí Minh

Tầng 11 Toà nhà Đại Minh, 77 Hoàng Văn Thái, Phường Tân Phú, Quận 7, TP Hồ Chí Minh Điện thoại: (08) 54318900 Fax: (08) 54318898

Email: shane.emms@syngenta.com Website: www.syngenta.com

1.2 Giống cây trồng biến đổi gen đăng ký khảo nghiệm

- Cây trồng chuyển gen khảo nghiệm: Ngô/Bắp (Zea May L.), thuộc chi Maydeae, họ

hoà thảo (Poaceae hay gramineae), bộ hoà thảo (Poales hay Graminales), lớp một lá mầm (Monocotylens), ngành hạt kín (Angiospermatophyta), phân giới thực vật bậc cao (Cosmobionia)

- Sự kiện chuyển gen: Bt11, có gen Cry1Ab và gen pat là gen chỉ thị

- Đặc tính biểu hiện: Ngô Bt11 mang đặc tính có lợi là kháng sâu đục thân ngô và chống chịu thuốc trừ cỏ chứa hoạt chất glufosinate ammonium

- Giống nền sử dụng: NK66, là giống đã được thương mại hóa tại Việt Nam năm 2006

1.3 Đơn vị khảo nghiệm

Theo quyết định số 252/QĐ-BNN-KHCN, v/v Chỉ định Tổ chức khảo nghiệm đánh giá rủi ro đối với đa dạng sinh học và môi trường của giống cây trồng chuyển gen, Công ty Trách nhiệm Hữu Hạn Syngenta Việt Nam đã chọn Viện Di Truyền Nông nghiệp, Trung tâm khảo kiểm nghiệm giống, sản phẩm cây trồng và phân bón Nam Bộ và Viện Bảo vệ Thực vật là các đơn vị thực hiện khảo nghiệm đánh giá tác động của ngô chuyển gen Bt11 đối với môi trường và đa dạng sinh học ở Việt Nam

 Viện Di truyền Nông nghiệp- Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam

Đại diện: PGS.TS Lê Huy Hàm

Chức vụ: Viện trưởng, Viện Di truyền Nông nghiệp

Địa chỉ: Đường Phạm Văn Đồng, Từ Liêm, Hà Nội, Việt Nam

Điện thoại: 84 4 8386734; Fax: 84 4 7543196

E-mail: LHHAM@agi.ac.vn Website: http:// www.agi.gov.vn

 Viện Bảo vệ thực vật

Đại diện: Tiến sĩ Ngô Vĩnh Viễn

Chức vụ: Viện Trưởng

Địa chỉ: Đông Ngạc, Từ Liêm, Hà Nội

Điện thoại: + 84 4 38389724 Fax: +84 4 38363563

Email: nipp-khkh@hn.vnn.vn

 Trung tâm khảo kiểm nghiệm giống, sản phẩm cây trồng và phân bón Nam Bộ

Đại diện: ThS Nguyễn Quốc Lý

Chức vụ: Giám đốc

Địa chỉ: 135A Paster, Quận 3, Hồ Chí Minh

Điện thoại: + 84 838229085 Fax: + 84 838229086

1.4.2 Khảo nghiệm diện rộng

Thực hiện theo quyết định số 403/QĐ/BNN-KHCN quyết định V/v “Công nhận kết quả khảo nghiệm hạn chế và cấp phép khảo nghiệm diện rộng đánh giá rủi ro đối với đa dạng sinh học

và môi trường của cây ngô chuyển gen” do Thứ trưởng bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn ký ngày 07 tháng 03 năm 2011

Phần II TỔNG QUAN VỀ GIỐNG CÂY TRỒNG BIẾN ĐỔI GEN

2.1 Sinh vật cho gen

Sự kiện Bt11 có chứa thêm hai gen mã hoá cho hai protein là gen Cry1Ab và gen pat (là gen

chỉ thị), trong đó:

- Vi khuẩn B thuringiensis là vi khuẩn gram dương sống phổ biến trong đất, cho

protein CryIAb được phát hiện ở nước Đức;

- Vi khuẩn Streptomyces viridochromogenes là vi khuẩn gram dương, sống trong đất

thuộc họ Actinomycetae cho protein PAT

B thuringiensis là vi khuẩn gram dương tạo bào tử trong điều kiện hiếu khí, có thể tạo ra các

protein dạng tinh thể, các protein dạng tinh thể này có tác dụng như các loại thuốc trừ sâu sinh học để kiểm soát một số loại côn trùng và sâu bọ nhạy cảm chuyên biệt khi chúng ăn

phải Vì có quá trình hình thành các loại protein này nên B thuringiensis đã được sử dụng

như một loại thuốc trừ sâu sinh học nhiều thập kỷ nay Độc tố Bt được sinh ra từ nhiều chủng

B thuringiensis khác nhau chuyên biệt cho bộ cánh vảy, côn trùng hai cánh và bọ cánh cứng

(Yamamoto và Powell, 1993; Gill và cs., 1992), protein CryIAb được mã hoá bởi gen CryIAb (Btk) kháng hữu hiệu với bộ cánh vảy (Koziel và cs., 1993)

Phương thức hoạt động của protein tinh thể của B thuringiensis: Bacillus thuringiensis

var kurstaki (Btk) tạo ra nhờ việc tinh thể hoá protein trong quá trình tạo tiền độc tố trong

quá trình hình thành bào tử, còn được gọi là “protoxins” Những protoxins này bị phân huỷ bởi dịch tiêu hoá trong ruột có tính kiềm và bị qúa trình thuỷ phân cắt thành các mạch nhỏ có độc tính, đây chính là các mạch chính cần quan tâm (Höfte và Whiteley, 1989), các mạch hoạt động này có tính trơ với các qúa trình tiêu hoá tiếp theo bởi theo các protease như trypsin Các protein được kích hoạt sẽ bám vào lớp mao mạch của màng nang trong ruột giữa của côn trùng, thúc đẩy qúa trình tạo lỗ làm ảnh hưởng đến cân bằng thẩm thấu Các tế bào sẽ phình lên và bị ly giải do vậy các ấu trùng nhạy cảm với protein này sẽ ngừng ăn và chết từ

từ Đối với nhiều loại protein Bt, các điểm bám chuyên biệt đã được trình bày là có tồn tại trên biểu mô ruột giữa của các côn trùng nhạy cảm (Höfte và Whiteley, 1989)

Ngoài gen Btk, ngô Bt11 cũng mang một gen pat được phân lập từ Streptomyces

viridochromogenes (vi khuẩn gram dương), sống trong đất thuộc họ Actinomycetae Phương

thức hoạt động của gen pat mã hoá là enzyme phosphinothricin-N-acetyl transferase có tác

dụng khử glufosinate ammonium (thành phần hoạt động trong thuốc diệt cỏ Basta®) Glufosinate ammonium ngăn chặn sự xúc tác tổng hợp glutamine của cây, gây ra quá trình tích luỹ ammonia trong các mô thực vật, khiến cho cây bị chết khi phun thuốc diệt cỏ này, tuy

nhiên cây chuyển gen biểu hiện gen pat sẽ được bảo vệ trước thuốc diệt cỏ có chứa hoạt chất glufosinate-ammonium Pat là gen chỉ thị dùng trong quá trình chọn lọc tạo event Bt11

Protein PAT được đánh giá là an toàn sinh học bởi APHIS (Dịch vụ kiểm tra sức khỏe cây trồng và động vật-bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ)

Phương thức hoạt động của gen pat: gen pat mã hoá enzyme phosphinothricin-N-acetyl

transferase có tác dụng khử glufosinate ammonium, thành phần hoạt động trong thuốc diệt cỏ Basta® Glufosinate ammonium ngăn chặn sự xúc tác tổng hợp glutamine của cây, gây ra quá trình tích luỹ ammonia trong các mô thực vật, khiến cho cây bị chết (Hình I) Cây chuyển gen

biểu hiện gen pat sẽ được bảo vệ trước thuốc diệt cỏ có chứa hoạt chất

glufosinate-ammonium

Sự chuyển hoá glufosinate ammonium: Sự chuyển hoá glufosinate ammonium trên cây có

chứa gen pat đã được nghiên cứu kỹ trên cây ngô làm thức ăn gia súc Enzyme PAT khử

glufosinate ammonium (GA) thông qua quá trình acetyl hoá phosphinothrincin, tạo thành acetyl-glufosinate (NAG) cùng hai sản phẩm chuyên hoá nữa là 3-methylphosphinicopropionic acid (MPP) và 3-methylphosphinicoacetic acid (MPA) Còn rất

N-ít GA tồn tại trong hạt và MPP thường là thấp hơn giới hạn định lượng, lượng NAG được xác định vào khoảng 0,1 ppm

Hình I: Phản ứng được xúc tác bởi glutamine synthetase Phản ứng này nếu ngăn chặn bởi glufosinate ammonium (phosphinothricin) sẽ gây ra sự tích luỹ ammonia đến nồng

độ gây độc cho tế bào

Hình II Glufosinate ammonium (GA) và sản phẩm chuyển hoá của nó, glufosunate (NAG), Methylphosphinicopropionic acid (MPP) và 3- methylphosphinicoacetic acid (MPA) (Huang và cs., 1995)

N-acetyl-O

O

O

-N H2O

-N H O

O

-O P

Giới hạn dư lượng cho hạt ngô làm thức ăn gia súc với nồng độ 0,2 ppm đã được công nhận vào ngày 5 tháng 2 năm 1997 tại Hoa Kỳ, giới hạn này bao gồm tổng các chất nguồn và các chất chuyển hoá có thể tồn tại trong hạt ngô (EPA, 1997a) Sự chuyển hoá GA và NAG trong

các động vật có ăn ngô mang gen pat cũng đã được nghiên cứu Không có vấn đề gì về an

toàn được tìm thấy với sự hiện diện của glufosinate ammonium và dư lượng của nó trong thức ăn cho động vật, trong điều kiện thực tế trong nông nghiệp (Hình II- Huang và cs., 1995)

2.2 Thông tin về quá trình chuyển nạp gen

Ngô Bt11 được tạo ra từ dòng bố mẹ ban đầu được chuyển gen sử dụng plasmid pZO1502 mang gen kháng sâu và chống chịu thuốc diệt cỏ glufosinate ammonium, phương pháp chuyển gen dung hợp tế bào trần (protoplast transformation) sau đó tái sinh cây

Vị trí đoạn gen được chuyển: Đoạn gen được chèn vào nằm ở dọc trên nhiễm sắc thể số 8

Việc chèn đó kết hợp vững chắc vào trong nhiễm sắc thể cây ngô và được di truyền như một gen trội đơn theo quy luật di truyền Mendel

Số lượng bản sao của gen đưa vào: Vị trí chèn là 1 bản sao của cả gen Bt và pat và được

điều khiển bởi đoạn vector 35S trên nhiễm sắc thể số 8 Ngoài ra, vị trí chèn cho thấy tính ổn định của gen được di truyền qua các thế hệ và biểu hiện như một tính trạng trội theo quy luật

di truyền của Mendel

Bản đồ của plasmid PZ01502 cho thấy plasmid có chứa ba gen; gen Btk (kháng sâu), gen pat (chống chịu thuốc trừ cỏ) và gen amp mang đặc tính kháng ampicilin Gen bla có nguồn gốc

Prokaryote (cũng có thể gọi là amp R) được điều khiển bởi promoter Prokaryote mã hoá cho lactamase, mang đặc tính kháng appicillin; nó được sử dụng như một marker chọn lọc vi khuẩn (Bolivar và cs., 1977) Plasmid được phân loại trước khi chuyển gen với enzyme hạn

ß-chế là Notl Nó chia tách Plasmid thành hai đoạn, một mang gen Btk và pat, một đoạn khác

mang gen kháng ampillicin Vật liệu chuyển gen sau tái sinh được trồng và lai ngược/lai chéo với các dòng không chuyển gen có cùng đặc tính của công ty Syngenta, sử dụng như nguồn giống lai thương mại bố mẹ

 Gen lac Z, mã hoá một phần ß-glactosidase (Kalnins và cs., 1983) Gen này không

chức năng

 Nguồn gốc sao chép plasmid pUC là từ plasmid pBR 322 (Helinski, 1985), mang đột biến (Chambers và cs., 1988)

2.2.2 Kích thước, trình tự, chức năng của gen hoặc đoạn gen đưa vào

Các phân đoạn sau đã được chèn vào plasmid pUC18, để thành plasmid pZO1502, bao gồm

phân đoạn gen 35S-1/intron/Btk HD-1/nos và phần đoạn gen 35S-2/intron/pat/nos Cả 2 phân

