3.2.1 Định tớnh bằng phản ứng húa học
Lấy 2 g bột dƣợc liệu (nụ, lỏ vối) cho vào bỡnh nún, chiết siờu õm với 20ml ethanol 900 trong 30 phỳt, lọc lấy dịch lọc. Dựng dịch lọc để làm cỏc phản ứng định tớnh.
Nhỏ vài giọt dung dịch chiết lờn miếng giấy lọc, để khụ rồi hơ lờn miệng lọ amoniac đặc, quan sỏt sự thay đổi màu của vết chất thấy vết chất chuyển từ vàng sang vàng đậm.
Kết luận: Cú flavonoid
Phản ứng với kiềm loóng.
Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, nhỏ vài giọt dung dịch natri hydroxid 10%, lắc, dung dịch trong ống nghiệm chuyển màu vàng, sau xuất hiện tủa vàng.
Kết luận: Cú flavonoid
Phản ứng cyanidin (phản ứng Shinoda).
Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thờm ớt bột magie kim loại, rồi nhỏ từ từ vài giọt dung dịch acid hydroclorid đậm đặc. Sau vài phỳt dung dịch xuất hiện màu hồng.
Kết luận: Cú flavonoid
Phản ứng với dung dịch sắt(III) clorid 5%.
Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thờm vài giọt dung dịch sắt(III)clorid 5%, lắc sẽ xuất hiện màu xanh đen.
Kết luận: Cú flavonoid
Dựa trờn cỏc tài liệu tham khảo, cỏc cụng trỡnh nghiờn cứu định tớnh flavonoid của cỏc nhà khoa học ở cỏc Trƣờng đại học, cỏc Viện nghiờn cứu ở trong nƣớc và trờn thế giới. Trong luận văn này khẳng định lại một lần nữa cỏc hợp chất vụ cơ nhƣ NH3, NaOH, FeCl3…luụn là những thuốc thử cho phản ứng rất nhạy, tạo màu đặc trƣng cho việc phỏt hiện flavonoid trong thực vật.
3.2.2 Định tớnh bằng TLC
a) Chuẩn bị mẫu chấm sắc ký
Dung dịch thử: Lấy 1 gam bột dƣợc liệu (nụ, lỏ vối) cho vào bỡnh nún, thờm 50 ml methanol (MeOH) rồi đem siờu õm 30 phỳt, lọc qua giấy lọc, dịch lọc để làm cỏc phộp định tớnh.
Dung dịch đối chiếu: Dung dịch flavonoid chớnh (tỏch đƣợc ở nụ vối)
trong MeOH (hàm lƣợng khoảng 1 mg/ml).
Đƣa chất phõn tớch lờn bản mỏng: Lƣợng mẫu cần đƣa lờn bản mỏng là khoảng 10 μl dung dịch đó pha ở trờn. Cỏc vết chấm cựng trờn một đƣờng xuất phỏt cỏch mộp dƣới của bản mỏng 1,5 cm, đƣờng kớnh vết chấm 3-5 mm và cỏch nhau 15 mm, hai vết chấm ngoài cựng của bản mỏng cỏch mộp ngoài khoảng 1cm.
b) Hệ dung mụi sắc ký: Tiến hành khảo sỏt triển khai sắc ký cho cỏc hệ
dung mụi sau: Hệ 1: Toluen:EtOAc:Aceton:Acid formic =5:2:2:1 (v:v:v )
Hệ 2: EtOAc:Acid acetic:Acid formic:Nƣớc =10:1:1:2 (v:v:v:v ) Hệ 3: n-Hexan : EtOAc : Acid formic =6:3:0,1 (v:v:v )
Hệ 4: EtOAc : Toluen : Acid formic : Nƣớc = 7:3:1,5:1 (v:v:v) Tiến hành triển khai sắc ký lỏ, nụ vối và chất rắn CO-1. Qua khảo sỏt cỏc hệ dung mụi ở trờn, chỳng tụi thấy với hệ 3 cho kết quả sắc ký đồ tỏch tốt nhất (hỡnh 3.5A) nờn dựng hệ 3 làm hệ dung mụi khai triển.
