1.2.1 Phƣơng phỏp định tớnh
a) Phương phỏp ống nghiệm Phản ứng với hơi amoniac
Nhiều flavonoid thay đổi màu khi gặp hơi NH3. Cú thể quan sỏt sự biến đổi màu này bằng mắt thƣờng hoặc dƣới ỏnh sỏng tử ngoại [6].
Phản ứng với kiềm loóng.
Cho dịch chiết flavonoid vào dung dịch kiềm nếu xuất hiện: + Nếu vàng: Nhúm flavone, flavonon
+ Màu đỏ: Nhúm isoflavanon + Màu tớm: Nhúm chalcone + Màu xanh: antoxyanin
Phản ứng cyanidin (phản ứng Shinoda).
Phản ứng do sự cú mặt nhõn γ-penzopyron trong đa số flavonoid. Thuốc thử là HCl đặc và bột Magie kim loại [6].
Phản ứng bằng thuốc thử Sibata và dung dịch H2SO4 đậm đặc
Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thờm vài mililit H2SO4 đậm đặc, sau đú cho thờm 0,1 gam Mg, tiếp theo thờm từ từ rƣợu isoamylic theo thành ống nghiệm. Đun núng, cú màu hồng từ từ xuất hiện rồi chuyển sang đỏ cam hoặc đỏ tớm [6].
Phản ứng với dung dịch sắt (III) clorid 5%.
Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thờm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5%, lắc sẽ xuất hiện màu xanh đen.
Hoàng Thị Lý đó định tớnh flavonoid bằng phản ứng húa học và chỉ ra rằng flavonoid là nhúm chất chớnh trong nụ vối [13].
b) phương phỏp sắc ký lớp mỏng (SKLM)
SKLM là một kỹ thuật tỏch cỏc chất đƣợc tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh, trờn đú ta đặt hỗn hợp cỏc chất cần tỏch [23].
Pha tĩnh là chất hấp phụ đƣợc lựa chọn phự hợp theo từng yờu cầu phõn tớch, đƣợc trải thành lớp mỏng đồng nhất và đƣợc cố định trờn cỏc phiến kớnh, phiến kim loại hoặc phiếm nhựa.
Pha động là hệ dung mụi đơn hoặc đa thành phần đƣợc trộn với nhau theo tỷ lệ thớch hợp cho cỏc yờu cầu phõn tớch.
Trong quỏ trỡnh di chuyển qua lớp hấp phụ, cỏc thành phần trong hỗn hợp mẫu di chuyển trờn lớp mỏng theo hƣớng pha động, với những tốc độ khỏc nhau tựy theo đặc điểm của chỳng. Kết quả ta thu đƣợc một sắc ký đồ trờn lớp mỏng.
Đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ di chuyển của cỏc chất phõn tỏch là hệ số di chuyển Rf đƣợc tớnh bằng tỷ lệ giữa khoảng cỏch di chuyển của chất thử và khoảng cỏch di chuyển của dung mụi. Rf = a : b
Trong đú: a là khoảng cỏch từ điểm xuất phỏt đến tõm của vết mẫu thử, cm. b: là khoảng cỏch từ điểm xuất phỏt đến mức dung mụi đo trờn cựng đƣờng đi của vết, cm.
Rf cú giỏ trị từ 0 đến 1. Vỡ vậy khi định tớnh cỏc chất ta thƣờng nờn triển khai song song với chất chuẩn hoặc chất đối chiếu để định tớnh cỏc chất thụng qua Rf.
Trần Quang Vinh định tớnh flavonoid trong cõy chựm ngõy bằng hệ dung mụi khai triển n-butylacetat : nƣớc : acid formic = 15: 5: 5 (v:v:v) đƣợc phỏt hiện bằng UV-254nm, 366 nm và thuốc thử FeCl3, hơi NH3 [20].