đoạn pZO1502 được liệt kê trong bảng 1, và sơ đồ plasmid pZO1502 (Hình III)

Gen Btk là một phiên bản biến đổi của toàn bộ chiều dài gen CryIA(b) của vi khuẩn Bacillus

thurigiensis var kurstaki HD-1 Gen Btk có nguồn gốc từ phân đoạn Ncol-BglII dài 1,8 kb

Sự thay đổi gen CryIA(b) bao gồm những thay đổi trên ADN và được xén bớt để tăng sự biểu

hiện trên cây, như Perlak và cs (1991) đã mô tả Sự thay đổi không gây ra bất cứ những thay đổi đoạn amino acid nào Protein CryIAb đã cắt ngắn N-terminal 615 amino acid của protein

tự nhiên gồm 1155 amino acid

Gen pat (phosphinothricin acetyl transferase) được dòng hoá từ vi sinh vật có trong đất

Steptomyces viridochromogenes chủng Tu494 (Schauch và cs., 1988b) Đoạn ban đầu

(Wohlleben cùng cs., 1988b) được thay đổi để tối thích sự biểu hiện ở thực vật Những thay đổi bao gồm việc thay đổi codon ban đầu là GTG thành ATG và những thay đổi codon sao cho hàm lượng GC thấp hơn, đoạn amino acid thì vẫn không đổi

Các promoter 35S lấy từ các virus khảm cây bông cải (CaMV) (Gardner và cs., 1981; Franck

và cs., 1980) 35S-1 có nguồn gốc từ CM1841 trong CaMV (Gardner cùng cộng sự, 1981) là

một đoạn Ddel đến Ddel dài 500bp, sau đó chen vào các vị trí SacI.35S-2 có nguồn gốc từ chủng Cabb-S của CaMV (Franck và cs., 1980), là một đoạn từ AluI đến Ddel (dài 425 bp),

có hai điểm cuối được biến đổi

Các intron gen mã hoá alcohol dehydrogenase 1S của ngô (Feeling & Bennett, 1985) Việc sử dụng các intron này làm tăng sự biểu hiện gen dị hợp tử đã được mô tả trước đây (Mascarenhas và cs., 1990)

Terminator nos ở vị trí 423-678 của gen nopaline synthetase từ Agrobacterium tumefaciens

(Bevan và cs., 1983) được thêm vào các điểm cắt hạn chế

Khả năng chuyển của plasmid pUC18: Sự chuyển plasmid trong vi khuẩn được trung gian

bởi 2 nhóm gen mã hoá plasmid là gen chuyển (tra) và gen mã hoá cho chức năng vận động (mob) Chức năng chuyển là sự phối hợp của ít nhất 12 gen khác nhau, chịu trách nhiệm tổng

hợp các lông và các thành phần bề mặt khác Các lông giới tính này là nơi xảy ra sự tiếp xúc vật lý-điều kiện tiên quyết cho sự tiếp hợp-giữa tế bào cho và tế bào nhận

Bảng 1 Các thành phần trên plasmid pZO1502

1,845 kb Mã hoá phiên bản đã cắt bớt của

protein có chiều dài đầy đủ

CryIAb

Bacillus thurigiensis

subsp Kurstaki chủng HD-1

Terminator nos 0,27 kb Cung cấp vị trí pulyadenyl hoá Agrobacterium

IVS2 0,178 kb Tăng cường sự biểu hiện protein Ngô (Zea mays)

Gene pat 0,558 kb Mã hoá cho phosphinothricin

acetyl-transferase

Streptomyces viridochromogenes

Terminator nos 0,22 kb Cung cấp vị trí polyadenyl hoá Agrobacterium

tumefqciens

Hình III Sơ đồ plasmid map pZO1502 cho thấy những vị trí hạn chế chính, các thành

phần di truyền bao gồm các đoạn gen của cây có mang gen Bt và gen pat, và tổng thể plasmid, bao gồm vị trí của gen beta-lactamase (amp hay bla) và vùng khởi đầu sao chép

(ORI)

Chức năng vận động được xác định tại ít nhất 2 vị trí trên DNA plasmid Một vùng mã hoá cho protein vận động gắn với vùng protein vận động (mob) khác trên DNA plasmid Việc tạo phức hợp không chặt chẽ liên quan tới một điểm đứt mạch trên vùng này, thường gọi là vùng

nic/bom Plasmid pUC18 vừa không có chức năng tra vừa không có điểm nic/bom Vì thế

plasmid không có khả năng tiếp hợp do đó không xảy ra quá trình chuyển (Helinski, 1985)

Đoạn DNA được chèn: Đặc tính di truyền của giống Bt11 chuyển gen được đặc trưng bởi số

lượng bản sao, sự ổn định qua các thế hệ, sự vắng mặt của gen tổng hợp beta-lactam và sự mô

tả các trình tự của vector đã trình bày phần trên Vị trí đột biến bao gồm đột biến trên 1 bản sao của đoạn vector mang cả gen Bt và PAT trên phần dài của nhiễm sắc thể số 8 Ngoài ra,

vị trí đột biến cho thấy tính ổn định của gen được chuyển qua các thế hệ và biểu hiện như một tính trạng trội theo quy luật di truyền của Mendel

2.3 Sinh vật nhận gen

2.3.1 Mô tả về cây ngô/bắp (sinh vật nhận gen):

2.3.1.1 Đặc điểm hình thái, nông sinh học của ngô

Ngô hay còn gọi là bắp có tên khoa học là Zea mays L., thuộc chi Maydeae, họ hoà thảo

(Poaceae hay gramineae), bộ hoà thảo (Poales hay Graminales), lớp một lá mầm (Monocotylens), ngành hạt kín (Angiospermatophyta), phân giới thực vật bậc cao (Cosmobionia)

a) Nguồn gốc và phân bố:

- Ngô, trong tiếng Anh “maize” xuất phát từ tiếng Tây Ban Nha (maíz) là thuật ngữ trong tiếng Taino để chỉ loài cây này, là từ thông dụng Vương quốc Anh để chỉ cây ngô Tại Hoa Kỳ, Canada và Australia, thuật ngữ hay được sử dụng là corn, là từ trước đây dùng

để gọi cho một loại cây lương thực, hiện nay thuật ngữ này dùng để chỉ cây ngô, là dạng rút gọn của "Indian corn" là “cây lương thực của người Anh điêng” Lịch sử nghiên cứu thuộc các lĩnh vực khảo cổ, di truyền học, thực vật học, dân tộc học và địa lý học…quan tâm và đưa ra nhiều giả thuyết Có giả thuyết cho là nguồn gốc cây ngô khoảng năm 5.500 tới 10.000 trước công nguyên (TCN) Những nghiên cứu về di truyền học gần đây cho rằng quá trình thuần hóa ngô diễn ra vào khoảng năm 7000 TCN tại miền trung Mexico và tổ tiên của nó là loại cỏ teosinte hoang dại gầngiống nhất với ngô ngày nay vẫn còn mọc trong lưu vực sông Balsas Liên quan đến khảo cổ học, người ta cũng đã phát hiện các bắp ngô có sớm nhất tại hang Guila Naquitz trong thung lũng Oaxaca, có niên đại vào khoảng năm 4.250 TCN, các bắp ngô cổ nhất trong các hang động gần Tehuacan, Puebla, có niên đại vào khoảng 2750 TCN Một số giả thuyết cho rằng, có lẽ sớm nhất khoảng năm 1500 TCN, ngô bắt đầu phổ biến rộng và nhanh, ngô là lương thực chính của phần lớn các nền văn hóa tiền Columbus tại Bắc Mỹ, Trung Mỹ, Nam Mỹ và khu vực Caribe Với người dân bản xứ tại đây, ngô được suy tôn như bậc thần thánh và có tầm quan trọng về mặt tôn giáo do ảnh hưởng lớn của nó đối với đời sống của họ

- Việc gieo trồng ngô đã lan rộng từ Mexico vào tây nam Hoa Kỳ sau đó vào đông bắc nước này cũng như đông nam Canada, làm biến đổi cảnh quan các vùng đất này do thổ dân châu Mỹ đã dọn sạch nhiều diện tích rừng và đồng cỏ để trồng ngô Ngô lan truyền sang châu Âu và phần còn lại của thế giới sau khi có tiếp xúc của người châu Âu với châu

Mỹ

- Ngô được đưa vào châu Âu đầu tiên ở Tây Ban Nha trong chuyến thám hiểm thứ hai của Columbus vào khoảng năm 1494 Người châu Âu đã nhận biết được giá trị của nó và nhanh chóng phổ biến rộng rãi Vào những năm đầu của thế kỷ XVI, bằng đường thủy các tầu của Bồ Đào Nha, Tây Ban Nha, Italia đã đưa cây ngô ra hầu hết các lục địa của thế giới cũ Năm 1517, ngô xuất hiện ở Ai Cập, Thổ Nhĩ Kỳ, Pháp, Đức sau đó là nam châu Âu và Bắc Phi Năm 1521, ngô đến Đông Ấn Độ và quần đảo Indonesia Vào khoảng năm 1575 ngô đến Trung Quốc

- Ở Việt Nam, ngô là loại cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa Ngô được trồng khắp nơi, từ đồng bằng đến trung du và khá nhiều ở miền núi Có nhiều loại ngô, thường được xếp vào các loại khác nhau về cả tính chất và công dụng như ngô nếp (hạt màu trắng, dẻo hạt), chủ yếu để ăn, ngô tẻ (hạt màu trắng hoặc vàng), cứng nhưng sản lượng cao nên dùng làm thức ăn cho gia súc hai loại là ngô đường (hạt màu vàng không đều), vị ngọt và ngô rau (bắp nhỏ, ít tinh bột) dùng để ăn

- Cây ngô ở Việt Nam có nguồn gốc từ Trung Quốc Theo Lê Quý Đôn trong “Vân Đài loại ngữ “ hồi đầu đời Khang Hi (1662-1762), Trần Thế Vinh, người huyện Tiên Phong (Sơn Tây, phủ Quảng Oai) sang sứ nhà Thanh lấy được giống ngô đem về nước Khắp cả hạt Sơn Tây đã dùng ngô thay cho lúa gạo Từ đó ngô được phổ biến và phát triển ra khắp đất nước Nhà nông có câu: “Được mùa chớ phụ ngô khoai”, điều đó đủ để thấy rằng, mặc dù trong những năm tháng đã có đủ lúa gạo nhưng ngô vẫn giữ vai trò quan trọng đối với người nông dân

- Tuy nhiên, do là một nước có truyền thống sản xuất lúa gạo, trong một thời gian dài ngô

ít được chú ý mà chỉ những năm gần đây mới phát triển Cuộc cách mạng về giống ngô lai đã góp phần phần tăng nhanh diện tích, năng suất và sản lượng ngô toàn quốc, đưa nước ta đứng vào hàng ngũ những nước trồng ngô lai tiên tiến của vùng châu Á

b) Đặc tính thực vật học của ngô

Ngô (Zea mays L.) là cây nông nghiệp một lá mầm thuộc chi Zea, họ hòa thảo (Poaceae hay còn gọi là Gramineae) Các giống ngô ở Việt Nam có những đặc điểm như chiều cao cây, thời gian sinh trưởng, chống chịu sâu bệnh và thích ứng với điều kiện ngoại cảnh khác nhau Song cây ngô đều có những dặc điểm chung về hình thái, giải phẫu Các bộ phận của cây ngô bao gồm: rễ, thân, lá, hoa (bông cờ, bắp ngô) và hạt

Rễ ngô: Ngô có hệ rễ chùm tiêu biểu cho bộ rễ các cây họ hòa thảo Độ sâu và sự mở

rộng của rễ phụ thuộc vào giống, độ phì nhiêu và độ ẩm của đất Ngô có 3 lọai rễ chính:

Rễ mầm, rễ đốt và rễ chân kiềng

Rễ mầm (còn gọi là rễ mộng, rễ tạm thời, rễ hạt): gồm có: rễ mầm sơ sinh và rễ mầm

- Rễ mầm thứ sinh: Rễ mầm thứ sinh còn được gọi là rễ phụ hoặc rễ mầm phụ

Rễ này xuất hiện từ sau sự xuất hiện của rễ chính và có số lượng khoảng từ 3 đến 7 Tuy nhiên, đôi khi ở một số cây không xuất hiện lọai rễ này Rễ mầm thứ sinh cùng với rễ mầm sơ sinh tạo thành hệ rễ tạm thời cung cấp nước và các chất dinh dưỡng cho cây trong khoảng thời gian 2 - 3 tuần đầu Sau đó vai trò này nhường cho hệ rễ đốt