Tiến hành triển khai chạy sắc ký dịch chiết của nụ, lỏ và chất đối chiếu
CO-1 trờn cựng bản mỏng. Sau đú chỳng tụi tiến hành soi ở cỏc bƣớc súng UV- 254 nm, UV-366 nm và ỏnh sỏng trắng.
Hỡnh 3.5A: Sắc ký đồ định tớnh flavonoid trong nụ và lỏ vối
C: Chất chuẩn CO-1 N: Nụ vối L: Lỏ vối A: UV-254nm
B: Ánh sỏng trắng (trƣớc khi phun thuốc thử) C: UV- 366nm
D: Ánh sỏng trắng (sau khi phun thuốc thử) E: UV-366 sau khi phun thuốc thử
Cỏc sắc ký đồ hỡnh (A,B,C) cho thấy flavonoid trong nụ, lỏ vối cho cỏc vết màu đen xỏm khi soi dƣới UV-254 nm và UV-366 nm. Sau khi phun thuốc thử H2SO4 10%/ethanol và sấy ở 1050C, ở miền ỏnh sỏng trắng cho cỏc vết cú màu vàng (Rf =0,47) đặc trƣng của flavonoid.
Với thuốc thử acid boric/acid oxalix với tỷ lệ 2:1 cho ta kết quả sắc ký đồ ở hỡnh D, E nhƣ sau: Cũng cho một vệt xỏm đen khi soi ở bƣớc súng UV-366 nm, Sau khi sấy ở 1050C cho ta một vết màu vàng (Rf = 0,47) đặc trƣng của flavonoid.
Nhƣ vậy cú thể sử dụng hệ 3 làm hệ dung mụi cho việc triển khai sắc ký để định tớnh flavonoid trong việc xõy dựng tiờu chuẩn cơ sở cho dƣợc liệu nụ, lỏ vối.
a) Chuẩn bị dịch chấm sắc ký: hũa tan một ớt cao đặc nụ vối và cao phõn đoạn EtOAc trong MeOH.
Dựng bản mỏng silica gel 60F254 đó trỏng sẵn và hoạt húa ở 110oC/ 60 phỳt.
b) Hệ dung mụi khai triển:
Hệ 1: Toluen : EtOAc : Aceton : Acid formic = 5:2:2:1 (v:v:v ) Hệ 2: EtOAc : Acid acetic : Acid formic : Nƣớc = 10:1:1:2 (v:v:v ) Hệ 3: Toluen : EtOAc : Acid formic = 6:4:1 (v:v:v )
Hệ 4: EtOAc : Toluen : Acid formic : Nƣớc = 7:3:1,5:1 (v:v:v ) Qua khảo sỏt cỏc hệ dung mụi khỏc nhau, hệ dung mụi 3 cho kết quả tỏch cỏc chất cú trong cao EtOAC của nụ vối là tốt nhất. Cho nờn dựng hệ 3 làm hệ dung mụi khai triển và kết quả đƣợc trỡnh bày ở hỡnh 3.5B và bảng 3.3.
