Khảo sát quá trình lên men rượu vang chanh dây

Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu quá trình lên men rượu vang chanh dây bằng tế bào men Saccharomyces cerevisiae tự do và cố định trên chất mang BC, kết quả thu được như sau: - Xác

B

LU KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH LÊN MEN

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

O SÁT QUÁ TRÌNH LÊN MEN

ỢU VANG CHANH DÂY

GVHD: PGS TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG SVTH : NGUYỄN XUÂN HỒNG THOA

PHAN THỊ HỒNG THẮM p: HC06BSH

Lời đầu tiên chúng em tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp chúng em hoàn thành tốt luận văn này

Chúng em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thúy Hương – người đã tận tình theo sát, chỉ bảo, giúp đỡ, tạo cho chúng em sự say mê trong học tập và nghiên cứu Ở

cô, chúng em thấy được một người thầy hết lòng vì công việc và sự bao dung, quan tâm đến sinh viên Cô ơi, chúng em cảm ơn cô! Sau này khi ra trường, chúng em sẽ nhớ cô lắm

Chúng em cũng xin cảm ơn các anh chị lớp cao học CH2008, CH2009 đã nhiệt tình giúp đỡ

Xin cảm ơn tất cả các thành viên của lớp HC06BSH, những người bạn đã đồng hành cùng chúng mình trong suốt những năm tháng đại học, đã quan tâm, chia sẽ, động viên, đặc biệt là luôn tạo một không khí vui vẻ để thời gian làm luận văn thật đáng nhớ, một thời sinh viên không thể nào quên

Chúng con xin cảm ơn gia đình đã luôn theo sát, ủng hộ, khích lệ và động viên trong suốt quãng đường mà chúng con đã đi

Cảm ơn các thành viên của nhóm Xù, Quỷ, Bờ ná na, Gec – ko, Tại, Thùy, những người bạn thân thiết nhất đã cùng nhau trải qua mọi niềm vui, nỗi buồn để đạt được kết quả như ngày hôm nay và cũng làm cho quãng đời sinh viên thật đáng nhớ Chúng ta sẽ mãi như bây giờ nhé! Yêu mọi người rất nhiều!

Cuối cùng, xin gửi những lời thân thương nhất đến tất cả những người đã sát cánh cùng chúng tôi trong thời gian qua

TP Hồ Chí Minh, ĐHBK, tháng 01 năm 2011

Phan Thị Hồng Thắm

Nguyễn Xuân Hồng Thoa

Chanh dây là một loại trái cây phổ biến, giàu chất dinh dưỡng và có mùi thơm rất đặc trưng, thích hợp để là nguyên liệu lên men rượu Cellulose vi khuẩn – BC được biết đến là chất mang hiệu quả, được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu quá trình lên men rượu vang chanh dây bằng tế bào

men Saccharomyces cerevisiae tự do và cố định trên chất mang BC, kết quả thu được

như sau:

- Xác định được tỉ lệ giống nấm men Saccharomyces cerevisiae thích hợp bổ

sung cho quá trình lên men rượu là 7%, pH = 4 là pH thích hợp lên men và nồng độ chất khô thích hợp là Brix 20, thời gian lên men rượu thích hợp đối với rượu chanh dây là 7 ngày Độ cồn sau 7 ngày lên men đạt khoảng 10.59o

- Cố định được tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae trên chất mang BC

bằng hai phương pháp: bẫy – hấp phụ và nhốt chủ động Sử dụng chế phẩm nấm men cố định trên BC có kích thước 2cm x 1cm, chế độ lắc 200 vòng/phút của phương pháp bẫy – hấp phụ sau 3 ngày ủ với mật độ là 14.48 x 108CFU/cm3 để tiến hành lên men Kết quả thu được cho thấy khi sử dụng chế

phẩm nấm men Saccharomyces cerevisiae cố định trên chất mang BC để lên

men rượu đối với rượu vang chanh dây thì hiệu quả lên men vẫn đảm bảo sau 7 lần tái sử dụng

- Sau khi tối ưu các điều kiện, tiến hành lên men rượu và tàng trữ Chúng tôi tiến hành đánh giá cảm quan và nhận thấy: chất lượng cảm quan của rượu lên men

sử dụng tế bào tự do và rượu lên men sử dụng chế phẩm cố định có mùi vị tương đối giống nhau mặc dù độ trong và màu sắc có khác nhau Rượu sau quá trình lên men rượu có hương vị đặc trưng của rượu chanh dây, chưa hài hòa giữa vị chua và vị rượu do chứa một lượng acid malic có vị chua gắt làm giảm hương vị của rượu

MỤC LỤC

Danh mục bảng vi

Danh mục hình vii

Danh mục đồ thị ix

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về chanh dây 3

2.1.1 Nguồn gốc 3

2.1.2 Đặc điểm sinh học 3

2.1.3 Thành phần hóa học 4

2.1.4 Ứng dụng 5

2.2 Quá trình lên men rượu 6

2.2.1 Giới thiệu về rượu vang 6

2.2.2 Cơ sở hóa sinh 6

2.2.3 Tác nhân vi sinh vật 9

2.2.4 Sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu 11

2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu 12

2.3 Kỹ thuật cố định 18

2.3.1 Lịch sử phát triển 18

2.3.2 Định nghĩa 19

2.3.3 Chất mang 19

2.3.4 Phương pháp cố định 23

2.3.5 Ưu nhược điểm của cố định tế bào 29

2.3.6 Yêu cầu đối với vi sinh vật cố định 30

2.3.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến cố định vi sinh vật 31

2.3.8 Chất mang cellulose vi khuẩn – BC 32

2.4 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về hướng của đề tài 44

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 49

3.1 Vật liệu 49

3.1.1 Chanh dây 49

3.1.2 Giống vi sinh vật 49

3.1.3 Môi trường nuôi cấy 49

3.1.4 Vật liệu, hóa chất 50

3.1.5 Thiết bị và dụng cụ 51

3.2 Phương pháp thí nghiệm 51

3.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 51

3.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 52

3.2.3 Phương pháp phân tích thí nghiệm 57

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 61

4.1 Khảo sát giống 61

4.1.1 Khảo sát giống S.cerevisiae 28 61

4.1.2 Khảo sát giống A.xylinum 64

4.2 Tạo chế phẩm BC 65

4.2.1 Lên men thu nhận BC 65

4.2.2 Xử lý chế phẩm BC thô 65

4.2.3 Khảo sát phương pháp cố định 66

4.3 Lên men rượu sử dụng tế bào tự do 73

4.3.1 Tối ưu điều kiện lên men rượu 73

4.3.2 Kiểm tra các biến động trong quá trình lên men rượu ở điều kiện tối ưu 76

4.4 Lên men rượu sử dụng chế phẩm cố định BC 82

4.4.1 Khảo sát hiệu quả lên men qua các lần tái sử dụng 82

4.4.2 Kiểm tra tỷ lệ rửa trôi 85

4.5 So sánh lên men rượu tự do với lên men rượu cố định 86

4.6 Kết quả cảm quan 87

4.7 Kết quả kiểm tra vi sinh 87

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 88

5.1 Kết luận 88

5.2 Kiến nghị 88

Tài liệu tham khảo 90

PHỤ LỤC 94

Danh mục bảng

Bảng 2 1 Thành phần dinh dưỡng trong 100g "thịt quả" 5

Bảng 2 2 Tỷ lệ đường trong chanh dây 5

Bảng 2 3 Hàm lượng acid có trong chanh dây 5

Bảng 2 4 Khả năng chịu được hàm lượng cồn trong môi trường của một số nấm men 16

Bảng 2 5 Ưu nhược điểm của từng loại chất mang 23

Bảng 2 6 Bảng so sánh ưu nhược điểm của các phương pháp cố định tế bào thông dụng 29

Bảng 2 7 Cấu trúc BC của một số loài vi sinh vật 33

Bảng 2 8 So sánh một số tính chất của việc lên men sử dụng nấm men cố định trên gel alginate và nấm men cố định trên BC 44

Bảng 2 9 Thành phần hóa học của rượu lên men từ các chủng nấm men khác nhau 47

Bảng 3 1 Thành phần môi trường Hansen 49

Bảng 3 2 Thành phần môi trường giữ giống (MT3) 50

Bảng 3 3 Môi trường nhân giống (MT4) 50

Bảng 4 1 Kết quả lập đường chuẩn của nấm men S.cerevisiae 62

Bảng 4 2 Kết quả cố định bằng phương pháp nhốt 67

Bảng 4 3 Mật độ tế bào nấm men cố định trên BC 68

Bảng 4 4 Ảnh hưởng của thời gian ủ đến mật độ tế bào cố định trên BC 70

Bảng 4 5 So sánh 2 phương pháp cố định 72

Bảng 4 6 Kết quả đo độ cồn 77

Bảng 4 7 Kết quả đo Brix 78

Bảng 4 8 Kết quả đo pH 79

Bảng 4 9 Kết quả đo độ chua 80

Bảng 4 10 Một số thông số quá trình lên men rượu qua các lần tái sử dụng chế phẩm cố định 82

