đánh giá độc tính của tartrazine lên sự phát triển của phôi cá ngựa vằn

SỞ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HÀ NỘI TRƯỜNG THPT HÀ NỘI – AMSTERDAM (CẦU GIẤY) ************** ĐỀ TÀI DỰ THI KHOA HỌC, KỸ THUẬT DÀNH CHO HỌC SINH TRUNG HỌC CẤP THÀNH PHỐ LẦN THỨ TƯ (NĂM HỌC 2014 - 2015) Tên đề tài: ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA TARTRAZINE LÊN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI CÁ NGỰA VẰN Lĩnh vực: Biochemistry NGƯỜI HƯỚNG DẪN - TS. Lê Quỳnh Liên - Đơn vị công tác: Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. TÁC GIẢ: 1. Nguyễn Thanh Khoa Lớp: 11H1 Trường: THPT Hà Nội- Amsterdam 2. Bùi Minh Đức Lớp: 11A1 Trường: THPT Hà Nội-Amsterdam Hà Nội, tháng 12 năm 2013 MỤC LỤC MỤC LỤC 1 1 DANH MỤC BẢNG 2 PHẦN I: LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI 3 I.1. Lí do chọn đề tài 3 PHẦN II: TỔNG QUAN 4 II.1. Tartrazine 4 II.2. Phôi cá ngựa vằn với vai trò đối tượng thử độc tính 5 II.3. Tính mới của đề tài: 5 PHẦN III: QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ 5 III.1. QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU 5 III.2. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 11 Bảng 4. Nồng độ dung dịch thí nghiệm 11 Biểu đồ 1 12 PHẦN IV: TỔNG KẾT 20 IV.1. Kết luận 20 IV.2. Dự kiến mở rộng đề tài 20 THAM KHẢO 21 DANH MỤC BẢNG MỤC LỤC 1 DANH MỤC BẢNG 2 PHẦN I: LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI 3 PHẦN II: TỔNG QUAN 4 PHẦN III: QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ 5 Bảng 4. Nồng độ dung dịch thí nghiệm 11 2 Biểu đồ 1 12 PHẦN IV: TỔNG KẾT 20 THAM KHẢO 21 KÍ HIỆU VIẾT TẮT Dpf Ngày sau thụ tinh Hpf Giờ sau thụ tinh LC 50 Median lethal concentration – nồng độ chất cần thiết để làm chết 50% cá thể ở cuối thí nghiệm EC 50 Half Maximal effective concentration – nồng độ gây dị dạng cho 50% phôi thí nghiệm TI Teratogenic index - chỉ số đánh giá mức độ độc hại của hóa chất. TI = LC 50 /EC 50 . Nếu TI > 1, hóa chất được coi là chất có ảnh hưởng gây quái thai là chủ yếu, nếu TI<1, hóa chất được cho là chất có ảnh hưởng gây chết là chủ yếu ADHD Attention deficit hyperactivity disorder: rối loạn tăng động giảm chú ý PHẦN I: LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI I.1. Lí do chọn đề tài Các chất hóa học đã trở thành một phần không thể tách rời của cuộc sống hiện đại. Vai trò của các hóa chất là không thể thay thế trong các ngành công nghiệp và kinh tế hiện đại, nhất là các ngành liên quan đến sản xuất hàng hóa. Bên cạnh những lợi ích nhãn tiền của hóa chất, một số loại hóa chất và cách sử dụng chưa hợp lí của con người đang tạo ra những tác động tiêu cực lên môi trường và sức khỏe con người. Việc thử độc tố của các chất hóa học trong thế kỷ XXI ngày càng trở nên cấp thiết. Phôi cá ngựa vằn (tên khoa học là Danio rerio) là một mô hình độc tính hóa chất ngày càng phổ biến với nhiều đặc tính ưu việt như dễ dàng quan sát sự phát triển bởi phôi cá ngựa vằn trong suốt, có thể quan sát được những biến đổi về hình thái bên 3 trong, số lượng phôi lớn và có thể chủ động, quá trình phát triển phôi sớm (gần giống với sự phát triển của các loài động vật có xương sống, hệ gen đã được giải mã và tương đồng cao với con người). Hơn nữa phương pháp nghiên cứu sử dụng phôi cá ngựa vằn sẽ giúp tiết kiệm nhiều thời gian, chi phí và không vấp phải các vấn đề đạo đức. Tartrazine là một chất phụ gia được đánh số E102 trong Hệ thống đánh số phụ gia thực phẩm được Ủy ban mã thực phẩm châu Âu chấp nhận, là một phụ gia thực phẩm hiện được sử dụng rộng rãi trong việc nhuộm màu vàng cho nhiều loại thực