A B C D
Hỡnh 3.5B: Sắc ký đồ định tớnh flavonoid trong cao ETOAC
1: Cao tổng nụ vối. 2: Cao phõn đoạn EtOAc nụ vối (A). Quan sỏt ở UV 254nm (B).Quan sỏt ở UV 365nm
Bảng 3.3. Kết quả SKLM cao phõn đoạn EtOAc TT Rf x 100 Màu sắc UV 254 nm UV 365 nm AS thƣờng (Hơ amoniac) AS thƣờng H2SO4/cồn
1 89,7 Nõu đậm Lam đậm Cam nhạt Nõu nhạt
2 76,9 Nõu nhạt Xanh nhạt Tớm đậm
3 69,2 Nõu nhạt Xanh nhạt Tớm nhạt
4 64,1 Nõu đậm Xanh sỏng Tớm nhạt
5 53,8 Nõu đậm Xanh sỏng Tớm nhạt
6 46,1 Nõu nhạt Lam nhạt Tớm nhạt
7 39,2 Nõu nhạt Nõu nhạt Nõu nhạt
8 37,2 Nõu nhạt
9 24,4 Nõu nhạt Lam nhạt Nõu nhạt
10 19,2 Nõu nhạt Xanh sỏng Tớm nhạt Tớm nhạt
Trờn sắc ký đồ cho thấy ở UV-254 nm, UV-365 nm và sau khi nhỳng H2SO4 10%/ cồn, cao phõn đoạn EtOAc cú 10 vết cú Rf và màu sắc tƣơng đƣơng với cao đặc nụ vối. Khi hơ amoniac thỡ cao đặc nụ vối và cao phõn đoạn EtOAc đều cú 4 vết cú Rf và màu sắc tƣơng đƣơng.
Nhƣ vậy dựa vào cấu trỳc, độ phõn cực của flavonoid và khả năng tỏch trờn bản mỏng, chỳng tụi đó đƣa ra đƣợc 2 hệ dung mụi là: n-Hexan : EtOAc : Acid formic (6:3:0,1) và Toluen : EtOAc : Acid formic (6:4:1) phự hợp để định tớnh sự cú mặt của flavonoid trong dƣợc liệu vối bằng phƣơng phỏp TLC.
3.2.3 Định tớnh bằng HPLC
* Chuẩn bị dung dịch lỏ vối: Cõn chớnh xỏc khoảng 1g bột dƣợc liệu,
thờm chớnh xỏc khoảng 25,00 ml methanol, đem siờu õm 30 phỳt, làm lặp 2 lần, để nguội, bổ sung lƣợng methanol đó mất cho đủ 50,00ml. Lọc, đem đi xỏc định hàm lƣợng.
* Chuẩn bị dung dịch nụ vối: Cõn chớnh xỏc khoảng 1g bột dƣợc liệu,
để nguội, bổ sung lƣợng methanol đó mất cho đủ 50,00 ml. Lọc, hỳt ra chớnh xỏc 1ml đem hũa tan định mức thành 10,00ml bằng methanol, sau đú đem đi tiờm sắc ký.
* Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn: Cõn chớnh xỏc 1,10 mg chất CO-1,
thờm chớnh xỏc 1,00 ml methanol, sau đú đem siờu õm trong 10 phỳt. Hỳt chớnh xỏc 0,50 ml đem pha loóng bằng methanol tới 5,00 ml để đƣợc nổng độ của
CO-1 là 0,11 mg/ml, sau đú đem tiờm sắc ký.
Kết quả định tớnh bằng phƣơng phỏp húa học và bằng TLC đó chỉ ra rằng hoạt chất flavonoid chớnh trong nụ và lỏ vối là chất rắn CO-1. Vỡ vậy chỳng tụi chỉ tiến hành xõy dựng phƣơng phỏp định tớnh hoạt chất chớnh này bằng phƣơng phỏp HPLC.
Hệ thống sắc ký:
- Hệ thống HPLC – LC 10A, Shimadzu, Nhật Bản.
