2.5.1 Định lƣợng flavonoid toàn phần bằng phƣơng phỏp trắc quang
Định lƣợng toàn phần flavonoid trong nụ và lỏ vối bằng phƣơng phỏp tắc quang: Thực hiện dựa trờn phản ứng của flavonoid với AlCl3 sẽ tạo phức màu hồng cú độ hấp thụ ỏnh sỏng cực đại ở bƣớc súng 510 nm. Đo độ hấp thụ của dung dịch ở bƣớc súng 510 nm rồi tớnh ra hàm lƣợng flavonoid (tớnh theo chất chuẩn CO-1 và catechin) tƣơng đƣơng với mẫu chuẩn làm cựng điều kiện.
Khảo sỏt lựa chọn dung mụi thớch hợp trong việc định lƣợng flavonoid toàn phần.
Dựa trờn phản ứng tạo phức của flavonoid với thuốc thử tạo màu trong việc lựa chọn bƣớc súng xỏc định.
Xõy dựng phƣơng phỏp phõn tớch theo cỏc chỉ tiờu: + Tớnh đặc hiệu
+ Độ lặp lại + Độ đỳng
+ khoảng tuyến tớnh
+ Giới hạn của phƣơng phỏp
2.5.2 Định lƣợng flavonoid chớnh bằng phƣơng phỏp HPLC
Khảo sỏt lựa chọn chƣơng trỡnh sắc ký thớch hợp để định lƣợng flavonoid chớnh trong nụ và lỏ vối.
Dựa trờn cụng thức phõn tử và cấu trỳc húa học của flavonoid chớnh chiết xuất đƣợc từ dƣợc liệu nụ vối, để tỡm cỏc điều kiện sắc ký phự hợp nhƣ: Bản chất pha tĩnh, thành phần pha động, bƣớc súng phỏt hiện, tốc độ dũng pha động, thể tớch tiờm mẫu, nồng độ dung dịch thử, dung mụi pha mẫu.
Xõy dựng phƣơng phỏp phõn tớch theo cỏc tiờu chỉ tiờu: - Tớnh đặc hiệu.
- Độ tuyến tớnh và khoảng nồng độ tuyến tớnh. - Độ chớnh xỏc.
- Độ đỳng: Độ đỳng đƣợc xỏc định bằng phƣơng phỏp thờm chuẩn và tớnh thụng qua tỷ lệ thu hồi:
Tỷ lệ thu hồi (%) = Hamluongtimthay
Hamluongthucchovao x 100% - Giới hạn của phƣơng phỏp
- Sự phự hợp của hệ thống sắc ký
2.6 Một số đặc trƣng thống kờ để xử lý và đỏnh giỏ kết quả
Cỏc số liệu thực nghiệm đƣợc xử lý bằng phƣơng phỏp thống kờ thụng qua cỏc đặc trƣng sau: - Giỏ trị trung bỡnh: n i i x n x 1 1 - Phƣơng sai: S2 = 2 1 ( ) 1 n i xi x n - Độ lệch chuẩn: SD = 2 1 ( ) 1 n i xi x n - Độ lệch chuẩn tƣơng đối: RSD(%) = SD
2.7 Thiết bị, dụng cụ và húa chất, dung mụi 2.7.1 Thiết bị, dụng cụ 2.7.1 Thiết bị, dụng cụ
- Cõn kỹ thuật Precisa XT 620M - Cõn phõn tớch Precisa XT 220A - Mỏy cất quay Buchi B481 - Tủ sấy Binder – FD 115 - Đốn tử ngoại
- Hệ thống HPLC _ LC10A, hóng Shimadzu (Nhật Bản)
- Mỏy TLC chấm mẫu bỏn tự động CAMAG LINOMAT5, CAMAG REPROSTAR3.
- Mỏy UV-VIS 1800, dải đo 190 nm-900 nm, hóng Shimadzu (Nhật Bản)
2.7.2 Húa chất, dung mụi
- Dung mụi: methanol, n-hexan, ethyl acetat, toluen… dựng cho sắc ký đạt tiờu chuẩn phõn tớch, dung mụi dựng trong chiết xuất đạt tiờu chuẩn cụng nghiệp đƣợc chƣng cất lại trƣớc khi dựng.
- Bản sắc ký lớp mỏng trỏng sẵn Silica gel GF254 (Merck). - Silica gel sắc ký cột pha thƣờng, cỡ hạt 40-63àm (Merck).
- Húa chất: cỏc húa chất để làm cỏc phản ứng định tớnh bằng phƣơng phỏp húa học, định tớnh phƣơng phỏp sắc ký lớp mỏng (TLC) và định lƣợng bằng phƣơng phỏp đo quang, HPLC.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Chiết xuất và phõn lập một flavonoid chớnh từ nụ vối
3.1.1. Chiết xuất dƣợc liệu và phõn đoạn
Cõn 8 kg dƣợc liệu (nụ vối) làm khụ, chiết bằng ethanol 96% bằng phƣơng phỏp ngõm lạnh, cho ethanol ngập hết dƣợc liệu, thời gian ngõm là 1 tuần/lần rỳt dung dịch chiết, ngõm 3 lần (dịch đó nhạt màu). Dung dịch chiết thu đƣợc, đem cất thu hồi dung mụi ethanol và cụ cỏch thủy, thu đƣợc cao toàn phần (1192 g). Lấy 1000 g cao đem hũa tan một lƣợng vừa đủ 0,5 lớt ethanol 96%, và tiếp tục bổ xung thờm 1,5 lớt nƣớc cất để hũa tan. Sau đú lắc chiết với (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
n-hexan theo tỉ lệ 1:1 đến nhạt màu (5 lần), thu hồi dung mụi n-hexan đƣợc cao chiết n-hexan (cao H, 241,5 g). Phần dịch chiết cũn lại tiếp tục đem lắc, chiết với ethyl acetat theo tỉ lệ 1:1 đến nhạt màu (5 lần), cất thu hồi dung mụi ethyl acetat đƣợc cao chiết ethyl acetat (cao E, 640 g). Dung dịch chiết cũn lại đƣợc lắc chiết với n-butanol (5 lần), cất thu hồi n-butanol, ta thu đƣợc cao chiết n- butanol (cao B) Quy trỡnh chiết đƣợc túm tắt ở sơ đồ 3.1:
Sơ đồ 3.1: Sơ đồ chiết và phõn đoạn cao nụ vối
3.1.2 Phõn lập flavonoid chớnh trong cao phõn đoạn ethyl acetat
Để định hƣớng cho việc phõn lập, tiến hành thử định tớnh flavonoid trong cỏc cao H, cao E. Lấy 0,02g cao H, cao E hũa tan vào 10ml methanol ta đƣợc cỏc dung dịch H, E tƣơng ứng.
* Phản ứng tạo màu với FeCl3 5%: Lấy riờng 1 ml dung dịch H, E (ở
trờn) cho vào từng ống nghiệm sau đú cho vào mỗi ống nghiệm 1 giọt FeCl3 5% lắc và quan sỏt màu. Kết quả chỉ ra ở bảng 3.1.
Lắc chiết với n-butanol (làm lặp lại 5 lần)
Lắc chiết với ethyl acetat (làm lặp lại 5 lần) Lắc chiết với n-hexan (làm lặp lại 5lần)
Dung dịch ethy acetat Dung dịch nƣớc
Dung dịch n-butanol Dung dịch nƣớc Cao n- hexan Cao Ethyl Cao n- butanol Dung dịch nƣớc Cao tổng Dung dịch n-hexan Dung dịch nƣớc
* Phản ứng với NaOH 10%: Lấy riờng 1 ml dung dịch H, E (ở trờn) cho vào từng ống nghiệm sau đú cho vào mỗi ống nghiệm1 giọt NaOH 10% lắc và quan sỏt màu. Kết quả chỉ ra ở bảng 3.1
Bảng 3.1: Kết quả định tớnh sơ bộ flavonoid ở cao H và cao E
Mẫu Thuốc thử hiện màu
Dung dịch NaOH 10% Dung dịch FeCl3 5%
Cao H Khụng phản ứng Khụng phản ứng
Cao E Xuất hiện tủa màu vàng Dung dịch màu xanh đen
Qua kết quả định tớnh sơ bộ bảng 3.1 cho thấy trong phõn đoạn cao E cú chứa flavonoid, việc phõn lập một flavonoid chớnh đƣợc thực hiện từ cao E.
* Sắc ký cột:
Hũa một ớt cao phõn đoạn EtOAc trong methanol, tiến hành khảo sỏt bằng phƣơng phỏp SKLM để lựa chọn phƣơng phỏp chạy sắc ký cột phự hợp nhất, thử với một số hệ dung mụi Hx : ethyl acetat, Hx : cloroform…, kết quả khảo sỏt cho hệ dung mụi Hx : ethyl acetat là phự hợp nhất. Vỡ vậy tiến hành sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel pha thuận cỡ hạt 40-63 àm, pha động là Hx : ethyl acetat với tỉ lệ tăng dần độ phõn cực.
