đánh giá độc tính của tartrazine lên sự phát triển của phôi cá ngựa vằn

Nồng độ dung dịch thí nghiệm...11Biểu đồ 1...12 PHẦN IV: TỔNG KẾT...20 THAM KHẢO...21 KÍ HIỆU VIẾT TẮT Dpf Ngày sau thụ tinh Hpf Giờ sau thụ tinh LC50 Median lethal concentration – nồng

Tên đề tài: ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA TARTRAZINE LÊN SỰ PHÁT

TRIỂN CỦA PHÔI CÁ NGỰA VẰN

Lĩnh vực: Biochemistry

NGƯỜI HƯỚNG DẪN

- TS Lê Quỳnh Liên

- Đơn vị công tác: Viện Hóa sinh biển,

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ

MỤC LỤC 1

DANH MỤC BẢNG 2

PHẦN I: LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI 3

I.1 Lí do chọn đề tài 3

PHẦN II: TỔNG QUAN 4

II.1 Tartrazine 4

II.2 Phôi cá ngựa vằn với vai trò đối tượng thử độc tính 5

II.3 Tính mới của đề tài: 5

PHẦN III: QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ 5

III.1 QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU 5

III.2 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 11

Bảng 4 Nồng độ dung dịch thí nghiệm 11

Biểu đồ 1 12

PHẦN IV: TỔNG KẾT 20

IV.1 Kết luận 20

IV.2 Dự kiến mở rộng đề tài 20

THAM KHẢO 21

DANH MỤC BẢNG MỤC LỤC 1

DANH MỤC BẢNG 2

PHẦN I: LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI 3

PHẦN II: TỔNG QUAN 4

PHẦN III: QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ 5

Bảng 4 Nồng độ dung dịch thí nghiệm 11

Biểu đồ 1 12

PHẦN IV: TỔNG KẾT 20

THAM KHẢO 21

KÍ HIỆU VIẾT TẮT

Dpf Ngày sau thụ tinh

Hpf Giờ sau thụ tinh

LC50

Median lethal concentration – nồng độ chất cần thiết để làm chết 50% cá thể ở cuối thí nghiệm

EC50

Half Maximal effective concentration – nồng độ gây dị dạng cho 50% phôi thí nghiệm

TI

Teratogenic index - chỉ số đánh giá mức độ độc hại của hóa chất

TI = LC50/EC50 Nếu TI > 1, hóa chất được coi là chất có ảnh hưởng gây quái thai là chủ yếu, nếu TI<1, hóa chất được cho là chất có ảnh hưởng gây chết là chủ yếu

ADHD Attention deficit hyperactivity disorder: rối loạn tăng động giảm

chú ý

PHẦN I: LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI I.1 Lí do chọn đề tài

Các chất hóa học đã trở thành một phần không thể tách rời của cuộc sống hiện đại Vai trò của các hóa chất là không thể thay thế trong các ngành công nghiệp và kinh

tế hiện đại, nhất là các ngành liên quan đến sản xuất hàng hóa Bên cạnh những lợi ích nhãn tiền của hóa chất, một số loại hóa chất và cách sử dụng chưa hợp lí của con người đang tạo ra những tác động tiêu cực lên môi trường và sức khỏe con người Việc thử độc tố của các chất hóa học trong thế kỷ XXI ngày càng trở nên cấp thiết

Phôi cá ngựa vằn (tên khoa học là Danio rerio) là một mô hình độc tính hóa chất

ngày càng phổ biến với nhiều đặc tính ưu việt như dễ dàng quan sát sự phát triển bởi phôi cá ngựa vằn trong suốt, có thể quan sát được những biến đổi về hình thái bên trong, số lượng phôi lớn và có thể chủ động, quá trình phát triển phôi sớm (gần giống với sự phát triển của các loài động vật có xương sống, hệ gen đã được giải mã và tương đồng cao với con người) Hơn nữa phương pháp nghiên cứu sử dụng phôi cá ngựa vằn

sẽ giúp tiết kiệm nhiều thời gian, chi phí và không vấp phải các vấn đề đạo đức

Tartrazine là một chất phụ gia được đánh số E102 trong Hệ thống đánh số phụ gia thực phẩm được Ủy ban mã thực phẩm châu Âu chấp nhận, là một phụ gia thực phẩm hiện được sử dụng rộng rãi trong việc nhuộm màu vàng cho nhiều loại thực phẩm như:

mì tôm, kem, nước ngọt có ga, kẹo, ngũ cốc, Ngoài việc sử dụng riêng để tạo màu

vàng, Tartrazine còn được dùng chung với Brilliant Blue FCF (E133) và Green S

(E142) để tạo các màu xanh lá Gần đây, một số nghiên cứu khoa học đã tìm thấy mối liên hệ của Tartrazine với một số biến đổi trong cấu trúc và chức năng của hệ tuần hoàn hoặc thần kinh, đặc biệt là các nghi vấn liên quan đến hội chứng tăng động giảm chú ý ở người Việc đánh giá toàn diện và sâu sắc hơn độc tính và ảnh hưởng của các phụ gia thực phẩm đang trở thành mối quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu cũng như các nhà quản lý về an toàn thực phẩm, sức khỏe con người

Xuất phát từ các thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của

Tartrazine lên phôi cá ngựa vằn Do đó chúng tôi chọn đề tài “Đánh giá độc tính của Tartrazine lên sự phát triển của phôi cá ngựa vằn”.

PHẦN II: TỔNG QUAN II.1 Tartrazine

Tartrazine được kí hiệu là E102 trong hệ thống mã thực phẩm của Ủy ban mã thực phẩm Châu Âu Tan tốt trong nước, ít tan trong ethanol Tartrazine trong dung môi nước có đặc tính của ion dương Khi tiếp xúc với mắt, Tartrazine có thể gây ngứa và tổn thương ở một vài đối tượng Khi tiếp xúc với da, Tartrazine có thể gây ảnh hưởng tới sức khỏe khi tiếp xúc với các vết trầy xước và tổn thương Tartrazine chưa được chứng minh có hại khi bị nuốt phải bởi thiếu cơ sở thí nghiệm đầy đủ trên người và động vật

Ở một số đối tuợng, Tartrazine có thể gây dị ứng đối với da Khi bị hít phải, Tartrazine

có thể gây kích ứng họng và phổi Tartrazine cũng bị nghi vấn gây tăng động giảm chú ý.

II.2 Phôi cá ngựa vằn với vai trò đối tượng thử độc tính

Phôi cá ngựa vằn có nhiều đặc điểm ưu việt để trở thành mẫu thử độc tính ngày càng được ưa chuộng ở các phòng thí nghiệm Thứ nhất, phôi cá ngựa vằn là một cá thể sống tách biệt và độc lập nhưng chưa phải là động vật (vẫn còn là phôi) nên không vướng phải các vấn đề về đạo đức Thứ hai, số lượng phôi sinh sản rất cao từ 50 - 300 phôi/một cặp cá/tuần và thời gian sinh trưởng ngắn làm phôi cá ngựa vằn trở thành một mẫu thử tiềm năng để áp dụng vào việc thử hóa chất Bên cạnh đó, sự phát triển của phôi cá ngựa vằn khá giống với sự phát triển của hầu hết các loài động vật có xương sống, nhưng nhanh hơn (hình thành ấu trùng sau 72 giờ ), có thể quan sát được dưới kính hiển vi Bộ gen của loài này chung với bộ gen của con người từ 60 - 80%, trong đó

có cả các gen liên quan tới các đặc điểm vận động

II.3 Tính mới của đề tài:

Tartrazine là một chất phụ gia được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm và được cho là rất ít độc cho con người khi tiếp nhận theo đường tiêu hóa Chính vì vậy, những nghiên cứu cụ thể về Tartrazine sẽ làm cơ sở vững chắc để biết được mức độ độc hại của Tartrazine lên cơ thể sống Với một đối tượng thử độc tính mới có nhiều đặc tính ưu việt là phôi cá ngựa vằn, nghiên cứu của nhóm đề tài sẽ phần nào làm rõ hơn được điều này Tartrazine tuy không phải là một chất mới được tìm ra song việc nghiên cứu tính độc hại của chất này trên phôi cá ngựa vằn chưa được một tài liệu nào trên thế giới công

bố Đề tài này sẽ đưa ra những số liệu khách quan để phản ánh ảnh hưởng của Tartrazine lên phôi cá ngựa vằn, qua đó làm cơ sở để liên hệ với ảnh hưởng của Tartrazine lên cơ thể người

PHẦN III: QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ III.1 QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU

III.1.1 Mục đích nghiên cứu

Đề tài này nhắm tới việc tìm hiểu ảnh hưởng độc tính của Tartrazine lên phôi cá ngựa vằn để đưa ra những số liệu để phản ánh được mức độ độc tính của Tartrazine trên phôi cá ngựa vằn

Đề tài hướng tới những mục đích chính như sau:

• Nghiên cứu tìm ra khoảng nồng độ trong đó Tartrazine thể hiện ảnh hưởng độc tính tới phôi cá ngựa vằn.

