xây dựng phương pháp định tính, định lượng flavonoid trong nụ và lá vối

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- NGUYỄN QUỐC TUẤN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOID TRONG NỤ VÀ LÁ VỐI Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN QUỐC TUẤN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG

FLAVONOID TRONG NỤ VÀ LÁ VỐI

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội – 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN QUỐC TUẤN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG

FLAVONOID TRONG NỤ VÀ LÁ VỐI

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60 44 29

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHƯƠNG THIỆN THƯƠNG

Hà Nội – 2012

Mục lục

Trang

MỞ ĐẦU……….……….……… ……….…1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN………… ……….……….… 3

1.1 Tổng quan cây vối……….….……… 3

1.1.1 Tên gọi ……… ………3

1.1.2 Đặc điểm thực vật……… ………3

1.1.3 Phân bố, sinh thái……….…… 3

1.1.4 Thu hái và chế biến……… ………….4

1.1.5 Thành phần hóa học……… ……….5

1.1.6 Flavonoid trong cây vối……….7

1.1.7 Tác dụng sinh học……… ……….13

1.1.8 Ứng dụng……… ……… 16

1.2 Các phương pháp định tính, định lượng flavonoid ……… …17

1.2.1 Phương pháp định tính……….………17

1.2.2 Phương pháp định lượng……….……….20

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………26

2.1 Đối tượng nghiên cứu……… ……….26

2.2 Nội dung nghiên cứu ……… ………… 27

2.3 Phương pháp nghiên cứu……… ……….27

2.3.1 Chiết xuất, phân lập flavonoid chính………….……… 27

2.3.2 Xác định cấu trúc chất phân lập……….…… 28

2.4 Xây dựng phương pháp định tính trong nụ và lá vối……… … 28

2.4.1 Định tính bằng phương pháp hóa học……….……….28

2.4.2 Định tính bằng phương pháp sắc ký……… ………… 28

2.5 Xây dựng phương pháp định lượng flavonoid trong nụ và lá vối…….…….30

2.5.1 Định lượng flavonoid toàn phần bằng phương pháp trắc quang…….…30

2.5.2 Định lượng flavonoid chính bằng phương pháp HPLC……….… 30

2.6 Một số đặc trưng thống kê để xử lý và đánh giá kết quả…… ………31

2.7 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất, dung môi………32

2.7.1 Thiết bị, dụng cụ……… 32

2.7.2 Hóa chất, dung môi……… 32

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……… 33

3.1 Chiết xuất và phân lập một flavonoid chính từ nụ cây vối……… 33

3.1.1 Chiết xuất dược liệu và phân đoạn… ……….33

3.1.2 Phân lập flavonoid chính trong cao phân đoạn ethyl acetat……….34

3.1.3 Xác định cấu trúc chất phân lập……… ………37

3.2 Xây dựng phương pháp định tính flavonoid trong lá và nụ vối…… …… 41

3.2.1 Định tính bằng phản ứng hóa học……… ……….41

3.2.2 Định tính bằng TLC……… ………… 42

3.2.3 Định tính bằng HPLC……… ……46

3.3 Xây dựng phương pháp định lượng flavonoid trong lá và nụ vối………… 48

3.3.1 Xây dựng bằng phương pháp trắc quang……… ……… 48

3.3.2 Xây dựng phương pháp định lượng CO-1 bằng HPLC……… ………61

KẾT LUẬN……….……… …74

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 76 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các thành phần chính trong tinh dầu vối ……… 6 Bảng 1.2 Thành phần flavonoid trong nụ vối……… 8 Bảng 1.3 Một số hệ dung môi khai triển để phân tích flavonoid bằng TLC 19 Bảng 2.1 Bảng chi tiết mẫu nụ và lá vối……… 26

Bảng 3.1 Kết quả định tính sơ bộ flavonoid ở cao H và cao E……… 35 Bảng 3.2 Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất CO-1………… 40

Bảng 3.3 Kết quả SKLM cao phân đoạn ETOAC……… 46 Bảng 3.4 Kết quả độ lặp lại của phương pháp trắc quang……… 49 Bảng 3.5 Kết quả xây dựng đường chuẩn theo chất đối chiếu CO-1……… 50 Bảng 3.6 Kết quả xây dựng đường chuẩn theo chất Catechin……… 51

Bảng 3.7 Kết quả xác định độ lệch chuẩn của mẫu trắng……… 52 Bảng 3.8 Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOL của chất chuẩn CO-1… 53 Bảng 3.9 Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOL của chất Catechin…… 53

Bảng 3.10 Kết quả xác định độ đúng của phương pháp……… 54

Bảng 3.11A Kết quả đánh giá độ ổn định của phương pháp theo cách 1… 55

Bảng 3.11B Kết quả đánh giá độ ổn định của phương pháp theoc cách 2 56

Bảng 3.12 Kết quả xác định flavonoid toàn……….… 58

Bảng 3.13 Kết quả khảo sát pha động ……… 62

Bảng 3.14 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống……… … 63

Bảng 3.15 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính……… 64

Bảng 3.16 Giá trị hệ số bi ……… …… 65

Bảng 3.17 Các đại lượng thống kê……….… 65

Bảng 3.18A Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp bằng mẫu CO-1 66

Bảng 3.18B Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp bằng mẫu thực… 66 Bảng 3.19 Kết quả khảo sát độ đứng của phương pháp……… 67

Bảng 3.20 Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOD……… 69

Bảng 3.21 Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOL……… 69

Bảng 3.22 Kết quả đánh giá sai số của phương pháp……… 71

Bảng 3.23 Kết quả định lượng hoạt chất trong một số mẫu nụ và lá vối… 72

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ

Hình 1.1 Hình ảnh cây vối……… ……… 4

Hình 1.2 Sắc ký đồ hai chất và các thông số đặc trưng……….……….23

Hình 3.1 Hình ảnh SKLM và chất CO-1 phân lập từ nụ vối……… 37

Hình 3.2 Sắc ký đồ HPLC chất CO-1……… … 37

Hình 3.3 Phổ tử ngoại UV chất CO-1……….38

Hình 3.4 Công thức cấu tạo chất CO-1……….… 41

Hình 3.5A Sắc ký đồ định tính flavonoid trong nụ và lá vối……….….44

Hình 3.5B Sắc ký đồ định tính flavonoid trong cao ETOAC……….45

Hình 3.6 Sắc ký đồ của mẫu đối chiếu CO-1 và nụ, lá vối……….48

Hình 3.7 Đường chuẩn xác định flavonoid toàn phần theo CO-1……… …50

Hình 3.8 Đường chuẩn xác định flavonoid toàn phần theo Catechin……….51

Hình 3.9 Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL của CO-1……… …53

Hình 3.10 Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL của Catechin………… 54

Hình 3.11 Đường chuẩn xác định hàm lượng CO-1 trong nụ và lá vối…… 64

Hình 3.12 Chiều cao tín hiệu phát hiện LOD……… 69

Hình 3.13 Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL……….70

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ chiết xuất và phân đoạn cao nụ vối……… 34

Sơ đồ 3.2: Quy trình định lượng flavonoid toàn phần ……….57

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

(Thin Layer Chromatography)

HPLC : Sắc kí lỏng hiệu năng cao

(High Performance Liquid Chromatography)

SD : Độ lệch chuẩn

(Standard deviation)

RSD : Độ lệch chuẩn tương đối

(Relative standard devition)

LOD : Giới hạn phát hiện

MỞ ĐẦU

Cây Vối, một loại cây quen thuộc của làng quê các tỉnh Đồng Bằng bắc

bộ, có tên khoa học là Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr et Perry thuộc họ

Sim (Myrtaceae) Từ lâu nhân dân ta đã biết dùng lá và nụ vối với cách chế biến đơn giản tạo thành loại trà nấu hay hãm lấy nước uống hàng ngày vừa có tác dụng thanh nhiệt vừa có tác dụng kiện tỳ, tiêu thực

Đến nay đã có nhiều nghiên cứu về cây Vối Thành phần hóa học chính của lá và nụ Vối gồm tinh dầu, triterpenoid và flavonoid Theo Trung học dược

từ hải I (1993), tinh dầu lá vối có 27 thành phần Vỏ cây chứa một chất triterpen nhóm ursan đã được nhận dạng là acid ursolic Nụ vối có nhiều thành phần hóa học đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa học, chủ yếu là các flavonoid

Thành phần hóa học chính trong nụ vối là flavonoid, với khoảng hơn 20 flavonoid khác nhau Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn có cấu trúc hóa học

C6-C3-C6, thường gặp nhiều trong thực vật Đến nay, số lượng flavonoid từ thực vật đã được tìm thấy lên tới trên 8150 flavonoid khác nhau Các flavonoid có nhiều tác dụng sinh học quý như chống ung thư, chống dị ứng, chống co giật, giảm đau, nghẽn mạch, nghẽn phế quản, lợi mật, diệt nấm Do đó, chúng được dùng nhiều trong các ngành công nghiệp dược phẩm, thực phẩm, và mỹ phẩm, phục vụ lợi ích của con người

Các flavonoid của lá và nụ vối cũng đã được chứng minh có nhiều tác dụng sinh học quan trọng như chống oxy hóa, chống ung thư, ức chế một số enzym (xanthin oxydase, α-glucosidase, maltase, acetylcholinesterase và butyrylcholinesterase) Đặc biệt, một số chất một hợp chất có tác dụng đối với ung thư như 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone, 3,5',3'-trihydroxy-6,7,4'-trimethoxy flavon; 3,3'-dihydroxy-5,6,7,4'-tetramethoxy

flavon Do được sử dụng nhiều để làm trà uống và làm thuốc trong y học dân gian nên cần thiết phải có tiêu chuẩn cho nguyên liệu lá và nụ vối Trong dự thảo Dược Điển Việt Nam V (dự kiến xuất bản năm 2013-2014) đã có chuyên luận về lá và nụ vối Tuy nhiên, trong các chuyên luận này chưa có tiêu chí về định tính và định lượng flavonoid trong nụ vối, trong khi flavonoid là thành phần chính và có nhiều tác dụng quan sinh học trọng

Với thực trạng trên, chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài “Xây dựng phương pháp định tính, định lượng flavonoid trong nụ và lá vối” Kết quả

của đề tài sẽ là cơ sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn và kiểm tra chất lượng dược liệu nụ và lá vối phục vụ việc quản lý chất lượng dược liệu trên thị trường

Các mục tiêu của đề tài gồm có:

• Phân lập được một flavonoid chính trong nụ vối dùng làm chất đối chiếu trong việc định tính, định lượng flavonoid

• Xây dựng được quy trình định tính và định lượng flavonoid trong dược liệu nụ và lá vối

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cây vối

1.1.1 Tên gọi

- Tên tiếng Việt: Cây vối, vối nhà

- Tên Latin: Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr et Perry

- Tên đồng nghĩa: Eugenia operculata Roxb

Hoa nhỏ màu trắng lục nhạt, gần như không cuống, hợp thành cụm hoa dạng chùy rộng, mọc ở kẽ những lá đã rụng Nụ hoa dài, lá bắc dễ rụng Đài dính vào bầu Hoa đều lưỡng tính 4 cánh hình tròn hay hình bầu dục, nhiều tuyến mờ dính lại ở đỉnh thành mũ hình chóp Nhị nhiều xếp thành 7-9 dãy có hình bầu dục nằm sâu trong ống đài, bị nhị che kín [3, 4, 10, 22, 42]

Quả hình cầu hay hơi hình trứng, đường kính 7-12 mm, xù xì, khi chín có màu tím, thể chất nạc, vị ngọt [3, 4, 10, 22, 42]

Mùa hoa quả: Tháng 4 – 6

1.1.3 Phân bố, sinh thái

Chi Cleistocalyx Blume gồm một số loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt

đới Đông Nam Á Việt Nam có 3 loài Vối là cây đặc hữu của vùng Việt Nam và Nam Trung Quốc Ở Việt Nam, vối mọc tự nhiên dọc theo suối hay bờ ao hồ ở vùng núi thấp và trung du, thuộc các tỉnh Cao Bằng (Hà Quảng, Thông Nông, Thạch An…); Lạng Sơn (Đồng Mỏ, Hữu Lũng); Bắc Giang (Sơn Động, Lục Nam, Yên Thế ); Vĩnh Phúc (Lập Thạch, Tam Dương); Phú Thọ, Tuyên Quang, Hà Tây, Hòa Bình….Cây vối còn được trồng rải rác trong nhân dân các tỉnh đồng bằng và trung du Bắc Bộ

Vối thuộc loại cây gỗ ưa sáng, ưa ẩm, sinh trưởng và phát triển nhanh; trong vòng 3 năm đầu, chiều cao thân có thể đến 5 m Cây phân cành nhiều chồi

và lá non ra nhiều trong mùa xuân, hè Những cây mọc ở chỗ được chiếu sáng đầy đủ ra hoa quả rất nhiều, tái sinh tự nhiên từ hạt

ơ

Hình 1.1: Hình ảnh Cây và Nụ vối

1.1.4 Thu hái và chế biến

Hái lá tươi, phơi khô, nhưng có người đem ủ rồi mới phơi khô, cách làm như sau: thái nhỏ, rửa sạch, cho vào thùng hay thúng ủ cho đến khi đen đều thì

lấy ra rửa sạch, phơi khô Lá vối ủ uống thơm ngon hơn Để làm thuốc thường dùng lá tươi phơi khô [4,10]

Nụ vối được thu hái, phơi khô dùng để pha nước và làm thuốc [4, 10]

1.1.5 Thành phần hóa học

Lá Vối chứa rất ít tanin, vết alcaloid (nhóm indolic) và tinh dầu, tinh dầu

lá gồm nhiều thành phần trong đó thành phần chính là (Z)-β-ocimen, myrcen, (E)-β-ocimen [3, 4, 17] Trong lá vối có chứa flavonoid, coumarin, tanin, acid hữu cơ, đường tự do và sterol

Vỏ cây chứa triterpen nhóm ursan là acid usolic [3]

Nụ vối chứa nhiều flavonoid khác nhau, với nhiều thành phần đã xác định cấu trúc hóa học được trình bày ở Bảng 1.2

- Tinh dầu: Từ mẫu nụ vối Việt Nam, với phương pháp sắc kí khí khối

phổ GC/MS, Nguyễn Thị Dung và cộng sự đã xác định được 55 thành phần khác nhau có trong tinh dầu nụ vối (Bảng 1.1), gồm các monoterpen, serquiterpen và hydrocarbon serquiterpen [5]

Bảng 1.1 Các thành phần chính trong tinh dầu nụ vối

- Thành phần khác: ethyl galat, acid galic, acid ursolic, β-sitosterol và

acid cinamic [3, 4, 17, 21, 33]

1.1.6 Flavonoid trong cây Vối

Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn thường gặp trong thực vật

Về cấu trúc hóa học flavonoid có khung cơ bản theo kiểu C6-C3-C6 (có 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon) và được chia làm nhiều nhóm khác nhau [16]

Đã có nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước nghiên cứu về thành phần hóa học của cây vối đều chỉ ra rằng flavonoid trong lá và nụ vối có thể ở dạng

tự do hoặc dạng glycosid Chủ yếu là nhóm chalcone, flavanol, flavone và flavanonol Các flavonoid thường dễ kết tinh và thường có màu Flavone có màu vàng nhạt hoặc màu da cam; flavonol màu vàng nhạt đến màu vàng; Chalcone màu vàng đến cam-đỏ; flavanonol kết tinh không màu Các flavonoid được trình bày ở bảng 1.2

Bảng 1.2: Thành phần flavonoid trong nụ vối

1

2',4'-dihydroxy-6'-dimethylchalcone

methoxy-3',5'-[18], [22], [33]

7-methoxy-6-[31], [33]

[33]

11

(2S)-2,7-dihydroxy-5-dimethylflavanol

methoxy-6,8-[33]

12

(E)-4,2',4'-trihydroxy-6'-dimethylchalcone

17

(2S)-7-hydroxy-5-methylflavanon

methoxy-3',5'-[18]

22 Tamarixetin [28]

24

Myricetin-3'-methyether-galactopyranoside

1.1.7 Tác dụng sinh học

a) Tác dụng của lá và nụ vối

Năm 1968, Nguyễn Đức Minh thuộc phòng đông y thực nghiệm Viện nghiên cứu Đông y [10], nghiên cứu thăm dò tính kháng khuẩn của lá và nụ vối với một số vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) đã đi tới kết luận sau:

- Ở tất cả các giai đoạn phát triển lá và nụ vối đều có tác dụng kháng khuẩn Mùa đông kháng sinh tập chung nhiều nhất ở lá

- Chất kháng khuẩn tan trong nước, các dung môi hữu cơ như ether, CCl4, ehtyl acetat, chloroform, aceton, toluen, dầu hỏa

- Chất kháng khuẩn bền vững với nhiệt độ 1000C/30 phút, bền vững ở môi

trường có PH > 7, tác dụng mạnh nhất đối với Streptococcus (hemolytic và

staman), sau đó đến vi khuẩn bạch cầu và Staphylococcus và Pneumococcus

- Chất kháng khuẩn có thể kết tinh trong hỗn hợp dung môi methanol: nước, cho tinh thể hình kim không màu

- Liều độc cao LD50 = 7830 mg/kg (thử trên chuột nhắt trắng bằng đường uống)

* Chất chiết từ nụ vối bằng chloroform tách khỏi dung dịch đệm PH > 7 có màu vàng, vị đắng, dạng muối natri tan nhiều trong nước có tác dụng đặc biệt với

đơn bào Entamoeba histolytica, E moshkovskii ở độ pha loãng 1/1200

* Chất kháng khuẩn làm tăng khả năng thực bào trên chuột lang, tăng cường co bóp tim cô lập, tăng huyết áp nhẹ trên thỏ [3, 10]

Đào Thị Thanh Hiền đã thử tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu lá vối ủ, tinh dầu lá vối không ủ, cao khô lá vối ủ, cao khô lá vối không ủ đối với: Vi

khuẩn Gram (-): E coli, P aeruginosa, vi khuẩn Gr (+): Bacteroides subtillis,

S aureus, nấm mốc: Asp niger, Furanium oxysporum, nấm men: Candida albicans Kết quả cho thấy đối với E coli thì mẫu thử của cao khô lá vối ủ có

tác dụng tốt nhất (nồng độ ức chế tối thiểu nhỏ nhất) Đối với tụ cầu vàng (S

aureus) cao khô lá vối cho tác dụng tốt hơn tinh dầu lá vối Đối với Bacteroides subtillis cả 4 mẫu thử đều cho tác dụng tốt (MIC = 50 μg/ml) còn đối với nấm

mốc thì cả 4 mẫu đều không có tác dụng Đối với nấm men thì chỉ có cao khô lá vối cho tác dụng [7]

Tinh dầu lá vối có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư gan, ung thư màng tử cung và ung thư màng tim….[7]

Dịch chiết lá vối ủ với 2 liều 10 g/kg và 20 g/kg thể trọng của chuột đều

có tác dụng lợi mật rõ rệt Liều 20 g/kg thể trọng chuột thì chế phẩm có tác dụng lợi mật lớn hơn 1,5 lần so với liều 10 g/kg thể trọng chuột [7]

Theo Trương Thị Tuyết Mai và các cộng sự đã thử nghiệm thành công khả năng chống oxy hóa của nụ vối trong ống nghiệm và trên chuột tiểu đường [14] Với kết quả của nghiên cho thấy bột chiết tách từ nụ vối có khả năng triệt tiêu gốc tự do là rất mạnh với giá trị IC50 nhỏ nhất là 22,9 mg/ml Và có hiệu quả chống oxy hóa, ức chế peroxy hóa lipid trên chuột đái tháo đường [14]

Byung Sun Min cùng với các cộng sự đã tách được 7 flavonoid (trình bày trong bảng 1.2) trong nụ vối được thu hái ở Việt Nam và chứng minh chỉ ra rằng các flavonoid đều có tác dụng chống ung thư [28]

b) Tác dụng của các flavonoid trong lá và nụ vối

Trước hết, các chất flavonoid là những chất oxy hóa chậm hay ngăn chặn quá trình oxy hóa do các gốc tự do, có thể là nguyên nhân làm cho tế bào hoạt động khác thường Các gốc tự do sinh ra trong quá trình trao đổi chất thường là các gốc tự do như OH•, ROO•, R•, O2

-•

, (là các yếu tố gây biến dị, hủy hoại tế bào, ung thư, tăng nhanh sự lão hóa,…) Thí nghiệm cho thấy khả năng dập tắt của một số flavonoid theo thứ tự: myricetin > quercetin > rhammetin > morin >

diosmetin > naringenin > apigenin > catechin> 5,7 dihydroxy-3',4',5' trimethoxy flavon > robinin > kaempferol > flavon [9]

Các flavonoid còn có khả tạo phức với các ion kim loại nên có tác dụng như những chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hóa Do đó, các chất flavonoid có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hóa, thoái hóa gan, tổn thương do bức xạ [17]

Thành phần của màng tế bào có các chất lipid dễ bị peroxyd hóa, tạo ra những sản phẩm làm rối loạn sự trao đổi chất cũng dẫn đến sự hủy hoại tế bào Đưa các chất chống oxi hóa như flavonoid vào cơ thể để bảo vệ tế bào thì có thể ngăn ngừa các nguy cơ như xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hóa, tổn thương do bức xạ, thoái hóa gan

Flavonoid còn có tác dụng bảo vệ hệ tim mạch, giảm nguy cơ tử vong do các bệnh lý tim mạch như thiếu máu cơ tim, đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim, xơ vữa động mạch,…nhờ khả năng chống oxy hóa không hoàn toàn cholesterol

Flavonoid cùng với acid ursolic tham gia trong quá trình hoạt động của enzym oxy hóa-khử Flavonoid còn ức chế tác động của hyaluronidazơ Enzym này làm tăng tính thẩm của mao mạch Khi enzym này thừa thì gây hiện tượng xuất huyết dưới da mà y học gọi là bệnh thiếu vitamin P (Pavitaminose)

Flavonoid được dùng trong các trường hợp rối loạn chức năng tĩnh mạch, tĩnh mạch suy yếu, giãn tĩnh mạch, trĩ, chảy máu do đặt vòng trong phụ khoa, các bệnh trong nhãn khoa như sung huyết kết mạc, rối loạn tuần hoàn võng mạc Các dẫn chất anthocyanozid có tác dụng tái tạo tế bào võng mạc và đã được chứng minh có tác dụng tăng thị lực vào ban đêm

Tác dụng chống độc của flavonoid thể hiện làm giảm thương tổn gan, bảo vệ được chức năng gan khi một số chất độc được đưa vào cơ thể súc vật thí

nghiệm (CCl4, benzen, etanol, CHCl3, quinin, novasenol…) Dưới tác dụng của flavonoid, ngưỡng ascorbic được ổn định đồng thời lượng glycogen trong gan tăng Sự tích lũy glycogen có ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao chức năng giải độc gan

Flavonoid thể hiện tác dụng chống co thắt những tổ chức cơ nhẵn (túi mật, ống dẫn mật, phế quản và một số tổ chức khác)

Tác dụng chống viêm của nhiều flavonoid thuộc các nhóm flavone, flavanon, dihydroflavonol, anthocyanin, flavan-3-ol, chalcone, isoflavone, biflavone, 4-arylcoumarin, 4-arylchroman đều được chứng minh bằng thực nghiệm do các chất flavonoid này ức chế con đường sinh tổng hợp prostagladin

Trên hệ tim mạch, nhiều flavonoid thuộc nhóm flavonol, flavan-3-ol, anthocyanin như quercetin, rutin, myricetin, pelargonin, hỗn hợp catechin của trà có tác dụng làm tăng biên độ co bóp và tăng thể tích phút của tim, thí nghiệm làm hồi phục tim khi bị ngộ độc bởi CHCl3, quinin, methanol, bình thường lại sự rối loạn nhịp

- Tác dụng ức chế sự phát triển của TB ung thư:

2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone phân lập từ nụ vối có tác dụng ức chế sự phát triển của

TB ung thư với các dòng TB ung thư khác nhau [29, 30, 35, 36]

- Tác dụng làm giảm đường huyết: tác dụng ức chế maltase đường ruột làm

giảm đường huyết trên chuột gây bệnh tiểu đường [45]

- Tác dụng chống oxy hóa: ức chế các enzym α-glucosidase [27]

- Tác dụng chống Alzheimer: các flavonoid như quercetin, kaempferol,

tamarixetin được phân lập từ nụ vối có tác dụng chống Alzheimer thông qua ức chế acetylcholinesterase và butyrylcholinesterase [43]

1.1.8 Ứng dụng

Lá và nụ vối từ lâu được nhân dân ta nấu nước uống thay trà, vừa thơm vừa có tác dụng tiêu cơm Lá vối tươi hay khô sắc đặc có tính chất kháng sinh sát trùng để rửa mụn nhọt, lở loét, ghẻ [4, 10]

Lá, vỏ thân, hoa chữa đầy bụng, khó tiêu, ỉa chảy, mụn nhọt, viêm đại tràng mạn, lị trực trùng [3, 4]

Ở Ấn Độ, rễ sắc đặc dạng siro dùng đắp vào khớp sưng đỏ, quả ăn trị phong thấp [4]

Ở Trung Quốc, các bộ phận của cây dùng trị cảm mạo, đau đầu phát sốt, lỵ trực khuẩn, viêm gan, mẩn ngứa, viêm tuyến sữa, ngứa ngáy ngoài da, nấm ở chân, vết thương [3, 4]

1.2 Các phương pháp định tính, định lượng flavonoid

1.2.1 Phương pháp định tính

a) Phương pháp ống nghiệm

Phản ứng với hơi amoniac

Nhiều flavonoid thay đổi màu khi gặp hơi NH3 Có thể quan sát sự biến

đổi màu này bằng mắt thường hoặc dưới ánh sáng tử ngoại [6]

Phản ứng với kiềm loãng

Cho dịch chiết flavonoid vào dung dịch kiềm nếu xuất hiện:

+ Nếu vàng: Nhóm flavone, flavonon + Màu đỏ: Nhóm isoflavanon

+ Màu tím: Nhóm chalcone + Màu xanh: antoxyanin

Phản ứng cyanidin (phản ứng Shinoda)

Phản ứng do sự có mặt nhân γ-penzopyron trong đa số flavonoid Thuốc thử là HCl đặc và bột Magie kim loại [6]

Phản ứng bằng thuốc thử Sibata và dung dịch H 2 SO 4 đậm đặc

Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài mililit H2SO4 đậm đặc, sau đó cho thêm 0,1 gam Mg, tiếp theo thêm từ từ rượu isoamylic theo thành ống nghiệm Đun nóng, có màu hồng từ từ xuất hiện rồi chuyển sang đỏ cam hoặc

đỏ tím [6]

Phản ứng với dung dịch sắt (III) clorid 5%

Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5%, lắc sẽ xuất hiện màu xanh đen

Hoàng Thị Lý đã định tính flavonoid bằng phản ứng hóa học và chỉ ra rằng flavonoid là nhóm chất chính trong nụ vối [13]

b) phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM)

SKLM là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di

chuyển qua pha tĩnh, trên đó ta đặt hỗn hợp các chất cần tách [23]

Pha tĩnh là chất hấp phụ được lựa chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính, phiến kim loại hoặc phiếm nhựa

Pha động là hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ thích hợp cho các yêu cầu phân tích

Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các thành phần trong hỗn hợp mẫu di chuyển trên lớp mỏng theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau tùy theo đặc điểm của chúng Kết quả ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng

Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tách là hệ

số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất thử

và khoảng cách di chuyển của dung môi R f = a : b

Trong đó: a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, cm b: là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết, cm

Rf có giá trị từ 0 đến 1 Vì vậy khi định tính các chất ta thường nên triển khai song song với chất chuẩn hoặc chất đối chiếu để định tính các chất thông qua

Rf

Trần Quang Vinh định tính flavonoid trong cây chùm ngây bằng hệ dung

môi khai triển n-butylacetat : nước : acid formic = 15: 5: 5 (v:v:v) được phát

hiện bằng UV-254nm, 366 nm và thuốc thử FeCl3, hơi NH3 [20]

Elisabetta Campeol đã tiến hành phân tích định tính flavonoid trong các

cây thực vật thuộc chi Vicia bằng TLC với hệ dung môi triển khai ethyacetat :

acid formic:acid acetic:nước = 10 : 1,1 : 1,1 : 2,7 (v:v:v:v) hoặc hệ toluen: ethylacetat: acid formic = 5 : 4 : 1 (v:v:v) [34]

Marica Medić-Šarić đã nghiên cứu về định tính flavonoid bằng TLC đã đưa ra được chín hệ dung môi triển khai được trình bày ở bảng 1.3 [40]

Bảng 1.3 Một số dung môi khai triển để phân tích flavonoid bằng TLC

1 Toluene:ethyl acetate:formic acid 36:12:5

2 Cyclohexane:ethyl acetate:formic acid 30:15:5

3 Toluene:ethyl acetate:acetic acid 36:12:5

4 Cyclohexane:ethyl acetate:acetic acid 31:14:5

6 Toluene:acetone:formic acid 38:10:5

8 Petroleum ether:ethyl acetate:formic acid 30:15:5

9 Carbon tetrachloride:acetone:formic acid 35:10:5

C đến khối lượng không đổi, cân

Hàm lượng flavonoid toàn phần trong dược liệu được tính theo công thức sau:

[flavonoid]tp(%) =

.(100% %)

m

m: khối lượng cắn flavonoid thu được (g)

a: Khối lượng dược liệu đem định lượng (g)

x%: Độ ẩm của dược liệu

Phương pháp này đơn giản nhưng sai số lớn vì ngoài flavonoid còn có rất nhiều chất khác cũng tan trong phân đoạn ethyl acetat như tritecpenoid, coumarin, các phenolic, các saponin có gắn ít đường…

b) Phương pháp trắc quang

Phương pháp này là phương pháp phổ hấp thụ của phân tử trong vùng UV-VIS Ở điều kiện thường, các phân tử, nhóm phân tử của chất bền vững và nghèo năng lượng Đây là trạng thái cơ bản, nhưng khi có một chùm sáng với

năng lượng thích hợp chiếu vào thì các điện tử hóa trị trong các liên kết (δ, Π, n) sẽ hấp thụ năng lượng chúm sáng, chuyển lên trạng thái kích thích với năng lượng cao hơn Hiệu số giữa hai mức năng lượng (cơ bản EO và kích thích Em) chính là năng lượng mà phân tử hấp thụ từ nguồn sáng để tạo ra phổ hấp thụ phân tử của chất [8, 12]

Nguyên tắc: Phương pháp xác định dựa trên việc đo độ hấp thụ ánh sáng

của một dung dịch phức tạo thành giữa chất cần xác định với thuốc thử vô cơ hay hữu cơ trong môi trường thích hợp khi được chiếu bởi chùm sáng Phương trình định lượng của phép đo dựa trên định luật Lamber-Beer: A = K.C

và là một trong những phương pháp được sử dụng khá phổ biến [8, 12]

Đối với flavonoid cho tạo màu khi phản ứng cyanidin, phản ứng kết hợp với muối diazoni, tạo phức màu với AlCl3, muối titan…[25]

Trần Quang Vinh xác định tổng hàm lượng flavonoid trong cây chùm ngây theo các giai đoạn phát triển Dựa vào phản ứng của quercetin với AlCl3 2% đo sự hấp thụ của dung dịch thu được tại bước sóng 415 nm [20]

Hàm lượng quercetin (Q%) trong dược liệu được tính bằng công thức:

Cc: Nồng độ (μg/ml) dung dịch chuẩn K: Độ pha loãng của mẫu thử Hàm lượng flavonoid toàn phần (F%) trong dược liệu được tính bằng công thức

F(%) = Q(%) x 2,51

2,51: Hệ số chuyển đổi từ flavonol sang flavonol glycosid (flavonoid)

Lui Alberto Lia SOARES và các cộng sự cũng đã dựa trên phản ứng tạo màu của flavonoid với AlCl3 2% và đem đo hấp thụ quang ở bước sóng 428

nm Xác định được tổng hàm lượng của flavonoid trong cây Diệp hạ châu [38]

Hàm lượng tổng flavonoid trong Tabernaemontana heyneana Wall Cũng

được tính theo chất chuẩn Rutin với điều kiện: Cho Rutin phản ứng tạo màu với AlCl3 10%+NaNO2 5%+H2O sau đó dung dịch thu được đem đo ở bước sóng

510 nm [44] Cũng với điều kiện như vậy Mudsir Sultana đã sử dụng Quercitin làm chất chuẩn và định lượng hàm lượng toàn phần flavonoid trong Ageratum Conyzoides là 1172,55 ± 17,69 mg [41]

Phương pháp trắc quang có độ nhạy, độ ổn định cũng như độ chính xác khá cao và là phương pháp được sử dụng phổ biến trong phân tích

c) Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp hóa lý dựa vào ái lực khác nhau của các chất khác nhau với hai pha luôn tiếp xúc và không đồng tan với nhau, một pha động và một pha tĩnh Pha động là chất lỏng chảy qua cột với một tốc độ nhất định, còn pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã được được phâ chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ Quá trình sắc ký xảy ra do các cơ chế: Hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc rây phân tử [11, 16]

Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột:

Pha tĩnh là yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quỏ trỡnh sắc ký và loại sắc ký Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ ta cú sắc ký hấp phụ, nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion ta cú sắc ký trao đổi ion, pha tĩnh là chất được gắn pha liờn kết ta cú sắc ký phõn bố, nếu pha tĩnh là gel ta cú sắc ký gel hay sắc ký rõy phõn tử Quyết định hiệu quả tỏch ở đõy là tổng hợp cỏc tương tỏc:

Pha tĩnh Pha động

F

2 1

3

Chất phân tích (A+ B+C)

Tổng của 3 tương tỏc này sẽ quyết định chất nào được rủa giải ra trước tiờn khi lực lưu giữ nhỏ nhất và ngược lại

Thời gian lưu của một chất là thời gian tớnh từ lỳc tiờm mẫu vào cột đến khi chất đú ra khỏi cột đạt giỏ trị cực đại cho pic trờn sắc ký đồ:

Hỡnh 1.2: Sắc ký đồ của hai chất và cỏc thụng số đặc trưng

Nếu gọi t R là thời gian lưu giữ của một chất thỡ : t R = t R - t o

Trong đú : t ’ R là thời gian lưu thực (thời gian lưu hiệu chỉnh)

t o là thời gian chết (thời gian không lưu giữ)

Khi pha động chảy qua cột với một tốc độ không thì thời gian lưu có thể thay thế bằng thể tích lưu Thể tích lưu là thể tích pha động thu được sau cột trong khoảng thời gian tương ứng với thời gian lưu [11, 16]

Hiện nay HPLC được ứng dụng vào việc phân tích định tính và định lượng các hợp chất thiên đang dần được phổ biến Flavonoid cũng được các nhà khoa học tại các trường đại học, các viện nghiên cứu phân tích rất nhiều bằng phương pháp HPLC

Năm 2005, L Tao và cộng sự Trường Đại Học Khoa Học và Công Nghệ Trung Quốc đã dùng HPLC xây dựng được phương pháp phân tích các flavonoid (Galangin và 3-O-methyl Galangin) trong thân rễ cây Riềng Với các điều kiện như sau: Sử dụng cột tách ZORBAX, Eclipe SB-C18, pha động được dùng là MeOH-H2O-H3PO4 với tỷ lệ 60:38:2 (v:v:v) Rửa rải theo phương pháp đẳng dòng với tốc độ 0,8 ml/phút Các flavonoid được phát tại bước sóng 254

nm, nhiệt độ cột tách 400C với thể tích tiêm 10μl [39]

Hoàng Thị Tuyết Nhung đã xây dựng được phương pháp phân tích định lượng Kaempferol (thuộc hợp chất flavonoid) trong cây Đơn đỏ bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với điều kiện: Cột RP18 (250mm x 4,6mm; 5μm), nhiệt độ cột 250C, pha động là hỗn hợp Methanol-dung dịch NaH2PO4 0,05M đã điều chỉnh với PH = 2 với acid H3PO4 (55:45); Dùng Detector tử ngoại khả kiến UV-VIS loại DDA, phát hiện ở bước sóng 362 nm; tốc độ dòng: 1,4ml/phút; Thể tích tiêm mẫu 20 μl [15]

C-L Ye và các cộng sự cũng đã phân tích đồng thời methyl-3',5' dimethyl chalcone và ursolic acid bằng HPLC Sử dụng cột tách

2',4'-dihydroxy-C18 với pha động MeOH-H2O/H3PO4 Các chất được phát hiện tại bước sóng 220nm [32].

Brás H de Oliveira và cộng sự đã phân tích định tính, định lượng đồng thời eupafolin và hispidulin trong cây Eupatorium littorale bằng HPLC với điều kiện: Cột Dynamax C18 (250mm x 4,6mm; 5μm) với pha động là hỗn hợp MeOH/H2O, tốc độ dòng 1 ml/min Detecter UV phát hiện ở bước sóng 339 nm [26]

James M.Harnly đã xác định hàm lượng của 20 flavonoid khác nhau trong 60 mẫu rau, quả và các loại hạt bằng HPLC với cột tách Zorbax Eclipse XDB-C18 (250mm x 4,6mm, 5μm) Pha động là hỗn hợp methanol + acetonitrile +trifluoroacetic với tốc độ dòng 1 ml/phút, rửa giải theo chương trình gradien Kết quả chỉ ra rằng các flavonoid cho hấp thụ cực đại tốt nhất trong khoảng từ 200 – 600 nm [37]

Cụ thể : Nhóm anthocyanidin hấp thụ tại bước sóng tại 210 nm

Nhóm flavon hấp thụ cực đại tại bước sóng tại 260 nm

Nhóm flavanon và flavan-3-ol hấp thụ cực đại tại bước sóng tại 278 nm Nhóm flavonol hấp thụ cực đại tại bước sóng tại 360 nm

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Nụ và lá vối nhà, Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr.et Perry thuộc

họ Sim (Myrtaceae) được thu hái ở các địa phương khác nhau, ở các tỉnh phía Bắc được trình bày ở bảng 2.1 Sau đó phơi và sấy ở 500C cho đến khô Các mẫu nụ và lá vối được lưu ở Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu Mỗi mẫu nụ và lá vối được lấy một lượng nhỏ nghiền thành bột mịn, đủ dùng cho việc nghiên cứu

Bảng 2.1: Bảng chi tiết mẫu nụ và lá Vối

1 Lá vối Việt Trì - Phú Thọ 15/3/2012 8,70

2 Lá vối Xuân Mai - Hòa Bình 20/4/2012 15,10

3 Lá vối Yên Dũng - Bắc Giang 25/4/2012 9,30

4 Lá vối Hà Đông – Hà Nội 17/4/2012 11,10

5 Lá vối Tiên Du – Bắc Ninh 12/4/2012 11,50

6 Lá vối Tiền Hải - Thái Bình 06/05/2012 10,90

7 Lá vối Đông triều – Quảng Ninh 15/4/2012 11,5

10 Nụ vối Hà Đông - Hà Nội 17/4/2012 7,65

11 Nụ vối Tp Hà Nam – Hà Nam 10/04/2012 8,00

12 Nụ vối Chợ Đồng Xuân – Hà Nội 27/04/2012 12,62

13 Nụ vối Chí Linh – Hải Dương 19/04/2012 6,77

14 Nụ vối Đồng Hỷ - Thái Nguyên 23/04/2012 7,85

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập một flavonoid chính từ nụ vối Tinh chế hoạt chất đạt độ tinh khiết cần thiết cho việc định tính, định lượng

- Xây dựng phương pháp định tính flavonoid từ lá và nụ vối

- Xây dựng phương pháp định lượng một flavonoid chính từ lá và nụ vối

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Chiết xuất, phân lập flavonoid chính

► Chiết xuất: Để chiết được nhóm chất chứa trong đối tượng nghiên cứu,

phải xây dựng được các quy trình chiết xuất thích hợp Tùy theo tính chất của mỗi chất mà sử dụng dung môi có độ phân cực khác nhau Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chiết xuất (chiết nguội, chiết nóng) để đảm bảo hợp lý cả hai yêu cầu: Chiết được tối đa lượng chất nghiên cứu và tối thiểu tạp chất để thuân tiện cho quá trình phâp và tinh chế tiếp theo [21]

Đối với hợp chất flavonoid: Sử dụng phương pháp ngâm lạnh hoặc chiết nóng với ethanol ở các độ cồn khác nhau

Chiết dược liệu (nụ vối) với dung môi là ethanol 96%, sau đó đem cất cô quay để thu hồi dung môi, ta thu được cắn tổng Hòa tan cắn tổng với lượng nước thích hợp rồi chiết từng phân đoạn với dung môi có độ phân cực tăng dần:

n-hexan, ethyl acetat, n-butanol ta thu được các phân đoạn cắn khác nhau

►Phân lập: Sử dụng sắc ký cột với các loại pha tĩnh hấp phụ (silica gel),

phân bố pha đảo (C18), thấm qua gel (Sephadex LH-20) Tùy theo từng chất mà chọn pha tĩnh thích hợp hoặc phải kết hợp sử dụng các pha tĩnh khác nhau Khảo sát lựa chọn dung môi rửa giải bằng TLC [47]

Phân lập flavonoid chính trong nụ vối bằng phương pháp sắc ký cột (Column Chromatography): pha tĩnh là silica gel, cỡ hạt 40-63 µm (Merck), pha

động là hệ dung môi hữu cơ có độ phân cực khác nhau (n-hexan, diclomethan,

ethyl acetat, aceton, methanol…)

2.3.2 Xác định cấu trúc chất phân lập

Kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, xác định cấu trúc chất phân lập thông qua phân tích tính chất hóa lý (cảm quan, nhiệt độ nóng chảy, năng suất quay cực) kết hợp với việc phân tích các phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR), khối phổ (MS) và so sánh với dữ liệu trong các tài liệu tham khảo

2.4 Xây dựng phương pháp định tính flavonoid trong nụ và lá vối

2.4.1 Định tính bằng phương pháp hóa học

Định tính flavonoid chính bằng các phản ứng hóa học thông thường [6]

+ Phản ứng với hơi amoniac

a Định tính bằng TLC

Khảo sát điều kiện phân tích định tính phù hợp áp dụng cho nhóm chất flavonoid trong nụ và lá vối, gồm có các yếu tố liên quan như: Cách xử lý mẫu, pha tĩnh, pha động, cách phát hiện…

Xử lý mẫu (chuẩn bị mẫu chấm sắc ký):

Một trong những ưu điểm của kỹ thuật TLC là loại sắc ký mở, có pha tĩnh là các bản mỏng chỉ dùng một lần Do vậy, việc xử lý mẫu không đòi hỏi khắt khe như các loại sắc ký cột khác Có thể tiến hành bằng phương pháp siêu

âm (sonicating) hoặc phương pháp chiết hồi lưu trên cách thủy với dung môi thích hợp Dung môi methanol đã được áp dụng phổ biến để chiết với đa số các thành phần hoạt chất Tuy nhiên, trong một số trường hợp cần thiết ta có thể áp

dụng chiết với các dung môi khác, với mục đích làm giàu thành phần nhóm chất, hoạt chất cần phân tích và loại bớt tạp chất gây cản trở cho việc tách và phát hiện nhóm chất, hoạt chất đó

Pha tĩnh:

Là bản mỏng silica gel GF254 Trước khi sử dụng, bản mỏng được sấy ở

105 – 1100C khoảng 30 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng

Pha động:

Tiến hành khảo sát lựa chọn hệ dung môi sắc ký phù hợp áp dụng cho việc tách thành phần nhóm chất flavonoid trong nụ và lá vối Tiến hành khảo sát dựa trên cơ sở tham khảo từ tài liệu về các hệ dung môi đã được áp dụng tách nhóm chất flavonoid Ta có thể điều chỉnh, thay đổi tỷ lệ hoặc thành phần dung môi cho phù hợp Bên cạnh đó, tiến hành khảo sát có dựa trên cơ sở tham khảo tính chất phân cực (có ảnh hưởng đến giá trị Rf của chất phân tích) và tính lựa chọn của mỗi loại dung môi (có ảnh hưởng đến sự thay đổi vị trí của các vết

trên sắc ký đồ) để lựa chọn

Triển khai sắc ký: Đặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình triển khai,

các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi khai triển (cách khoảng 5 mm) Đậy kín bình để nguyên ở nhiệt độ thường, không đổi Khi dung môi đã triển khai trên bản mỏng được một đoạn, lấy bản mỏng ra khỏi bình, đánh dấu mức dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại trên bản mỏng rồi hiện vết bằng cách phun thuốc thử

Kết quả là các sắc ký đồ TLC của flavonoid chính có giá trị hệ số di chuyển Rf (được tính bằng tỉ số giữa quãng đường đi được của chất cần phân tích và quãng đường pha động đi được)

b Định tính bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

HPLC được sử dụng kết hợp với TLC để kiểm tra sự có mặt của hợp chất

là đối tượng nghiên cứu ngay từ khâu định tính dược liệu và trong quá trình

chiết xuất bằng cách so sánh thời gian lưu t R, phổ sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu đối chiếu [1, 2]

2.5 Xây dựng phương pháp định lượng flavonoid trong nụ và lá vối

2.5.1 Định lượng flavonoid toàn phần bằng phương pháp trắc quang

Định lượng toàn phần flavonoid trong nụ và lá vối bằng phương pháp tắc quang: Thực hiện dựa trên phản ứng của flavonoid với AlCl3 sẽ tạo phức màu hồng có độ hấp thụ ánh sáng cực đại ở bước sóng 510 nm Đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 510 nm rồi tính ra hàm lượng flavonoid (tính theo chất

chuẩn CO-1 và catechin) tương đương với mẫu chuẩn làm cùng điều kiện

Khảo sát lựa chọn dung môi thích hợp trong việc định lượng flavonoid toàn phần

Dựa trên phản ứng tạo phức của flavonoid với thuốc thử tạo màu trong việc lựa chọn bước sóng xác định

Xây dựng phương pháp phân tích theo các chỉ tiêu:

Dựa trên công thức phân tử và cấu trúc hóa học của flavonoid chính chiết xuất được từ dược liệu nụ vối, để tìm các điều kiện sắc ký phù hợp như: Bản chất pha tĩnh, thành phần pha động, bước sóng phát hiện, tốc độ dòng pha động, thể tích tiêm mẫu, nồng độ dung dịch thử, dung môi pha mẫu

Xây dựng phương pháp phân tích theo các tiêu chỉ tiêu:

2.6 Một số đặc trưng thống kê để xử lý và đánh giá kết quả

Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phương pháp thống kê thông qua các đặc trưng sau:

- Giá trị trung bình: 



i i x n

1

n i

1

n i

2.7 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất, dung môi

2.7.1 Thiết bị, dụng cụ

- Cân kỹ thuật Precisa XT 620M

- Cân phân tích Precisa XT 220A

- Máy cất quay Buchi B481

- Máy UV-VIS 1800, dải đo 190 nm-900 nm, hãng Shimadzu (Nhật Bản)

2.7.2 Hóa chất, dung môi

- Dung môi: methanol, n-hexan, ethyl acetat, toluen… dùng cho sắc ký đạt

tiêu chuẩn phân tích, dung môi dùng trong chiết xuất đạt tiêu chuẩn công nghiệp được chưng cất lại trước khi dùng

- Bản sắc ký lớp mỏng tráng sẵn Silica gel GF254 (Merck)

- Silica gel sắc ký cột pha thường, cỡ hạt 40-63µm (Merck)

- Hóa chất: các hóa chất để làm các phản ứng định tính bằng phương pháp hóa học, định tính phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) và định lượng bằng phương pháp đo quang, HPLC