* Chuẩn bị silica gel
Cõn khoảng 600g silica gel pha thƣờng cho vào cốc cú mỏ dung tớch 1000 ml, thờm n-hexan cho ngập bề mặt silica gel 4-5 cm, khuấy đều, cho bay hết khớ.
* Chuẩn bị cột sắc ký
Dựng cột thủy tinh trung tớnh cú đƣờng kớnh 10 cm, chiều dài 100 cm đƣợc lắp thẳng đứng trờn giỏ, phớa dƣới cột cú van điều chỉnh tốc độ chảy của
dung mụi. Lút một lớp bụng mỏng ở đỏy cột, ngay trờn van để chất nhồi sau khi đƣợc nhồi vào cột khụng gõy tắc. Đổ từ từ silica gel đó chuẩn bị ở trờn vào cột sao cho cột khụng bị rỗ, bề mặt cột phẳng và để yờn cho cột ổn định. Mở khúa cho dung mụi chảy và thờm n-hexan để ổn định cột.
* Chuẩn bị mẫu và đưa lờn cột
Cõn khoảng 300g cao phõn đoạn EtOAc hũa tan hoàn toàn bằng một lƣợng tối thiểu methanol, rồi đem mẫu đú tẩm với khoảng 100 g silica gel pha thƣờng. Sau đú đổ phần silica gel đó tẩm mẫu ra khay để bay hơi hết dung mụi, rồi đem sấy ở 50oC cho đến khụ. Nếu thấy vún cục thỡ cú thể dựng chày và cối sứ nghiền nhỏ để cú đƣợc hạt silica gel đó tẩm chất là mịn nhất. Sau khi chuẩn bị xong mẫu, đƣa mẫu từ từ vào cột sao cho khụng bị xỏo trộn lớp chất nhồi bờn trong cột, dựng pipet trỏng vũng quanh bờn trong cột trƣớc khi thờm dung mụi rửa giải.
* Tiến hành sắc ký cột
Tiến hành chạy cột với hệ dung mụi n-hexan: ethyl acetat với độ phõn cực tăng dần (tỉ lệ dung mụi từ 49:1 đến 1:1). Dựng bỡnh nún cú thể tớch 250 ml để hứng dung dịch ra khỏi cột, thu đƣợc 32 bỡnh (200 ml). Tất cả cỏc bỡnh hứng đều đƣợc kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng. Bằng cỏch này, ta thấy từ bỡnh 04 đến bỡnh 09 cho sắc đồ giống nhau cú 1 vết màu vàng (hỡnh 3.1), gộp cỏc bỡnh này lại, cất thu hồi dung mụi và cụ cỏch thủy đến khụ thu đƣợc chất rắn cú màu da cam, gọi là chất rắn CO-1(4,329 g). Khi kiểm tra lại bằng phƣơng phỏp SKLM pha thƣờng với 2 hệ dung mụi là : n-hexan:ethyl acetat (2:1), CHCl3:MeOH (20:1), và SKLM pha đảo với hệ dung mụi MeOH:nƣớc (20:1), chất rắn CO-1
a) Hỡnh ảnh SKLM b) Hỡnh ảnh chất CO-1
Hỡnh 3.1: Hỡnh ảnh SKLM và chất CO-1 phõn lập từ nụ vối (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.1.3. Xỏc định cấu trỳc chất phõn lập
Chất rắn CO-1 là tinh thể cú màu vàng da cam, cú điểm núng chảy 125- 1270C. Kiểm tra độ tinh khiết bằng mỏy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) cho biết chất CO-1 phõn lập đƣợc cú độ tinh khiết 98,21% tớnh theo diện tớch pic, sắc ký đồ thể hiện ở hỡnh 3.2 Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 m AU 0 100 200 34016 1457 5242 1199 1875 691 2476 66 6412 2036 1009 2351 1201 15949 4250687 506 116 160 102 142 300 197 358 314 146 113 259 545 258 165 179 252 83 251 206 966 581 381 144 9: 341 nm, 8 nm nuvoistd
nu voi_stdCO55(0.11mg-ml)- 13042012 - 5uL -002.dat
Area
Phổ UV (MeOH) của chất CO-1 cho đỉnh hấp thụ cực đại ở λ= 340nm, nằm trong vựng hấp thụ mạnh của cỏc chalcon (300-400nm) [4] .
Hỡnh 3.3: Phổ tử ngoại (UV) chất CO-1
Phổ hồng ngoại cho đỉnh hấp thụ ở νmax = 3371 cm-1 đặc trƣng cho dao động húa trị của nhúm OH liờn kết hydro, đỉnh ở νmax =2938 cm-1 đặc trƣng cho dao động húa trị của liờn kết C-H, đỉnh ở νmax =1626 cm-1 đặc trƣng cho dao động húa trị của liờn kết C=O, đỉnh ở νmax =1537 cm-1 đặc trƣng cho dao động húa trị của liờn kết C=C, đỉnh ở νmax =1166 cm-1 đặc trƣng cho dao động húa trị của liờn kết C-O. Nhƣ vậy, trong cụng thức của hợp chất 1 cú nhúm –OH, nhúm C-O, nhúm C=O và liờn kết đụi C=C. (xem phụ lục)
Phổ 1
H-NMR (CD3OD, 500MHz) : cú độ dịch chuyển δ ppm: Cú 2 pic methyl (CH3, δH =2,076, s, và δH 2,13, s), 1 pic methoxy (OCH3, δH 3,64, s), một nhúm gồm 5 proton thuộc vũng thơm δH 7,405-7,453 và 7,652-7,671. Điều này khẳng định chất CO-1 cú vũng thơm. Hai proton cú độ dịch chuyển δH 8,02
(d) và δH 7,78 (d) cú hằng số tƣơng tỏc lớn (J=15,5 Hz), chứng tỏ chất CO-1 cú cấu hỡnh trans. (xem phụ lục).
Phổ 13
C-NMR (CD3OD, 125MHz) cú tất cả 18 tớn hiệu cho biết chất
CO-1 cú 18 nguyờn tử C. Cỏc tớn hiệu cho biết cú hai nhúm methyl (CH3) cú độ dịch chuyển δC 8,1 và 8,9 ppm, vỡ độ dịch chuyển của hai nhúm xuất hiện ở trƣờng cao độ nờn nú phải đƣợc gắn vào vũng thơm. Một nhúm methoxy (OCH3) cú δC 62,6 ppm, cũng gắn vào vũng thơm. Phổ 13C-NMR cũng cho biết cú 14 tớn hiệu cỏc bon của vũng thơm hoặc liờn kết đụi cú độ dịch chuyển từ δC 108,5 đến 163,1 ppm, và một nhúm keton (C=O) cú độ dịch chuyển δC 194,5 ppm. (xem phụ lục)
Kết hợp số liệu cỏc phổ UV, IR, 1
H-NMR và 13C-NMR cho thấy chất
CO-1 cú vũng thơm, cú nhúm C=O, nhúm OH, nhúm OCH3. Với việc cú 18 cỏc bon, nhƣng cú 3 cỏc bon đƣợc gắn vào vũng thơm chứng tỏ chất CO-1 cú khung gồm 15 cỏc bon, do đú sẽ là một flavonoid. Kết hợp phổ UV, phổ 1
H- NMR cho biết cú 2 proton cú cấu hỡnh trans, và phổ 13
C-NMR cho biết cú một nhúm C=O cú độ dịch chuyển ở trƣờng thấp chỳng tụi đi đến kết luận chất CO- 1 là một flavonoid thuộc nhúm chalcon. Kết hợp cỏc tài liệu tham khảo [11, 22], và cỏc dữ kiện phổ thu đƣợc chỳng tụi kết luận chất CO-1 là 2',4'- dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcon, cú CTPT là C18H18O4 và KLPT 298 amu. Phổ khối MS cho pic ion phõn tử ở [M+H]+, cú m/z = 299; ở [M-H]+ cú m/z = 297, tƣơng ứng với khối lƣợng phõn tử của chất rắn CO-1 là M = 298 amu.
Bảng 3.2: Số liệu phổ 1 H-NMR và 13C-NMR của chất CO-1 Vị trớ Số liệu NMR 13 C-NMR δC (ppm) 1 H-NMR δH (ppm) (mult, J in Hz) 1 136,8 - 2 129,3 7,67 (dd, J = 8, J=1,5 Hz) 3 130,0 7,42 (m) 4 131,2 7,41 (m) 5 130,0 7,43 (m) 6 129,3 7,67 (dd, J =8, J=1,5 Hz) C=O 194,5 - Α 128,2 7,79 (d, J = 15,5 Hz) Β 143,5 8,03 (d, J = 15,5 Hz) 1′ 109, 4 - 2′ 162,6 - 3′ 108,5 - 4′ 163,1 - 5′ 111,4 - 6′ 160,2 - 3′-CH3 8,1 2,08 (s) 5′-CH3 8,9 2,13 (s) OCH3 62,6 3,64 (s)
Từ cỏc dữ liệu giải phổ IR, UV, 1
H-NMR, 13C-NMR và cỏc số liệu đƣợc trỡnh bày ở bảng 3.1 đó khẳng định chắc chắn cụng thức phõn tử của hợp chất này. Cụng thức cấu tạo của chất CO-1 đƣợc trỡnh bày trong hỡnh 3.4.
Hỡnh 3.4: Cụng thức cấu tạo chất CO-1
Nhƣ vậy flavonoid chớnh tỏch đƣợc trong nụ vối là 2′,4′-dihydroxy- 6′methoxy-3′,5′-dimethylchalcone (ký hiệu ngắn gọn là CO-1). Đƣợc xỏc định thụng qua cảm quan, cỏc phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hƣởng từ hạt nhõn (1H và 13C NMR), khối phổ (MS) khi so sỏnh với cỏc tài liệu tham khảo [14, 27]. Kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC, đo nhiệt độ núng chảy của CO-1 nhiều lần đều cho kết quả ổn định ở 125-127oC. Nhƣ vậy, cú thể sử dụng mẫu chất CO-1
phõn lập đƣợc làm chất đối chiếu trong phộp xõy dựng phƣơng phỏp định tớnh, định lƣợng flavonoid và chất này trong cỏc mẫu nụ và lỏ vối.
3.2 Xõy dựng phƣơng phỏp định tớnh flavonoid trong lỏ và nụ vối 3.2.1 Định tớnh bằng phản ứng húa học 3.2.1 Định tớnh bằng phản ứng húa học
Lấy 2 g bột dƣợc liệu (nụ, lỏ vối) cho vào bỡnh nún, chiết siờu õm với 20ml ethanol 900 trong 30 phỳt, lọc lấy dịch lọc. Dựng dịch lọc để làm cỏc phản ứng định tớnh.
Nhỏ vài giọt dung dịch chiết lờn miếng giấy lọc, để khụ rồi hơ lờn miệng lọ amoniac đặc, quan sỏt sự thay đổi màu của vết chất thấy vết chất chuyển từ vàng sang vàng đậm.
Kết luận: Cú flavonoid
Phản ứng với kiềm loóng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, nhỏ vài giọt dung dịch natri hydroxid 10%, lắc, dung dịch trong ống nghiệm chuyển màu vàng, sau xuất hiện tủa vàng.
Kết luận: Cú flavonoid
Phản ứng cyanidin (phản ứng Shinoda).
Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thờm ớt bột magie kim loại, rồi nhỏ từ từ vài giọt dung dịch acid hydroclorid đậm đặc. Sau vài phỳt dung dịch xuất hiện màu hồng.
Kết luận: Cú flavonoid
Phản ứng với dung dịch sắt(III) clorid 5%.
Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thờm vài giọt dung dịch sắt(III)clorid 5%, lắc sẽ xuất hiện màu xanh đen.
Kết luận: Cú flavonoid
Dựa trờn cỏc tài liệu tham khảo, cỏc cụng trỡnh nghiờn cứu định tớnh flavonoid của cỏc nhà khoa học ở cỏc Trƣờng đại học, cỏc Viện nghiờn cứu ở trong nƣớc và trờn thế giới. Trong luận văn này khẳng định lại một lần nữa cỏc hợp chất vụ cơ nhƣ NH3, NaOH, FeCl3…luụn là những thuốc thử cho phản ứng rất nhạy, tạo màu đặc trƣng cho việc phỏt hiện flavonoid trong thực vật.
3.2.2 Định tớnh bằng TLC
a) Chuẩn bị mẫu chấm sắc ký
Dung dịch thử: Lấy 1 gam bột dƣợc liệu (nụ, lỏ vối) cho vào bỡnh nún, thờm 50 ml methanol (MeOH) rồi đem siờu õm 30 phỳt, lọc qua giấy lọc, dịch lọc để làm cỏc phộp định tớnh.
Dung dịch đối chiếu: Dung dịch flavonoid chớnh (tỏch đƣợc ở nụ vối)
trong MeOH (hàm lƣợng khoảng 1 mg/ml).
Đƣa chất phõn tớch lờn bản mỏng: Lƣợng mẫu cần đƣa lờn bản mỏng là khoảng 10 μl dung dịch đó pha ở trờn. Cỏc vết chấm cựng trờn một đƣờng xuất phỏt cỏch mộp dƣới của bản mỏng 1,5 cm, đƣờng kớnh vết chấm 3-5 mm và cỏch nhau 15 mm, hai vết chấm ngoài cựng của bản mỏng cỏch mộp ngoài