• Nghiên cứu các kiểu biến dạng chính mà Tartrazine gây ra cho phôi cá ngựa vằn

• Tìm được các giá trị LC50, EC50, TI là những giá trị thể hiện cho mức độ độc hại của Tartrazine lên phôi cá ngựa vằn

Công thức hóa học chất Sử

dụng

Tartrazine

Sigma Aldrich (Cas No:1934-21-0)

50g/l (trong

Dung dịch gốc (stock solution) được chuẩn bị bằng việc pha trộn hóa chất tinh khiết với dung dịch E3 được pha với methylene blue nồng độ 10-4% mục đích làm dung môi pha chế có tính diệt khuẩn (không gây ảnh hưởng tới phôi)

Dung dịch gốc sau đó cũng sẽ được pha loãng trong E3 tới các nồng độ mong muốn

III.1.2.2 Dụng cụ thí nghiệm

Bảng 2 Danh sách dụng cụ sử dụng trong thí nghiệm

Micropipette 10-1000µL Gilson (Hoa Kì)

Đĩa 24-giếng Corning (Hoa Kì)

III.1.3 Phương pháp tiến hành

Dựa theo hướng dẫn của OECD về việc thực hiện thí nghiệm thử độc tính trên phôi cá ngựa vằn vào 2013, thực nghiệm được tiến hành theo các bước sau:

• Ghép cá bố mẹ để cho sinh sản

• Thu nhận và rửa phôi

• Chọn phôi đang phát triển

• Phơi nhiễm phôi trong hóa chất

• Đánh giá các biến đổi hình thái phôi và xác định tỷ lệ phôi chết

• Phân tích kết quả

III.1.3.1 Nuôi dưỡng cá ngựa vằn trưởng thành

Tập hợp và chọn cá trưởng thành: Ấu trùng cá ngựa vằn được giữ trong bể nuôi,

nhiệt độ 26 - 28°C, theo chu kì 14h sáng/10h tối trong 1 ngày, cho ăn hàng ngày và hút chất thải 2h sau khi cho ăn Đến khi cá trưởng thành (sau 5 - 6 tháng), cá đực và cá cái được tách riêng vào các bể khác nhau Các con trưởng thành được chia thành các cặp, giao phối theo cặp, mỗi cặp từ 3 đến 4 lần Nếu kết quả tốt thì cá được tách nhau ra Ngược lại, tráo các cặp và giao phối lại để chọn những con đực và cái có khả năng sinh sản tốt Những cặp tốt sẽ có những đặc tính sau: trung bình khoảng 100 trứng mỗi lần sinh sản (3 - 4 ngày), tỷ lệ thụ tinh cao (trên 90%), tỷ lệ phôi thụ tinh nở cao hơn 75%,

tỷ lệ phôi dị dạng nhỏ hơn 10%

Hình 1 Bể nuôi cá ngựa vằn trưởng thành

Sinh sản:

Trước ngày sinh sản, thả cá đực và cá cái vào cùng một bể chứa được ngăn cách bởi một tấm lưới

Cá bắt đầu quá trình thụ tinh ở đầu chu kì sáng vào ngày hôm sau Lưới được bỏ

và đưa một tấm lưới khác trong bể để tránh cá ăn phôi Thời gian thụ tinh kéo dài 25 –

30 phút, sau đó cá bố mẹ được chuyển trả về bể nuôi Phôi được hút vào khay, rửa bằng nước sạch để loại bỏ chất bẩn và phôi không thụ tinh, sau đó được bảo quản trong đĩa nước cất Thời điểm này được tính là 0dpf tức 0 ngày sau thụ tinh

Chọn phôi: Ở 2 giờ sau thụ tinh ( 2hpf), phôi được chọn dưới kính hiển vi Ở giai

đoạn này, thường các phôi sẽ có 32, 64,hoặc 128 tế bào Chỉ có các phôi hình thái bình thường ( trên thành phôi và trong noãn hoàng) và phân cắt đồng đều mới được chọn

Hình 2 Đĩa chọn phôi

III.1.3.2 Phơi nhiễm hóa chất và quan sát phôi

Pha chế dung dịch: chuẩn bị hóa chất vào ngày trước , với các nồng độ thí

nghiệm được xác định từ các thí nghiệm giới hạn trước đó

Phơi nhiễm hóa chất:

Sử dụng thí nghiệm giới hạn để xác định khoảng nồng độ thích hợp cho thí nghiệm Thí nghiệm giới hạn là thí nghiệm nhằm xác định khoảng giới hạn nồng độ thí nghiệm cho thí nghiệm chính thức, trong đó nồng độ thấp nhất là nồng độ mà các phôi phơi nhiễm không bị chết hay dị dạng, còn nồng độ cao nhất là nồng độ làm tất cả các phôi phơi nhiễm đều bị chết trong vòng 24h phơi nhiễm

Xác định nồng độ hóa chất cần thí nghiệm và chuẩn bị đĩa chứa dung dịch hóa chất trước khi phơi nhiễm

Dung dịch E3 1X được sử dụng làm đĩa đối chứng âm Tartrazine là chất phơi nhiễm

Các nồng độ Tartrazine sử dụng trong thí nghiệm là: 0.2g/l, 0.5g/l, 1g/l, 2g/l, 4g/l, 8g/l, 16g/l.

1ml hóa chất được bơm vào từng giếng và mỗi đĩa chứa một nồng độ Mỗi đĩa gồm 20 giếng phơi nhiễm hóa chất và 4 giếng đối chứng nội chứa dung dịch E3 1X

Mỗi giếng chứa 1 phôi

Mỗi ngày, hóa chất và E3 sẽ được thay thế 700 µl mỗi giếng Phơi nhiễm kéo dài đến 4dpf (96hpf)

Quan sát phôi: Đánh giá sự phát triển của phôi dựa trên các tiêu chuẩn sau:

Bảng 3 Bảng đánh giá sự phát triển phôi

III.1.3.3 Phương pháp đánh giá

Mỗi thí nghiệm được làm lại ít nhất 3 lần

Nếu chỉ có ít hơn 2 phôi chết trong 4 phôi ở các giếng đối chứng nội thì kết quả thí nghiệm ở đĩa đó được chấp nhận Ngược lại thì bỏ qua kết quả đĩa đó.

Phân tích kết quả sử dụng phần mềm GraphPad Prism 6.0 để tính được LC50,

EC50, và TI

Trong đề tài này, mẫu thí nghiệm độc tính có thể được thực hiện bằng cách sử dụng các điểm đầu cuối khác nhau mà trong số đó có thể là bất kỳ quá trình sinh học hoặc hóa học, phản ứng, hoặc tác dụng, đánh giá của một bài kiểm tra Các tiêu chí cơ bản nhất là sự sống còn và quan sát hình thái học trong và sau khi tiếp xúc với hóa chất

ở các giai đoạn khác nhau Sau đó, tất cả các giá trị này sẽ được phân tích bằng phần mềm thống kê, các đường cong nồng độ phản ứng có thể được tạo ra và các chỉ số độc tính có thể thu được Có 3 chỉ số quan trọng trong nghiên cứu của chúng tôi:

LC50: Median lethal concentration – nồng độ chất cần thiết để làm chết 50% cá thể ở cuối thí nghiệm

EC50: Half Maximal effective concentration – nồng độ mà 50% cá thể chịu ảnh hưởng dị dạng

TI là một chỉ số để đánh giá khả năng gây dị dạng của hóa chất TI được tính theo công thức:

TI = LC50/EC50

Nếu TI>1, hóa chất được coi là chất có ảnh hưởng gây quái thai là chủ yếu

Nếu TI<1, hóa chất được cho là chất có ảnh hưởng gây chết là chủ yếu

III.2 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

III.2.1 Kết quả của thí nghiệm giới hạn

Để xác định chính xác khoảng nồng độ cho các thí nghiệm, những thí nghiệm giới hạn đã được thực hiện nhiều lần

Sau nhiều lần thí nghiệm, khoảng nồng độ thí nghiệm được thể hiện trong bảng dưới đây.

Bảng 4 Nồng độ dung dịch thí nghiệm

III.2.2 Kết quả thí nghiệm

Sau 24h:

Không có nhiều biến dạng được quan sát một cách rõ ràng tại thời điểm này Từ khoảng nồng độ 0.2g/l đến 4g/l, không có phôi nào bị chết Ở các nồng độ cao hơn, tỷ

lệ sống giảm xuống, cụ thể: trên 50% ở nồng độ 8g/l và 0% ở nồng độ 16g/l

Sau khi xử lý số liệu bằng phần mềm, thu được LC50= 9.803g/l

Từ khoảng nồng độ 0.2g/l đến 4g/l, không có phôi nào bị chết Ở các nồng độ cao hơn, tỷ lệ sống giảm xuống, cụ thể: trên 70% ở nồng độ 8g/l và 0% ở nồng độ 16g/l

Tỷ lệ dị dạng tăng chậm theo các nồng độ song không rõ rệt

Sau khi xử lý số liệu bằng phần mềm thu được LC50= 9.858g/l

Tất cả các mẫu đối chứng đều không có các phôi chết hay dị dạng

Từ khoảng nồng độ 0.2g/l đến 4g/l, không có phôi nào bị chết Ở các nồng độ cao hơn, tỷ lệ sống giảm xuống, cụ thể: trên 70% ở nồng độ 8g/l và 0% ở nồng độ 16g/l

Ở giai đoạn 72h do các phôi bước vào giai đoạn nở thành ấu trùng, chúng di chuyển rất nhanh trong giếng nên khó có thể quan sát được các ảnh hưởng biến dạng một cách chính xác nên nhóm đã bỏ đường đồ thị biểu hiện tỷ lệ phôi dị dạng ở 72h.

Sau khi xử lý số liệu bằng phần mềm thu được LC50= 9.701g/l

Tỷ lệ dị dạng tăng đều theo chiều tăng dần của nồng độ Từ xấp xỉ 0% ở 0.2g/l tỷ

lệ dị dạng tăng dần và vượt ngưỡng 50% từ nồng độ 1g/l

Ở 96h, chúng tôi so sánh tỷ lệ dị dạng của mỗi kiểu dị dạng:

III.2.3 Ảnh hưởng của Tartrazine tới hình thái phôi cá ngựa vằn

Sau 24h:

A Phôi đối chứng bình thường ở 24h

B Phôi ở nồng độ 4g/l không có biểu hiện bất thường

C Phôi ở nồng độ 16g/l cơ thể bị phân huỷ.

Sau 48h:

D Phôi ở nồng độ 2g/l nở sớm.

E Phôi ở nồng độ 4g/l có dấu hiệu bị tụ máu noãn hoàng (a) và hoại tử noãn hoàng (b)

F Phôi bị phù noãn hoàng, không thấy rõ mắt.

Sau 96h:

G Ấu trùng đối chứng có thân thẳng, mắt to, noãn dẹt lại, có sắc tố và cơ thể có đốt

H Ấu trùng ở 0.2g/l phát triển bình thường, có dấu hiệu bị tụ máu nhẹ song không đáng

kể

I Ấu trùng ở 0.5g/l có dấu hiệu bị tụ máu ở phía trên noãn (c)

J Ấu trùng ở 1g/l có noãn bị phình to (d) và bị tụ máu phía trong noãn (e) khiến cơ thể

bị cong gập

K Ấu trùng ở 2g/l bị hoại tử (f) và tụ máu (g) ở noãn, bị phù đầu (h)

L Ấu trùng ở 4g/l bị hoại tử noãn nghiêm trọng (i) và cong đuôi ở đằng lưng (j)

M Ấu trùng ở 8g/l bị tụ máu ở noãn (k) và bị phù đầu nghiêm trọng (l)

PHẦN IV: TỔNG KẾT IV.1 Kết luận

Thí nghiệm đã đạt được kết quả sau:

• Tartrazine chỉ thể hiện độc tính lên sự phát triển của phôi cá ngựa vằn ở khoảng nồng độ cao 0.2g/l tới 16g/l

• Tartrazine có TI=6.16 >1 sau 96 giờ phơi nhiễm do đó ban đầu chúng tôi nhận định đây là chất chất gây quái thai ở nồng độ gây độc

• Kiểu dị dạng đặc trưng mà Tartrazine gây ra là tụ máu và phù noãn hoàng

IV.2 Dự kiến mở rộng đề tài

• Tìm hiểu về cơ chế hoạt động của Tartrazine trong cơ thể, thời gian phân hủy của Tartrazine qua đó dự đoán mức độ ảnh hưởng của Tartrazine lên cơ thể khi tiếp xúc với các loại thực phẩm có chứa Tartrazine trong thời gian dài

• Nghiên cứu sự ảnh hưởng của Tartrazine lên các thế hệ con cháu của thế hệ ban đầu đã bị phơi nhiễm với Tartrazine

• Nghiên cứu tác động của Tartrazine tới hoạt động chức năng của hệ tuần hoàn, thần kinh và cơ