nghiêu cứu xác định cloramphenicol trong dược phẩm bằng phương pháp von-ampe sử dụng điện cực giọt thủy ngân treo

Nguyễn Phương Hà NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CLORAMPHENICOL TRONG DƯỢC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP VON-AMPE SỬ DỤNG ĐIỆN CỰC GIỌT THỦY NGÂN TREO Chuyên ngàng: Hóa Phân tích Mã số: 60 44 29 LUẬN V

Nguyễn Phương Hà

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CLORAMPHENICOL TRONG DƯỢC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP VON-AMPE SỬ DỤNG

ĐIỆN CỰC GIỌT THỦY NGÂN TREO

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Nguyễn Phương Hà

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CLORAMPHENICOL TRONG

DƯỢC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP VON-AMPE SỬ DỤNG

ĐIỆN CỰC GIỌT THỦY NGÂN TREO

Chuyên ngàng: Hóa Phân tích

Mã số: 60 44 29

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS TS HOÀNG THỌ TÍN

MỞ ĐẦU 1

1.2.2 Các cực làm việc thường dùng trong phương pháp von-ampe 11

1.3.3.1 Cực phổ xung vi phân 19

1.3.3.3 Phương pháp điện di mao quản sử dụng đầu dò vi sợi cacbon 20

2.2.1 Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp von-ampe xung vi phân 23

3.1 Khảo sát đáp ứng điện hóa của cloramphenicol trên HMDE 28 3.2 Khảo sát tính chất điện hóa của cloramphenicol trong một số

3.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH và nồng độ dung dịch đệm 33

3.4 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ quét thế 35

3.6 Khảo sát ảnh hưởng của các chất hữu cơ 40

3.6.1 Ảnh hưởng của axit oxalic 40

3.11.3 Xác định cloramphenicol trong mẫu thực tế 51

„

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.2: (a) Sự biến thiên thế thời gian, (b) Dạng đường von-ampe

trong kỹ thuật von-ampe xung vi phân

14

Hình 1.3: (a) Sự biến thiên thế thời gian, (b) Dạng đường von-ampe

trong kỹ thuật von-ampe sóng vuông

Hình 3.3: Đường quét xung vi phân (a) và đồ thị (b) biểu diễn sự ảnh

hưởng của pH đến giá trị chiều cao pic của cloramphenicol nền đệm axetat

34

Hình 3.4: Đường quét von-ampe vòng của cloramphenicol nồng độ

2,5ppm trong nền axetat tại các tốc độ quét khác nhau

37

Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa chiều cao pic

cloramphenicol và tốc độ quét

37

Hình 3.6: Đường quét xung vi phân của (a) cloramphenicol, oxi và hỗn

hợp của chúng và (b) ảnh hưởng của thời gian xục khí

38

Hỉnh 3.7: Đường quét xung vi phân của cloramphenicol trong sự có mặt

của axit oxalic tại các tỷ lệ nồng độ khác nhau

40

Hình 3.8: Đường quét xung vi phân của cloramphenicol trong sự có mặt

của axit citric tại các tỷ lệ nồng độ khác nhau

40

Hình 3.9: Đường quét xung vi phân của cloramphenicol trong sự có mặt

của glucozơ tại các tỷ lệ nồng độ khác nhau

Hình 3.11: Đường quét xung vi phân của cloramphenicol trong sự có mặt

của ion Ca2+ tại các tỷ lệ nồng độ khác nhau

44

HÌnh 3.12: Đường quét xung vi phân của cloramphenicol trong sự có mặt

của ion Fe3+ tại các tỷ lệ nồng độ khác nhau

Bảng 3.4: Giá trị Ipa và Ipc thay đổi theo tốc độ quét 36

Bảng 3.6: Giá trị Ip của cloramphenicol trong sự có mặt của axit oxalic

Bảng 3.13: Giá trị b‟ trong kiểm tra các hệ số của phương trình hồi quy 47

Bảng 3.15: Các giá trị dùng để khảo sát độ đúng của hệ số a 47

Bảng 3.17: Các số liệu thống kê đánh giá độ đúng của phương pháp 49 Bảng 3.18: Các giá trị thống kê về độ chính xác của phương pháp 50 Bảng 3.19: Giá trị Ip của 10 mẫu cloramphenicol 1,5ppm 50 Bảng 3.20: Số liệu thống kê về giá trị Ip của 10 mẫu cloramphenicol

1,5ppm

50

Bảng 3.21: Giá trị Ip của cloramphenicol trong mẫu thuốc nhỏ mắt và

các giá trị thêm chuẩn

cao Thêm vào đó, môi trường sống ô nhiễm là một trong những nguyên nhân khiến

tỉ lệ mắc các bệnh do nấm và khuẩn ở người ngày càng tăng Việc nghiên cứu thuốc chữa trị các loại bệnh này rất được quan tâm chú ý Kháng sinh là chất có khả năng

ức chế hoặc tiêu diệt một số loài nấm, vi khuẩn gây bệnh cho người và sinh vật Vì vậy các loại thuốc kháng sinh đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ và nâng cao sức khỏe của sinh vật nói chung và con người nói riêng Hoạt động kiểm soát hàm lượng thuốc kháng sinh đưa vào cơ thể sao cho phù hợp với các mức độ nhiễm khuẩn đóng vai trò quyết định trong pháp đồ điều trị bệnh Do đó, việc xác định được chính xác hàm lượng thuốc là điều cần thiết

Hiện nay, có rất nhiều phương pháp được dùng để xác định hàm lượng kháng sinh Trong số đó, phương pháp cực phổ được đánh giá là một trong những phương pháp có rất nhiều thuận lợi, đặc biệt là đối với các chất kháng sinh có tính điện hoạt như cloramphenicol Việc nghiên cứu xác định hàm lượng kháng sinh cloramphenicol đã được nghiên cứu nhiều trên thế giới cũng như ở trong nước Tuy nhiên các phương pháp chủ yếu được nghiên cứu là các phương pháp sắc ký và các phương pháp quang Trong luận văn này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu sử dụng phương pháp cực phổ với kỹ thuật đo xung vi phân để xác định hàm lượng kháng sinh cloramphenicol trong một số loại dược phẩm khác nhau, ở dạng dung dịch cũng như ở dạng bột

Sóng cực phổ của cloramphenicol là sóng cực phố anot, thế xuất hiện pic nằm xung quanh vị trí 0V, do đó ít bị ảnh hưởng bởi các hóa chất khác Việc sử dụng phương pháp cực phổ một lần nữa khẳng định tính ưu việt của các phương pháp phân tích điện hóa, cho phép xác định nhanh hàm lượng các chất, việc xử lý mẫu trước khi tiến hành đo đơn giản và tránh làm mất chất trong quá trình phân tích

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu chung

1.1.1 Giới thiệu về kháng sinh

Kháng sinh là chất có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt một số loài nấm, vi khuẩn gây bệnh cho người và sinh vật

Thuốc kháng sinh thường được chiết suất từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật (nấm, vi khuẩn) Ngày nay với công nghệ phát triển, thuốc kháng sinh còn được tổng hợp bằng phương pháp hóa học [8]

 Phân loại:

Hiện có khoảng hơn 12000 chủng loại kháng sinh khác nhau [8], chúng được chia thành 10 nhóm chính [29]

- Nhóm phenicol: cloramphenicol, Thiaphenicol, Florphenicol, Florfenicol amin…

- Nhóm sulfonamide: Sulfadimethoxine, Sulfamethoxipyridine, Sulfamoxole, Sulfisoxazole, Sulfixomidine, Sulfamethazine, Sulfamethoxazole…

- Nhóm β-lactam: Peneciline, Amoxilline, Cloxacilline, Penicilline G, Cephalosporin, Cètazidime…

- Nhóm quinolone: Nalidixic acid, Danofloxacin, oxonilic acid, Ciprofloxacin, Norfloxacine…N

- Nhóm Tetracyline: Tetracyline, Oxy Tetracyline, Clortetracyline…

- Nhóm amino Glycoside: Gentamicin, Gentamicin C, Spectinomycin, Hygromycin

B, Treptomicin, Dihydrotreptomicin…

- Nhóm ionorphore polyether: Semduramicin, Monensin, Salinomycine, Narasine…

- Nhóm Macrolide: Erythromycine A, Cladonose, Spiramicin, Neospiramycin, Tylosine…

- Nhóm Nitrofuran: Furazolidone, Nitrofurazone, Furaltadone,…

- Nhóm Miscellaneous: N-acylamico dilactone, 4-butyrolactiones, Antimycin A…

1.1.2 Giới thiệu về cloramphenicol

1.1.2.1 Giới thiệu chung [1,2,11,12,13]

Cloramphenicol là kháng sinh thuộc nhóm phenicol, ban đầu được phân lập

từ Streptomyces venezuelae vào năm 1947, nay được sản xuất bằng phương pháp tổng hợp Cloramphenicol thường có tác dụng kìm khuẩn, nhưng có thể diệt khuẩn

ở nồng độ cao hoặc đối với những vi khuẩn nhạy cảm cao Tên quốc tế của cloramphenicol là

2,2-dichloro-N-[1,3-dihydroxy-1-(4-nitrophenyl)propan-2-yl]acetamide

Cloramphenicol có công thức hóa học và cấu trúc như sau

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của cloramphenicol [12]

Cloramphenicol được tìm thấy vào năm 1948 là chống lại bệnh sốt phát ban

có hiệu quả và trở thành kháng sinh đầu tiên trải qua quy mô sản xuất lớn Đến năm

1950, cộng đồng y khoa đã nhận thức được rằng thuốc có thể gây ra thiếu máu bất sản nghiêm trọng và có khả năng gây tử vong, và nó nhanh chóng bị ghét bỏ Cloramphenicol hiện đang được sử dụng tại Hoa Kỳ chỉ chỉ để chống lại những nhiễm trùng nghiêm trọng mà các kháng sinh khác không có hiệu quả hoặc bị chống

chỉ định Cloramphenicol được liệt kê trong Báo cáo thường niên lần thứ nhất về

chất gây ung thư vào năm 1980 như là một chất gây ung thư cho con người (NTP

1980) Danh sách này dựa trên báo cáo nghiên cứu trường hợp thiếu máu bất sản ở người do sử dụng cloramphenicol kéo theo sự phát triển của bệnh bạch cầu

Cloramphenicol đã được sửa lại kể từ Báo cáo thường niên lần thứ hai về chất gây

ung thư vào năm 1981 dựa trên một đánh giá lại của Cơ quan Nghiên cứu Ung thư

Quốc tế (IARC) trên thuốc này IARC đã kết luận rằng các dữ liệu gây ung thư trên của cloramphenicol ở người là không đủ sức mạnh để làm chứng cứ và không có dữ liệu trên thực nghiệm động vật (IARC 1976) IARC đã xem xét cloramphenicol một lần nữa vào năm 1987 và vào năm 1990 và kết luận rằng cũng có những bằng chứng nhất định để kết luận chất này gây ung thư ở động vật thực nghiệm nhưng khả năng

ở người là rất hạn chế Trong tổng thể đánh giá, IARC lưu ý rằng cloramphenicol gây ra bệnh thiếu máu bất sản và điều này là điều kiện liên quan đến sự xuất hiện của bệnh bạch cầu Đánh giá tổng thể của IARC, cloramphenicol là chất có thể gây ung thư cho con người thuộc Nhóm 2A (1987 IARC, 1990) [13]

1.1.2.2 Tính chất hóa lý

Cloramphenicol tồn tại như một tinh thể hình kim hoặc tấm kéo dài, nhìn mắt thường ở dạng bột mịn màu trắng xám, trắng hoặc vàng trắng, với nhiệt độ nóng chảy vào khoảng 150,5oC đến 151.5oC Nó thăng hoa trong chân không cao và nhạy cảm với ánh sáng Các nhóm nitro là dễ dàng khử thành các nhóm amin Tính chất điện hóa của cloramphenicol được thể hiện một cách rõ ràng ở vị trí cấu trúc này:

Trong 4 chất đồng phân lập thể, chỉ có dạng αR, βR (hay còn gọi là dạng D)

là có hoạt tính (IARC 1990) Các thuộc tính vật lý và hóa học của cloramphenicol được liệt kê trong Bảng 1.1.[13]

Bảng 1.1: Các tính chất vật lý và hóa học của cloramphenicol

Trạng thái vật lý Tinh thể hình kim hoặc

tấm kéo dài, bột tinh thể

Budavari et al 1996, Chemfinder

2000 Nhiệt độ nóng

Áp suất bay hơi 1,73.10-12 mmHg HSDB 1995

Thời gian bán hủy

Tan Tan tốt Tan tốt

Chemfinder 2000, HSDB 1995 HSDB 1995

HSDB 1995 HSDB 1995 HSDB 1995 HSDB 1995

HSDB 1995 HSDB 1995 HSDB 1995 HSDB 1995 HSDB 1995 HSDB 1995 HSDB 1995

• Ức chế quá trình tổng hợp vách của vi khuẩn (vỏ) của vi khuẩn Các nhóm kháng sinh gồm có penicillin, bacitracin, vancomycin Do tác động lên quá trình tổng hợp vách nên làm cho vi khuẩn dễ bị các đại thực bào phá vỡ do thay đổi áp suất thẩm thấu

• Ức chế chức năng của màng tế bào Các nhóm kháng sinh gồm có : colistin, polymyxin, gentamicin, amphoterricin Cơ chế làm mất chức năng của màng làm cho các phân tử có khối lƣợng lớn và các ion bị thoát ra ngoài

• Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein

- Nhóm aminoglycosid gắn với receptor trên tiểu phân 30S của ribosome làm cho quá trình dịch mã không chính xác

- Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phân 50S của ribosome ức chế enzyme peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide

- Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S của ribosome làm ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide

• Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic

- Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao

mã tạo thành mRNA (RNA thông tin)

- Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho hai mạch đơn của DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của DNA

- Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (p aminobenzonic acid) có tác dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp acid nucleotid

- Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân purin làm ức chế quá trình tạo acid nucleic

Đối với Cloramphenicol, cơ chế kháng khuẩn được cụ thể hóa qua việc ức chế sinh tổng hợp protein ở những vi khuẩn nhạy cảm bằng cách gắn vào tiểu thể 50S của ribosom Thuốc có cùng vị trí tác dụng với erythromycin, clindamycin, lincomycin, oleandomycin và troleandomycin

Cloramphenicol cũng ức chế tổng hợp protein ở những tế bào tăng sinh nhanh của động vật có vú Cloramphenicol có thể gây ức chế tủy xương và có thể không hồi phục được Cloramphenicol có hoạt tính ức chế miễn dịch nếu cho dùng toàn thân trước khi kháng nguyên kích thích cơ thể Tuy vậy, đáp ứng kháng thể có thể không bị ảnh hưởng đáng kể khi dùng cloramphenicol sau kháng nguyên

Nhiều vi khuẩn có sự kháng thuốc cao với cloramphenicol ở Việt Nam thuốc này gần như không có tác dụng đối với Escherichia coli, Shigella flexneri, Enterobacter spp., Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Streptococcus

pneumoniae và ít có tác dụng đối với Streptococcus pyogenes Cloramphenicol không có tác dụng đối với nấm

Nói chung, cloramphenicol ức chế in vitro những vi khuẩn nhạy cảm ở nồng

độ 0,1 - 20 microgam/ml

Kháng thuốc

Tỷ lệ kháng thuốc đối với cloramphenicol, thử nghiệm in vitro ở Việt Nam

trong năm 1998: Shigella flexneri (85%), Escherichia coli (83%), Enterobacter spp (80%), Staphylococcus aureus (64%), Salmonella typhi (81%), Streptococcus pneumoniae (42%), Streptococcus pyogenes (36%),Haemophilus influenzae (28%)

Thử nghiệm in vitro cho thấy sự kháng thuốc đối với cloramphenicol tăng dần từng

bước Sự kháng thuốc này là do sử dụng quá mức và được lan truyền qua plasmid

Sự kháng thuốc đối với một số thuốc kháng khuẩn khác, như aminoglycosid, sulfonamid, tetracyclin, cũng có thể được lan truyền trên cùng plasmid

Dược động học của Cloramphenicol được hấp thu nhanh qua đường tiêu hóa Cloramphenicol palmitat thủy phân trong đường tiêu hóa và được hấp thu dưới dạng cloramphenicol tự do Ở người lớn khỏe mạnh, sau khi uống liều 1 g cloramphenicol, nồng độ đỉnh cloramphenicol trong huyết tương trung bình đạt khoảng 11 microgam/ml trong vòng 1 - 3 giờ Ở người lớn khỏe mạnh uống liều 1 g cloramphenicol bazơ, cứ 6 giờ một lần, tổng cộng 8 liều, nồng độ đỉnh trong huyết tương trung bình đạt khoảng 18 microgam/ml sau liều thứ 5 và trung bình đạt 8 - 14 microgam /ml trong 48 giờ

Sau khi tiêm tĩnh mạch cloramphenicol natri sucinat, có sự khác nhau đáng

kể giữa các cá thể về nồng độ cloramphenicol trong huyết tương, tùy theo độ thanh thải của thận Khi tiêm tĩnh mạch liều 1 g cloramphenicol natri sucinat cho người lớn khoẻ mạnh, nồng độ cloramphenicol trong huyết tương xê dịch trong khoảng 4,9 - 12 microgam/ml sau 1 giờ, và 0 - 5,9 microgam/ml sau 4 giờ

Sau khi dùng tại chỗ ở mắt, cloramphenicol được hấp thu vào thủy dịch Những nghiên cứu ở người bệnh đục thể thủy tinh cho thấy mức độ hấp thu thay đổi

theo dạng thuốc và số lần dùng thuốc Nồng độ thuốc trong thủy dịch cao nhất khi dùng thuốc mỡ tra mắt cloramphenicol nhiều lần trong ngày

Cloramphenicol phân bố rộng khắp trong phần lớn mô cơ thể và dịch, kể cả nước bọt, dịch cổ trướng, dịch màng phổi, hoạt dịch, thủy dịch và dịch kính Nồng

độ thuốc cao nhất trong gan và thận Nồng độ trong dịch não - tủy bằng 21 - 50% nồng độ trong huyết tương ở người bệnh không bị viêm màng não và bằng 45 - 89%

ở người bệnh bị viêm màng não Cloramphenicol gắn kết khoảng 60% với protein huyết tương

Nửa đời huyết tương của cloramphenicol ở người lớn có chức năng gan và thận bình thường là 1,5 - 4,1 giờ Vì trẻ đẻ non và trẻ sơ sinh có cơ chế liên hợp glucuronid và thải trừ thận chưa trưởng thành, nên những liều cloramphenicol thường dùng thích hợp với trẻ lớn lại có thể gây nồng độ thuốc trong huyết tương quá cao và kéo dài ở trẻ sơ sinh Nửa đời huyết tương là 24 giờ hoặc dài hơn ở trẻ nhỏ 1 - 2 ngày tuổi, và khoảng 10 giờ ở trẻ nhỏ 10 - 16 ngày tuổi Nửa đời huyết tương của cloramphenicol kéo dài ở người bệnh có chức năng gan suy giảm Ở người bệnh có chức năng thận suy giảm, nửa đời huyết tương của cloramphenicol kéo dài không đáng kể

Cloramphenicol bị khử hoạt chủ yếu ở gan do glucuronyl transferase Ở người lớn có chức năng gan và thận bình thường, khoảng 68 - 99% một liều uống cloramphenicol thải trừ trong nước tiểu trong 3 ngày; 5 - 15% liều này thải trừ dưới dạng không đổi trong nước tiểu qua lọc cầu thận và phần còn lại thải trừ qua ống thận, dưới dạng những chất chuyển hóa không hoạt tính ở người lớn có chức năng thận và gan bình thường, sau khi tiêm tĩnh mạch cloramphenicol natri sucinat, khoảng 30% liều bài tiết dưới dạng không đổi trong nước tiểu; tuy vậy, tỷ lệ liều bài tiết dưới dạng không đổi trong nước tiểu biến thiên đáng kể, trong phạm vi 6 - 80%

ở trẻ sơ sinh và trẻ em Một lượng nhỏ cloramphenicol dưới dạng không đổi bài tiết trong mật và phân sau khi uống thuốc

Thẩm tách phúc mạc không ảnh hưởng đến nồng độ cloramphenicol trong huyết tương và thẩm tách thận nhân tạo chỉ loại trừ một lượng thuốc nhỏ

1.1.2.4 Sản xuất [11]

Cloramphenicol được sản xuất một cách tự nhiên từ Streptomyces venezuelae Hiện nay nó được sản xuất theo phương thức tổng hợp hóa học Quá trình lên men đã được mô tả là không cần phân tách lập thể (IARC 1990) Năm

1948, cloramphenicol được sản xuất một cách thương mại hóa lần đầu tiên tại Hoa

Kỳ Mỹ sản xuất của cloramphenicol được ước tính là lớn hơn 908 kg (2.002 lb) vào năm 1977 và 1979 Mỹ nhập khẩu cho những năm này được ước tính khoảng 8.150 kg (£ 17.970) và 8.200 kg (18.080 £), (HSDB 1995) Hiện tại mức độ sản xuất cho cả hai loại dùng trong thú y và con người không được công bố trong các tài liệu

1.2 Giới thiệu về phương pháp von-ampe [3,4,5,6,7,10]

1.2.1 Giới thiệu chung

Phương pháp von–ampe là nhóm các phương pháp phân tích dựa vào việc nghiên cứu đường von–ampe hay còn gọi là đường phân cực, là đường biểu diễn sự phụ thuộc của cường độ dòng điện vào điện thế khi tiến hành điện phân dung dịch chất phân tích

Quá trình điện phân được thực hiện trong một bình điện phân đặc biệt gồm 3 điện cực:

+ Cực làm việc: thường là cực giọt thuỷ ngân tĩnh, cực rắn đĩa hay cực màng (màng thủy ngân; màng vàng; màng bitmut; )

+ Cực so sánh: là cực có thế không đổi thường là cực calomen hoặc cực bạc clorua có bề mặt lớn

+ Cực phù trợ glassy carbon hoặc Pt

Nắp bình điện phân còn có một lỗ để dẫn một luồng khí trơ vào với mục đích để đuổi khí oxy hoà tan trong dung dịch ra khỏi bình điện phân Để vẽ được đường phân cực người ta liên tục theo dõi và đo cường độ dòng điện chạy qua mạch khi tăng dần điện thế đặt vào hai cực của bình điện phân, sau đó vẽ đồ thị biễu diễn

sự phụ thuộc của I–E, trong đó I là cường độ dòng điện chạy qua mạch, E là điện thế đặt vào hai cực của bình điện phân Ta sẽ được một đường cong đó chính là đường cong von-ampe hoà tan

1.2.2 Các cực làm việc thường dùng trong phương pháp von-ampe

a Cực giọt thủy ngân treo (HMDE)

Cực HMDE là loại cực được dùng phổ biến nhất trong phương pháp ampe Nó là một giọt thủy ngân hình cầu kích thước nhỏ được treo trên đầu cuối của một mao quản có đường kính trong 0,15 † 0,50 mm Sau mỗi phép đo, giọt thủy ngân bị cưỡng bức rơi ra khỏi mao quản và nó được thay thế bằng một giọt mới tương tự Một kiểu cực giống với cực HMDE cũng thường được dùng là cực giọt thủy ngân tĩnh (SMDE) do hãng PAR (USA) chế tạo Cực HMDE và SMDE cho kết quả đo có độ chính xác và độ lặp lại cao, có quá thế với hidro lớn khoảng -1,5 V trong môi trường kiềm và trung tính, -1,2 V trong môi trường axit, nên các cực này

von-có khoảng điện hoạt rộng, do đó cho phép chúng ta nghiên cứu được các chất trong một khoảng thế rộng Chúng được dùng rộng rãi để xác định hàng chục kim loại và

á kim như Cd, Cu, Pb, Zn, In, Bi, Sb, Se, các halogenua,… và nhiều hợp chất hữu

cơ theo phương pháp ASV hoặc CSV Điểm hạn chế của cực HMDE và SMDE là khó chế tạo, vì rất khó tạo ra các giọt thủy ngân có kích thước lặp lại một cách hoàn hảo Ngoài ra, chúng không cho phép xác định các kim loại có thế hòa tan dương hơn như Au, Ag,…

b Cực màng thủy ngân (MFE)

Cực MFE là một màng mỏng thủy ngân phủ trên bề mặt cực rắn trơ (thường

là cực rắn đĩa quay) có đường kính 2 † 4 mm và làm bằng các loại vật liệu trơ như than thủy tinh (glassy carbon), graphit, than nhão (paste carbon), Cực MFE được

chuẩn bị dễ dàng bằng cách điện phân dung dịch HgII 10-4 - 10-5 M trên cực rắn đĩa ở thế thích hợp (khoảng -0,8 † -1,3 V so với cực Ag/AgCl/KClbh hoặc Hg/Hg2Cl2/KClbh) và trong thời gian thích hợp (thường khoảng 3 - 5 phút) Bằng cách như vậy, cực MFE có thể được hình thành theo 2 kiểu: in situ và ex situ

- Theo kiểu in situ, dung dịch HgII được thêm vào dung dịch phân tích và như vậy, khi điện phân làm giàu, cực MFE được hình thành đồng thời với quá trình tập trung chất phân tích lên cực MFE

- Theo kiểu ex situ, cực MFE được tạo ra trước bằng cách điện phân dung dịch HgII như trên, sau đó tia rửa cực cẩn thận bằng nước sạch, rồi nhúng cực vào dung dịch phân tích để tiến hành nghiên cứu Cực MFE dạng ex situ thường có bề dày màng thủy ngân lớn hơn so với dạng in situ

Cho đến nay, bản chất của cực MFE vẫn còn là vấn đề hấp dẫn các nhà nghiên cứu Khi khảo sát các cực MFE được tạo ra theo kiểu in situ và ex situ, H Ping Wu cho rằng: cực MFE như một màng mỏng gồm các giọt thủy ngân nhỏ li ti

và liên tục trên cực rắn đĩa , kích thước các giọt thuỷ ngân đó phụ thuộc vào lượng thủy ngân trên bề mặt cực rắn đĩa và thường khoảng từ < 0,1 † 1 μg

Ngoài những ưu điểm giống như đối với cực HMDE, cực MFE còn có một

số ưu điểm khác: do nồng độ của kim loại trong hỗn hống của cực MFE cao hơn, tốc độ khuếch tán của kim loại ra khỏi cực MFE nhanh hơn và có đặc điểm của quá trình điện phân hóa lớp mỏng Mặt khác, có thể sử dụng cực MFE quay, nên điều kiện đối lưu và đi kèm là sự chuyển khối sẽ tốt hơn, do đó cực MFE có độ nhạy và

độ phân giải cao hơn so với cực HMDE, đặc biệt là khi phân tích các kim loại tan được trong thủy ngân tạo hỗn hống Tuy vậy, cực MFE cũng có nhược điểm là các hợp chất “gian kim loại” (intetmetallic) dễ dàng hình thành trên nó khi phân tích các kim loại theo phương pháp ASV và do đó, có thể làm biến dạng tín hiệu von-ampe hào tan và gây sai số, trong khi đó cực HMDE và SMDE lại khắc phục được điều này Mặt khác, độ hồi phục của các phép đo khi đi từ cực MFE này đến cực MFE khác thường kém hơn so với cực HMDE và SMDE

c Cực đĩa rắn

Cả cực HMDE và MFE đều không cho phép xác định các kim loại có thế oxy hóa–khử tương đối dương như Ag, Au,… hoặc các kim loại không tan trong thủy ngân như As, Mn, Nhưng các kim loại đó lại có thể xác định được trên các cực rắn đĩa Cực rắn đĩa là một mặt phẳng tròn (hình đĩa) có đường kính khoảng 2 †

4 mm và được làm bằng các kim loại vật liệu trơ như than thủy tinh (glassy carbon), than nhão (paste carbon), graphit, graphit ngâm tẩm (wax-impregnated graphite), Các cực rắn đĩa thường dùng để xác định các kim loại khác như Ag, Au, Hg theo phương pháp ASV và phân tích một số kim loại khác như Mn, Co, Ce, Sb, As,… theo phương pháp CSV Cực rắn đĩa có nhược điểm là các hợp chất “gian kim loại”

dễ hình thành trên nó và cực dễ bị biến đổi do các kim loại, oxit kim loại,… kết tủa trên bề mặt cực và do đó, kết quả của phép đo trước ảnh hưởng đến phép đo sau, dẫn đến làm giảm độ lặp lại hoặc gây sai số

1.2.3 Các kỹ thuật ghi đường von-ampe

Trong phương pháp SV, để ghi đường von-ampe, người ta có thể dùng các

kỹ thuật khác nhau như von-ampe xung vi phân, von-ampe sóng vuông,… Khi đó, một cách tương ứng, phương pháp von-ampe cũng được gắn thêm tên của các kỹ thuật đó như: von-ampe xung vi phân, von-ampe sóng vuông,… Dưới đây sẽ giới thiệu nguyên tắc của một số kỹ thuật von-ampe thường dùng trong phương pháp von-ampe

1.2.3.1 Kỹ thuật von-ampe xung vi phân (Differential Pulse Voltametry)

Kỹ thuật von-ampe xung vi phân là một trong những kỹ thuật được dùng phổ biến hiện nay Theo kỹ thuật này, những xung thế có biên độ như nhau khoảng 10

†100 mV và bề rộng xung không đổi khoảng 30 † 100 ms được đặt chồng lên mỗi bước thế (xem hình 1.2.a) Dòng được đo hai lần: trước khi nạp xung (I1) và trước khi ngắt xung (I2), khoảng thời gian đo dòng thông thường là 10 † 30 ms Dòng thu được là hiệu của hai giá trị dòng đó (I = I1 - I2) và I được ghi là hàm của thế đặt lên

cực làm việc Biến thiên thế theo thời gian và dạng đường von-ampe hòa tan được nêu ở hình 1.2

Khi xung thế được áp vào, dòng tổng cộng trong hệ sẽ tăng lên do sự tăng dòng Faraday (If) và dòng tụ điện (Ic) Dòng tụ điện giảm nhanh hơn nhiều so với dòng Faraday vì: Ic~ e-t/RC* và If ~ t-1/2; ở đây t là thời gian, R là điện trở, C* là điện dung vi phân của lớp kép Theo cách ghi dòng như trên, dòng tụ điện ghi được trước lúc nạp xung và trước lúc ngắt xung là gần như nhau và do đó, hiệu số dòng ghi được chủ yếu là dòng Faraday Như vậy, kỹ thuật von-ampe xung vi phân cho phép loại trừ tối đa ảnh hưởng của dòng tụ điện [14]

Error!

Hình 1.2 (a) Sự biến thiên thế thời gian, (b) Dạng đường von-ampe trong kỹ thuật von-ampe xung vi phân:

Pulse amplitude - Biên độ xung Voltage step - Bước thế

Start potential - Thế bắt đầu Voltage step time - Thời gian mỗi bước thế Pulse time - Bề rộng xung Peak height - Chiều cao pic

Peak voltage - Thế đỉnh pic

Lund và Onshus đã đưa ra phương trình dòng đỉnh hòa tan xung vi phân (khi phân tích theo phương pháp ASV) trên cực HMDE như sau:

Ip = k n2 r ∆E.ω1/2 tdp.C

(b)

(a)

Trong đó: k - Hằng số

∆E (mV) - Biên độ xung

ω(vòng/giây) - Tốc độ khuấy khi điện phân làm giàu

r (cm) - Bán kính của điện cực HMDE

1.2.3.2 Kỹ thuật von-ampe sóng vuông (Square – wave Voltammetry)

Kỹ thuật von-ampe sóng vuông được Barker đề xuất từ năm 1958 và sau đó được Ostryoung cải tiến vào những năm 1977-1980 [24] Theo kỹ thuật này, những xung sóng vuông đối xứng có biên độ nhỏ và không đổi (khoảng 50/n mV) được đặt chồng lên mỗi bước thế (xem hình 1.3) Trong mỗi chu kỳ xung, dòng được đo ở 2 thời điểm: thời điểm 1 (dòng dương I1) và thời điểm 2 (dòng âm I2) Dòng thu được

là hiệu của hai giá trị dòng đo (I = I1 - I2) và I được ghi là hàm của thế đặt lên cực làm việc Theo cách ghi dòng như vậy, kỹ thuật này loại trừ được tối đa ảnh hưởng của dòng tụ điện

Trong một số trường hợp, kỹ thuật von-ampe sóng vuông có độ nhạy cao hơn so với kỹ thuật von-ampe xung vi phân, nhưng về GHPH, nói chung là tương đương nhau

Hình 1.3 (a) Sự biến thiên thế thời gian

(b) Dạng đường von-ampe trong kỹ thuật von-ampe sóng vuông:

Start potential - thế bắt đầu Peak height - chiều cao pic

Voltametry step - bước thế Peak voltametry - thế đỉnh pic

Amplitude - biên độ

1.3.1 Phương pháp sắc kí

1.3.1.1 Phân tích bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao [28,36,38,40]:

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp sắc ký lỏng chủ yếu được

sử dụng để xác định cloramphenicol, đặc biệt là trong thực phẩm Phương pháp này cho phép xác định cloramphenicol ở cấp độ siêu vết Trên thế giới có rất nhiều các nhóm nghiên cứu sử dụng phương pháp này, trong đó pha tĩnh được sử dụng là pha tĩnh không phân cực C8 hoặc C18 [36,38]

Dung môi động có tính phân cực cao như: Hỗn hợp

H2O/Acetonitril(75/25,v/v) hay hỗn hợp axit axetic 1% trong methanol/H2O (55/45,v/v) Tốc độ pha động 1ml/phút

(a)

(b)

Detectơ thường được sử dụng là UV-VIS ở bước sóng 278nm hay detectơ

MS Detectơ UV-VIS có độ nhạy không cao lắm (LOD khoảng 0,4 – 2 ng/g; trong khi với detectơ MS giá trị LOD có thể đạt đến 0,1ng/g Các kỹ thuật ion hóa thường được sử dụng trong MS như ion hóa ở áp suất thường (Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI) hay kỹ thuật phun ion hóa (Electrospray Ionization, ESI) Trong phương pháp LC/MS/MS, với kỹ thuật APCI, các mũi m/z đặc trưng cho Cloramphenicol là 321, 152, 257 và 194; với kỹ thuật ESI cho các mũi 321, 257, 194, 176 và 152

Phương pháp này thông thường được áp dụng để phân tích hàm lượng cloramphenicol trong thực phẩm Đối với các đối tượng mẫu như trứng, mật ong sữa, tác giả Yanbin Lu [38] còn sử dụng thêm cột chiết pha rắn với ống cacbon đa vách làm chất hấp phụ trước khi mẫu được chạy qua cột sắc ký lỏng kết hợp detectơ khối phổ (HPLC/MS) Với cách làm này, ông đã hạ giới hạn phát hiện của cloramphenicol xuống là 0,004µg/kg, 0,003µg/kg và 0,003µg/L lần lượt với 3 đối tượng trứng, mật ong và sữa Giới hạn định lượng thu được lần lượt là 0,012 µg/kg, 0,09 µg/kg và 0,08 µg/L Hiệu suất thu hồi mẫu rất cao nằm trong khoảng 95,8% đến 102,3%

Về khía cạnh detectơ, nhóm tác giả Van der Lee và các cộng sự [36] đã sử dụng hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao để tách cloramphenicol và nhóm các dẫn xuất của nó sử dụng detectơ điện hóa thay vì detectơ UV thông thường Pha tĩnh được sử dụng là cột C8 (MOS-Hypersil, 5µm), pha động là hỗn hợp axit pecloric:methanol 85:15 và natri 1-pentasulphonat 5.10-4M, tốc độ dòng là 2,2mL/phút Kết quả thu được rất tốt với khoảng tuyến tính là 0,1µg/mL đến 1mg/mL tương đương 3.10-7M đến 3.10-3M, độ nhạy của phương pháp khá cao đạt 0,3nA/ng và giới hạn phát hiện là10ng/mL Tác giả đã chứng minh số liệu thu được khi phân tích bằng hệ sắc ký lỏng sử dụng detectơ điện hóa này (là detectơ đo dòng sử dụng điện cực thủy ngân)

có độ nhạy không kém gì detectơ UV thông thường

1.3.1.2 Phân tích bằng sắc ký khí [16,22,30]

Điều kiện tiến hành phân tích: Pha tĩnh polysiloxan có độ phân cực từ thấp

đến trung bình với tỷ lệ phenyl từ 5-50% (metyl 95-50%), pha động là khí N2, tốc

đọ pha động: 1mL/phút, đầu dò thường được sử dụng là đầu dò ECD hay MS

Các tác giả Allen P Pfenning, Jose E Roybal, heidi S Rupp, Sherri B Turnipspeed, Steve A Gonzales and Jeffrey A Hurbut [16] đã thành công trong việc xác định đồng thời tồn dư của 4 loại kháng sinh trong đó có cloramphenicol trong tôm sử dụng sắc kí khí với detecto ECD Chất nội chuẩn là meta-nitrochloramphenicol Các chất được chiết ra khỏi tôm bằng dung môi etylaxetat và hỗn hợp của nó với acetonitril Hai loại cột được sử dụng là cột C18 và cột polysunfonic với các pha động thích hợp Giới hạn phát hiện đối với cloramphenicol là 0,7 ppb với hiệu suất thu hồi là 88%

Khi dùng detecto MS, thường dùng kỹ thuật bắn phá ion (Electron Impact, EI), hay ion hóa học âm (Negative Ion Chemical Ionization, NICI) Kỹ thuật NICI

có độ nhạy đối với CAP cao hơn EI do trong phân tử cloramphenicol có chứa nguyên tử clo, mà NICI đặc biệt nhạy với các chất có chứa nguyên tố có độ âm điện cao Khi phân tích bằng sắc ký khí, để tăng độ nhạy cho phép phân tích, cloramphenicol thường được dẫn xuất hóa thành trimetylsilyl-cloramphenicol (TMS-CAP) GC/MS, với kỹ thuật NICI, các mũi m/z đặc trưng cho TMS-CAP là

466, 468, 470,376, 378 GC/MS/MS, với kỹ thuật NICI cho các mũi đặc trưng 304,

322, 358, 394, 430 LOD có thể đạt đến 0,1ng/g mẫu [22,30]

1.3.2 Phương pháp quang [19,20,21,25]

Nguyên tắc chung của phương pháp quang này là khử nhóm nitro của cloramphenicol thành nhóm amino để tạo thành hợp chất có màu Các nhóm nghiên cứu khác nhau có thể sử dụng các chất khác nhau để làm tác nhân khử

Nhóm tác giả Devani MB [20] khử nhóm nitro ở gốc hydrocacbon thơm bằng hỗn hợp Zn và Ca/HCl, cho sản phẩm tác dụng với trisodium pentacyanoaminoferrat đế tạo thành sản phẩm có màu đỏ tía có độ hấp thụ cực đại giữa 480 – 540 nm Khoảng nồng độ tuyến tính theo định luật Beer là từ 4 đến 32

µg/mL Tác giả còn áp dụng được phương pháp này vào việc xác định hàm lượng cloramphenicol và các este của nó trong thuốc với hệ số thu hồi là 99,9% đối với cloramphenicol và khoảng 99,9% - 101,06% đối với các este Phương pháp này không bị ảnh hưởng bởi các thuốc khác thường được sử dụng như: benzocaine, lignocaine, sulfadiazine, nitrofurantoin, ascorbic acid, hydrocortisone, prednisolone, streptomycin, and tetracycline…

Hoặc cloramphenicol cũng có thể được khử bằng TiCl3, trong dung dịch axit axetic băng ở nhiệt độ phòng trong vòng 10 phút như nhóm nghiên cứu của Chukwuenweniwe J Enoka [19] đã thực hiện Sản phẩm khử được gia nhiệt với p-dimetylaminobenzaldehit trong 20 phút, sản phẩm tạo thành có màu vàng tươi, hấp thụ mạnh ánh sáng ở vùng khả kiến và tuân theo định luật Beer ở 440nm Theo như tác giả biện luận, phương pháp là sự kế thừa phương pháp của Glazko và Wolf Theo phương pháp cũ, cloramphenicol được khử bằng kali bohydrat trong môi trường kiềm, tiếp đó là sử dụng Pd để tạo thành sản phẩm p-dimetylaminobenzaldehit Tuy nhiên phương pháp này có 2 nhược điểm là chất tạo thành không tan được hoàn toàn trong môi trường kiềm và phản ứng không định lượng

1.3.3 Phương pháp điện hóa [15,35,25,14,37]

1.3.3.1 Cực phổ xung vi phân [35]

Tác giả Van der Lee là người có nhiều nghiên cứu về cloramphenicol, đặc biệt là phát triển các phương pháp điện hóa [35] cũng như chế tạo các cảm biến điện hóa đối với cloramphenicol như đã được đề cập ở trên [38] Trong số đó cơ bản nhất cloramphenicol được xác định bằng phương pháp cực phổ xung vi phân dựa trên sự khử nhóm nitro trên điện cực giọt thủy ngân [35] Dung dịch nền là đệm axetat pH từ 4 đến 6, khoảng xuất hiện pic Ep = -0,23V (dao động từ -23mV đến 56mV) so với điện cực calomen và là -0,27V so với điện cưc Ag/AgCl Khoảng nồng độ có thể xác định là 300ppb đến 20ppm đối với máy Mode 174 và 100ppb

đến 20ppm đối với máy Mode 374 Dựa vào đường chuẩn để xác định hàm lượng cloramphenicol trong mẫu

1.3.3.2 Cực phổ sóng vuông[15,37]

Các tác giả Alemu, Hailemichael; Hlalele, Lebohang [15] sử dụng điện cực cacbon thủy tinh (glasy cacbon) đã được tiền xử lý để tiến hành xác định cloramphenicol trong môi trường đệm CH3COONa/CH3COOH 0,05M pH 5,3 Đường von-ampe vòng cho thấy pic khử của cloramphenicol xuất hiện ở thế -0,646V Khoảng tuyến tính làm việc tốt là 1.0 x 10-7 - 7.0 x 10-5 M cloramphenicol

và giới hạn phát hiện là 6.0 x 10-9 M

Sử dụng vi điện cực cacbon hoạt hóa, phương pháp này được dùng để xác định cloramphenicol ở hàm lượng thấp Điều kiện tối ưu cho phương pháp là sử dụng dung dịch đệm 0,05mol/L HPO42- pH 7,8; Ep = - 0.646V Khoảng tuyến tính 1.10-7 – 1.10-4 mol/L Giới hạn phát hiện 4,7.10-8M [32]

1.3.3.3 Phương pháp phân tích dòng chảy sử dụng detecto điện hóa [34]

Phương pháp này là sự cải tiến của các phương pháp cực phổ thông thường trong cách tiến hành thí nghiệm Thay vì dung dịch đo trong tế bào điện là cố định thì ở phương pháp này, dung dịch đo được thay đổi liên tục thông qua dòng chảy và thao tác bơm mẫu Do đó, việc lặp lại thí nghiệm khá nhanh chóng và tín hiệu đo rất lặp lại ở các lần thí nghiệm khác nhau

Nhóm tác giả người Nhật [34] sử dụng hệ điện cực trong đó điện cực làm việc là màng kim cương mỏng gắn nguyên tố Bo (boron-doped diamond thin-layer), điện cực so sánh Ag/AgCl và cực đối Pt Nền đệm được chọn là đệm photphat pH 6 chứa 1% etanol Thế làm việc E = -0,7V, khoảng tuyến tính thu là 0,1-50 µM (R2=0.9948), giới hạn phát hiện là 0,3µM

1.3.3.4 Phương pháp điện di mao quản sử dụng đầu dò vi sợi cacbon [14]

Phương pháp này đòi hỏi thế áp vào rất cao, khoảng 20kV, trong mỗi lần đo cung cấp một xung 5kV trong thời gian 5s Điều kiện tối ưu cho phương pháp này

là sử dụng dung dịch đệm 8,4.10-4mol/L HOAc – 3,2.10-4mol/L NaOAc Trong phương pháp này, không cần đuổi oxi, điện tích điện cực càng nhỏ thì ảnh hưởng của oxi càng giảm Khoảng tuyến tính 5.10-6 – 1.10-3mol/L, giới hạn phát hiện 9,1.10-7 mol/L

1.3.4 Một số phương pháp khác [17,23,29,31]

Dư lượng Chloramphenicol trước đây thường được phát hiện bằng phương pháp miễn dịch phóng xạ (radioimmunologically) hoặc sắc ký khí (gas chromatographically) Tuy nhiên, xét nghiệm miễn dịch men (enzyme immunoassay) lại cho thấy các ưu điểm rõ rệt so với các phương pháp truyền thống Không cần dùng đến các nguyên liệu phóng xạ, cũng như thời gian thực hiện xét nghiệm giảm đáng kể so với khi thực hiện phương pháp sắc ký khí

Lâu nay muốn kiểm nghiệm sản phẩm một lô hàng thực phẩm thủy sản phải tiến hành lấy mẫu và biết được kết quả cũng phải mất cả tuần Còn muốn nhanh bằng cách mua thiết bị phát hiện (đọc kết quả) thì lại không đủ điều kiện vì hệ thống máy và hóa chất rất đắt tiền, như máy sắc ký

Đó là chưa nói đến việc vận hành mất nhiều thời gian, quy trình nhiều bước phức tạp cần phải có vài nhân viên đạt trình độ kỹ năng nhất định Đặc biệt, do các thiết bị máy móc tinh vi nên việc xử lý mẫu thử rất phức tạp Mặt khác, nhiệt độ phòng, độ ẩm không khí, độ chiếu sáng, hạn chế tối đa các chất trong không khí đều đặt ra rất khắt khe để tránh gây nhiễm môi trường xét nghiệm Từ đó bắt buộc cần phải trang bị phòng vô trùng, tủ đặc biệt thiết kế để đựng dụng cụ xử lý rác và chất thải…

Hiện nay phương pháp phân tích miễn dịch cạnh tranh (ELISA ) là phương pháp tương đối đơn giản, chi phí không quá cao, kết quả xét nghiệm lại chính xác

và có độ tương hợp cao với phương pháp sắc ký Đây phương pháp xét nghiệm nhanh (GICA), dùng để định lượng Chloramphenicol trong mô thịt, cá, tôm… có thời gian xét nghiệm 20 phút, cho độ chính xác trên 95%

Chương 2: NỘI DỤNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nguyên cứu

Trong khóa luận này, chúng tôi nghiên cứu xây dựng quy trình xác định lượng thuốc kháng sinh cloramphenicol theo phương pháp von-ampe, dùng điện cực thủy ngân treo (HMDE) Sau đó áp dụng quy trình tìm được để phân tích một số mẫu thực tế

Để giải quyết những nhiệm vụ đó cần khảo sát các đường von-ampe vòng để tìm hiểu đặc tính von-ampe hòa tan hấp phụ của cloramphenicol trên cực HMDE Qua đó xác định tính thuận nghịch của phản ứng điện cực của chất cần nghiên cứu

Và đồng thời đánh giá khả năng xác định cloramphenicol theo phương pháp ampe

von-Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến thế đỉnh pic (Ep) và giá trị dòng (Ip) khi xác định cloramphenicoltheo phương pháp von-ampe trên cực làm việc HMDE Các yếu tố khảo sát bao gồm:

- Thành phần nền, pH, nồng độ nền

- Ảnh hưởng của tốc độ quét và các thông số kỹ thuật von-ampe xung vi phân

- Ảnh hưởng của oxy hòa tan và các nguyên tố cản

- Đánh giá độ lặp lại và độ phục hồi, độ nhạy, GHPH và khoảng tuyến tính khi dùng cực HMDE Qua đó, đánh giá khả năng ứng dụng của phương pháp

Sau đó trên cơ sở khảo sát các điều kiện tối ưu chúng tôi tiến hành phân tích một số mẫu nước thực tế Áp dụng phương pháp thêm chuẩn để định lượng cloramphenicol

Mục đích của nghiên cứu là làm tăng độ chính xác, độ lặp lại, giới hạn phát hiện của phép phân tích

2.2 Phương pháp nguyên cứu

2.2.1 Tiến trình thí nghiệm theo phương pháp von-ampe với kỹ thuật đo xung

vi phân

Các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến tín hiệu điện hóa (Ep

và Ip) của cloramphenicol được thực hiện đối với mẫu tự tạo Tất cả các thí nghiệm đều được tiến hành ở nhiệt độ phòng, thường là 250C Tiến trình thực hiện các thí nghiệm được bố trí theo một trình tự nhất định

2.2.2 Ghi đường von-ampe

Chuẩn bị dung dịch nghiên cứu chứa thành phần nền và chất chuẩn cloramphenicol, điều chỉnh pH phù hợp rồi cho vào bình điện phân 3 cực: cực HMDE, cực so sánh Ag/AgCl và cực phụ trợ Pt Tiếp theo, xục khí N2 với thời gian thích hợp để đuổi O2 Sau đó, quét thế từ âm sang dương với khoảng thế nhất định, đồng thời ghi đường von-ampe hòa tan bằng kỹ thuật von-ampe xung vi phân với thông số kỹ thuật thích hợp Cuối cùng, xác định thế và dòng đỉnh hòa tan (Ep và Ip)

từ đường von-ampe thu được

Toàn bộ quá trình ghi đường von-ampe hòa tan và xác định Ep, Ip đều được thực hiện tự động trên máy cực phổ 757 VA theo một chương trình được đưa vào từ bàn phím

2.2.3 Các yếu tố đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích [8]

Một phép đo hay một phương pháp phân tích (PPPT) bất kỳ, được các phòng thí nghiệm thừa nhận và áp dụng vào thực tế, chỉ khi nó có độ tin cậy cao Chính vì vậy, khi nghiên cứu phát triển PPPT, nhất thiết phải đánh giá độ tin cậy của nó Các yếu tố đánh giá độ tin cậy của một phép đo cũng như một PPPT bao gồm: độ lặp lại,

độ nhạy, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng, Các yếu tố này bắt buộc phải xây dựng và công bố với bất kỳ một phương pháp nào [8]

a Độ lặp lại và độ hồi phục

Độ lặp lại (repeatability) và độ hồi phục (reproducibility), một cách tương ứng là độ sai lệch giữa các giá trị riêng lẻ xi và giá trị trung bình đo được (hay xác định được) trong những điều kiện (người phân tích, phương pháp, thời gian, thiết bị

và hóa chất, ) giống nhau và không giống nhau Độ lặp lại và độ phục hồi đều được xác định qua độ lệch chuẩn hoặc độ lệch chuẩn tương đối (hệ số biến động) Như vậy, khi độ lệch chuẩn (S) hoặc độ lệch chuẩn tương đối (RSD) càng lớn, thì sai số của phép đo hay của PPPT càng lớn

b Độ nhạy

Một cách tổng quát, độ nhạy của phép đo hay PPPT được xác định bởi độ biến thiên của tín hiệu đo (y) khi có biến thiên của thông số kích thích, chẳng hạn nồng độ của chất phân tích (C), hoặc pH, nhiệt độ, Như vậy, độ nhạy chính là độ dốc của đường chuẩn Nếu phương trình đường chuẩn có dạng y = a + bC, thì độ nhạy = ∆y/ ∆C = b

c Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Có hai cách xác định yb và Sb:

 Cách 1:

Tiến hành n thí nghiệm để xác định nồng độ mẫu trắng, thu đuợc các giá trị ybi (i

= 1 † n) từ đó tính yb và Sb theo các công thức sau:

yb = Σybi/n; Sb= (ybi-yb)2 (n-1)Sau đó tính LOD Việc xác định yb và Sb nhƣ vậy sẽ tốn nhiều thời gian Để giảm số lƣợng thí nghiệm và tính nhanh LOD có thể tiến hành theo cách 2

2.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

2.3.1 Thiết bị và dụng cụ

- Máy đo pH meter TOA - Nhật Bản

- Cân phân tích STARTORIUS (độ chính xác 0,2 mg)

- Thiết bị phân tích điện hóa 757-VA COMPUTRACE có ghép nối với máy tính và phần mềm điều khiển, do hãng Metrohm, Thủy Sĩ sản xuất

Hệ điện cực:

+ Cực làm việc: điện cực giọt thủy ngân (HMDE)

+ Cực so sánh: Ag/AgCl/KCl (bão hòa)

- Nước dùng để pha chế hóa chất và tráng rửa dụng cụ là nước cất 2 lần

- Các hóa chất được sử dụng đều thuộc loại tinh khiết (PAR)

Các dung dịch đệm acetat (CH3COONa + CH3COOH) có nồng độ và pH khác nhau được pha từ tinh thể CH3COONa.3H2O và CH3COOH tinh khiết với các tỷ lệ thích hợp

- Các dung dịch chuẩn cloramphenicol được pha hàng ngày bằng cách pha loãng các dung dịch chuẩn “gốc” có nồng độ 100ppm (được bảo quản trong tủ lạnh và dùng trong 3 ngày)

Hình 2.1 Thiết bị phân tích điện hóa 757 – VA,

metrhm