- Cột bondapak TM C18 (3,9mm ID x 300mm; 5μm) hóng Millipore - Detector diod array SPD-M10A: 341 nm
Pha động: Methanol (A) và dung dịch NaH2PO4 0,05M (B)
Điều kiện sắc ký: - Tốc độ dũng: 0,7 ml/phỳt
- Thể tớch tiờm: 10μl
- Rửa giải theo chƣơng trỡnh đẳng dũng A:B = 80:20 (v/v) Sau khi khảo sỏt cỏc hệ dung mụi và cỏc điều kiện khỏc nhau, tỡm đƣợc điều kiện phõn tớch chất rắn CO-1 nhƣ đó xỏc định ở trờn. Sắc ký đồ thu đƣợc cho 1 pic tỏch rừ ràng, nhiễu nền thấp, thể hiện qua sắc ký đồ của mẫu đối chiếu và mẫu thử nụ, lỏ vối. Trờn sắc ký đồ (hỡnh 3.6 C, N, L ) của mẫu thử nụ và lỏ vối đều cú pic cú thời gian lƣu trựng với thời gian lƣu (tR) của pic CO-1 trong sắc ký đồ của mẫu đối chiếu là 9,3 phỳt.
Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 m AU 0 100 200 34016 1457 5242 11991875691 2476 66 6412 2036 1009 2351 1201 15949 4250687 506 116 160 102 142 300 197 358 314 146 113259 545 258 165 179 252 83 251 206966 581381 144 9: 341 nm, 8 nm nuvoistd
nu voi_stdCO55(0.11mg-ml)- 13042012 - 5uL -002.dat
Area Sắc ký đồ chất đối chiếu (C) Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 m AU 0 20 40 60 80 1885 597620 40768 31034 145292 37467107289 688406308852777 35304 1652910 5215 4829 5537 3529 77788 54358 3252 2988 54711672 1178 1307425 227 61169 429 452 25493140 171 155 9: 341 nm, 8 nm nuvoihungyen nuvoihungyenm2(4mg.ml)- 25042012 - 10uL -001.dat
Area Sắc ký đồ của nụ vối (N) Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 m AU 0 100 200 300 400 9: 341 nm, 8 nm lavoi
lavoibacgiang(20mg.ml)- 29052012 - 10uL -003.dat
Area
Sắc ký đồ của lỏ vối (L)
Hỡnh 3.6 : Sắc ký đồ của mẫu đối chiếu CO-1 và nụ, lỏ vối
Qua tiến hành thớ nghiệm tỡm ra điều kiện định tớnh CO-1 trong nụ và lỏ vối bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thụng qua thời gian lƣu tR. Trong bản dự thảo Dƣợc điển Việt Nam V chƣa cú qui định cho việc định tớnh flavonoid bằng HPLC. Do đú, dự kiến sẽ ỏp dụng kết quả này để xõy dựng tiờu chuẩn cơ sở cho nguyờn liệu cõy vối.
3.3 Xõy dựng phƣơng phỏp định lƣợng flavonoid trong lỏ và nụ vối 3.3.1 Xõy dựng bằng phƣơng phỏp trắc quang 3.3.1 Xõy dựng bằng phƣơng phỏp trắc quang
3.3.1.1 Tớnh đặc hiệu của phƣơng phỏp
Tiến hành thực hiện đo quang mẫu trắng, làm lặp lại 6 lần với 2 loại nền mẫu nhƣ sau:
Loại 1: Lấy (1ml) H2O cất cho vào bỡnh định mức cú dung tớch 10 ml cú chứa sẵn 4ml H2O cất. Thờm vào bỡnh 0,3 ml NaNO2 5%, sau khoảng 5 phỳt thờm 0,3 ml AlCl3 10 %, sau 6 phỳt tiếp, cho thờm 2ml NaOH 1M và sau đú thờm H2O cất cho đủ 10ml. Dung dịch đƣợc trộn đều đem đo khụng cho tớn hiệu.
Loại 2: Lấy (1ml) MeOH cho vào bỡnh định mức cú dung tớch 10ml cú chứa sẵn 4ml MeOH phõn tớch. Thờm vào bỡnh 0,3 ml NaNO2 5%, sau khoảng 5 phỳt thờm 0,3 ml AlCl3 10 %, sau 6 phỳt tiếp, cho thờm 2ml NaOH 1M và sau đú thờm MeOH cho đủ 10ml. Dung dịch đƣợc trộn đều đem đo thấy cho tớn hiệu.