Bảng 4 11 Kết quả tỷ lệ rửa trôi 86

Bảng 4 12 So sánh các biến động trong quá trình lên men ở điều kiện tối ưu của lên men rượu sử dụng chế phẩm tự do và chế phẩm cố định trên BC 86

Bảng 4 13 Kết quả kiểm tra vi sinh 87

Danh mục hình

Hình 2 1 Chanh dây 4

Hình 2 2 Cơ sở hóa sinh quá trình lên men ethanol 7

Hình 2 3 Nấm men S cerevisiae 10

Hình 2 4 Phân loại chất mang 20

Hình 2 5 Phương pháp cố định vi sinh vật 23

Hình 2 6 Cố định tế bào trên bề mặt chất mang 24

Hình 2 7 Cố định tế bào trong lòng chất mang 25

Hình 2 8 Liên kết giữa các tế bào 26

Hình 2 9 Cố định tế bào bằng màng membrane 26

Hình 2 10 Acetobacter xylinum 33

Hình 2 11 Cấu trúc A – BC tạo ra từ môi trường lắc (a), S – BC tạo ra từ môi trường tĩnh (b) 36

Hình 2 12 Cấu trúc BC (a) và PC (b) (x 200) 37

Hình 2 13 Vị trí – quá trình biến dưỡng carbon và tổng hợp cellulose ở A xylinum 40 Hình 2 14 Con đường dự đoán của quá trình sinh tổng hợp và tiết ra cellulose khi glucose được tế bào A xylinum hấp thụ từ bên ngoài 40

Hình 2 15 Sự tổng hợp vi sợi bởi Acetobacter xylinum 41

Hình 2 16 Con đường chuyển hóa carbon của Acetobacter xylinum 42

Hình 2 17 Hàm lượng acid hữu cơ từ dịch chanh dây sử dụng 46

Hình 2 18 Nồng độ các chất trung gian tạo ra trong rượu lên men từ 3 chủng nấm men 47

Hình 2 19 Nồng độ acetate và ester ethyl trong rượu lên men từ 3 chủng nấm men 48

Hình 3 1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 51

Hình 3 2 Sơ đồ thu nhận BC 53

Hình 3 3 Sơ đồ xử lý BC thô 53

Hình 3 4 Sơ đồ xác định số tế bào sống bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 58

Hình 3 5 Sơ đồ phương pháp xác định số lượng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu 59

Hình 4 1 Hình ảnh đại thể S cerevisiae trên môi trường đặc 61

Hình 4 2 Hình ảnh vi thể của S.cerevisiae qua kính hiển vi 62

Hình 4 3 Hình ảnh đại thể của A xylinum trên môi trường đặc 64

Hình 4 4 Khả năng lên men tạo BC của A xylinum trong môi trường lỏng ở chế độ tĩnh 64

Hình 4 5 Hình ảnh qua kính hiển vi (x100) của A.xylinum 65

Hình 4 6 BC tươi sau khi lên men 65

Hình 4 7 BC sau khi xử lý và cắt thành các kích thước khác nhau 66

Hình 4 8 BC trước (a) và sau khi xử lý (b) 66

Hình 4 9 BC sau khi cố định bằng phương pháp nhốt 67

Danh mục đồ thị

Đồ thị 4 1 Đường chuẩn nấm men S.cerevisiae 63

Đồ thị 4 2 Đường cong sinh trưởng của nấm men S.cerevisiae 63

Đồ thị 4 3 Mật độ tế bào nấm men cố định trên BC với các kích thước và chế độ khuấy đảo khác nhau 69

Đồ thị 4 4 Mật độ tế bào cố định trên BC theo ngày ủ 71

Đồ thị 4 5 Khảo sát pH cho quá trình lên men 73

Đồ thị 4 6 Khảo sát thời gian lên men tối ưu cho quá trình lên men 74

Đồ thị 4 7 Khảo sát tỷ lệ giống thích hợp cho quá trình lên men 75

Đồ thị 4 8 Khảo sát nồng độ chất khô thích hợp cho quá trình lên men 76

Đồ thị 4 9 Độ cồn theo ngày lên men 77

Đồ thị 4 10 Brix theo ngày lên men 78

Đồ thị 4 11 pH theo ngày lên men 79

Đồ thị 4 12 Độ chua theo ngày lên men 80

Đồ thị 4 13 Các biến động trong quá trình lên men ở các điều kiện tối ưu 81

Đồ thị 4 14 So sánh Brix giữa lên men đối chứng (ĐC) và qua các lần tái sử dụng chế phẩm 83

Đồ thị 4 15 So sánh pH giữa lên men mẫu đối chứng (ĐC) và qua các lần tái sử dụng chế phẩm 83

Đồ thị 4 16 So sánh V NaOH giữa lên men mẫu đối chứng (ĐC) và qua các lần tái sử dụng chế phẩm 84

Đồ thị 4 17 So sánh độ cồn giữa mẫu lên men đối chứng (ĐC) và qua các lần tái sử dụng chế phẩm cố định 84

Trên thế giới việc sản xuất rượu vang đã có rất lâu đời, nhưng mãi đến đầu thế

kỷ XIX ngành sản xuất rượu vang mới được phát triển mạnh và chuyển sang sản xuất với qui mô công nghiệp Ngày nay, ngành sản xuất rượu vang đã phát triển mạnh mẽ tại các nước trên thế giới như: nổi tiếng nhất là Pháp, kế đó là Ý, Tây Ban Nha, Algeria, Rumania, Argentina, Nga, Hungary, Hoa Kỳ …

Loại trái cây đầu tiên được dùng để sản xuất rượu vang là nho, nên từ lâu người

ta thường gọi rượu vang là rượu nho Ngày nay với công nghệ sản xuất rượu vang phát triển, để đáp ứng đủ nhu cầu tiêu thụ và tăng tính đa dạng của rượu vang, ở các nước trên thế giới còn sử dụng nhiều loại trái cây như: táo, đào, dâu, cam, mận, chuối… để

sản xuất rượu vang Chanh dây được biết đến là một loại trái cây có mùi thơm đặc

biệt, chứa nhiều chất dinh dưỡng và cũng là một đối tượng đáng chú ý để sử dụng làm nguyên liệu lên men rượu Sản phẩm rượu vang lên men từ chanh dây góp phần đa dạng hóa các sản phẩm thức uống hiện nay

Việc lên men rượu vang (lên men chính) được thực hiện bằng cách bổ sung thêm giống nấm men vào nước trái cây Giống vi sinh vật tốt nhất dùng cho quá trình

này là Saccharomyces cerevisiae, được sử dụng rộng rãi để chuyển hóa ethanol từ đường glucose và fructose trong nước ép nho (Klingshirn, 2002)

Công nghệ lên men truyền thống sử dụng tế bào tự do đã có từ rất lâu đời, con người đã đạt được những thành tựu trong nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong đời sống và sản xuất Ngày nay, các nhà khoa học vẫn tiếp tục nghiên cứu những hướng đi mới nhằm nâng cao hơn hiệu quả và kinh tế cho các quá trình lên men Một trong những hướng nghiên cứu và được ứng dụng mạnh mẽ nhất là kỹ thuật cố định tế bào

vi sinh vật Vật liệu và phương pháp cố định là hai yếu tố mang tính chất quyết định đến hiệu quả của việc cố định vi sinh vật Trong đó, đặc biệt tính chất của vật liệu cố định (hay còn gọi là chất mang) là cơ sở cho sự lựa chọn phương pháp cố định Cố định vi sinh vật đã được chứng minh là mang lại nhiều ưu điểm hơn so với việc sử

dụng tế bào tự do (Y Kourkoutas và cộng sự, 2009)

Chính vì những lý do trên, chúng tôi chọn đề tài luận văn tốt nghiệp với nội

dung là “Khảo sát quá trình lên men rượu vang từ quả chanh dây sử dụng nấm men tự

do và chế phẩm nấm men cố định trên chất mang Cellulose vi khuẩn”

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về chanh dây

2.1.1 Nguồn gốc

Có khoảng 400 loại chanh dây được trồng ở các nước nhiệt đới, nhưng chỉ có

30 loại ăn được Chanh dây là loại trái cây có hình quả trứng, mọc chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt

Loài cây này có nguồn gốc ở Brazil, được nhập vào Việt Nam khoảng đầu thế

kỷ XX, được trồng ở Lâm Đồng, Kontum, Gia Lai, Đắk Lắk … để lấy quả làm nước giải khát, làm cảnh và che bóng mát Đến nay, một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long như: Hậu Giang, Cần Thơ, An Giang, Kiên Giang… cũng bắt đầu phát triển trồng chanh dây để lấy quả cung ứng cho nhu cầu thị trường [41]

2.1.2 Đặc điểm sinh học

Cây chanh dây hay còn gọi là dây mát, mát mát, dây lạc tiên trứng, dây chùm

bao trứng, tên khoa học Passiflora edulis Sims, thuộc họ Lạc tiên (Passifloraceae), bộ

Violales Trong đó có khoảng 60 loài cho trái ăn được Chanh dây là một loại dây leo,

thân nhỏ, hình trụ có rãnh dọc, nhiều lông thưa Cây mọc leo có khi dài tới hàng chục mét

Hoa mọc ở kẽ lá, màu trắng hồng, đài 5 cánh màu xanh lục, cánh hoa dài 2 – 2.5 cm; tràng 5 cánh rời nhau, xếp xen kẽ với các lá đài; tràng phụ do 4 – 5 hàng sợi trắng, gốc tím; cuống nhụy dài 1.5 cm Quả mọng, hình cầu hoặc hình trứng, da trơn hoặc nhăn nhăn nhẹ, rộng 4 – 6 cm, vỏ màu tím đỏ hoặc màu vàng Bên ngoài trái cây chứa nhiều nước vị chua chua ngọt ngọt, thơm nhẹ nhàng, với vô số hạt nhỏ

Người ta thường chỉ trồng chanh dây cho trái màu nâu tím, hoặc loại trái màu vàng, chịu được nóng Có thể trồng cây bằng cách gieo hạt, giâm cành hoặc chiết ghép Cây chanh dây rất dễ trồng, ưa đất khô ráo, cần ít nước, thậm chí sống được cả nơi sỏi đá hoặc đất cát Cây đạt độ trưởng thành ở 12 tháng tuổi, có thể vươn dài tới 15m, cho thu hoạch tốt trong vòng 5 – 6 năm, mỗi năm từ tháng 10 đến tháng 4, nhưng thường sau 4 năm người ta lại thay cây mới [41]

Hình 2 1 Chanh dây [37]

2.1.3 Thành phần hóa học

Chanh dây có hàm lượng đường vừa phải (8.5g glucide/100g), thấp hơn một số loại trái cây thông thường khác (trung bình là 9 – 12 g/100g), nhưng phần lớn lượng đường này là fructose có độ ngọt cao (so với đường saccharose), vì vậy chanh dây vẫn

có vị ngọt Ngoài ra nó còn chứa các loại acid hữu cơ, chủ yếu là acid citric (3.9g/100g, ít chua hơn trái chanh) Trong chanh dây còn có một tỉ lệ chất nhất định protein, lipid, các chất khoáng và chất vi lượng như sắt, photpho, kẽm, magnesium,… nhiều loại vitamin đặc biệt là vitamin C và nhất là chất xơ (fibre); Về năng lượng cung cấp, chanh dây tương đương với xoài, sơri, về magnesium, tương đương với chuối… Thêm nước chanh vào nước giải khát, làm kem thì hương vị thật thơm mát

Các acid amin gồm có: prolin, valin, tyrosin, treonin, glycin, leucin, arginin Hạt có chứa nhiều dầu béo ăn được

Bảng 2 1 Thành phần dinh dưỡng trong 100g "thịt quả"

Bảng 2 2 Tỷ lệ đường trong chanh dây

Loại chanh dây

Dịch chanh dây có nhiều chất alkaloid giúp hạ huyết áp, an thần, giảm đau, và chống lại các cơn co thắt (trong cơn động kinh), vitamin C, có tác dụng chống oxi hóa

và chống viêm nhiễm, do đó làm giảm các triệu chứng viêm nhiễm

Chanh dây cũng là một loại quả giàu chất xơ, giúp ngăn ngừa các bệnh về tim mạch Ngoài ra, chanh dây còn có tác dụng an thần, gây ngủ nhẹ, giảm sự lo âu hồi hộp, hạ huyết áp, giảm cơn đau bụng cơ năng và đau bụng kinh [41]

2.2 Quá trình lên men rượu

2.2.1 Giới thiệu về rượu vang

Rượu vang là loại đồ uống có cồn, tạo ra từ quá trình lên men dịch nho tươi, khi quá trình lên men kết thúc, người ta không chưng cất mà để lắng trong tự nhiên, gạn lọc và hoàn thành sản phẩm tạo nên một thức uống có giá trị dinh dưỡng cao, hương vị thơm ngon và có lợi cho sức khỏe con người khi sử dụng điều độ

Ngoài thành phần chủ yếu là nước (chiếm từ 65% đến 85%), rượu nho còn chứa nhiều hợp chất khác : các hợp chất vô cơ, hợp chất hữu cơ gồm rượu (chủ yếu là rượu etylic, rượu glycerol), acid hữu cơ, polyphenol (gồm anthocyane (chất màu thực vật: xanh da trời, tím hoa cà), và chất chát), enzyme, vitamin Hàm lượng đường của rượu biến đổi từ 4.5% đến 16%

Rượu vang đỏ thường được lên men từ nước ép và vỏ quả nho, còn rượu vang trắng được lên men chỉ từ nước nho Rượu vang được lên men không qua chưng cất, nồng độ rượu dao động từ 10 – 15o

Trên thế giới, nhất là ở các nước Châu Âu, rượu vang đã có từ lâu đời và được dùng rất phổ biến Nhưng ở nước ta, sản phẩm rượu vang vẫn chưa được quan tâm nhiều, qui mô sản xuất chủ yếu dưới dạng thủ công

2.2.2 Cơ sở hóa sinh

Quá trình lên men rượu là một quá trình phức tạp Đầu tiên đường thẩm thấu vào trong tế bào nấm men, ở đó đường chuyển hóa qua hàng loạt sản phẩm trung gian, thẩm thấu và cuối cùng tạo thành sản phẩm acid pyruvic Acid pyruvic dưới tác dụng của enzyme pyruvat decarboxylase tạo thành acetaldehyde (enzyme này có coenzym là thiamin pyrophosphate, và cần có Mg2+ làm chất hoạt hóa) Sau đó, acetaldehyde bị khử thành cồn etylic do enzyme alcol dehydrogenase xúc tác (enzyme này có phân tử lượng là 151000 có chứa bốn tâm hoạt động độc lập nhau và bốn nguyên tử Zn, coenzym của enzyme này là NAD), phương trình tổng quát như sau:

Hình 2 2 Cơ sở hóa sinh quá trình lên men ethanol [5]

Tùy theo điều kiện môi trường, sự lên men rượu có thể xảy ra theo mấy cách sau:

2.2.2.1 Sự lên men rượu bình thường

Kiểu lên men này xảy ra khi pH môi trường từ 4 – 5 Cơ chế chung xảy ra ở phản ứng

Fructose-6-phosphat

Phosphofructokinaza

Fructose-1,6-diphosphat

Triophosphat izomeraza Glyceraldehyd-3-phosphat

Pyruvate-decarboxylaza

Aldodeshydrogena

 Thời kỳ tĩnh:

Khi acetaldehyde đã đạt được một lượng nào đó, chất tiếp nhận hydro lúc này là acetaldehyde và acetaldehyde bị khử thành rượu etylic Vậy trong sự lên men rượu bình thường, glycerin chỉ là sản phẩm phụ mà thôi Phương trình phản ứng tổng quát của sự lên men rượu bình thường như sau:

C6H12O6 + 2H3PO4 + 2ADP 2CH3CH2OH + CO2 + 2ATP + 2H2O

2.2.2.2 Sự lên men rượu trong môi trường kiềm

Nếu kiềm hóa môi trường bằng các chất như Na2CO3, K2CO3 hoặc các carbonat amon thì acetaldehyde khi đó không còn bị khử bình thường như trước nữa,

mà chất nhận hydro từ NADH2 là dehydroxy aceton phosphate Do đó, không còn NADH2 (ở dạng khử) nữa để có thể khử acetaldehyde thành ethanol Thay vào đó một phản ứng khác xảy ra do enzyme aldehyddehydrogenase có coenzyme là NAD+ xúc tác và kết quả là sản phẩm tạo thành là glycerin theo phản ứng:

Vậy sản phẩm thu được trong môi trường kiềm là glycerin, acid acetic, cồn etylic, với glycerin là thành phần chính Phản ứng tổng cộng của sự lên men rượu trong môi trường kiềm như sau:

2C6H12O6 + H2O 2CO2 + CH3COOH + C2H5OH + C3H8O3

2.2.2.2 Sự lên men rượu trong môi trường có Bisulfit

Khi đưa bisulfate natri (hoặc hydrazine thế) sẽ kết hợp với acetaldehyde tạo thành hợp chất khó tan Nói cách khác khi đó enzyme alcoldehydrogenase thiếu mất chất tiếp nhận hydro bình thường là acetaldehyde và chất tiếp nhận hydro bây giờ là dihytroxyaceton phosphate

Phản ứng trên do enzyme glycerol-3-phosphate dehydrogenase xúc tác Sau

đó, dưới tác dụng của enzyme phosphate, glycerol-3-phosphate chuyển thành glycerin

Phương trình phản ứng tổng quát của sự lên men rượu trong môi trường có bisulfit như sau:

2C6H12O6 CH3CHO + C3H8O3 + CO2Trong thực tế thường thu được 40% glycerin so với lượng đường cho vào

Hình dạng nấm men: Nấm men thường có hình dạng khác nhau Chúng thường

có hình cầu, hình elip, hình bầu dục và cả hình dài Một số loài nấm men có tế bào

hình dài nối với nhau thành những sợi gọi là khuẩn ty (mycelium) hay khuẩn ty giả (pserdomycelium) Hình dạng của nấm men hầu như không ổn định, phụ thuộc vào

tuổi của nấm men và phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy [13]

Kích thước tế bào nấm men: Tế bào nấm men thường có kích thước lớn gấp từ

5 – 10 lần tế bào vi khuẩn Kích thước trung bình của tế bào nấm men như sau: chiều dài 9 – 10 µm, chiều rộng 2 – 7 µm Kích thước của tế bào nấm men thay đổi theo điều kiện nuôi cấy, theo tuổi sinh lý

Hình 2 3 Nấm men S cerevisiae [40]

2.2.3.2 Cấu tạo nấm men

Tế bào nấm men, cũng như nhiều loại tế bào khác, được cấu tạo chủ yếu từ các phần cơ bản như sau:

Thành tế bào nấm men được cấu tạo từ nhiều thành phần khác nhau Trong đó đáng kể nhất là: glucan, manan, protein, lipit và một số thành phần nhỏ khác như kitin

Màng nguyên sinh chất có cấu tạo tương tự như màng nguyên sinh chất của vi khuẩn, gồm có các hợp chất phức tạp như protein, phospholipit, enzym permease

Chất nguyên sinh thường có màu xám Khi tế bào còn non hầu như không nhận thấy, càng về già ta càng thấy có sự thay đổi rõ rệt Trong thành phần của chúng, cũng giống như của các vi sinh vật khác, chủ yếu được cấu tạo từ nước, protit, gluxit, lipit, các muối khoáng, enzym, và các cơ quan con

Nhân tế bào thường có hình bầu dục hay hình cầu Nhân được bao bọc một lớp màng, bên trong là lớp dịch nhân, trong đó một thể rắn gọi là hạch nhân hay nhân con Nhân nấm men có chứa protein, và axit nucleic

Tế bào nấm men có nhiều không bào Không bào chứa đầy dịch tế bào, bên ngoài được bao bọc bởi một lớp màng hypoproteit gọi là màng không bào Không bào

là nơi chứa đựng các protease

Volutin thường thấy trong không bào Là chất dự trữ các chất dinh dưỡng của

tế bào Tham gia vào việc điều hòa quá trình sinh trưởng, phát triển của tế bào Ngoài volutin ra còn thấy hạt mỡ, glycogen, trehalose, lipit

Ty thể của nấm men cũng giống như ty thể của nhiều sinh vật khác, cung cấp năng lượng cho tế bào hoạt động

Ribosome của nấm men cũng giống như ribosome của các sinh vật khác Chúng tham gia quá trình tổng hợp các hợp chất trong cơ thể Tồn tại hai loại: loại 80S tồn tại

tự do, loại 70S liên kết với cấu trúc màng [13]

2.2.3.3 Sự sinh sản của nấm men

Sinh sản bằng cách nảy chồi, bằng cách phân đôi, bằng bào tử và sự hình thành bào tử (tiếp hợp đẳng giao, tiếp hợp dị giao, sinh sản đơn tính) [13]

2.2.4 Sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu

Trong quá trình lên men, ngoài sản phẩm chính là rượu và CO2 thì còn tạo ra nhiều sản phẩm phụ khác Bằng cách phân tích sắc kí khí, các nhà phân tích đã phát hiện trên 50 chất khác nhau, nhưng có thể xếp thành 4 nhóm chính: acid, este, aldehyde, rượu cao phân tử

2.2.4.1 Sự tạo thành acid

Trong quá trình lên men rượu luôn tạo ra các acid hữu cơ bao gồm: acid acetic, acid lactic, acid citric, acid pyruvic, acid succinic và có hai loại acid thường có mặt chính trong rượu vang là acid tartaric, acid malic Hàm lượng của hai acid này có thể lên đến 90% hàm lượng của acid có mặt trong rượu vang và chúng tạo nên vị chua đặc trưng cho dịch rượu vang Hàm lượng acid malic trong dịch khoảng 3 – 4.5 g/l Hầu hết nấm men đều có thể sử dụng acid malic làm cơ chất và mức độ chuyển hóa

acid malic còn tùy thuộc vào từng loài Ví dụ, S cerevisiae chỉ phân giải được 3 – 4.5

% lượng acid malic có trong dịch nuôi cấy, trong khi Schizosaccharomyces pombe và Schizosaccharomyces malidevorans có thể chuyển hóa hoàn toàn acid này thành

ethanol và CO2

2.2.4.2 Rượu cao phân tử

Một trong những sản phẩm phụ quan trọng được tạo thành trong quá trình lên men rượu là các rượu cao phân tử Chúng tuy ít nhưng gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm rượu Đó là các rượu propylic, izo butylic, izo amylic, amylic,… Hàm lượng của chúng chỉ khoảng 0.4 – 0.5 % so với ethanol nhưng gây cho sản phẩm có mùi khét nên gọi là dầu khét Nguyên nhân là do nấm men sử dụng nitơ của acid amin Phương trình tổng quát quá trình này là:

RCH(NH2)COOH + H2O RCH2OH + NH3 + CO2

2.2.4.3 Sự tạo thành ester

Song song với việc tạo ra acid và rượu, dưới tác dụng của enzyme esterase của nấm men, các acid và alcol sẽ tác dụng lẫn nhau tạo ra những ester tương ứng Có thể viết phương trình phản ứng tổng quát sau:

R1CH2OH + R2COOH R2COO - CH2R1 + H2O

[1]

2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu

2.2.5.1 Nồng độ oxy của môi trường

Hầu hết các chủng nấm men trong lên men rượu vang thuộc giống

Saccharomyces Chúng là nhóm vi sinh vật kỵ khí tùy tiện

Trong quá trình lên men giai đoạn đầu yêu cầu oxy cao nhất để nấm men sinh sản, phát triển tăng sinh khối Nếu có giai đoạn nhân giống thì cũng cần phải cung cấp oxy bằng cách lắc hoặc sục khí

Độ thoáng khí của môi trường ngược lại rất bất lợi cho quá trình lên men rượu, khi bắt đầu sang giai đoạn lên men, sự lên men phải xảy ra trong điều kiện yếm khí hoàn toàn, ở điều kiện này sự phát triển vi sinh vật cần oxy bị cản trở (như vi khuẩn acetic, các loại nấm men dại)

Trong môi trường này, sự hô hấp của nấm men bị ức chế và bắt đầu phải tìm năng lượng cần thiết bằng con đường lên men

Để đáp ứng năng lượng cần thiết, nấm men cần phân hủy một lượng đường lớn

và đường sẽ chuyển thành rượu etylic, CO2 Đó chính là nguyên nhân muốn có được cồn nhiều thì không được thoáng khí cho môi trường Thực tế cũng cho thấy việc sục khí vào dịch lên men là không cần thiết, lượng oxy hòa tan trong dịch đường ban đầu

đủ để nấm men tăng sinh khối trong giai đoạn đầu, ngoài ra sục khí sẽ làm tăng lượng rượu bay hơi, nếu dư sẽ dẫn đến tạo nhiều sinh khối và aldehyl, do đó làm giảm hiệu suất lên men rượu [11], [43]

2.2.5.2 Nhiệt độ

Nhiệt độ lên men ảnh hưởng đến đời sống của nấm men, đến quá trình lên men

và chất lượng sản phẩm Nấm men bền vững trong nhiệt độ thấp và rất nhạy cảm với nhiệt độ cao

Mỗi loài vi sinh vật có nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng Đối với nấm

men Saccharomyces, nhiệt độ tối ưu nằm trong giới hạn 28 – 30 oC Tuy nhiên, nếu bắt đầu lên men ở nhiệt độ thấp thì khả năng lên men sẽ cao và kéo dài hơn Mặt khác nếu

có điều kiện làm lạnh dịch đường tới 20 – 22 oC sẽ hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn Sau 8 – 10 giờ nhiệt độ lên men sẽ tăng đến 28 – 30 oC, tiếp đó cần làm lạnh để giữ nhiệt độ trong giới hạn tối ưu Ở nhiệt độ cao, hoạt động của nấm men sẽ giảm nhanh nhưng chủ yếu là dễ bị nhiễm lactic và nấm men hoang dại Ở nhiệt độ 30oC,

men hoang dại phát triển nhanh hơn Saccharomyces từ 2 – 3 lần, còn ở nhiệt độ 35 –

38 oC chúng phát triển nhanh gấp 6 – 8 lần Mặt khác, khi lên men ở nhiệt độ cao sẽ tạo nhiều ester, aldehyl và tổn thất rượu theo CO2 tăng

Nhiệt độ lên men cao nhất là 39oC và thấp nhất là 4 – 6 oC

Nhiều công trình nghiên cứu về sản xuất rượu vang đã xác định được khoảng nhiệt độ lên men rượu vang trắng thích hợp là 15 – 30 oC, nếu lên men ở những thang

2.2.5.3 Nồng độ đường của dịch lên men

Trong nước quả thường có hàm lượng đường không đều do vậy người ta thường bổ sung thêm đường saccharose Đa số các loại nấm men hoạt động bình thường trong môi trường đường dưới 20% Có một số chủng hoạt động ở môi trường

có đường cao hơn Khi nhân giống thường dùng môi trường có đường thấp dưới 10%

Các loại dịch quả, dịch đường hóa, mật rỉ loãng đều tạo nên một áp suất thẩm thấu Áp suất này càng tăng khi gia tăng nồng độ đường của môi trường Các vi sinh vật phát triển trong môi trường này đểu phải chịu ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu của môi trường Các nấm men đều phải có khả năng cân bằng áp suất thẩm thấu của môi trường với áp suất nội thể Trường hợp ngược lại nấm men bị co nguyên sinh Trong dung dịch đường saccharose nồng độ 25%, nấm men phải chịu áp suất là 23 atm, trong dung dịch đường glucose 25% áp suất là 58 atm

Từng loại nấm men riêng biệt có khả năng chịu đựng áp suất thẩm thấu khác nhau Những nòi nấm men lên men nổi có đặc tính là khả năng chịu đựng áp suất thẩm

thấu lớn hơn những nòi khác Những nấm men của giống Zygosaccharomyces có thể

phát triển trong nước nho đậm đặc với hàm lượng đường từ 50 – 80 % (tương ứng với

áp suất thẩm thấu 120 – 250 atm), thông thường những nấm men này phát triển trên bề mặt của môi trường

Người ta đã chứng minh rằng, với sự gia tăng nồng độ đường trong môi trường

sẽ kéo dài thời gian lên men, và hiệu suất rượu từ một đơn vị đường sẽ giảm, lượng rượu tạo ra không đáng kể Phần lớn với các nấm men rượu vang với sự gia tăng nồng

độ đường lên trên 30% thì nhận thấy sự giảm dần hiệu suất cồn etylic, với nồng độ đường quá cao thì quá trình lên men sẽ dừng lại ở 5 – 6 %V Nguyên nhân là phần lớn

tế bào nấm men đã chết do hiện tượng co nguyên sinh chất Ngoài ra sự lên men trong môi trường có nồng độ đường cao thường dẫn đến hiện tượng lượng acid bay hơi tạo thành trong môi trường sẽ cao Để tránh hiện tượng này cũng như để tăng hiệu suất rượu cao hơn có thể cho lượng đường vào từ từ (hoặc chia làm nhiều lần cho vào) thay

vì cho cùng một lúc

Bendensvin đã làm thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường lên sự lên men cồn etylic của loài nấm men và được kết quả như sau:

- Tăng lượng đường sẽ ức chế, làm giảm khả năng lên men của nấm men

- Bắt đầu từ nồng độ đường tối ưu 30% khả năng lên men bắt đầu giảm

Những nấm men chịu được nồng độ rượu cao là những nấm men chịu được áp suất thẩm thấu của đường mạnh

[11], [43]

2.2.5.4 pH của môi trường

Nồng độ H+ trong canh trường ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm men Chúng có khả năng làm thay đổi điện tích các chất của vỏ tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu của chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men Mỗi vi sinh vật chỉ có thể phát triển tốt trong những trạng thái ion nhất định, trạng thái này lại phụ thuộc pH của canh trường pH tối thích cho sự phát triển và lên men rượu của nấm men không cố định mà phụ thuộc nhiều yếu tố, cụ thể những yếu tố chính

sau:

 Loài, chủng nấm men

 Thành phần của môi trường lên men

 Điều kiện lên men (nhiệt độ)

Đối với các loại nấm men rượu vang, pH tối thích của chúng khoảng từ 4 – 5, của nấm men bia 6.0, của nấm men rượu là 4 – 4.5, của đa số các loài nấm men là 3.5

Nấm men có khả năng phát triển ở môi trường trung tính, kiềm, nhưng lên men rượu tốt nhất ở môi trường acid Đặc tính chịu được dộ acid cao của một số loài nấm men giúp ích rất nhiều trong công nghiệp rượu vì giúp loại trừ một số vi khuẩn có hại không thể phát triển được trong môi trường có độ acid cao, đồng thời tránh việc tạo ra nhiều glycerin làm giảm hiệu suất lên men rượu Tuy nhiên nếu pH môi trường quá thấp (pH = 2.6) thì có thể ức chế sự phát triển của nấm men

Đối với nấm men giống Saccharomyces, giới hạn pH môi trường có thể phát

triển được thấp nhất là 2.0 – 2.4, cao nhất là 12 Ở pH = 8 – 11, đa số nấm men hô hấp hiếu khí hơn là lên men

Ngoài ra, pH môi trường còn ảnh hưởng đến các enzym hình thành trong nấm men Theo nghiên cứu của Haldane thì enzym có pH tối thích từ 4 – 8, ở pH < 4, hoạt tính của các enzyme bắt đầu yếu dần

Trong quá trình lên men rượu, một số acid sẽ được hình thành thêm, dẫn đến sự

hạ thấp pH xuống

Trong thực tế lên men những dịch quả chua thường được rượu vang ngon Đối với dịch quả thường có độ pH từ 2.8 – 3.8 Khoảng pH này nấm men vẫn hoạt động được Trong sản xuất rượu vang người ta thường chuẩn bị môi trường nước quả có độ

pH 3.0 – 3.5

[11], [43]

Ảnh hưởng nồng độ cồn etylic vào các loại nấm men không giống nhau Đa số loại nấm men ở điều kiên nhiệt độ tối ưu chịu được nồng độ cồn khoảng 14 – 16 % thể tích Bảng dưới đây cho thấy khả năng chịu được hàm lượng cồn có trong môi trường trong điều kiện bình thường

Bảng 2 4 Khả năng chịu được hàm lượng cồn trong môi trường của một số nấm men

Loài nấm men Nồng độ cồn cực đại nấm men

CO2 tích tụ lại trong môi trường chỉ làm giảm khả năng sinh sản của nấm men, nhưng không làm yếu khả năng lên men của chúng

Theo Muler Turgar, với nồng độ 0.25% trọng lượng CO2 trong môi trường sẽ

ức chế sự sinh sản của nấm men rượu vang

Theo Smitener, sự sinh sản của nấm men ngừng lại khi nồng độ CO2 lên đến 1.5% trọng lượng, với lượng CO2 này tương ứng với áp suất 7.7 atm ở 150C

Khi môi trường chứa hàm lượng đường cao sẽ cản trở CO2 thoát ra, dẫn đến ức chế sinh sản của nấm men và sự lên men có hiệu suất thấp CO2 nằm trong khoảng không giữa bề mặt môi trường và không khí có tác dụng kiềm chế sự phát triển của những vi sinh vật hiếu khí gây hại Do vậy các thùng lên men phải dùng nút bằng nguyên liệu đặc biệt chỉ cho phép CO2 bay ra mà không cho không khí vào

2.2.5.7 Thời gian lên men

Thời gian là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm rượu vang Thời gian lên men phụ thuộc nhiều yếu tố: nhiệt độ lên men, nồng độ đường, chủng nấm men Thời gian lên men bắt đầu từ khi cấy chủng nấm men vào môi trường lên men, qua các giai đoạn sinh sản, phát triển, bắt đầu lên men, lên men mạnh, lên men yếu Người ta chưa xác định rõ khi nào là lên men kết thúc Người ta thường xác định điểm kết thúc lên men bằng cách nếm không khí cảm thấy vị ngọt của đường hoặc bằng cách quan sát thấy khả năng tạo CO2 rất yếu Ở đây chỉ nói thời gian kết thúc giai đoạn lên men chính Giai đoạn lên men phụ là giai đoạn ủ chín và tàng trữ kéo dài từ vài tháng trở lên [11], [43]

thấp thì phải bổ sung thêm Đối với các loại nấm men Saccharomyces, muối amon

thích hợp nhất vì chúng đồng hóa được các muối này Theo kết quả của nhiều thí nghiệm, cho vào 1 lít nước quả 0.05 đến 0.1g muối amon thì lên men thường mạnh hơn Nên cho thêm trước khi lên men vì nếu cho muộn, chúng không còn khả năng đồng hóa đạm

Từ muối amon, nấm men có thể tổng hợp tất cả các acid amin và protein cần thiết cho mình nhưng nếu cho thêm acid amin nhất là dưới dạng hỗn hợp nhiều loài thì tác dụng kích thích rất rõ Khả năng tổng hợp acid amin của nấm men lớn, do đó cho thêm tương đối nhiều amon thì hàm lượng đạm trong men tăng lên, khi chết nấm men

tự hủy, acid amin hòa tan trong rượu vang, có thể tăng đạm tổng số của rượu lên tới

ba, bốn lần (Flanzy và Poux 1965)

Fe2O3 : 0.06 – 7.3 P2O5 : 15 – 59 Cl : 0.03 – 1.0 Ngoài ra còn một lượng nhỏ các chất Al, Br, Cr, Cu, Pb, Mn, Ag, Sr, Te, Sn, Zn Tất cả các muối khoáng chiếm 5 – 10 % khối lượng khô của men

Thông thường những nước quả tối thí dụ như nho, chứa đủ các chất khoáng, nhưng khi làm thí nghiệm thêm P2O5 và MgO bao giờ cũng kích thích sự lên men Nguồn K và P có thể dùng K2HPO4, KH2PO4, (NH4)2HPO4, NH4H2PO4, và

K2SO4, nguồn Mg và lưu huỳnh – MgSO4, nguồn sắt – FeCl3, FeSO4

2.3 Kỹ thuật cố định

2.3.1 Lịch sử phát triển

Năm 1916, Nelson và Griffin đã tiến hành thí nghiệm với enzyme invertase của nấm men, và nhận thấy khi hấp phụ vào than thì vẫn có khả năng thủy phân đường saccharose Sau đó trên thế giới người ta đã nghiên cứu tìm ra được rất nhiều enzyme

có thể cố định trên các loại chất mang và hoàn toàn có thể lên men tốt bình thường, thậm chí một số cho hiệu quả lên men tốt hơn Dựa trên phương pháp cố định enzyme, người ta tiến hành cố định tế bào Với một loạt những nghiên cứu tế bào vi sinh vật, hiện nay phương pháp cố định tế bào vi sinh vật đang rất được phát triển

Năm 1960 Hattori và Furusaka đã cố định tế bào E.coli hấp thụ trên Dowex 1

và vẫn duy trì hoạt động trao đổi chất

Năm 1864 công nghệ hiện đại sử dụng tế bào cố định đầu tiên đã được thực hiện tại nhà máy U.A Squibb Đó là sự biến đổi sinh học của steroid hormone bởi tế bào chịu nhiệt

Năm 1966 Mosbach đã đề ra lần đầu tiên phương pháp bọc tế bào trong hệ thống lỗ xốp, đó là bọc trong gel polyacrylamide

Năm 1985 Klein và Vorlop đã phát triển phương pháp này, đồng thời bổ sung nhiều kĩ thuật mới, điều này đã đem lại nhiều lợi thế hơn hẳn các phương pháp khác Năm 1973 nhà máy Nhật Tanabe Seyaku đã sử dụng gel arylamide và carrageenan để cố định tế bào nhằm sản xuất liên tục acid L – aspartic, sản phẩm L – malic từ acid fumaric vào năm 1974 và sản phẩm L – alanine từ acid L – malic vào năm 1982

Năm 1973 Chibata và các cộng tác viên cũng đã thành công trong việc cố định

tế bào vi sinh vật đầu tiên để sản xuất L – aspartate từ ammonium fumarate bằng gel acrylamide

Hiện nay có rất nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật cố định tế bào vi sinh vật để sản xuất như lên men bia, cồn, hay thu nhận enzyme…

2.3.2 Định nghĩa

Cố định vi sinh vật là quá trình gắn tế bào vi sinh vật vào phase riêng biệt tách khỏi phase tự do của dung dịch, nhưng vẫn có khả năng trao đổi chất với các phân tử

cơ chất có mặt trong phase tự do nói trên [18]

Sự cố định vi sinh vật là việc gắn tế bào vi sinh vật vào chất mang không hòa tan trong nước Tế bào sau khi cố định có thể sử dụng nhiều lần, không lẫn vào sản phẩm và có thể chủ động ngừng phản ứng mong muốn [9]

2.3.3 Chất mang

Là vật liệu để cố định vi sinh vật lên bề mặt hay để nhốt vào Chất mang rất đa dạng về chủng loại, nguồn gốc, tính chất và đặc tính

2.3.3.1 Yêu cầu của chất mang

Chất mang đóng vai trò quan trọng trong ảnh hưởng đến khả năng cố định vi sinh vật Một chất mang lý tưởng cần có những tính chất như sau:

- Rẻ, dễ kiếm, có hiệu quả kinh tế của quy trình công nghệ ở quy mô công nghiệp

- Bền vững, ổn định cơ lý; chịu được các điều kiện môi trường như khuấy trộn,

áp lực trong quy trình sản xuất

- Bền vững hóa học, không tan lẫn trong môi trường phản ứng

- Chất mang không được làm mất hay không được ức chế hoạt tính enzyme của

vi sinh vật Chất mang không gây ra những phản ứng hấp phụ không đặc biệt

- Chất mang phải có tính kháng khuẩn cao, bền vững với những sự tấn công của

vi sinh vật

- Có hình dạng phù hợp với thiết bị phản ứng sinh học

- Chất mang phải được chọn lọc sao cho việc cố định vi sinh vật dễ dàng

- Có thể sử dụng lại nhiều lần

- An toàn với môi trường sống

- Có độ trương tốt, có diện tích bề mặt tiếp xúc lớn Tính chất này của chất mang vừa tăng khả năng cố định vi sinh vật, vừa tăng khả năng tiếp xúc của cơ chất với enzyme, nhờ đó làm tăng hoạt tính enzyme và số lần tái sử dụng

- Chất mang có thể có cầu trúc siêu lỗ, lỗ xốp, dạng hạt, dạng màng, dạng phim mỏng…

[18], [12]

2.3.3.2 Phân loại chất mang

Tùy vào nguồn gốc, đặc điểm, tính chất, cấu tạo mà người ta phân chia chất mang ra thành 4 loại: chất mang hữu cơ tự nhiên, chất mang hữu cơ tổng hợp, chất mang vô cơ tự nhiên, chất mang vô cơ tổng hợp

Hình 2 4 Phân loại chất mang [21]

Chất mang hữu cơ tự nhiên

Cellulose: được sử dụng rộng rãi làm chất mang cố định tế bào Cellulose là

thành phần cấu tạo chủ yếu của các vật liệu như rơm, bã mía, dăm bào, trấu, mùn cưa… Đây là nguyên liệu rẻ tiền Các cellulose là một loại homopolymer của D- glucose Các gốc D-glucose được nối kết với nhau qua liên kết β-1,4-glucan Mức độ polymer hóa của cellulose thay đổi nhiều, trung bình là 3000 Tùy theo loại thực vật

mà phân tử cellulose có khối lượng phân tử khác nhau, từ 50,000 đến 2,500,000

Nhờ phương pháp phân tích bằng tia Ronghen người ta biết rằng cellulose có cấu tạo hệ sợi Các sợi này liên kết thành các bó nhỏ người ta gọi là microfibrin có cấu trúc không đồng nhất Chúng có những phần đặc (phần kết tinh) và những phần xốp (phần vô định hình)

Cellulose là một trong các hợp chất tự nhiên khá bền vững Nó không tan trong nước mà chỉ bị phồng lên do hấp thụ nước Cellulose cũng bị phân hủy khi đốt nóng với acid hay kiềm ở nồng độ khá cao Cellulose cũng bị phân hủy ở nhiệt độ thường hay ở nhiệt độ 40 – 45 oC nhờ enzyme phân hủy cellulose là cellulase

Ngoài ra người ta còn sử dụng các dẫn xuất của cellulose như C – cellulose, DEAE – celllulose… có tính chất cơ lý khá tốt, giá rẻ nhưng lại không đồng nhất nên chỉ sử dụng ở dạng sợi hay dạng vi hạt

Collagen: là chất mang thích hợp cho quá trình cố định tế bào ở điều kiện “nhẹ

nhàng” Collagen là protein sợi ở các mô liên kết ở cơ thể động vật, bản chất protein của nó quyết định khả năng gắn thông qua liên kết hóa trị Collagen không ưa nước,

do vậy trong dung dịch nước nó nở rất mạnh và khi đó nó sẽ cải biến do sự thay đổi tương quan giữa các gốc kỵ nước và ưa nước Chính các tính chất này đã làm cho nó thành chất mang thuận tiện trong quá trình cố định

Agar: gel agar thu nhận từ rong biển cũng có thể đóng vai trò quan trọng làm

chất mang trong quá trình cố định nhưng ít khi được sử dụng trong thực tế do độ bền

cơ học của gel thấp ngoài ra còn phải thêm giai đoạn đun dịch huyền phù chứa tế bào trước khi tạo gel

K – carrageenan: trong các loại polymer tự nhiên thì K – carrageenan có ý

nghĩa hơn cả bởi nó đảm bảo cho sự hình thành dạng bào mềm K – carrageenan là polysaccharide chiết từ tảo biển đỏ Nó sẽ bị chảy ra khi đốt nóng và đông lại khi làm lạnh

Tuy nhiên vật liệu này có nhược điểm là gel không ổn định trong môi trường có phosphate

Gel alginate: có nguồn gốc từ rong biển, gel alginate – Ca hay Al được sử

dụng rộng rãi cho mục đích cố định Cấu trúc của gel được qui định bởi sự tạo thành các liên kết ion giữa các mạch đa điện ly Về mặt bản chất, các mạch này là các D – mannoic acid và D – gulonic acid Alginate bền về mặt cơ học, sự có mặt các tác nhân tạo phức có ảnh hưởng xấu đến chức năng hoạt động của gel alginate – Ca vì chúng phá cấu trúc gel do liên kết với ion Ca, nhưng loại gel này lại bền với áp suất thủy tĩnh

Chitin và chitosan: có những đặc tính ưu việt mà các polymer khác không có:

tự hủy, dễ tương thích, không độc hại và có tính hấp phụ cao Chitosan có đặc tính lý học, sinh học như khả năng tạo gel, khả năng kháng khuẩn

Hiện nay có xu hướng chung là sử dụng các vật liệu polymer tự nhiên được ghép copolymer với các polymer tổng hợp để cải thiện tính cơ lý

Chất mang hữu cơ tổng hợp

Các loại polymer hữu cơ tổng hợp như: polyacrylamide, polyester, polyvinylacetate, polyacrylic, polyvinylalcohol…

Chất mang vô cơ tự nhiên

Zeolit: là các aluminosilicat có cấu trúc tinh thể theo không gian ba chiều, hình thành các cửa sổ và các lỗ xốp có kích thước cỡ phân tử Cấu trúc lỗ xốp bao gồm khoang lớn bên ngoài và các khoang nhỏ bên trong hình thành từ các bát diện cụt

Ngoài ra còn có than hoạt tính, silicate…

Chất mang vô cơ tổng hợp

Thường sử dụng alluminium oxide, silicum oxide, sợi bông thủy tinh…

[18], [12] Mỗi loại chất mang đều có ưu nhược điểm riêng của từng loại do bản chất, sức bền cơ lý khác nhau (bảng 2.5), việc lựa chọn chất mang phụ thuộc vào yêu cầu của quá trình lên men, quyết định đến hiệu quả của quá trình cố định tế bào

Bảng 2 5 Ưu nhược điểm của từng loại chất mang

Chất mang hữu

cơ tổng hợp

Bền, tính chất cơ lý tốt, hoàn toàn trơ với sự tấn công của vi sinh vật, độ trương tốt và đặc biệt có thể điều chỉnh được kích thước chất mang để nâng cao hiệu quả cố định

Giá thành cao, sự trương sinh học kém, khó phân hủy trong tự nhiên gây ô nhiễm môi trường

Chất mang vô cơ

tự nhiên Có cấu trúc lỗ xốp

Không an toàn sử dụng trong thực phẩm

Chất mang vô cơ

tổng hợp

Có cấu trúc lỗ xốp và khả năng hấp phụ tốt

Tan trong môi trường kiềm có pH > 7.5

[18], [12], [21]

2.3.4 Phương pháp cố định

Hình 2 5 Phương pháp cố định vi sinh vật [18]

2.3.4.1 Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trên bề mặt chất mang

Hình 2 6 Cố định tế bào trên bề mặt chất mang [18]

a Phương pháp liên kết cộng hóa trị

Đây là phương pháp liên kết tế bào với các polymer đã được hoạt hóa Bản chất liên kết cộng hóa trị là nối tế bào vi sinh vật với chất mang thông qua cầu nối nào đó Cầu nối này phải có kích thước không lớn lắm và có hai đầu, một đầu nối polymer còn đầu kia nối với tế bào

Các chất mang thường dùng: polypeptid, polysaccharide, dẫn xuất cellulose, dextrin, các polymer tổng hợp…Có 2 cách thực hiện:

- Chất mang có khả năng liên kết trực tiếp tế bào Việc gắn sẽ hiệu quả hơn nếu điện tích của tế bào và của chất mang trái dấu nhau

- Kết hợp đồng hóa trị các phân tử tế bào riêng biệt lại thành một đại phân tử không hòa tan Người ta thường sử dụng aldehit glutaric để làm chất gắn liên kết

b Phương pháp hấp phụ

Đây được coi là phương pháp tiêu biểu đầu tiên về cố định tế bào vi sinh vật Hatori và Furusaka là những nhà khoa học đầu tiên đi tiên phong trong phương pháp

cố định vi sinh vật bằng phương pháp này Trong quá trình cố định vi sinh vật bằng

phương pháp hấp phụ có các liên kết sau được hình thành:

- Liên kết tĩnh điện Van der walls: giữa tế bào và bề mặt chất mang tạo nên một

sự chênh lệch điện thế giúp tế bào và chất mang gắn với nhau

- Lực mao quản: chất mang có các mao quản, khi được ngâm trong các huyền phù vi sinh vật sẽ hình thành các lực mao quản kéo huyền phù vi sinh vật vào trong lòng chất mang

- Lực ion: tế bào vi sinh vật và chất mang gắn với nhau do bề mặt mang các ion trái dấu

Phương pháp tiến hành:

- Phương pháp cổ điển: gắn chất mang vào huyền phù vi sinh vật, vi sinh vật sẽ

tự động kết lắng và liên kết với chất mang bằng cách hấp phụ lên chất mang đó

- Phương pháp bán cổ điển: sử dụng thêm cánh khuấy nhằm mục đích phân bố đều vi sinh vật và chất mang trong dung dịch để tăng thêm diện tích tiếp xúc giữa chất mang và vi sinh vật, vì vậy hiệu suất được cải thiện đáng kể

- Phương pháp bơm canh trường qua cột chứa chất mang: phương pháp này cần

có dòng hồi lưu vi sinh vật để nâng cao hiệu suất gắn tế bào vi sinh vật

2.3.4.2 Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong lòng chất mang

Đối với tế bào vi sinh vật, trong một số trường hợp không nhất thiết phải gắn chặt tế bào vào bề mặt chất mang polymer mà có thể giữ nó bên trong polymer do polymer tạo mạng lưới nhốt tế bào Mạng lưới này có lỗ nhỏ tới mức không cho tế bào chui ra khỏi mạng, nhưng vẫn đủ lớn để cơ chất và sản phẩm tạo ra có thể ra vào dễ dàng

Hình 2 7 Cố định tế bào trong lòng chất mang [18]

b Nhốt trong các sợi nhỏ của sợi tổng hợp

Ta cho dòng chảy tuần hoàn bên trong sợi do đó hạn chế được sự phân cực bề mặt và sự bịt lắp thông thường gặp với các màng Phương pháp này thường tốt hơn phương pháp nhốt trong gel Các sợi được dùng là các sợi nhân tạo Các sợi này thường có độ bền acid, kiềm, các loại ion, và các dung môi hữu cơ hòa tan Tính chất trên phụ thuộc vào bản chất hóa học của các polymer tạo ra loại sợi này

Phương pháp này đơn giản thao tác hoạt động và không đòi hỏi cải biến hóa học với chất mang polymer sợi Polymer tạo sợi sử dụng trong cố định tế bào thường

có giá rẻ và phổ biến với số lượng đáng kể

Cách tiến hành: Người ta bổ sung vào dung dịch có polymer tạo sợi trong dung môi hữu cơ không phân cực hoặc dung dịch huyền phù chứa đối tượng sinh học cần cố định và sau đó nhũ hóa hỗn hợp bằng cách khuấy

Điều chỉnh nồng độ polymer đến giá trị tạo được sợi và sau đó ép chúng qua thiết bị ép đùn vào bể lắng chứa dung môi hữu cơ trộn lẫn với dung môi của polymer tạo sợi

2.3.4.3 Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật không cần chất mang

a Phương pháp liên kết chéo giữa các tế bào

Đây là phương pháp không sử dụng chất mang mà sẽ liên kết các protein của tế bào cũng như các nhóm chức năng với nhau để tạo thành một cụm tế bào không hòa tan Các tế bào sẽ được polymer hóa bằng các liên kết ngang cùng với các tác nhân liên kết như: bezidin dithiocyanat, bifuntional alkylating và glutaraladehyde

Ở phương pháp này ta thấy có sự nhả hấp phụ các liên kết ra

Hình 2 8 Liên kết giữa các tế bào [18]

b phương pháp cố định bằng màng membrane

Hình 2 9 Cố định tế bào bằng màng membrane [18]

Các vỏ bán thấm cellulose có kích thước 10 – 12 µm đường kính và bề dày được hình thành Mỗi vỏ nhỏ có chứa vi sinh vật bên trong Các vỏ này được tạo ra từ các màng hay nguyên liệu polymer Các màng này có vai trò thẩm thấu cho các cơ chất và sản phẩm của quá trình phản ứng enzyme, nhưng các vi sinh vật không thể đi

ra ngoài do phân tử quá lớn Hoạt động của vi sinh vật diễn ra trong màng hạt bao màng bán thấm vì vậy phương pháp này có giới hạn là các cơ chất lớn như protein, polysaccharide không thể cho phép đi vào bên trong màng và lúc đó enzyme không thể thực hiện phản ứng thủy phân

Có nhiều cách gói vi sinh vật trong màng bán thấm Cho một dung dịch lỏng và một monomer ưa nước trong một dung môi hữu cơ không hòa lẫn trong nước để tạo nhũ tương, sau đó thêm một monomer kỵ nước để gây phản ứng trùng hợp tạo màng bao quanh những giọt cầu nhỏ, thường phải thêm vào một tác nhân hoạt động bề mặt

để làm bền nhũ tương cũng như điều khiển kích thước

Một phương pháp khác: sử dụng màng siêu lọc Phương pháp này thì tế bào tự

do trong dung dịch, màng lọc có vai trò tách sản phẩm và cơ chất Cơ chất được tiếp tục đưa vào hệ thống, còn sản phẩm được lấy ra khỏi màng lọc Phương pháp này cho phép áp dụng trong trường hợp cơ chất lớn hoặc cơ chất không tan Trong quá trình đó

cơ chất và tế bào được giữ lại cùng một bên màng lọc Kết quả này còn tùy thuộc vào chất lượng màng lọc

2.3.4.4 Một số phương pháp khác

a Phương pháp cố định trong quá trình lạnh sâu

Sự cố định trong quá trình lạnh sâu cho phép tạo được hệ sợi có hoạt tính sinh học cao Đặc điểm quan trọng của gel lạnh sâu là có nhiều cấu trúc lỗ to Ngoài ra kích thước và hình dạng của chúng có thể điều chỉnh được bằng cách thay đổi chế độ làm việc của quá trình tạo cấu trúc lạnh sâu hoặc thay đổi nồng độ của các chất tạo gel trong dung dịch ban đầu Vì các gel lạnh sâu có độ lỗ cao nên chúng là vật liệu rất có triển vọng làm chất mang các tế bào vi sinh vật cố định

Người ta tạo ra các gel lạnh sâu bằng cách trộn lẫn các thành phần tạo gel cần thiết và cho lạnh đến một nhiệt độ âm nào đó Khi dịch lỏng chuyển sang trạng thái rắn, thì nó được giữ ở trạng thái này trong thời gian nhất định sau đó mới làm tan nó

Khi chất tạo gel là polymer tự tạo gel (như gelatin, agar, rượu polyvinyl …) thì dịch ban đầu của polymer đó phải ở nồng độ thấp hơn nồng độ ngưỡng tạo gel ở nhiệt

độ trên 0oC Chất tạo gel lạnh sâu phổ biến hơn cả để cố định tế bào vi sinh vật (vi khuẩn hoặc bào tử nấm) là rượu polyvinyl

b Cố định liên hợp

Mặc dù kĩ thuật cố định tế bào vi sinh vật đang phát triển, nhưng người ta vẫn còn thận trọng trong việc tạo hỗn hợp tế bào trong cùng một pha cố định để lên men

Ví dụ trong lên men cồn người ta đã hỗn hợp S diastaticus, Schwanniomyces castellii

và Endomycopsis fibuligera Reilly và Scott đã làm một vài thử nghiệm với việc lên

men hỗn hợp cố định để có được các kết quả khác nhau Hay việc kết hợp nuôi tạo và

vi sinh vật hiếu khí bằng cách bẫy trong vỏ capsule để giải quyết vấn đề oxi, như

Wikstrom đã liên kết Chlorella vulgaris với Providencia sp trong agarose để lên men

tạo ketoisocaproic acid từ L – leucine

c Quá trình cố định nhờ photopolymer ( quang polymer)

Đây là phương pháp cố định có triển vọng dựa vào photopolymer là urethane Photopolymer là oligomer mà phân tử của nó chứa các nhóm chức năng có khả năng tham gia vào làm dài hoặc khâu mạch để tạo thành polymer có trọng lượng phân tử cao Các gel được khâu nối nhờ ánh sáng như trên thông thường được tạo thành bằng cách chiếu sáng cận tử ngoại theo từng đợt ngắn lên hỗn hợp dịch lỏng photopolymer

có chứa các chức nhạy cảm với ánh sáng và với sự có mặt của các chất mang cảm ứng

và dịch huyền phù chứa tế bào vi sinh vật Còn gel polyurethande được tạo thành bằng cách trộn photopolymer của urethande tan trong nước với dịch huyền phù chứa vi sinh vật Người ta thường sử dụng pholypolymer là các chất: dimethylacrylate polyethyleneglycol (PEGM), ENTP là sản phẩm của oxyethylacrylate, isophorodi iso cyanate, polypropyleneglycol

[21], [25]

Bảng 2 6 Bảng so sánh ưu nhược điểm của các phương pháp cố định tế bào thông dụng

- Tế bào dễ bị tách khỏi chất mang do tác động cơ học hoặc khi thay đổi điều kiện môi trường

- Số lượng tế bào cố định được thường thấp

- Quá trình cố định “thụ động” khó điều khiển

2 Liên kết

cộng hóa trị

với chất

mang

- Khả năng trao đổi chất cao

- Độ bền liên kết giữa tế bào

và chất mang tốt

- Thường ảnh hưởng đến sự sống và hoạt tính của tế bào

- Mỗi tế bào phải có phản ứng đặc thù

3

Liên kết giữa

các tế bào

- Điều kiện nhẹ nhàng, có khả năng kéo dài thời gian hoạt động của tế bào

- Tế bào vi sinh vật khi cố định có tính bền nhiệt và bền với pH hơn so với tế bào

tự do bình thường Cho nên thời gian bảo quản lâu hơn và ít bị ảnh hưởng bởi các chất

đó trong môi trường

- Mật độ tế bào cao Điều này làm năng suất sản xuất tăng cao vì khi mât độ tế bào cao thì sản phẩm trao đổi chất tao ra càng nhiều, năng suất tăng, thời gian sản xuất được rút ngắn

- Làm tăng khối lượng sản phẩm

- Rút ngắn thời gian phản ứng

- Kích thước thiết bị nhỏ gọn

- Khả năng tái sử dụng được nhiều lần

- Quá trình sản xuất liên tục, tế bào vi sinh vật không bị rửa trôi

- Sử dụng được nhiều loại cơ chất Quy trình thiết kế đơn giản hơn

- Chất lượng sản phẩm đồng đều

- Tế bào cố định được bảo vệ không bị ức chế bởi cơ chất và sản phẩm cuối

2.3.5.2 Nhược điểm

- Hoạt lực thấp hơn tế bào tự do

- Trong môi trường phản ứng sử dụng tế bào cố định, không thể không tránh khỏi hiện tượng rửa trôi tế bào ra khỏi chất mang Các tế bào này sẽ lẫn vào sản phẩm, dẫn đến khó khăn trong việc chiết tách và tinh sạch sản phẩm, gây tốn kém chi phí

- pH hoạt động tối ưu bị chuyển dịch sang kiềm hay acid so với tế bào bình thường

- Cơ chất muốn vào trong tế bào để thực hiện trao đổi chất tạo sản phẩm phải qua chất mang, thành tế bào, màng tế bào … các chất này ảnh hưởng đến sự thẩm thấu vào

ra của cơ chất và sản phẩm Vì thế phải lựa chọn chất mang phù hợp với kỹ thuật cố định tế bào để giảm sự trở lực của quá trình thẩm thấu

[2], [5], [9], [12], [19]

2.3.6 Yêu cầu đối với vi sinh vật cố định

Tế bào vi sinh vật giống như một tác nhân xúc tác bao gồm:

 Sự mất hoạt tính enzyme trong quá trình cố định tế bào phải ở mức độ thấp nhất

 Tế bào vi sinh vật cố định phải có khả năng chiếm thể tích riêng của reactor nhiều nhất nhằm làm tăng năng suất thể tích

 Cơ chất và sản phẩm trong quá trình trao đổi chất của tế bào phải có khả năng khắc phục được hàng rào cản khuếch tán, đó là chất mang và thành tế bào