Elisabetta Campeol đó tiến hành phõn tớch định tớnh flavonoid trong cỏc cõy thực vật thuộc chi Vicia bằng TLC với hệ dung mụi triển khai ethyacetat : acid formic:acid acetic:nƣớc = 10 : 1,1 : 1,1 : 2,7 (v:v:v:v) hoặc hệ toluen: ethylacetat: acid formic = 5 : 4 : 1 (v:v:v) [34].
Marica Medić-Šarić đó nghiờn cứu về định tớnh flavonoid bằng TLC đó đƣa ra đƣợc chớn hệ dung mụi triển khai đƣợc trỡnh bày ở bảng 1.3 [40].
Bảng 1.3. Một số dung mụi khai triển để phõn tớch flavonoid bằng TLC
STT Hệ dung mụi Tỷ lệ (v:v:v)
1 Toluene:ethyl acetate:formic acid 36:12:5 2 Cyclohexane:ethyl acetate:formic acid 30:15:5 3 Toluene:ethyl acetate:acetic acid 36:12:5 4 Cyclohexane:ethyl acetate:acetic acid 31:14:5 5 n-hexane:ethyl acetate:formic acid 31:14:5 6 Toluene:acetone:formic acid 38:10:5 7 n-hexane:ethyl acetate:acetic acid 31:14:5 8 Petroleum ether:ethyl acetate:formic acid 30:15:5 9 Carbon tetrachloride:acetone:formic acid 35:10:5
1.2.2 Phƣơng phỏp định lƣợng flavonoid
a) Phương phỏp cõn: Ứng dụng khi nguyờn liệu giàu cú flavone hoặc flavonol và dịch chất ớt tạp chất [5, 18].
Cõn chớnh xỏc khoảng 50 g bột dƣợc liệu, xỏc định độ ẩm, cho vào tỳi giấy lọc rồi cho vào dụng cụ Shoxlet. Thờm perthroether và chiết trong 8 giờ để loại chất bộo, chất màu. Sau đú, lấy tỳi lọc ra cho bay hơi hết perthoether, tiếp tục cho tỳi dƣợc liệu vào dụng cụ chiết Shoxlet và chiết flavonoid toàn phần bằng methanol đến khi dịch chiết cuối cựng hết phản ứng của flavonoid (khụng cho phản ứng với thuốc thử cyanidin). Cụ dịch chiết methanol dƣới ỏp suất giảm đến cắn. Hũa tan cắn trong 100 ml nƣớc cất núng, để nguội. Lắc nhiều lần với ethyl acetat cho đến kiệt flavonoid. Cất thu hồi dung mụi đƣợc cắn, sấy ở 800
C đến khối lƣợng khụng đổi, cõn.
Hàm lƣợng flavonoid toàn phần trong dƣợc liệu đƣợc tớnh theo cụng thức sau: [flavonoid]tp(%) =
.(100% %)
m
a x x100%
m: khối lƣợng cắn flavonoid thu đƣợc (g) a: Khối lƣợng dƣợc liệu đem định lƣợng (g) x%: Độ ẩm của dƣợc liệu.
Phƣơng phỏp này đơn giản nhƣng sai số lớn vỡ ngoài flavonoid cũn cú rất nhiều chất khỏc cũng tan trong phõn đoạn ethyl acetat nhƣ tritecpenoid, coumarin, cỏc phenolic, cỏc saponin cú gắn ớt đƣờng…
b) Phƣơng phỏp trắc quang
Phƣơng phỏp này là phƣơng phỏp phổ hấp thụ của phõn tử trong vựng UV-VIS. Ở điều kiện thƣờng, cỏc phõn tử, nhúm phõn tử của chất bền vững và nghốo năng lƣợng. Đõy là trạng thỏi cơ bản, nhƣng khi cú một chựm sỏng với
năng lƣợng thớch hợp chiếu vào thỡ cỏc điện tử húa trị trong cỏc liờn kết (δ, Π, n) sẽ hấp thụ năng lƣợng chỳm sỏng, chuyển lờn trạng thỏi kớch thớch với năng lƣợng cao hơn. Hiệu số giữa hai mức năng lƣợng (cơ bản EO và kớch thớch Em) chớnh là năng lƣợng mà phõn tử hấp thụ từ nguồn sỏng để tạo ra phổ hấp thụ phõn tử của chất [8, 12].