Nhận thấy nền mẫu loại 1 cho phức tan khụng màu khi cho cỏc thuốc thử vào. Cũn nền mẫu loại 2 thỡ tạo kết tủa Al(OH)3 khi cho cỏc thuốc thử vào vỡ trong mụi trƣờng MeOH độ tan của Al(OH)3 giảm mạnh, nờn ảnh hƣởng đến việc đo quang. Do đú nền mẫu loại 1 phự hợp cho việc tiến hành phõn tớch xỏc định hàm lƣợng flavonoid toàn phần trong nụ và lỏ vối.
3.3.1.2 Độ lặp lại của phƣơng phỏp
Để xỏc định độ lặp lại của phƣơng phỏp tiến hành với 6 thớ nghiệm riờng biệt cho mẫu nụ vối Hƣng yờn.
Chuẩn bị mẫu: Cõn chớnh xỏc khoảng 1g nụ vối Hƣng yờn tiến hành chiết
với 25 ml MeOH làm 2 lần. Lọc, và bổ xung lƣợng MeOH cho đủ 50 ml. Sau đú đem đi đo quang, kết quả cho thấy cỏc số liệu thống kờ nằm trong điều kiện cho phộp (bảng 3.4), cú thể ỏp dụng điều kiện đó lựa chọn để định lƣợng flavonoid trong mẫu dƣợc liệu nụ và lỏ vối.
Bảng 3.4: Kết quả độ lặp lại của phương phỏp trắc quang
STT 1 2 3 4 5 6
mmẫu(g) 1,0041 1,0064 1,0110 1,0365 1,0189 1,0831
Abs 0,174 0,181 0,184 0,191 0,196 0,193
Số liệu thống kờ SD = 0,83.10-2 ; RSD = 4,45% Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy phƣơng phỏp cú độ lặp lại cú thể chấp nhận đƣợc thụng qua RSD = 4,45% (< 5%).
Xõy dựng đường chuẩn bằng chất đối chiếu CO-1: Tiến hành pha một dóy dung dịch đối chiếu CO-1 (chất tỏch đƣợc từ nụ vối) với nồng độ chớnh xỏc là 12, 24, 36, 48 , 72 và 100 mg/l. Kết quả đƣợc trỡnh bày ở bảng 3.5 Dựa trờn phần mềm excel để vẽ đồ thị đƣờng chuẩn ở (hỡnh 3.7).
Bảng 3.5: Kết quả xõy dựng đường chuẩn theo chất đối chiếu CO-1
Nồng độ (mg/l) 12 24 36 48 72 100 A510 (Abs) 0,042 0,082 0,120 0,160 0,231 0,332 y = 0.0033x + 0.0026 R2 = 0.999 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0 20 40 60 80 100 120 Nồng độ CO -1 (mg/l) Đ ộ hấ p th ụ qu an g
Hỡnh 3.7:Đường chuẩn xỏc định flavonoid toàn phần theo CO-1
Từ kết quả ở bảng 3.5 và hỡnh 3.7 kết quả khảo sỏt trờn cho thấy với nồng độ của chất đối chiếu CO-1 từ 12-100 mg/l cú sự tƣơng quan tuyến tớnh giữa nồng độ và độ hấp thụ quang. Ta đƣợc y = 0.0033x + 0.0026 với hệ số tƣơng quan R2
= 0.9990. Dựa trờn phần mềm Originpro 7.5 tớnh đƣợc độ lệch chuẩn của phƣơng trỡnh hồi quy là Sy= 0,00366 và SA= 5,04.10-5 ; SB = 0,0028. Tra bảng ta t(0,95; 5) = 2,571
phƣơng trỡnh hồi quy đầy đủ: y = (0,0033 ± 1,30.10-4
Xõy dựng đường chuẩn bằng chất chuẩn catechin: Tiến hành pha một dóy dung dịch chuẩn catechin (Sigma) với cỏc nồng độ chớnh xỏc là 45, 90, 180, 360 và 450 mg/l. Kết quả đƣợc trỡnh bày ở bảng 3.6. Dựa trờn phần mềm excel để vẽ đồ thị đƣờng chuẩn ở (hỡnh 3.8).
