* Chuẩn bị dung dịch lỏ vối: Cõn chớnh xỏc khoảng 1g bột dƣợc liệu,
thờm chớnh xỏc khoảng 25,00 ml methanol, đem siờu õm 30 phỳt, làm lặp 2 lần, để nguội, bổ sung lƣợng methanol đó mất cho đủ 50,00ml. Lọc, đem đi xỏc định hàm lƣợng.
* Chuẩn bị dung dịch nụ vối: Cõn chớnh xỏc khoảng 1g bột dƣợc liệu,
để nguội, bổ sung lƣợng methanol đó mất cho đủ 50,00 ml. Lọc, hỳt ra chớnh xỏc 1ml đem hũa tan định mức thành 10,00ml bằng methanol, sau đú đem đi tiờm sắc ký.
* Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn: Cõn chớnh xỏc 1,10 mg chất CO-1,
thờm chớnh xỏc 1,00 ml methanol, sau đú đem siờu õm trong 10 phỳt. Hỳt chớnh xỏc 0,50 ml đem pha loóng bằng methanol tới 5,00 ml để đƣợc nổng độ của
CO-1 là 0,11 mg/ml, sau đú đem tiờm sắc ký.
Kết quả định tớnh bằng phƣơng phỏp húa học và bằng TLC đó chỉ ra rằng hoạt chất flavonoid chớnh trong nụ và lỏ vối là chất rắn CO-1. Vỡ vậy chỳng tụi chỉ tiến hành xõy dựng phƣơng phỏp định tớnh hoạt chất chớnh này bằng phƣơng phỏp HPLC.
Hệ thống sắc ký:
- Hệ thống HPLC – LC 10A, Shimadzu, Nhật Bản.
- Cột bondapak TM C18 (3,9mm ID x 300mm; 5μm) hóng Millipore - Detector diod array SPD-M10A: 341 nm
Pha động: Methanol (A) và dung dịch NaH2PO4 0,05M (B)
Điều kiện sắc ký: - Tốc độ dũng: 0,7 ml/phỳt
- Thể tớch tiờm: 10μl
- Rửa giải theo chƣơng trỡnh đẳng dũng A:B = 80:20 (v/v) Sau khi khảo sỏt cỏc hệ dung mụi và cỏc điều kiện khỏc nhau, tỡm đƣợc điều kiện phõn tớch chất rắn CO-1 nhƣ đó xỏc định ở trờn. Sắc ký đồ thu đƣợc cho 1 pic tỏch rừ ràng, nhiễu nền thấp, thể hiện qua sắc ký đồ của mẫu đối chiếu và mẫu thử nụ, lỏ vối. Trờn sắc ký đồ (hỡnh 3.6 C, N, L ) của mẫu thử nụ và lỏ vối đều cú pic cú thời gian lƣu trựng với thời gian lƣu (tR) của pic CO-1 trong sắc ký đồ của mẫu đối chiếu là 9,3 phỳt.
Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 m AU 0 100 200 34016 1457 5242 11991875691 2476 66 6412 2036 1009 2351 1201 15949 4250687 506 116 160 102 142 300 197 358 314 146 113259 545 258 165 179 252 83 251 206966 581381 144 9: 341 nm, 8 nm nuvoistd
nu voi_stdCO55(0.11mg-ml)- 13042012 - 5uL -002.dat
Area Sắc ký đồ chất đối chiếu (C) Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 m AU 0 20 40 60 80 1885 597620 40768 31034 145292 37467107289 688406308852777 35304 1652910 5215 4829 5537 3529 77788 54358 3252 2988 54711672 1178 1307425 227 61169 429 452 25493140 171 155 9: 341 nm, 8 nm nuvoihungyen nuvoihungyenm2(4mg.ml)- 25042012 - 10uL -001.dat
Area Sắc ký đồ của nụ vối (N) Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 m AU 0 100 200 300 400 9: 341 nm, 8 nm lavoi
lavoibacgiang(20mg.ml)- 29052012 - 10uL -003.dat
Area
Sắc ký đồ của lỏ vối (L)
Hỡnh 3.6 : Sắc ký đồ của mẫu đối chiếu CO-1 và nụ, lỏ vối
Qua tiến hành thớ nghiệm tỡm ra điều kiện định tớnh CO-1 trong nụ và lỏ vối bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thụng qua thời gian lƣu tR. Trong bản dự thảo Dƣợc điển Việt Nam V chƣa cú qui định cho việc định tớnh flavonoid bằng HPLC. Do đú, dự kiến sẽ ỏp dụng kết quả này để xõy dựng tiờu chuẩn cơ sở cho nguyờn liệu cõy vối.