Nguyờn tắc: Phƣơng phỏp xỏc định dựa trờn việc đo độ hấp thụ ỏnh sỏng
của một dung dịch phức tạo thành giữa chất cần xỏc định với thuốc thử vụ cơ hay hữu cơ trong mụi trƣờng thớch hợp khi đƣợc chiếu bởi chựm sỏng. Phƣơng trỡnh định lƣợng của phộp đo dựa trờn định luật Lamber-Beer: A = K.C
Trong đú: A: Độ hấp thụ quang K: Hằng số thực nghiệm C: Nồng độ chất phõn tớch
Phƣơng phỏp này cho phộp xỏc định nồng độ chất ở khoảng 10-5
– 10-7M và là một trong những phƣơng phỏp đƣợc sử dụng khỏ phổ biến [8, 12].
Đối với flavonoid cho tạo màu khi phản ứng cyanidin, phản ứng kết hợp với muối diazoni, tạo phức màu với AlCl3, muối titan…[25].
Trần Quang Vinh xỏc định tổng hàm lƣợng flavonoid trong cõy chựm ngõy theo cỏc giai đoạn phỏt triển. Dựa vào phản ứng của quercetin với AlCl3 2% đo sự hấp thụ của dung dịch thu đƣợc tại bƣớc súng 415 nm [20].
Hàm lƣợng quercetin (Q%) trong dƣợc liệu đƣợc tớnh bằng cụng thức:
Q(% ) = * *
* *100(100 )
At Cc K
Ac a h
Trong đú:
Ac: Độ hấp thụ của dung dịch chuẩn. a: Khối lƣợng dƣợc liệu (g). At: Độ hấp thụ của dung dịch thử. h: Hàm lƣợng ẩm của dƣợc liệu
Cc: Nồng độ (μg/ml) dung dịch chuẩn K: Độ pha loóng của mẫu thử Hàm lƣợng flavonoid toàn phần (F%) trong dƣợc liệu đƣợc tớnh bằng cụng thức
F(%) = Q(%) x 2,51
2,51: Hệ số chuyển đổi từ flavonol sang flavonol glycosid (flavonoid).
Lui Alberto Lia SOARES và cỏc cộng sự cũng đó dựa trờn phản ứng tạo màu của flavonoid với AlCl3 2% và đem đo hấp thụ quang ở bƣớc súng 428 nm. Xỏc định đƣợc tổng hàm lƣợng của flavonoid trong cõy Diệp hạ chõu [38].
Hàm lƣợng tổng flavonoid trong Tabernaemontana heyneana Wall. Cũng đƣợc tớnh theo chất chuẩn Rutin với điều kiện: Cho Rutin phản ứng tạo màu với AlCl3 10%+NaNO2 5%+H2O sau đú dung dịch thu đƣợc đem đo ở bƣớc súng 510 nm [44]. Cũng với điều kiện nhƣ vậy Mudsir Sultana đó sử dụng Quercitin làm chất chuẩn và định lƣợng hàm lƣợng toàn phần flavonoid trong Ageratum Conyzoides là 1172,55 ± 17,69 mg [41].
Phƣơng phỏp trắc quang cú độ nhạy, độ ổn định cũng nhƣ độ chớnh xỏc khỏ cao và là phƣơng phỏp đƣợc sử dụng phổ biến trong phõn tớch.
c) Phƣơng phỏp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phƣơng phỏp húa lý dựa vào ỏi lực khỏc nhau của cỏc chất khỏc nhau với hai pha luụn tiếp xỳc và khụng đồng tan với nhau, một pha động và một pha tĩnh. Pha động là chất lỏng chảy qua cột với một tốc độ nhất định, cũn pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đó đƣợc đƣợc phõ chia dƣới dạng tiểu phõn hoặc một chất lỏng phủ lờn một chất mang rắn hay một chất mang đó đƣợc biến đổi bằng liờn kết húa học với cỏc nhúm hữu cơ. Quỏ trỡnh sắc ký xảy ra do cỏc cơ chế: Hấp phụ, phõn bố, trao đổi ion hoặc rõy phõn tử [11, 16].
Pha tĩnh là yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quỏ trỡnh sắc ký và loại sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ ta cú sắc ký hấp phụ, nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion ta cú sắc ký trao đổi ion, pha tĩnh là chất đƣợc gắn pha liờn kết ta cú sắc ký phõn bố, nếu pha tĩnh là gel ta cú sắc ký gel hay sắc ký rõy phõn tử. Quyết định hiệu quả tỏch ở đõy là tổng hợp cỏc tƣơng tỏc:
Pha tĩnh Pha động F 2 1 3 F F Chất phân tích (A+ B+C)
Tổng của 3 tƣơng tỏc này sẽ quyết định chất nào đƣợc rủa giải ra trƣớc tiờn khi lực lƣu giữ nhỏ nhất và ngƣợc lại.
Thời gian lƣu của một chất là thời gian tớnh từ lỳc tiờm mẫu vào cột đến khi chất đú ra khỏi cột đạt giỏ trị cực đại cho pic trờn sắc ký đồ:
Hỡnh 1.2: Sắc ký đồ của hai chất và cỏc thụng số đặc trƣng
Nếu gọi tR là thời gian lƣu giữ của một chất thỡ : tR = tR - to
to là thời gian chết (thời gian khụng lƣu giữ).
Khi pha động chảy qua cột với một tốc độ khụng thỡ thời gian lƣu cú thể thay thế bằng thể tớch lƣu. Thể tớch lƣu là thể tớch pha động thu đƣợc sau cột trong khoảng thời gian tƣơng ứng với thời gian lƣu [11, 16].
Hiện nay HPLC đƣợc ứng dụng vào việc phõn tớch định tớnh và định lƣợng cỏc hợp chất thiờn đang dần đƣợc phổ biến. Flavonoid cũng đƣợc cỏc nhà khoa học tại cỏc trƣờng đại học, cỏc viện nghiờn cứu phõn tớch rất nhiều bằng phƣơng phỏp HPLC.
Năm 2005, L. Tao và cộng sự Trƣờng Đại Học Khoa Học và Cụng Nghệ Trung Quốc đó dựng HPLC xõy dựng đƣợc phƣơng phỏp phõn tớch cỏc flavonoid (Galangin và 3-O-methyl Galangin) trong thõn rễ cõy Riềng. Với cỏc điều kiện nhƣ sau: Sử dụng cột tỏch ZORBAX, Eclipe SB-C18, pha động đƣợc dựng là MeOH-H2O-H3PO4 với tỷ lệ 60:38:2 (v:v:v). Rửa rải theo phƣơng phỏp đẳng dũng với tốc độ 0,8 ml/phỳt. Cỏc flavonoid đƣợc phỏt tại bƣớc súng 254 nm, nhiệt độ cột tỏch 400C với thể tớch tiờm 10μl [39].
Hoàng Thị Tuyết Nhung đó xõy dựng đƣợc phƣơng phỏp phõn tớch định lƣợng Kaempferol (thuộc hợp chất flavonoid) trong cõy Đơn đỏ bằng phƣơng phỏp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với điều kiện: Cột RP18 (250mm x 4,6mm; 5μm), nhiệt độ cột 250C, pha động là hỗn hợp Methanol-dung dịch NaH2PO4 0,05M đó điều chỉnh với PH = 2 với acid H3PO4 (55:45); Dựng Detector tử ngoại khả kiến UV-VIS loại DDA, phỏt hiện ở bƣớc súng 362 nm; tốc độ dũng: 1,4ml/phỳt; Thể tớch tiờm mẫu 20 μl [15].
C-L Ye và cỏc cộng sự cũng đó phõn tớch đồng thời 2',4'-dihydroxy- methyl-3',5' dimethyl chalcone và ursolic acid bằng HPLC. Sử dụng cột tỏch
C18 với pha động MeOH-H2O/H3PO4. Cỏc chất đƣợc phỏt hiện tại bƣớc súng 220nm [32].
Brỏs H .de Oliveira và cộng sự đó phõn tớch định tớnh, định lƣợng đồng thời eupafolin và hispidulin trong cõy Eupatorium littorale bằng HPLC với điều kiện: Cột Dynamax C18 (250mm x 4,6mm; 5μm) với pha động là hỗn hợp MeOH/H2O, tốc độ dũng 1 ml/min. Detecter UV phỏt hiện ở bƣớc súng 339 nm [26].
James M.Harnly đó xỏc định hàm lƣợng của 20 flavonoid khỏc nhau trong 60 mẫu rau, quả và cỏc loại hạt bằng HPLC với cột tỏch Zorbax Eclipse XDB-C18 (250mm x 4,6mm, 5μm). Pha động là hỗn hợp methanol + acetonitrile +trifluoroacetic với tốc độ dũng 1 ml/phỳt, rửa giải theo chƣơng trỡnh gradien. Kết quả chỉ ra rằng cỏc flavonoid cho hấp thụ cực đại tốt nhất trong khoảng từ 200 – 600 nm [37].
Cụ thể : Nhúm anthocyanidin hấp thụ tại bƣớc súng tại 210 nm Nhúm flavon hấp thụ cực đại tại bƣớc súng tại 260 nm
Nhúm flavanon và flavan-3-ol hấp thụ cực đại tại bƣớc súng tại 278 nm Nhúm flavonol hấp thụ cực đại tại bƣớc súng tại 360 nm
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiờn cứu
Nụ và lỏ vối nhà, Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr.et Perry thuộc họ Sim (Myrtaceae) đƣợc thu hỏi ở cỏc địa phƣơng khỏc nhau, ở cỏc tỉnh phớa Bắc đƣợc trỡnh bày ở bảng 2.1. Sau đú phơi và sấy ở 500C cho đến khụ. Cỏc mẫu nụ và lỏ vối đƣợc lƣu ở Khoa Húa phõn tớch - Tiờu chuẩn, Viện Dƣợc liệu. Mỗi mẫu nụ và lỏ vối đƣợc lấy một lƣợng nhỏ nghiền thành bột mịn, đủ dựng cho việc nghiờn cứu
Bảng 2.1: Bảng chi tiết mẫu nụ và lỏ Vối
STT Tờn mẫu Nơi lấy mẫu Ngày lấy mẫu Độ ẩm (%)
1 Lỏ vối Việt Trỡ - Phỳ Thọ 15/3/2012 8,70 2 Lỏ vối Xuõn Mai - Hũa Bỡnh 20/4/2012 15,10 3 Lỏ vối Yờn Dũng - Bắc Giang 25/4/2012 9,30 4 Lỏ vối Hà Đụng – Hà Nội 17/4/2012 11,10 5 Lỏ vối Tiờn Du – Bắc Ninh 12/4/2012 11,50 6 Lỏ vối Tiền Hải - Thỏi Bỡnh 06/05/2012 10,90 7 Lỏ vối Đụng triều – Quảng Ninh 15/4/2012 11,5
8 Nụ vối Hƣng Yờn 17/3/2012 11,18
9 Nụ vối Nam Định 12/3/2012 11,14
10 Nụ vối Hà Đụng - Hà Nội 17/4/2012 7,65 11 Nụ vối Tp Hà Nam – Hà Nam 10/04/2012 8,00 12 Nụ vối Chợ Đồng Xuõn – Hà Nội 27/04/2012 12,62 13 Nụ vối Chớ Linh – Hải Dƣơng 19/04/2012 6,77 14 Nụ vối Đồng Hỷ - Thỏi Nguyờn 23/04/2012 7,85
2.2 Nội dung nghiờn cứu
- Phõn lập một flavonoid chớnh từ nụ vối. Tinh chế hoạt chất đạt độ tinh khiết cần thiết cho việc định tớnh, định lƣợng.
- Xõy dựng phƣơng phỏp định tớnh flavonoid từ lỏ và nụ vối.
- Xõy dựng phƣơng phỏp định lƣợng một flavonoid chớnh từ lỏ và nụ vối.
2.3 Phƣơng phỏp nghiờn cứu
2.3.1 Chiết xuất, phõn lập flavonoid chớnh
► Chiết xuất: Để chiết đƣợc nhúm chất chứa trong đối tƣợng nghiờn cứu,
phải xõy dựng đƣợc cỏc quy trỡnh chiết xuất thớch hợp. Tựy theo tớnh chất của mỗi chất mà sử dụng dung mụi cú độ phõn cực khỏc nhau. Khảo sỏt sự ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quỏ trỡnh chiết xuất (chiết nguội, chiết núng) để đảm bảo hợp lý cả hai yờu cầu: Chiết đƣợc tối đa lƣợng chất nghiờn cứu và tối thiểu tạp chất để thuõn tiện cho quỏ trỡnh phõp và tinh chế tiếp theo [21].
Đối với hợp chất flavonoid: Sử dụng phƣơng phỏp ngõm lạnh hoặc chiết núng với ethanol ở cỏc độ cồn khỏc nhau.
Chiết dƣợc liệu (nụ vối) với dung mụi là ethanol 96%, sau đú đem cất cụ quay để thu hồi dung mụi, ta thu đƣợc cắn tổng. Hũa tan cắn tổng với lƣợng nƣớc thớch hợp rồi chiết từng phõn đoạn với dung mụi cú độ phõn cực tăng dần:
n-hexan, ethyl acetat, n-butanol ta thu đƣợc cỏc phõn đoạn cắn khỏc nhau.
►Phõn lập: Sử dụng sắc ký cột với cỏc loại pha tĩnh hấp phụ (silica gel),
phõn bố pha đảo (C18), thấm qua gel (Sephadex LH-20). Tựy theo từng chất mà chọn pha tĩnh thớch hợp hoặc phải kết hợp sử dụng cỏc pha tĩnh khỏc nhau. Khảo sỏt lựa chọn dung mụi rửa giải bằng TLC [47].
Phõn lập flavonoid chớnh trong nụ vối bằng phƣơng phỏp sắc ký cột (Column Chromatography): pha tĩnh là silica gel, cỡ hạt 40-63 àm (Merck), pha động là hệ dung mụi hữu cơ cú độ phõn cực khỏc nhau (n-hexan, diclomethan, ethyl acetat, aceton, methanol…).
2.3.2 Xỏc định cấu trỳc chất phõn lập
Kiểm tra độ tinh khiết bằng phƣơng phỏp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, xỏc định cấu trỳc chất phõn lập thụng qua phõn tớch tớnh chất húa lý (cảm quan, nhiệt độ núng chảy, năng suất quay cực) kết hợp với việc phõn tớch cỏc phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hƣởng từ hạt nhõn (1H-NMR và 13C-NMR), khối phổ (MS) và so sỏnh với dữ liệu trong cỏc tài liệu tham khảo.
2.4 Xõy dựng phƣơng phỏp định tớnh flavonoid trong nụ và lỏ vối