Bảng 3.6: Kết quả xõy dựng đường chuẩn theo chất chuẩn catechin
Nồng độ (mg/l) 45 90 180 360 450 Độ hấp thụ quang A510(Abs) 0,107 0,214 0,457 0,890 1,091 y = 0.0024x + 0.0022 R2 = 0.9993 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 100 200 300 400 500 Nồng độ Catechin (mg/l) Đ ộ hấp t hụ q uan g
Hỡnh 3.8:Đường chuẩn xỏc định flavonoid toàn phần theo catechin
Kết quả ở bảng 3.6 và hỡnh 3.8 kết quả khảo sỏt trờn đó chỉ ra rằng với nồng độ của chất chuẩn catechin từ 45-450 mg/l cú sự tƣơng quan tuyến tớnh giữa nồng độ và độ hấp thụ quang. Ta đƣợc y = 0,0024x + 0,002 với hệ số tƣơng quan R2
= 0.9993. Tra bảng đƣợc t(0,95; 4) = 2,776. Dựa trờn phần mềm Originpro 7.5 ta tớnh đƣợc độ lệch chuẩn của phƣơng trỡnh hồi quy nhƣ sau: Sy = 0,01289 và Sa= 3,70.10-5 ; Sb = 0,01013.
Phƣơng trỡnh hồi quy đầy đủ là: y = (0,0024 ± 1,07.10-4)x + (0,002 ± 0,0028) 3.3.1.4 Giới hạn phƣơng phỏp.
a) Giới hạn phỏt hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ:
Để tiến hành xỏc định LOD và LOQ tiến hành chuẩn bị cỏc dung dịch mẫu trắng bằng cỏch lấy vào 10 bỡnh định mức cỡ 10 ml: Cho vào bỡnh cú chứa sẵn khoảng 4 ml nƣớc cất + 0,3 ml NaNO2 5% + 0,3 ml AlCl3 10% + 2 ml NaOH 1M sau đú định mức bằng nƣớc cất hai lần, sau khoảng 10 phỳt thỡ đem đi đo độ hấp thụ quang của dóy dung dịch trờn ở bƣớc súng 510 nm (với dung dịch so sỏnh là nƣớc cất) ta thu đƣợc kết quả nhƣ trong bảng 3.7.
Bảng 3.7: Kết quả xỏc định độ lệch chuẩn của mẫu trắng
STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
A510 0,002 0,002 0,003 0,002 0,004 0,002 0,003 0,002 0,002 0,004
Kết quả trờn ta tớnh đƣợc giỏ trị trung bỡnh: AO= 0,0026
Giỏ trị độ lệch chuẩn: SD = 0,843.10-3
Giới hạn phỏt hiện LOD và LOQ của phƣơng phỏp khi dựng chất CO-1
làm chất đối chiếu: LOD = 3.SY b = 3. 3 0,843.10 0, 0033 = 0,77 mg/l LOQ = 10.SY b = 10. 3 0,843.10 0, 0033 = 2,55 mg/l
Giới hạn phỏt hiện LOD và LOQ của phƣơng phỏp khi dựng chất chuẩn catechin làm chuẩn: LOD = 3.SY
b = 3. 3 0,843.10 0, 0024 = 1,05 mg/l LOQ = 10.SY b = 10. 3 0,843.10 0, 0024 = 3,51 mg/l
b) Giới hạn LOL: Xỏc định bằng cỏch nới rộng nồng độ ở điểm trờn của đƣờng chuẩn cho đến khi tƣơng quan giữa nồng độ và độ hấp thụ quang khụng cũn tuyến tớnh nữa.
Đối với chất đối chiếu CO-1: