Dựng cỏc phƣơng phỏp sắc ký: Sắc ký bản mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để định tớnh nhúm chất flavonoid trong nụ và lỏ vối.
a. Định tớnh bằng TLC
Khảo sỏt điều kiện phõn tớch định tớnh phự hợp ỏp dụng cho nhúm chất flavonoid trong nụ và lỏ vối, gồm cú cỏc yếu tố liờn quan nhƣ: Cỏch xử lý mẫu, pha tĩnh, pha động, cỏch phỏt hiện…
Xử lý mẫu (chuẩn bị mẫu chấm sắc ký):
Một trong những ƣu điểm của kỹ thuật TLC là loại sắc ký mở, cú pha tĩnh là cỏc bản mỏng chỉ dựng một lần. Do vậy, việc xử lý mẫu khụng đũi hỏi khắt khe nhƣ cỏc loại sắc ký cột khỏc. Cú thể tiến hành bằng phƣơng phỏp siờu õm (sonicating) hoặc phƣơng phỏp chiết hồi lƣu trờn cỏch thủy với dung mụi thớch hợp. Dung mụi methanol đó đƣợc ỏp dụng phổ biến để chiết với đa số cỏc thành phần hoạt chất. Tuy nhiờn, trong một số trƣờng hợp cần thiết ta cú thể ỏp
dụng chiết với cỏc dung mụi khỏc, với mục đớch làm giàu thành phần nhúm chất, hoạt chất cần phõn tớch và loại bớt tạp chất gõy cản trở cho việc tỏch và phỏt hiện nhúm chất, hoạt chất đú.
Pha tĩnh:
Là bản mỏng silica gel GF254. Trƣớc khi sử dụng, bản mỏng đƣợc sấy ở 105 – 1100C khoảng 30 phỳt, để nguội đến nhiệt độ phũng.
Pha động:
Tiến hành khảo sỏt lựa chọn hệ dung mụi sắc ký phự hợp ỏp dụng cho việc tỏch thành phần nhúm chất flavonoid trong nụ và lỏ vối. Tiến hành khảo sỏt dựa trờn cơ sở tham khảo từ tài liệu về cỏc hệ dung mụi đó đƣợc ỏp dụng tỏch nhúm chất flavonoid. Ta cú thể điều chỉnh, thay đổi tỷ lệ hoặc thành phần dung mụi cho phự hợp. Bờn cạnh đú, tiến hành khảo sỏt cú dựa trờn cơ sở tham khảo tớnh chất phõn cực (cú ảnh hƣởng đến giỏ trị Rf của chất phõn tớch) và tớnh lựa chọn của mỗi loại dung mụi (cú ảnh hƣởng đến sự thay đổi vị trớ của cỏc vết trờn sắc ký đồ) để lựa chọn.
Triển khai sắc ký: Đặt bản mỏng gần nhƣ thẳng đứng với bỡnh triển khai,
cỏc vết chấm phải ở trờn bề mặt của lớp dung mụi khai triển (cỏch khoảng 5 mm). Đậy kớn bỡnh để nguyờn ở nhiệt độ thƣờng, khụng đổi. Khi dung mụi đó triển khai trờn bản mỏng đƣợc một đoạn, lấy bản mỏng ra khỏi bỡnh, đỏnh dấu mức dung mụi, làm bay hơi dung mụi cũn đọng lại trờn bản mỏng rồi hiện vết bằng cỏch phun thuốc thử.
Kết quả là cỏc sắc ký đồ TLC của flavonoid chớnh cú giỏ trị hệ số di chuyển Rf (đƣợc tớnh bằng tỉ số giữa quóng đƣờng đi đƣợc của chất cần phõn tớch và quóng đƣờng pha động đi đƣợc)
HPLC đƣợc sử dụng kết hợp với TLC để kiểm tra sự cú mặt của hợp chất là đối tƣợng nghiờn cứu ngay từ khõu định tớnh dƣợc liệu và trong quỏ trỡnh chiết xuất bằng cỏch so sỏnh thời gian lƣu tR, phổ sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu đối chiếu [1, 2].