Rễ đốt (còn gọi là rễ phụ cố định): phát triển từ các đốt thấp của thân, mọc vòng

quanh các đốt dưới mặt đất bắt đầu lúc ngô được 3 - 4 lá Số lượng rễ đốt ở mỗi đốt của ngô từ 8 - 16 Rễ đốt ăn sâu xuống đất và có thể đạt tới 2,5m, thậm chí tới 5m, nhưng khối lượng chính của rễ đốt vẫn là ở lớp đất phía trên Rễ đốt làm nhiệm vụ cung cấp nước và các chất dinh dưỡng suốt thời kỳ sinh trưởng và phát triển của cây ngô

Rễ chân kiềng (còn gọi là là rễ neo hay rễ chống): mọc quanh các đốt sát mặt đất

Rễ chân kiềng to, nhẵn, ít phân nhánh, không có rễ con và lông hút ở phần trên mặt đất Ngoài chức năng chính là bám chặt vào đất giúp cây chống đỡ, rễ chân kiềng cũng tham gia hút nước và thức ăn

c) Thân ngô

- Thân ngô đặc và khá chắc, có đường kính từ 2-4 cm tùy thuộc vào giống, điều kiện sinh thái và chăm sóc Chiều cao của thân ngô khoảng 1,5-4 m Thân chính của ngô có nguồn gốc từ chồi mầm Từ các đốt dưới đất của thân chính có thể phát sinh ra từ 1-10 nhánh (thân phụ) với hình dáng tương tự như thân chính

- Thân ngô trưởng thành bao gồm nhiều lóng (dóng) nằm giữa các đốt và kết thúc bằng bông cờ Số lóng và chiều dài lóng là chỉ tiêu quan trọng trong việc phân loại các giống ngô Thường các giống ng8a1n ngày (thân cao 1,2-1,5 m) có khoàng 14-15 lóng; các giống trung ngày (thân cao 1,8-2,0 m) có 18-20 lóng; các giống dài ngày (thân cao từ 2,0-2,5 m) khoảng 20-22 lóng Nhưng không phải lóng nào cũng có bắp Lóng mang bắp có một sãnh dọc cho phép bắp bám và phát triển bình thường

d) Lá ngô

Căn cứ vào vị trí trên thân và hình thái có thể chia lá ngô làm 4 loại:

- Lá mầm: Là lá đầu tiên khi cây còn nhỏ, chưa phân biệt được phiến lá với vỏ bọc lá

- Lá thân: Lá mọc trên đốt thân, có mầm nách ở kẽ chân lá

- Phiến lá: Thường rộng, dài, mép lá lượn sóng, ở một số giống trên phiến lá có nhiều lông tơ Lá ở gần gốc ngắn hơn, những lá mang bắp trên cùng dài nhất

và sau đó chiều dài của lá lại giảm dần

- Thìa lìa: Là phần nằm giữa bẹ lá và phiến lá, gần sát với thân cây Tuy nhiên, không phải giống ngô nào cũng có thìa lìa; ở những giống không có thìa lìa, lá ngô gần như thẳng đứng, ôm lấy thân

Số lượng lá, chiều dài, chiều rộng, độ dày, lông tơ, màu lá, góc lá và gân lá thay đổi tùy theo từng giống khác nhau Số lá là đặc điểm khá ổn định ở ngô, có quan hệ chặt với số đốt và thời gian sinh trưởng Những giống ngô ngắn ngày thường có 15 - 16 lá, giống ngô trung bình: 18

- 20 lá, giống ngô dài ngày thường có trên 20 lá

e) Bông cờ và bắp ngô

Ngô là loài cây có hoa khác tính cùng gốc Hai cơ quan sinh sản: đực (bông cờ) và cái (bắp) nằm ở những vị trí khác nhau trên cùng một cây

Bông cờ (hoa đực): Hoa đực nằm ở đỉnh cây, xếp theo chùm gồm một trục chính và nhiều

nhánh Hoa đực mọc thành bông nhỏ gọi là bông chét, bông con hoặc gié Các gié mọc đối diện nhau trên trục chính hay trên các nhánh Mỗi bông nhỏ có cuống ngắn và hai vỏ nâu hình bầu dục trên vỏ trấu (mày ngoài và mày trong) có gân và lông tơ Trong mỗi bông nhỏ

có hai hoa: một hoa cuống dài và một hoa cuống ngắn Một bông nhỏ có thể có một hoặc ba hoa Ở mỗi hoa có thể thấy dấu vết thoái hoá và vết tích của nhụy hoa cái, quanh đó có ba chỉ đực mang ba nhị đực và hai mày cực nhỏ gọi là vẩy tương ứng với tràng hoa Bao quanh các

bộ phận của một hoa có hai mày nhỏ - mày ngoài tương ứng với lá bắc hoa và mày trong tương ứng với lá đài hoa

Bắp ngô (hoa cái): Hoa tự cái (bắp ngô) phát sinh từ chồi nách các lá, song chỉ 1 - 3 chồi

khoảng giữa thân mới tạo thành bắp Hoa có cuống gồm nhiều đốt ngắn, mỗi đốt trên cuống

có một lá bi bao bọc Trên trục đính hoa cái (cùi, lõi ngô), hoa mọc từng đôi bông nhỏ Mỗi bông có hai hoa, nhưng chỉ có một hoa tạo thành hạt, còn một hoa thoái hóa Phía ngoài hoa

có hai mày (mày ngoài và mày trong) Ngay sau mày ngoài là dấu vết của nhị đực và hoa cái thứ hai thoái hoá; chính giữa là bầu hoa, trên bầu hoa có núm và vòi nhụy vươn dài thành râu Râu ngô thuôn dài trông giống như một búi tóc, ban đầu màu xanh lục và sau đó chuyển dần sang màu hung đỏ hay hung vàng Trên râu có nhiều lông tơ và chất tiết làm cho hạt phấn bám vào và dễ nảy mầm

f) Hạt ngô

Hạt ngô thuộc loại quả dính gồm 5 phần chính: vỏ hạt, lớp alơron, phôi, nội nhũ và chân hạt

Vỏ hạt là một màng nhẵn bao xung quanh hạt Lớp alơron nằm dưới vỏ hạt và bao lấy nội nhũ và phôi Nội nhũ là phần chính của hạt chứa các tế bào dự trữ chất dinh dưỡng Nội nhũ

có 2 phần: nội nhũ bột và nội nhũ sừng Tỷ lệ giữa nội nhũ bột và nội nhũ sừng tùy vào chủng ngô, giống ngô

Phôi ngô chiếm 1/3 thể tích của hạt và gồm có các phần: ngù (phần ngăn cách giữa nội nhũ

và phôi), lá mầm, trụ dưới lá mầm, rễ mầm và chồi mầm

Các hạt ngô có kích thước cỡ hạt đậu Hà Lan, và bám chặt thành các hàng tương đối đều xung quanh một lõi trắng để tạo ra bắp ngô Mỗi bắp ngô dài khoảng 10 – 25 cm, chứa khoảng 200 - 400 hạt Các hạt có màu như ánh đen, xám xanh, đỏ, trắng và vàng

2.3.1.2 Đặc tính sinh sản của ngô

a) Chu kỳ phát triển ngô

Thời gian sinh trưởng của cây ngô dài, ngắn khác nhau phụ thuộc vào giống và điều kiện ngoại cảnh Trung bình thời gian sinh trưởng từ khi gieo đến khi chín là 90 - 160 ngày Sự phát triển của cây ngô chia ra làm 2 giai đoạn:

- Giai đoạn sinh trưởng dinh dưỡng: Từ khi gieo đến khi xuất hiện nhị cái

- Giai đoạn sinh trưởng sinh thực: Bắt đầu với việc thụ tinh của hoa cái cho đến khi hạt chín hoàn toàn Có nhiều ý kiến khác nhau về thời gian sinh trưởng phát triể của cây ngô, song có thể chia ra các thời kỳ sau: Thời kỳ nảy mầm, thời kỳ 3 - 6 lá, thời kỳ 8 -

10 lá, thời kỳ xoáy nõn, thời kỳ nở hoa và thời kỳ chín

b) Phương thức sinh sản

Ngô là loài cây có hoa khác tính cùng gốc Hai cơ quan sinh sản: đực (bông cờ) và cái (bắp) nằm ở những vị trí khác nhau trên cùng một cây

Ngô là cây một lá mầm với hoa đực và hoa cái nằm ở các vị trí khác nhau trên cùng một cây

và chúng là cây thụ phấn chéo trong cùng một thế hệ Tuy nhiên, tỉ lệ tự thụ trong ngô được báo cáo là khoảng 5% Hoa đực được mọc trên một cụm gọi là cờ nằm ở trên đỉnh của thân ngô theo trục thẳng đứng, những nhánh phụ của cờ ngô mọc xoắn quanh một trục Hoa cái của ngô thì nằm bên trong một bao được bao bọc dưới lá bắc dưới và chúng mọc lên từ một trong những nốt của thân ngô thông thường nằm ở giữa thân

Thời kỳ xoáy nõn: Vào giai đoạn cây được 12 lá, số noãn (hạt thế năng) trên mỗi bắp và độ

lớn của bắp được xác định Số hàng trên bắp đã được thiết lập Các chồi bắp trên vẫn còn nhỏ hơn các chồi bắp dưới, nhưng đang tiến tới sát dần nhau về độ lớn Điều kiện quan trọng cần được đảm bảo ở giai đoạn này là độ ẩm và chất dinh dưỡng , sự thiếu hụt của các yếu tố này dẫn đến sự giảm sút nghiêm trọng số hạt tiềm năng và độ lớn của bắp Các giống ngô lai chín sớm thường có bắp nhỏ hơn nên cần được trồng với mật độ cây cao hơn giúp chúng đảm bảo được lượng hạt tương đương với các giống lai chín muộn trên cùng đơn vị diện tích

Giai đoạn cây được 15 lá là giai đoạn quyết định đến năng suất hạt Các chồi bắp phía trên vượt hơn các chồi bắp phía dưới Sau 1 - 2 ngày lại hình thành một lá mới Râu ngô bắt đầu mọc từ những bắp phía trên Ở đỉnh của bẹ lá bao quanh, một số chồi bắp trên cũng đã bắt đầu xuất hiện Đỉnh của bông cờ cũng có thể nhìn thấy (Nguồn: Viện nghiên cứu ngô) Trong giai đoạn này, sự đảm bảo đủ nước là điều kiện quan trọng nhất để có được năng suất hạt tốt

Rễ chân kiềng bắt đầu mọc ra từ các đốt trên mặt đất khi cây được 18 lá Chúng giúp cây chống đổ và hút nước, chất dinh dưỡng ở những lớp đất bên trên trong giai đọan sinh thực Râu ngô mọc từ noãn đáy bắp rồi đến râu từ đỉnh bắp và tiếp tục phát triển Bắp ngô cũng phát triển nhanh chóng Cây ngô lúc này đang ở vào khoảng 1 tuần trước lúc phun râu

Thời kỳ nở hoa: Thời kỳ này bao gồm các giai đoạn: Trỗ cờ, tung phấn, phun râu, thụ tinh

và mẩy hạt

- Giai đoạn trổ cờ: Bắt đầu khi nhánh cuối cùng của bông cờ đã thấy hoàn toàn, còn râu thì chưa thấy Đây là giai đoạn trước khi cây phun râu khoảng 2 - 3 ngày Cây ngô hầu như đã đạt được độ cao nhất của nó và bắt đầu tung phấn Tùy thuộc vào giống và điều kiện bên ngoài mà thời gian giữa tung phấn và phun râu có thể dao động khác nhau Ở điều kiện ngoài đồng, tung phấn thường xuyên xảy ra vào cuối buổi sáng và đầu buổi chiều Giai đoạn tung phấn thường kéo dài từ 1 đến 2 tuần Trong thời gian này từng sợi râu cá thể có thể phun ra để thụ tinh nếu như hạt đã phát triển Thời kỳ này bông cờ và toàn bộ lá đã hoàn thiện nên nếu gặp mưa đá thì lá sẽ rụng hết sẽ dẫn đến mất hoàn toàn năng suất hạt

- Giai đoạn phun râu: Giai đoạn này bắt đầu khi một vài râu ngô đã được nhìn thấy bên ngoài lá bi Khi những hạt phấn rơi được giữ lại trên những râu tươi, mới này thì quá trình thụ phấn xảy ra Hạt phấn được giữ lại cần khoảng 24 giờ để thâm nhập vào từ râu cho đến noãn - nới xảy ra thụ tinh và noãn trở thành hạt Thường thường, tất cả râu trên 1 bắp phun hết và thụ phấn hết trong khoảng 2 - 3 ngày Râu mọc khoảng 2,5

- 3,8 cm mỗi ngày và tiếp tục kéo dài đến khi được thụ tinh Noãn hay hạt ở giai đoạn phun râu hầu như hoàn toàn chìm trong các vật liệu cùi bao quanh (mày, mày dưới, lá bắc nhỏ) và ở bên ngoài có màu trắng Vật liệu bên trong của hạt biểu hiện trong và hơi lỏng Phôi hoặc mầm còn chưa thấy rõ Đây là thời gian quyết định số noãn sẽ được thụ tinh Những noãn không dược thụ tinh sẽ không cho hạt và bị thoái hóa Ở giai đoạn này cần theo dõi các loại sâu hại rễ ngô, sau ăn rau và xử lý kịp thời Nhu cầu về kali của cây đã đủ, còn đạm và lân được hút nhanh

- Quá trình thụ phấn, thụ tinh và hình thành hạt ngô: Ngô là cây giao phấn (thụ phấn chéo), sự giao phấn này được thực hiện chủ yếu nhờ gió và côn trùng Khi hoa đực chín, các mày của nó phồng lên, các chỉ nhị dài ra, bao phấn tách ra khỏi hoa và tung

ra các hạt phấn hình trứng có đường kính khoảng 0,1mm Mỗi bông cờ có 2 hoa, mỗi hoa có 3 nhị đực, mỗi nhị đực có một bao phấn, mỗi bao phấn có 2 ô và trong mỗi ô

có khoảng 1000 - 2500 hạt phấn Như vậy tổng cộng mỗi bông cờ cho 10 - 13 triệu hạt phấn Khi bắt đầu nở, các hoa ở 1/3 phía đỉnh trục chính tung phấn trước, sau đó theo thứ tự từ trên xuống và từ ngoài vào trong Một bông cờ trong mùa xuân, hè đủ

ấm thường tung phấn trong 5 - 8 ngày; mùa lạnh, khô có thể kéo dài 10 - 12 ngày Thời gian phun râu của hoa cái thường sau tung phấn của hoa đực 1 - 5 ngày tuỳ thuộc vào giống và điều kiện tự nhiên Tuy nhiên, cũng có khi râu phun trước tung phấn Ở điều kiện Việt Nam, râu phun trong khoảng thời gian từ 5 - 12 ngày Trên một bắp hoa cái, gần cuống bắp phun râu trước rồi tiếp đến đỉnh bắp Trên một cây, bắp trên thường phun râu trước bắp dưới 2 - 3 ngày Hạt phấn từ bông cờ rơi trên râu ngô 5 - 6 giờ thì bắt đầu nảy mầm Ống phấn mọc dài và đi dọc theo chiều dài của râu ngô đến tận túi phôi Tế bào phát sinh trong hạt phấn phân chia nguyên nhiễm sinh ra hai tinh trùng di chuyển ra phía đầu ống phấn, khi noãn đầu ống vỡ ra, phóng hai tinh trùng vào trong noãn Ở đây quá trình thụ tinh diễn ra

- Giai đoạn mẩy hạt (10 - 14 ngày sau phun râu): Hạt có dạng hình mẩy và bên ngoài có màu trắng Nội nhũ và chất lỏng bên trong có màu trong và có thể thấy phôi rất nhỏ

Rễ mầm, bao lá mầm và lá phôi đầu tiên đã được hình thành mặc dù phôi còn phát triển chậm

Nhiều hạt đã mọc ra ngoài, các vật liệu bao quanh của cùi ở hạt và cùi đã gần như đạt tới kích thước cuối cùng Râu ngô đã hoàn thành chức năng ra hoa, đang thâm màu và bắt đầu khô Trong nội nhũ loãng của hạt bắt đầu tích luỹ tinh bột Hạt bắt đầu giai đoạn tích luỹ chất khô nhanh, chắc và bắp đầy hạt dần Mặc dù tổng lượng đạm và lân trong cây đang còn tích lũy nhanh, nhưng những chất dinh dưỡng này đang bắt dầu di chuyển từ các phần dinh dưỡng sang các bộ phận sinh thực Hạt có khoảng 85% độ ẩm Độ ẩm của hạt giảm dần cho đến thu hoạch

Thời kỳ chín:

- Giai đoạn chín sữa (18 - 22 ngày sau phun râu): Hạt bên ngoài có màu vàng và chất lỏng bên trong như sữa trắng do đang tích lũy tinh bột Phôi phát triển nhanh dần Phần lớn hạt đã mọc ra ngoài vật liệu bao quanh của cùi Râu có màu nâu, đã hoặc đang khô Do độ tích lũy chất khô trong hạt nhanh nên hạt lớn nhanh, độ ẩm khoảng 80% Sự phân chia tế bào trong nội nhũ của hạt cơ bản hoàn thành, tế bào phồng lên

và đầy lên bằng tinh bột

- Giai đoạn chín sáp (24 - 28 ngày sau phun râu): Tinh bột tiếp tục tích lũy bên trong nội nhũ làm chất sữa lỏng bên trong đặc lại thành bột hồ 4 lá phôi đã được hình thành Cùi tẽ hạt có màu hồng nhạt đến hồng do các vật liệu bao quanh hạt đổi màu Vào khoảng giữa giai đoạn này, bề ngang của phôi bằng quá nửa bề rộng của hạt

Chất lỏng giảm dần và độ cứng của hạt tăng lên sinh ra trạng thái sáp của hạt Sau đó, những hạt dọc theo chiều dài của bắp bắt đầu có dạng răng ngựa hoặc khô ở đỉnh Lá phôi thứ 5 (cuối cùng) và các rễ mầm thứ sinh được hình thành

- Giai đoạn hình thành răng ngựa (35 - 42 ngày sau phun râu): Tuỳ theo chủng mà các hạt đang hình thành răng ngựa hoặc đã có dạng răng ngựa Cùi đã tẽ hạt có màu đỏ hoặc trắng tuỳ theo giống Hạt khô dần bắt đầu từ đỉnh và hình thành một lớp tinh bột nhỏ màu trắng cứng Lớp tinh bột này xuất hiện rất nhanh sau khi hình thành răng ngựa như một đường chạy ngang hạt Hạt càng già, lớp tinh bột càng cứng và đường vạch càng tiến về phía đáy hạt (phía cùi) Vào đầu giai đoạn này hạt có độ ẩm khoảng 55% Ở giai đoạn này, nếu gặp thời tiết lạnh, chất khô trong hạt có thể ngừng tích luỹ

và lớp đen trên các hạt hình thành quá sớm Điều này dẫn đến sự giảm năng suất và trì hoãn công việc thu hoạch do ngô khô chậm khi gặp lạnh Để hạn chế thiệt hại do tác động của lạnh, nên chọn giống chín khoảng 3 tuần trước ngày lạnh gây tác hại đầu tiên ở mức trung bình

- Giai đoạn chín hoàn toàn - chín sinh lý (55 - 65 ngày sau phun râu): Sự tích luỹ chất khô trong hạt đạt mức tối đa và tất cả các hạt trên bắp cũng đã đạt trọng lượng khô tối

đa của nó Lớp tinh bột đã hoàn toàn tiến đến cùi và sẹo đen hoặc nâu đã hình thành Lớp đen này bắt đầu hình thành từ các hạt đỉnh bắp đến các hạt đáy bắp Hạt ngô lúc này ở thời điểm chính sinh lý và kết thúc sự phát triển Lá bi và nhiều lá không còn xanh nữa Độ ẩm của hạt ở thời gian này tuỳ thuộc vào giống và điều kiện môi trường, trung bình khoảng 30 - 35% Nếu thu hoạch ngô cho ủ chua (si-lô) thì đây là thời điểm thích hợp Còn bình thường nên để ngô ở ngoài đồng một thời gian nữa, lúc cả cây ngô đã ngả màu vàng để hạt ngô đủ khô (ở ngô tẻ độ ẩm khoảng 13 - 15%) để hạt cất giữ được an toàn

2.3.1.3 Lịch sử sử dụng sinh vật nhận

a) Lịch sử được thuần hóa, trồng trọt

Ngô trồng hiện nay được tiến hóa từ chi Cỏ ngô là một nhóm các loài cỏ lớn với danh pháp khoa học Zea, được tìm thấy tại Mexico, Guatemala và Nicaragua Các loài trong chi Zea bị ấu trùng của một số loài côn trùng trong bộ Cánh vẩy (Lepidoptera) phá hại,

như Spodoptera frugiperda; Helicoverpa zea; Diatraea và Chilo spp (tại châu Mỹ); còn tại Cựu thế giới là Gymnoscelis rufifasciata, Agrotis clavis, Agrotis exclamationis,

Hypercompe indecisa, Apamea sordens, Xestia c-nigrum, Agrotis segetum, Ostrinia nubilalis v.v

Các loài Cỏ ngô có thể kể ra như sau:

Zea diploperennis Zea luxurians Zea mays

Zea mays huehuetenangensis

Zea mays mays (ngô)

Zea mays mexicana Zea mays parviglumis

Zea nicaraguensis Zea perennis

Trong đó Zeamays chính là loài ngô được thuần hóa và sử dụng ngày nay

Quá trình tiến hóa của ngô: Cỏ ngô là thành phần cực kỳ quan trọng trong quá trình tiến

hóa của ngô, nhưng các quan điểm về quá trình này lại rất khác nhau Theo một mô hình tiến

hóa thì ngô đã phát triển lên trực tiếp từ Zea mays parviglumis bằng chọn lựa với các đột biến quan trọng; tới 12% thành phần bộ gen của nó có từ Zea mays mexicana thông qua trao đổi

gen Mô hình khác lại cho rằng ngô dại với các tai nhỏ đã được thuần hóa, và sau khi được

phát tán từ miền đông Trung Mexico, dạng lai ghép giữa ngô dại này với Z luxurians hoặc Z

diploperennis đã tạo ra sự bùng nổ lớn trong sự đa dạng gen của ngô, hình thái tai và lõi, khả

năng thích nghi với các môi trường sống mới, cũng như năng suất cây trồng được gia tăng

Mô hình thứ ba cho rằng ngô nguyên thủy là kết quả lai ghép chéo giữa Z diploperennis và các loài cỏ trong chi Tripsacum; nhưng hỗ trợ cho giả thuyết này là rất ít

Trong chi Zea này hiện tại người ta công nhận 5 loài cỏ ngô: Zea diploperennis, Zea

luxurians, Zea nicaraguensis, Zea perennis và Zea mays Loài cuối cùng này được chia tiếp

thành 4 phân loài là: huehuetenangensis, mexicana, parviglumis và mays, trong đó ba phân

loài đầu là cỏ ngô, còn phân loài cuối cùng là ngô, loại cây duy nhất trong chi này được con người gieo trồng làm lương thực hay thức ăn cho gia súc Chi này đôi khi cũng được chia ra

thành 2 nhánh (sectio), là nhánh Luxuriantes, bao gồm 4 loài đầu tiên, và nhánh Zea với loài duy nhất là Zea mays Nhánh thứ nhất có đặc trưng là các chỗ phồng sẫm màu cấu thành từ

heterochromatin ở cuối ở mỗi nhánh nhiễm sắc thể, trong khi phần lớn các phân loài của

nhánh Zea có thể có 0-3 chỗ phồng giữa mỗi đoạn cuối của nhiễm sắc thể và trung đoạn và rất ít chỗ phồng ở cuối (ngoại trừ phân loài huehuetenangensis có nhiều chỗ phồng lớn ở

cuối)

Các loài trong chi này có thể là cây một năm lẫn cây lâu năm Zea diploperennis và Z

perennis là cây lâu năm, trong khi các loài còn lại là cây một năm Gần như tất cả các loài

đều là lưỡng bội (n=10) với ngoại lệ là Z perennis (tứ bội (n=20)) Các loài và phân loài cỏ

ngô có thể dễ dàng phân biệt dựa trên các khác biệt về hình thái, di truyền học tế bào, protein

và ADN cũng như trên cơ sở nguồn gốc địa lý, cho dù hai loài lâu năm là cùng khu vực phân

bổ và khá giống nhau Phân loài cỏ ngô khó xử nhất là Zea mays huehuetenangensis, kết hợp các đặc trưng hình thái tương tự như của Zea mays parviglumis với nhiều chỗ phồng cuối của

nhiễm sắc thể và vị trí trung gian giữa hai nhánh Phân loài cỏ ngô khác biệt nhất về hình thái

và bị đe dọa nhiều nhất là Zea mays nicaraguensis, chỉ phát triển trong điều kiện ngập lụt dọc

theo 200 mét cửa một con sông nhỏ ở tây bắc Nicaragua

Như từ tên gọi có thể thấy, các loài/phân loài cỏ ngô tương tự như ngô ở nhiều điểm, đáng chú ý nhất là hình thái của cờ (cụm hoa đực) của chúng Điểm khác biệt đáng chú ý nhất giữa

cỏ ngô và ngô là chúng có nhiều nhánh, mỗi nhánh mang các chùm hoa cái nhỏ và khác biệt Mỗi chùm hoa này khi phát triển thuần thục sẽ tạo ra một 'tai' hai cấp gồm 5-10 đoạn rời hình tam giác hay hình thang, màu đen hay nâu, mỗi đoạn chứa một hạt Mỗi hạt được che phủ bằng lớp vỏ quả rất cứng, bao gồm một quả đấu hay chỗ lõm xuống trong cuống và mày thấp

và cứng Lớp vỏ này bảo vệ hạt không bị tiêu hóa trong ruột của các loài động vật nhai lại và giúp cho việc phát tán hạt khi chúng bị thải ra theo phân Hạt cỏ ngô khó nảy mầm nhưng sẽ nhanh chóng nảy mầm nếu được xử lý bằng dung dịch loãng của perôxít hiđrô

Tất cả các loài cỏ ngô Nicaragua có thể mọc trong hay rất gần với các cánh đồng trồng ngô, tạo cơ hội cho việc lai tạp giữa ngô và cỏ ngô Các thế hệ lai ghép đầu-cuối hay được tìm

thấy trong các đồng ngô này, nhưng tỷ lệ trao đổi gen là khá thấp Một vài quần thể Zea mays

mexicana có hình dáng bề ngoài giống như ngô trong các cánh đồng trồng ngô, có lẽ là kết

quả của quá trình tiến hóa dưới áp lực từ việc diệt cỏ dại có chọn lọc từ phía người nông dân Tại một vài khu vực thuộc Mexico, cỏ ngô bị các nông dân chuyên trồng ngô coi là một loại

cỏ dại khó tiêu diệt, trong khi tại một số khu vực khác thì người ta lại coi chúng như là cây đồng hành có ích, và khuyến khích việc chuyển gen từ cỏ ngô sang ngô của họ

Trên thực tế tất cả các quần thể cỏ ngô hiện đang ở tình trạng bị đe dọa hay nguy cấp: Zea

diploperennis tồn tại trong khu vực chỉ vài dặm vuông; Zea nicaraguensis hiện còn khoảng

6.000 cây trong khu vực 200 x 150 mét Trong những năm gần đây, chính quyền Mexico và Nicaragua đã có một số hành động nhằm bảo vệ các quần thể cỏ ngô hoang dã, bằng cách sử

dụng các phương pháp bảo tồn in situ (tại chỗ) và ex situ (không tại chỗ) Hiện tại, có một

lượng lớn sự chú ý, quan tâm từ giới khoa học đối với các đặc trưng có ích của cỏ ngô, như khả năng kháng côn trùng, khả năng sống lâu năm và chịu ngập lụt, nhằm cải tạo các giống ngô, mặc dù điều này là cực kỳ khó khăn do nó cũng kèm theo các đặc trưng có hại của cỏ ngô

Ngô chỉ lan truyền gen tới các loài thực vật khác tương thích về sinh sản và điều này chỉ có thể xảy ra ở những nơi mà có các loài họ hàng hoang dại của ngô mọc tại đó như Mexico và Guatemala (EEA, 2002)

Khả năng sống sót của ngô ngoài môi trường: Ngô ngày nay là một loại cây trồng đã được

thuần hóa cao và không thể tồn tại mà không có sự can thiệp của con người (Niebur, 1993) Ngô là loại cây trồng một năm, do cấu trúc đặc thù của bắp nên chúng không thể phát tán nếu như không có tác động cơ học để tách ra từ lõi và hầu như hạt ngô không có giai đoạn ngủ nghỉ Không tồn tại sự tái sinh từ các bộ phận khác của cây ở điều kiện môi trường tự nhiên

Sự sống của cây ngô phụ thuộc vào các điều kiện như nhiệt độ, độ ẩm hạt giống, kiểu gen, sự bảo vệ của vỏ và giai đoạn phát triển Ngô không phải là loại cỏ dại tồn tại dai dẳng Hạt giống ngô chỉ có thể tồn tại dưới một phạm vi hẹp của điều kiện khí hậu Những cây tự mọc

rễ ràng bị chết do lạnh, hoặc rễ ràng kiểm soát bằng các phương pháp nông học thông thường như canh tác đất và sử dụng các chất diệt cỏ chọn lọc (Niebur, 1993) Ngô không có khả năng duy trì sinh sản nếu không có sự canh tác của con người và không xâm hại môi trường sống

tự nhiên (OECD, 2003)

b) Lịch sử sử dụng làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

Tùy mỗi loại ngô khác nhau mà chúng được sử dụng cho các mục đích khác nhau Ngô có thể dùng trong chế biến thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, làm nguyên liệu chất đốt, nguyên liệu trong công nghiệp và làm thuốc chữa bệnh

Toàn thế giới sử dụng 21% sản lượng ngô làm lương thực cho người trong đó nhiều nước sử dụng ngô là lương thực chính Khẩu phần ăn ở các nước châu Mỹ La Tinh là bánh ngô, đậu

đỗ và ớt giống như các nước châu Á sử dụng cơm (gạo), cá, rau xanh và các nước châu Âu sử dụng bánh mỳ, khoai tây, sữa

Ở Việt Nam, ngô là loại lương thực quan trọng thứ 2 sau lúa gạo Hạt ngô có thể xay nhỏ nấu với gạo thành cơm hoặc chế biến thành các món ăn như xôi ngô, ngô bung, nhiều vùng miền núi thường bung ngô nếp với đậu đen ăn thay cơm, xay hạt ngô thành bột nấu bánh đúc ngô…Ngô sử dụng làm thực phẩm như ngô bao tử xào thịt, súp ngô, chè ngô, cháo ngô, ngô luộc, ngô hấp ngô rang, ngô nướng, kẹo ngô, bột dinh dưỡng ngô, rượu ngô…

Ngô làm thức ăn chăn nuôi: Từ ngô hạt có thể xay vỡ nuôi gia cầm (gà, vịt, ngan, ngỗng…), nghiền thành bột và chế biến làm thức ăn cho trâu bò, lợn và gia cầm, chế biến thức ăn cho cá Thân lá ngô có thể cho trâu bò ăn tươi, sau khi thu hoạch (nhất là ngô thu bắp non) băm nhỏ ủ chua làm thức ăn cho gia súc

Chế biến thức ăn chăn nuôi từ ngô: Ngô nghiền thành bột và có thể trộn theo thành phần và

tỷ lệ khác nhau với bột sắn (khoai mỳ), cám gạo, khô dầu lạc, khô dầu đậu tương, bột cá, vỏ tôm, vỏ sò…để chế biến làm các loại thức ăn cho gia súc, gia cầm và thủy sản…

Giá trị dinh dưỡng của thân, lá ngô ngô khá lớn, phụ thuộc vào giống ngô và thời vụ thu hoạch Trong 1 kg thân cây ngô có 600 - 700 g chất khô, 60 - 70 g protein, 280 - 300 g xơ

Do vậy, thân, lá ngô là nguồn thức ăn thô quan trọng cho trâu bò ở nhiều vùng Giá trị dinh dưỡng thân, lá ngô còn tăng lên nếu được chế biến theo cách lên men ủ chua

2.3.2 Đặc điểm giống ngô nền (NK66)

Giống ngô NK66 là giống ngô lai đơn đã được cho phép thương mại hóa ở Việt Nam từ năm

2006 NK66 là giống quốc gia, thích nghi rộng và có thể trồng trên tất cả các vùng sinh thái

và mùa vụ khác nhau Giống cho năng suất cao, ổn định và được nông dân và người tiêu dùng

ưa chuộng với diện tích trồng năm 2010 vào khoảng 70000 ha/1.1 triệu ha ngô

Sau đây là một số đặc điểm nông sinh học và chế độ canh tác cho ngô NK66 ở Việt Nam:

- Thời gian sinh trưởng: 95-100 ngày

- Dạng hình cây gọn, bộ lá đứng

- Lá bi bao kín trái bắp

- Bắp to, hạt hình trụ có 14-16 hàng hạt/bắp

- Khả năng thích ứng rộng

- Cho năng suất 12-14 tấn/ha

- Sử dụng để chế biến thức ăn gia súc, gia cầm

Yêu cầu kỹ thuật trồng trọt:

- Thời vụ trồng: Trồng nhiều vụ trong năm: Vụ Xuân, Hè, vụ Đông ở Miền Bắc và các

- Cách bón: Bón lót toàn bộ phân chuồng và phân lân

+ Thúc lần 1: lúc cây con có 3-4 lá, bón 1/3 lượng Urea +1/3 lượng kali

+ Thúc lần 2: Lúc cây 7-9 lá, bón 1/3 lượng Urea + 1/3 lượng Kali

+ Thúc lần 3: lúc cây xoắn ngọn, trước trổ cờ 3-5 ngày, bón hết lượng phân còn lại

2.4 Giống cây trồng biến đổi gen ngô Bt11

2.4.1 Tính trạng, điểm khác biệt giữa ngô Bt11 và ngô không chuyển gien

Loại cây trồng xin đăng ký tiến hành khảo nghiệm đồng ruộng hạn chế và diện rộng là ngô

chuyển gen Bt11, mang gen CryIA(b) kháng sâu đục thân Ngô có tên khoa học là Zea mays L., thuộc chi Maydeae, họ hoà thảo (Poaceae hay gramineae), bộ hoà thảo (Poales hay Graminales), lớp một lá mầm (Monocotylens), ngành hạt kín (Angiospermatophyta), phân giới thực vật bậc cao (Cosmobionia)

Ngô NK66 mang sự kiện Bt11 có đặc điểm nông sinh học hoàn toàn như giống nền của nó là NK66, điều này là tương tự như các thí nghiệm khảo nghiệm đánh giá và so sánh các đặc tính nông sinh học cũng như biểu hiện về kiểu hình của ngô chuyển gen mang sự kiện Bt11 so với giống nền không chuyển gen Ở các nước đã phê chuẩn các sự kiện được đánh giá an toàn, sau khi được phê chuẩn thì nó được sử dụng trên các giống đã được thương mại hoặc được đề nghị ở mỗi nước mong muốn sử dụng

Điểm khác biệt giữa ngô chuyển gen mang sự kiện Bt11 với giống nền là khả năng kháng sâu

hại bộ cánh vảy, đặc trị cho sâu đục thân ngô châu Á với sự hiện diện của gen Cry1Ab và khả

năng chống chịu với các loại thuốc trừ cỏ có chứa hoạt chất Glufosinate ammonium với sự

hiện diện của gen chỉ thị pat Để chứng minh điều này, rất nhiều các thí nghiệm đánh giá và

so sánh đặc tính nông học giữa giống chuyển gen và giống nền không chuyển gen đã được thực hiện

Trong thí nghiệm được tiến hành năm 1995 tại Pháp, các dữ liệu về đặc tính nông học (màu sắc của bắp, cờ, lá, lóng/đốt, mày; chiều cao cây và chiều chiều dài cờ, dạng hạt, tính chống chịu với sâu bệnh, số nhánh ban đầu, chiều cao đóng bắp, độ dài cuống hoa, số hàng hạt trên bắp) đã được thu thập và xác định tính tương đồng về kiểu hình của ngô Bt11 và không chuyển gen với cùng một giống nền Hơn nữa, không có sự khác nhau về kiểu hình và đặc tính nông học giữa ngô chuyển gen Bt và ngô không chuyển gen khi sử dụng trên cùng giống nền được xác định ở các địa điểm khác nhau (Tây Ban Nha, Pháp, Ý và Đồ Đào Nha) được tiến hành từ năm 1994 đến năm 2006 Điều này chỉ ra rằng, khi chuyền gen kháng sâu đục thân vào một giống ngô được xác định để phát triển thì hoàn toàn không có sự thay đổi về kiểu hình và đặc tính nông học của giống ngô đó Những kết quả và số liệu so sánh, kết luận

và khẳng định sự giống nhau giữa ngô chuyển gen Bt11 và ngô không chuyển gen cùng dòng

ở các nước khác được mô tả chi tiết trong phần III

2.4.2 Biểu hiện tính trạng/protein của ngô Bt11

Để nhận biết ngô biến đổi gen Bt11 thì cần nhận biết hai protein mới đưa vào, đó là:

 Gen Btk mã hóa protein CryIAb, kháng sâu đục thân (bore);

 Gen pat mã hoá enzyme PAT, kháng phosphinothricin

2.4.2.1 Sự biểu hiện của gen Btk trong ngô chuyển gen Bt11

Những phân tích, phát hiện gen Btk trên ruộng của cây ngô Bt11 được tóm tắt như sau:

Phương pháp: Để thống kê mức độ tổng hợp protein CryIAb của Bt11, tiến hành phân tích

hàm lượng protein CryIAb ở nhiều mẫu mô khác nhau trong quá trình phát triển của cây Ngô Bt11 được trồng trong nhà kính, chọn tối thiểu 5 cây con cho mỗi mẫu, mẫu mô được nghiền trong nitơ lỏng với 6 thể tích dịch tách chiết (50 mM bis-Tris propane, pH 5,7, 5 nM ethylene-diaminotetraacetic acid, 5 mM dithiothreitol, và 0,1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride), ủ 30-60 phút ở 40C, ly tâm 11.000 xg trong 20 phút, protein tổng và nồng độ Btk được xác định bằng phương pháp ELISA và phân tích protein Bio-rad Trọng lượng của mẫu

mô đã được tính toán sao cho tương đương với lượng vật liệu ban đầu, tất cả số liệu biểu thị cho khối lượng protein CryIAb (ng) trong 1mg protein tổng tách chiết được

Thử nghiệm thứ 2 tiến hành trên cây đã trồng ngoài đồng, khối lượng protein CryIAb được xác định trong nhiều mẫu mô khác nhau của cây lai trưởng thành trồng trong điều kiện tự nhiên Mẫu mô bao gồm lá, thân, vỏ bao và hạt, vật liệu cây được thu từ 4 dòng cây lai Mỗi dòng lai lấy 4 cây Cây được chia thành 2, Stanton MN (dòng X4334CBR và X4734CBR) và

St Joseph, IL (dòng lai X6534CBR và X7634CBR) Hai dòng lai không biến đổi và tương đồng về đặc điểm di truyền, NK4242 và NK7514 được chọn làm đối chứng cho mỗi nghiệm thức theo thứ tự Tất cả mẫu mô đều ở giai đoạn trưởng thành, xanh tươi và khoẻ mạnh (lá: nửa trái và lá bao; thân: khoảng 20cm phần trên trái; vỏ bao: 1/3 phần trên của vỏ bao trái) Hạt thu ở giai đoạn chín sớm (độ ẩm 50-60%) khi thu hoạch ở lô Stanton và ở giai đoạn chín muộn (độ ẩm 40-50%) ở lô St Joseph, phân tích và ly trích protein như quy trình đã mô tả ở phía trên

Mẫu lấy từ cây lai không biến đổi gen ở giai đoạn ra hoa với lượng protein Bt chuẩn đã biết được dùng làm đối chứng, và cùng quy trình thu mẫu cũng như tách chiết protein theo sự ước tính lượng protein Bt sẽ thu được từ các mẫu mô khác nhau Thí nghiệm đạt ý nghĩa thống kê cho thấy hiệu qủa ly trích protein ở các mô khác nhau là: lá 15,9% ± 2,4, vỏ bao 20,0% ±3,6, thân 24,1% ±7,3 và hạt 31,1%±1,6

Kết quả: Hàm lượng protein CryIAb cao nhất ở cây trồng trong vườn ươm tìm thấy ở mô lá Thông thường, hàm lượng cao nhất được phát hiện giai đoạn còn non hơn của mô đang phát triển Protein CryIAb được tìm thấy trong tất cả các mô của cây Lượng protein CryIAb giảm

khi cây ở giai đoạn phát triển hoàn toàn và khi mô lão hoá (bảng 2)

Bảng 2 Hàm lượng riêng của protein CryIAb trong mô ngô chuyển gen Bt11 trong chu trình sống của cây ngô (cây trồng trong nhà kính)

Mô Ng Btk protein/mg protein tổng*, ngày trồng

Lá mầm 20,5

(0,4)

36 (1,7)

(1,3)

11,7 (0,8)

37 (7) 12

(3,4)

18,2 (4)

2,2 (1,2)

(4,7)

27,9 (3)

22,4 (0,9)

125 (5)

38 (1,3)

55,6 (4)

(2)

168 (5)

34 (1,3)

54 (3,3)

16,7 (1,2)

(6)

30 (1,5)

9,4 (1)

(2,2)

10,2 (1,1) Biểu bì

thân

36 (3,3)

10,4 (2,6)

12,6 (3,4)

9,0 (2,2)

(3,1)

18,0 (4,8)

8,8 (2,0)

(1,4)

8,8 (2,0)

6,8 (4,2)

5,2 (3,8)

(2,3)

27,2 (8,8)

5,2 (1,4)

(2,9)

15,4 (5,3)

2,6 (2,6)

(3,0)

22,6 (6,4)

16,2 (3,3)

(1,2)

7,0 (2,1)

4,8 (2,1)

(2,5)

0,4 (0,4) *: Trong ngoặc đơn là độ lệch chuẩn Số liệu không đúng với hiệu quả tách chiết thực tế

Bảng 3 Hàm lượng protein CryIAb trong ngô Bt11 trồng ngoài đồng

Dòng lai/mô Tổng protein

tách chiết*

(mg prot/g chất tươi)

Btk protein (ng Btk/tổng

mg protein)

Btk protein (µg Btk/g chất tươi)

Tổng protein CryIAb thống

kê ** (µg Btk/g chất tươi)

2X4334CBR Lá 26,5 (1,5) 161 (16) 4,3 (0,66) 27,0 (4,2)

Vỏ bao 5,23 (1,7) 220 (18) 1,1 (0,26) 5,6 (1,3) Thân 4,71 (1,2) 146 (2,6) 0,71 (0,11) 3,0 (0,5) Hạt 30,8 (1,1) 38 (5,3) 1,5 (0,21) 4,9 (0,7) X4734CBR Lá 31,2 (2,7) 163 (9,6) 5,05 (0,35) 31,8 (2,2)

Vỏ bao 5,25 (0,6) 170 (12) 0,84 (0,18) 4,2 (0,9) Thân 3,9 (0,4) 145 (18) 0,55 (0,06) 2,3 (0,25) Hạt 35,2 (4,3) 43 (5,7) 1,3 (0,28) 4,2 (0,89) X6534CBR Lá 21,6 (2,1) 333 (71) 5,3 (0,9) 33,2 (5,7)

Vỏ bao 2,9 (0,3) 280 (29) 0,79 (0,03) 3,9 (0,2) Thân 1,3 (0,1) 495 (43) 0,64 (0,04) 2,6 (0,2) Hạt 26,6 (1,0) 56 (3,3) 1,50 (0,04) 4,7 (0,13) X7634CBR Lá 24,0 (1,3) 216 (24) 5,24 (0,78) 33,0 (4,9)

Vỏ bao 3,88 (0,3) 271 (64) 1,04 (0,23) 5,2 (1,2) Thân 2,09 (0,3) 254 (23) 0,53 (0,06) 2,2 (0,25) Hạt 27,1 (0,5) 58 (5,5) 1,60 (0,13) 5,0 (0,42)

*Trong ngoặc: Độ lệch chuẩn

**: các giá trị thực tế đo được điều chỉnh bằng ước lượng khai căn: lá =15,9%; vỏ = 20,0%; thân = 24,1%; hạt =31,3%

Kết quả xác định hàm lượng protein trong cây trồng ở ngoài đồng được mô tả trong bảng 3 Tính trên gram mô, nồng độ protein CryIAb cao nhất được phát hiện ở mô lá, nồng độ riêng

của protein CryIAb (ngBtk) protein/mg protein tổng) tương đương nhau ở lá, thân, và vỏ bao nhưng thấp hơn đáng kể trong hạt Số liệu cho thấy 4 dòng lai chuyển gen Bt11 cho ra cùng lượng protein CryIAb Kết quả này phù hợp với dự đoán khi tất cả các dòng đều cùng nguồn gốc chuyển gen cùng độ tuổi sinh lý và điều kiện chăm sóc

Sự biểu hiện của gen Btk trong ngô ngọt Bt11: Để mô tả mức độ biểu hiện của protein

chuyển gen trên cây ngô ngọt Bt11, lượng protein CryIAb được xác định từ nhiều loại mô khác nhau và từ các giai đoạn phát triển khác nhau của ba giống ngô ngọt- các giống ngô này được trồng trong điều kiện đồng ruộng vào năm 1996 Ngoài ra, protein CryIAb được định lượng trong ngô ngọt-các giống này được sản xuất từ 3 giống ngô lai Nhìn chung, lượng Btk không qúa khác biệt về kiểu gen Trong những giai đoạn phát triển về sau (sau thu hoạch), lượng Btk trong lá giảm ở mức 50% ngay từ lúc khởi đầu-khoảng 56 ngày sau khi trồng đến ngày thứ 105- cho 2 loại kiểu gen; tuy nhiên, việc này không được xem là loại kiểu gen thứ 3

Lá cây và lông tơ có mức độ biểu hiện protein CryIAb ở mức cao nhất và rất tương đồng với nhau (ca 4-6 µg Btk/g chất tươi), được sinh ra bởi vỏ, quả và rễ cây Mức độ tương đương của protein CryIAb được tìm thấy ở mô thân tại 2 thời điểm được phân tích và không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê qua kiểu gen

Mức độ của protein Bt trong hạt ngô được duy trì ở mức ổn định: một lượng khoảng 2,29

±1,11 Btk/g chất tươi được xác định một tuần trước khi thu hoạch, ở giai đoạn thu hoạch thì hàm lượng khoảng 1,97±0,36 µg Btk/g chất tươi, và dao động trong khoảng 1,08 ±0,48 µg Btk/g chất tươi đến 2,98 ±1,12 trong 4 tuần tiếp theo, protein CryIAb không được phát hiện ở trong bất kỳ mẫu ngô đóng hộp nào

Một nghiên cứu thứ 2 được thực hiện trên 2000 hạt ngô, lượng protein dao động từ 0,73-1,46

µg Btk/g chất tươi Kết quả này là một bằng chứng giúp khẳng định kết qủa nghiên cứu trước với kết luận là biểu hiện của protein Cry1Ab trong ngô Bt11 là không só sự khác biệt thống

kê

2.4.2.2 Biểu hiện của gen pat trong ngô Bt11

Các nghiên cứu đồng ruộng và phòng thí nghiệm để đánh giá biểu hiện tính trạng chống chịu

thuốc trừ cỏ glufosinate căn cứ vào mức độ biểu hiện của gen chỉ thị pat mã hóa protein pat

được đánh giá và xác định trong những bộ phận thực vật khác nhau của cây ngô Bt11

Phương pháp: Lượng enzyme PAT trong các loại mô ngô khác nhau được phân tích Mô

thực vật được thu trong giai đoạn trưởng thành của thực vật trồng trong điều kiện đồng ruộng (Stantun, MN) Vật liệu cây được thu ở giai đoạn ra hoa Mẫu được thu nhận từ 2 dòng lai chuyển gen (X43334CBR và X4734CBR) và mỗi dòng lai thu 3 cây Mẫu đối chứng được thu nhận từ những cây không chuyển gen với các đặc tính di truyền tương tự (NK4242) Mô sạch được làm lạnh trong nitơ lỏng, mẫu mô này được nghiền ra thành dạng bột và vận chuyển trong điều kiện lạnh tới phòng thí nghiệm Xenos để phân tích Vì số lượng mẫu có giới hạn, mẫu phấn hoa được sử dụng cho mỗi giống Mẫu hạt thu được bằng cách nghiền hạt chín

Kết quả: Bảng 4 tóm lược lại số liệu về lượng protein PAT trong lá, rễ, thân, hạt phấn, râu,

cờ, hạt của cây ngô chuyển gen Bt11 Mô tách chiết được pha loãng thành 0,4 mg/ml protein

để thu nhận được môi trường nền thấp phù hợp cho thử nghiệm Ở nồng độ này, một số mẫu cho thấy có lượng protein PAT rất thấp Khi việc pha loãng được áp dụng thì lượng protein PAT được phân tích tăng lên (có sai số) Mức độ ý nghĩa của protein PAT được tìm thấy ở lá

và cờ giữa ngô chuyển gen và ngô không chuyển gen cùng dòng Protein PAT còn được phát hiện ở râu ngô, các cơ quan khác (rễ, phấn hoa, và hạt) thì ở mức dưới ngưỡng LOD

Đối với ngô ngọt, việc định lượng protein PAT trong hạt ngô ngọt Bt11 (giai đoạn đầu thu hoạch) khẳng định rằng số lượng protein thấp hơn giới hạn phát hiện 9ng/g chất tươi

Bảng 4 Nồng độ protein PAT trong mô ngô Bt11 Dữ liệu được tóm tắt từ bảng 4 của báo cáo phân tích gởi đến từ phòng thí nghiệm của Xeros

phân tích* (ngPAT/ml dịch chiết)

Tổng lượng protein được chiết tách* (mg prot/g chất tươi)

Lượng PAT** (ngPAT/g chất tươi)

**: Xem phần thảo luận về độ tin cậy của các dữ liệu

¤: Giá trị trung bình thấp LOD nhưng một hoặc nhiều mẫu cá thể lập lại ở trên mức LOD và

vì thế được xem là có ý nghĩa

2.4.3 Tình hình cấp phép, sử dụng ngô Bt11 trên thế giới

Năm 1996, nông nghiệp thế giới đã có bước chuyển biến mới do sự cho phép thương mại hoá các cây trồng chuyển gen Sự phát triển và sử dụng các cây trồng chuyển gen trên phạm vi thế giới diễn ra rất nhanh chóng trong 16 năm qua cả về chủng loại cây và diện tích gieo trồng Từ năm 1996, cây trồng chuyển gen bắt đầu được trồng phổ biến trên thế giới, kể từ đó diện tích của loại cây trồng này tăng lên không ngừng qua từng năm: 2,8 triệu ha (1996); 12,8 triệu ha (1997); 27,8 triệu ha (1998); 40 triệu ha (1999); 44,2 triệu ha (2000); 52,6 triệu ha (2001); 58,7 triệu ha (2002); 81 triệu héc-ta (năm 2004); 90 triệu ha (năm 2005) và 160 triệu

ha (năm 2011), theo nguồn ISAAA, annual report 2012 Nhiều cây được chuyển gen để tạo ra khả năng chống chịu thuốc trừ cỏ (489 loài), tạo ra những tính trạng của gen đánh dấu (488 loài), khả năng chịu bệnh (185 loài), chống chịu côn trùng (89 loài), cải tiến chất lượng (72 loài)

Cây trồng chuyển gen đã được trồng ở nhiều quốc gia phát triển ở cả các nước phát triển và nước đang phát triển như: Hoa Kỳ (66,8 triệu ha), Brazil (25,4 triệu ha), Argentina (22,9 triệu ha), Ấn Độ (9,4 triệu ha), Canada (8,8 triệu ha), Trung Quốc (3,5 triệu ha), Paraguay (2,6 triệu ha), Pakistan (2,4 triệu ha), Nam Phi (2,2 triệu ha), Australia (0,635 triệu ha), Philippin (0,3 triệu ha) (dẫn theo N T P Thảo và N T T Linh, 2011), Philippine là nước có điều kiện khí hậu và canh tác ngô tương tự như Việt Nam đã tăng diện tích trồng ngô chuyển gen lên 0,6 triệu ha trong năm 2011 (nguồn ISAAA- annual report 2012) Theo thống kê, các quốc gia trồng cây chuyển gen chiếm 81-86 % tổng diện tích gieo trồng ngô của thế giới, 88-90 % tổng diện tích gieo trồng đậu tương, và 81-93 % tổng diện trồng bông toàn cầu

Ngô Bt11 đã được cho phép sản xuất, thương mại ở các nước Argentina, Colombia, Brazil, Canada, Hoa Kỳ, Nhật Bản, Philippines, Nam Phi và Uruguay vv Bt11 cũng đã được cho phép sử dụng làm thức ăn chăn nuôi ở Argentina, Úc, Brazil, Colombia, Cộng đồng Châu Âu, Canada, Trung Quốc, Hoa Kỳ, Nhật Bản, Hàn Quốc, Philippines, Nam Phi và Uruguay, Mexico, Thụy Sĩ, Anh, Đài Loan và Nga Ngô Bt11 được cho phép làm thực phẩm ở các nước Argentina, Úc, Brazil, Colombia, Công đồng Châu Âu, Canada, Trung Quốc, Hoa Kỳ, Nhật Bản, Hàn Quốc, Philippines, Nam Phi và Uruguay, Mexico, Thụy Sĩ và Anh Không có báo cáo về ảnh hướng đến sức khỏe hay tác hại môi trường liên quan với việc sử dụng các giống ngô Bt11

Bảng 5 là danh sách các nước đã cho phép canh tác cũng như sử dụng ngô chuyển gen Bt11 làm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi ở trên thế giới

Bảng 5 Danh sách các nước được phép canh tác ngô Bt11 và được phép sử dụng làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi trên thế giới

Nước Ngày chấp

thuận

Cơ quan phê chuẩn Số QĐ (nếu có) Ghi chú

Mỹ 18/1/1996 USDA (United State

Department of) Agriculture

States Environmental Protection Agency)

EPA Reg No 67979-1

Thức ăn chăn nuôi

Canada

Thực phẩm (cả ngô ngọt) China 6/4/2004 Ministry of

Resolución Nº

442

Canh tác (cả ngô ngọt)

27/7// 2001 Ministry of

Agriculture, Fisheries and Food

Resolución 392/2001

Thực phẩm, thức

ăn chăn nuôi và canh tác (cả ngô ngọt)

Japan 3/9/1996 Ministry of Health

and Welfare

Thực phẩm

26//9/1996 Ministry of

Agriculture, Forestry and Fisheries

Thức ăn

10/1996 Ministry of

Agriculture, Forestry and Fisheries

Canh tác

European

Union

9/6/1998 and 31/7/1998

EU-Commission Decision,

implemented by the

UK

C/GB/96/M4/1 Nhập khẩu và làm

thức ăn

Department of the Environment, Transport and the Regions 19/1/1998

EU-

Commission (notification, NFR)

Thực phẩm

Thụy Sĩ 14/10/1998 Swiss Federal Office

of Health

Thực phẩm (Cả ngô ngọt) 14/10/1998 Swiss Federal Office

for Agriculture

Thực phẩm (cả ngô ngọt)

Nam Phi 7/2/2002 National Department

of Agriculture

17/3(6/02/017) Sử dụng làm thực

phẩm, thức ăn chăn nuôi và canh tác (cả ngô ngọt) 18/6/2003 National Department

of Agriculture

Resolution no.3 Canh tác

Protection (Health and Employment)

01078 of 2009 thức ăn chăn nuôi

Mexico 18/7/2007 Mexico D.F.a 00306/2007 Thực phẩm và

thức ăn chăn nuôi Russia 15/9/2003 Feredal Servive on

Serveilance In The Area of Consumer Right Protection &

Phần III XÁC ĐỊNH VẤN ĐỀ KHẢO NGHIỆM Ở VIỆT NAM

3.1 Kết quả khảo nghiệm đánh giá rủi ro trên thế giới đối với ngô chuyển gen Bt11 3.1.1 Các kết quả nghiên cứu về kiểu hình của ngô Bt11

Thông tin về kiểu hình của ngô chuyển gen Bt11 mang gen cry1Ab và pat đã được thu thập từ

các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, nhà lưới và khảo nghiệm đồng ruộng Kết quả của những nghiên cứu này đã được trình bày chi tiết trong những những hồ sơ pháp lý với mục

đích chứng minh: i) nhận diện bất cứ thay đổi về kiểu hình mà nó có thể ảnh hưởng đến tính an toàn của môi trường canh tác; ii) Nhận diện bất cứ thay đổi không mong muốn tới hệ sinh sinh vật của cây trồng mà có thể làm ảnh hưởng đến sự an toàn của môi trường Số liệu về kiểu hình của ngô chuyển gen Bt11 và các công bố đã được thẩm định có

giá trị tương đương đã tập trung vào các đặc tính của cây trồng mà chúng có thể đóng góp vào sự sống sót hay tồn tại dai dẳng (như tiềm năng trở thành cỏ dại), hoặc những biểu hiện bất lợi của các đặc tính nông học (như mẫn cảm với bệnh hay ảnh hưởng đến năng suất) đã được nêu rõ trong các bộ hồ sơ nộp lên chính phủ của các nước đã phê chuẩn cho canh tác là: ANZFA 2000a, 2000b, 2001, 2002; CFIA 1995, 1998, 2005; FSANZ 2005; USDA APHIS

1993, 1995a, 1995c, 1996a, 1996b, 1997b, 1998a, 1998c, 2000a, 2001, 2003, 2004a, 2004c, 2004e, 2006)

Bởi vì protein Cry1Ab có chức năng kiểm soát sâu hại mục tiêu nên sự khác biệt với ngô không chuyển gen là đặc tính kháng sâu hại Các nghiên cứu đánh giá so sánh các đặc tính liên quan đến kiểu hình đã được thực hiện với các số liệu định lượng được thu thập như chiều cao cây, tỉ lệ nảy mầm của hạt trong khi các dữ liệu khác về định tính như sự khác biệt về tính mẫn cảm với bệnh hại cũng được đánh giá và ghi nhận trong các báo cáo đã được nộp lên chính phủ và đã được phê chuẩn (ANZFA 2000a, 2000b, 2000c, CFIA 1996a, 1996b, 1997a, 1997b, 1998, EC 1997, 1998 Japan BCH 2004a, 2004b, 2004c, 2004d, 2005a, 2005b,

2006, 2007a, 2007b, 2007c, 2007d, USDA APHIS 1995a, 1995c, 1996a, 1996c, 1997, USEPA 2001)

Bằng các số liệu thu thập từ các nghiên cứu được báo cáo trong các hồ sơ đã được đệ trình và phê chuẩn, những số liệu về kiểu hình cho thấy không có bất cứ sự thay đổi hay khác biệt nào liên quan đến đặc điểm về hình thái cũng như đặc điểm về kiểu hình của ngô kháng sâu đục

thân Bt11 mang gen cry1Ab so với ngô không chuyển gen cùng dòng, đặc điểm khác biệt của

chúng là khả năng kiểm soát côn trùng bộ cánh vảy lepidoptera đặc biệt là sâu đục thân ngô

Để xác định có hay không có sự khác biệt về kiểu hình khi một giống ngô có sự hiện diện của

gen pat, rất nhiều số liệu đã được thu thập, thống kê, báo cáo và đã được trình bày với mức

độ chi tiết khác nhau trong những hồ sơ liên quan đến phóng thích ra môi trường của cây trồng này, các hồ sơ đó là: ANZFA 2000, 2001a, 2001b, 2002, CFIA 1995a, 1995b, 1996a, 1996b, 1996c, 1996d, 1996e, 1996f, 1998a, 1998b, 1998c, 1999, 2002a, 2002b, 2004, 2005, 2006a, 2006b, EC 1996, 1997, 1998, 2001, EFSA 2005, 2006, 2008a, 2008b, 2009a, 2009b, FSANZ 2003, 2004a, 2004b, 2005a, 2005b, 2008, Japan BCH 1996a, 1996b, 1996c, Health Canada 2006a, 2006b, Japan BCH 1997a, 1997b, 1997c, 1997d, 1997e, 1999a, 1999b, 1999c,

1999d, 2002, 2003, 2005, 2006a, 2006b, 2006c, 2006d, 2006e, 2006f, 2007a, 2007b, 2008,

2009, 2010, OGTR 2003, 2006, Philippines 2005, USDA APHIS 1994a,b, 1995b, 1995d, 1995e, 1996a, 1996d, 1997a, 1997b, 1997d, 1997e, 1998b, 1998d, 1998f, 1998h, 1998k, 1998l, 2000, 2001a, 2002a, 2002c, 2003a, 2003b, 2004b, 2004d, 2006a, USEPA 2001, 2005, 2009a, 2009b) Các số liệu được báo cáo dựa vào các loài cây trồng khác nhau, nhưng nhìn chung là đã biểu hiện toàn bộ các đặc điểm tổng thể về hình thái như chiều cao cây, số lá, số lượng lóng, đốt…, các đặc tính sinh sản như sản xuất hạt giống, khả năng sống sót và nảy mầm, cường lực hạt giống, khả năng tồn tại qua mùa đông, tính mẫn cảm với sức ép của sâu bệnh hại và tính thường xuyên về khả năng mọc lại của cây chuyển gen sau thu hoạch

Các phân tích về kiểu hình bao gồm các đặc tính về nông học như năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất cũng đã được nghiên cứu và đánh giá Sự khác biệt được ghi nhận là rất ít đối với một số ít đặc tính về kiểu hình, sự khác biệt này được đề cập trong một thí nghiệm Tuy nhiên sự khác biệt này thì không lặp lại trong các thí nghiệm nhắc lại Các quyết định pháp lý sau khi xem xét là sự khác biệt này hoàn toàn không phải là do sự biểu hiện của protein PAT

và sự khác biệt đó thì không tái hiện có ý nghĩa liên quan đến tiềm năng gây ảnh hưởng bất

lợi của ngô Bt11 hay cây trồng mang gen pat đến môi trường

3.1.2 Các nghiên cứu về khả năng trở thành cỏ dại trong môi trường nông nghiệp của ngô Bt11

Ngô có tiềm năng mọc lại ở những mùa vụ tiếp theo khi hạt bị rơi rớt lại trên cánh đồng (OECD 2003, USDA APHIS 1995a, 1995c, 1996a, 1996c, 1997) Những đặc điểm mà chúng ảnh hưởng đến khả năng để một cây trồng mọc lại thì cũng như là đối với cỏ dại khi chúng có hiện tượng ngủ nghỉ, rơi rụng, khả năng cạnh tranh Tuy nhiên, ngô thì lại có rất ít những đặc điểm này (Baker 1974, OECD 2003, USDA APHIS 1995a, 1995c, 1996a, 1996c, 1997) Không có dữ liệu nào cho thấy được mối liên hệ giữa biểu hiện của protein Cry1Ab đối với khả năng sống dai dẳng hay khả năng tồn tại qua mùa đông, những yếu tố làm thay đổi tỉ lệ mọc lại của ngô trên đồng ruộng trong vụ mùa kế tiếp (ANZFA 2000a, 2000b, 2000c, CFIA 1996a, 1996b, 1997a, 1997b, 1998, EC 1997, 1998 Japan BCH 2004a, 2004b, 2004c, 2004d, 2005a, 2005b, 2006, 2007a, 2007b, 2007c, 2007d, USDA APHIS 1995a, 1995c, 1996a,

1996c, 1997, USEPA 2001) Giả sử như có các cây ngô biểu hiện gen cry1Ab mọc lại trong

vụ sau thì cũng không có bất kỳ khó khăn nào do tập quán cũng như kỹ thuật của người nông dân khi họ sẽ xử lý những cây này như những cây ngô truyền thống

Cũng trên cây trồng chuyển gen Bt11, các báo cáo khoa học đã kết luận rằng không có bất cứ

mối liên hệ nào giữa ngô mang gen pat với khả năng sống dai dẳng hoặc qua mùa đông để có

thể có những cây mọc lại trong mùa vụ kế tiếp Số liệu của các báo cáo được nêu chi tiết trong các hồ sơ đệ trình yêu cầu phê chuẩn cho việc canh tác từ các nước như sau: (CFIA 1995a, 1995b, 1996a, 1996b, 1996c, 1996d, 1996e, 1996f, 1998a, 1998b, 1998c, 1999, 2002a, 2002b, 2005, 2006, EC 1996, 1997, 1998, 2001, Japan BCH 1996a, 1996b, 1996c, 1997a, 1997b, 1997c, 1997d, 1997e, 1998, 1999a, 1999b, 1999c, 1999d, 2002, 2005, 2006a, 2006b, 2006c, 2006d, 2006e, 2007a, 2007b, 2008, 2009, 2010, OGTR 2002, 2003, 2006, Philippines 2005, USDA APHIS 1995a, 1995c, 1995f, 1996b, 1996b, 1996c, 1996e, 1997c,

1997f, 1998a, 1998c, 1998e, 1998g, 1998i, 1998j, 1999a, 1999b, 1999c, 2001b, 2001c, 2002b, 2003c, 2004a, 2004c, 2005, 2006b, USEPA 2001, 2005, 2009a, 2009b)

Những cây tự mọc từ hạt chuyển gen trong vụ sau sẽ bị loại bỏ vì các chương trình quản lý canh tác, đặc biệt là chế độ luân canh cây trồng liên tục Các lựa chọn thay thế cho kế hoạch quản lý như: sự tự mọc của cây trồng chuyển gen; thay đổi các loại thuốc khác nhau; hay kiểm soát cỏ dại bằng máy cũng đã được đề cập chi tiết trong các báo cáo của Beckie và cs.,

2004, Deen và cs., 2006, OECD 1997, OECD 2000, OECD 2001, OECD 2003a, OECD

2008, OGTR 2008, USDA APHIS 2004d

3.1.3 Khả năng trở thành cỏ dại của ngô Bt11 trong môi trường phi nông nghiệp

Các số liệu trong các báo cáo được đệ trình lên chính phủ của các nước đã cho phép canh tác

ngô Bt11 đều đã xem xét đến có hay không khả năng ngô chuyển gen mang gen cry1Ab và

pat có thể trở thành cỏ dại trong môi trường phi nông nghiệp do các yếu tố như sự rơi vãi hạt

giống trong quá trình vận chuyển hàng hóa hoặc là trôi gen từ cây chuyển gen đến quần thể thực vật cùng loài hoặc khác loài có liên quan (Mallory-Smith và Zapiola 2008) Cây ngô Bt11 cũng được xem xét những tác động tiềm năng liên quan đến cả hai vấn đề đó (ANZFA 2000a, 2000b, 2001, 2002; CFIA 1995, 1998, 2005; EFSA 2003, 2004a, 2004b, 2005a, 2005b, 2006a, 2006b, 2006c, 2008a, 2008b, 2009a, 2009b; FSANZ 2005; Japan BCH 2003, 2004; USDA APHIS 1994, 1995b, 1995d, 1996b, 1997a, 1998b, 1999, 2000b, 2002, 2004b, 2004d, 2005a, 2005b, 2007a)

Trong khi tất cả các cây trồng có thể được coi là cỏ dại trong các hoàn cảnh nhất định, ngô không được coi là một loài cỏ dại xâm lấn hoặc tích cực bên ngoài hệ thống nông nghiệp Ngô bị hạn chế trong khả năng tự phát triển mà không có sự can thiệp của con người (OECD

2003, USDA APHIS 1995a, 1995c, 1996a, 1996c, 1997) Số liệu nông học trong các nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng protein Cry1Ab không có tác động có ý nghĩa đến đặc tính trở thành cỏ dại (ANZFA 2000a, 2000b, 2000c, CFIA 1996a, 1996b, 1997a, 1997b, 1998, EC

1997, 1998 Japan BCH 2004a, 2004b, 2004c, 2004d, 2005a, 2005b, 2006, 2007a, 2007b, 2007c, 2007d, USDA APHIS 1994, 1995b, 1995d, 1996b, 1996d, USEPA 2001)

Mặc dù phóng thích từ các yếu tố kiểm soát tự nhiên (bao gồm cả động vật ăn cỏ) đã được cung cấp như là một lời giải thích một phần đối với sự thành công của các loài xâm lấn (Blumenthal 2005, Keane và Crawley 2002, Mason và CS., 2003, Mack 1996) Tất cả các quyết định của nhà quản lý từ các nước thu nhận báo cáo đã kết luận rằng ngô mang thêm gen kháng sâu hại bộ cánh vảy với biểu hiện protein Cry1Ab không có khả năng xâm lấn trong môi trường phi nông nghiệp vì chúng cũng hoàn toàn giống như cây ngô truyền thống (ANZFA 2000a, 2000b, 2000c, CFIA 1996a, 1996b, 1997a, 1997b, 1998, EC 1997, 1998 Japan BCH 2004a, 2004b, 2004c, 2004d, 2005a, 2005b, 2006, 2007a, 2007b, 2007c, 2007d, USDA APHIS 1994, 1995b, 1995d, 1996b, 1996d, USEPA 2001)

Nghiên cứu về tác động có thể này đối với biểu hiện của protein PAT trên cây trồng mang

gen này cho thấy các kết quả tương tự như đối với gen cry1Ab khi xem xét đến tính liên quan

giữa khả năng trở thành cỏ dại với các yếu tố có thể gây ra là trôi gen và rơi rụng hạt trong

quá trình vận chuyển Các báo cáo đánh giá rủi ro của các nước đã phê chuẩn cho canh tác đã

đề cập đến tính liên quan của hai yếu tố này đến khả năng xâm lấn của ngô chuyển gen mang protein PAT, các kết luận được nêu trong các hồ sơ, báo cáo đã được đệ trình và phê duyệt (CFIA 1995a, 1995b, 1996a, 1996b, 1996c, 1996d, 1996e, 1996f, 1998a, 1998b, 1998c, 1999, 2002a, 2002b, 2005, 2006, EC 1996, 1997, 1998, 2001, Japan BCH 1996a, 1996b, 1996c, 1997a, 1997b, 1997c, 1997d, 1997e, 1998, 1999a, 1999b, 1999c, 1999d, 2002, 2005, 2006a, 2006b, 2006c, 2006d, 2006e, 2007a, 2007b, 2008, 2009, 2010, OGTR 2002, 2003, 2006, Philippines 2005, USDA APHIS 1995a, 1995c, 1995f, 1996b, 1996b, 1996c, 1996e, 1997c, 1997f, 1998a, 1998c, 1998e, 1998g, 1998i, 1998j, 1999a, 1999b, 1999c, 2001b, 2001c, 2002b, 2003c, 2004a, 2004c, 2005, 2006b, USEPA 2001, 2005, 2009a, 2009b)

Dựa trên các số liệu trong các báo cáo đã đệ trình về các đặc điểm nông học, các kết luận của những nhà quản lý là cây trồng chuyển gen mang protein PAT thì không có bất cứ tác động nào đến đặc tính nông học hay đặc tính cấu thành năng suất (bao gồm cả những đặc tính liến quan đến khả năng trở thành cỏ dại) Bằng chứng cho đến nay cho thấy biểu hiện của protein PAT không dẫn đến bất kỳ tiềm năng thay đổi trở thành cỏ dại từ cây ngô chuyển gen Bt11, các kết luận này được nêu rõ trong các báo cáo đánh giá rủi ro của các nước đã cho phép Biểu hiện của protein PAT trong ngô chuyển gen chỉ ảnh hưởng đến khả năng mà cây ngô này vẫn còn sống sót nếu phun thuốc trừ cỏ có chứa hoạt chất glufosinate Cũng như trong các môi trường nông nghiệp, các lựa chọn quản lý khác sẽ được tiến hành để kiểm soát ngô chuyển gen Bt11 với các kế hoạch có sẵn được chỉ ra trong các báo cáo của Beckie và CS.,

2004, Deen và cs., 2006, OECD 1997, OECD 2000, OECD 2001, OECD 2003a, OECD

2008, OGTR 2008, USDA APHIS 2004d

3.1.4 Những nghiên cứu đánh giá tác động của ngô Bt11 đến sinh vật không chủ đích

Nói đến các nghiên cứu, đánh giá để kết luận các cây trồng chuyển gen nói chung và ngô Bt11 nói riêng, kháng sâu hại bộ cánh vảy đặc biệt là sâu đục thân là nói đến sự đánh giá biểu hiện của các gen được biến nạp trong cây trồng đó với mức độ phơi nhiễm cũng như có hay không sự ảnh hưởng bất lợi đến sinh vật không chủ đích khi ngô Bt11 có đặc tính kháng sâu hại bộ cánh vảy đặc biệt là sâu đục thân hại ngô là sinh vật chủ đích Để đánh giá sự biểu hiện

và tác động của ngô chuyển gen Bt11 đến sinh vật không chủ đích thì người tá đánh giá đến biểu hiện của protein Cry1Ab và protein PAT đến các sinh vật không chủ đích trong môi trường canh tác Các nghiên cứu ở các nước khác được thực hiện bởi các nhà khoa học cũng như từ phía công ty được liệt kê dưới đây

a) Những nghiên cứu đánh giá tác động sự phơi nhiễm sự biểu hiện protein Cry1Ab đến các sinh vật không chủ đích

Protein Cry1Ab thuộc nhóm protein Cry1 mà ban đầu chúng được phân nhóm dựa trên những tiềm năng kháng lại sâu hại bộ cánh vảy của chúng (Hofte và Whiteley 1989; Crickmore và

cs., 1998, 2005; OECD 2007) Mục tiêu của chuyển nạp gen cry1Ab vào cây trồng là để cung

cấp khả năng bảo vệ cây trồng từ khả năng gây hại của sâu bộ cánh vảy trong đó có sâu đục thân Các sinh vật khác mà không phải là loài gây hại trong hệ thống nông nghiệp cũng có thể

tiếp xúc với các protein Cry1Ab, và được coi là "sinh vật không phải mục tiêu hay sinh