phẩm như: mì tôm, kem, nước ngọt có ga, kẹo, ngũ cốc, Ngoài việc sử dụng riêng để tạo màu vàng, Tartrazine còn được dùng chung với Brilliant Blue FCF (E133) và Green S (E142) để tạo các màu xanh lá. Gần đây, một số nghiên cứu khoa học đã tìm thấy mối liên hệ của Tartrazine với một số biến đổi trong cấu trúc và chức năng của hệ tuần hoàn hoặc thần kinh, đặc biệt là các nghi vấn liên quan đến hội chứng tăng động giảm chú ý ở người. Việc đánh giá toàn diện và sâu sắc hơn độc tính và ảnh hưởng của các phụ gia thực phẩm đang trở thành mối quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu cũng như các nhà quản lý về an toàn thực phẩm, sức khỏe con người. Xuất phát từ các thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của Tartrazine lên phôi cá ngựa vằn. Do đó chúng tôi chọn đề tài “Đánh giá độc tính của Tartrazine lên sự phát triển của phôi cá ngựa vằn”. PHẦN II: TỔNG QUAN II.1. Tartrazine Tartrazine được kí hiệu là E102 trong hệ thống mã thực phẩm của Ủy ban mã thực phẩm Châu Âu. Tan tốt trong nước, ít tan trong ethanol. Tartrazine trong dung môi nước có đặc tính của ion dương. Khi tiếp xúc với mắt, Tartrazine có thể gây ngứa và tổn thương ở một vài đối tượng. Khi tiếp xúc với da, Tartrazine có thể gây ảnh hưởng tới sức khỏe khi tiếp xúc với các vết trầy xước và tổn thương. Tartrazine chưa được chứng minh có hại khi bị nuốt phải bởi thiếu cơ sở thí nghiệm đầy đủ trên người và động vật. Ở một số đối tuợng, Tartrazine có thể gây dị ứng đối với da. Khi bị hít phải, Tartrazine có thể gây kích ứng họng và phổi. Tartrazine cũng bị nghi vấn gây tăng động giảm chú ý. 4 II.2. Phôi cá ngựa vằn với vai trò đối tượng thử độc tính Phôi cá ngựa vằn có nhiều đặc điểm ưu việt để trở thành mẫu thử độc tính ngày càng được ưa chuộng ở các phòng thí nghiệm. Thứ nhất, phôi cá ngựa vằn là một cá thể sống tách biệt và độc lập nhưng chưa phải là động vật (vẫn còn là phôi) nên không vướng phải các vấn đề về đạo đức. Thứ hai, số lượng phôi sinh sản rất cao từ 50 - 300 phôi/một cặp cá/tuần và thời gian sinh trưởng ngắn làm phôi cá ngựa vằn trở thành một mẫu thử tiềm năng để áp dụng vào việc thử hóa chất. Bên cạnh đó, sự phát triển của phôi cá ngựa vằn khá giống với sự phát triển của hầu hết các loài động vật có xương sống, nhưng nhanh hơn (hình thành ấu trùng sau 72 giờ ), có thể quan sát được dưới kính hiển vi. Bộ gen của loài này chung với bộ gen của con người từ 60 - 80%, trong đó có cả các gen liên quan tới các đặc điểm vận động. II.3. Tính mới của đề tài: Tartrazine là một chất phụ gia được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm và được cho là rất ít độc cho con người khi tiếp nhận theo đường tiêu hóa. Chính vì vậy, những nghiên cứu cụ thể về Tartrazine sẽ làm cơ sở vững chắc để biết được mức độ độc hại của Tartrazine lên cơ thể sống. Với một đối tượng thử độc tính mới có nhiều đặc tính ưu việt là phôi cá ngựa vằn, nghiên cứu của nhóm đề tài sẽ phần nào làm rõ hơn được điều này. Tartrazine tuy không phải là một chất mới được tìm ra song việc nghiên cứu tính độc hại của chất này trên phôi cá ngựa vằn chưa được một tài liệu nào trên thế giới công bố. Đề tài này sẽ đưa ra những số liệu khách quan để phản ánh ảnh hưởng của Tartrazine lên phôi cá ngựa vằn, qua đó làm cơ sở để liên hệ với ảnh hưởng của Tartrazine lên cơ thể người. PHẦN III: QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ III.1. QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU III.1.1. Mục đích nghiên cứu Đề tài này nhắm tới việc tìm hiểu ảnh hưởng độc tính của Tartrazine lên phôi cá ngựa vằn để đưa ra những số liệu để phản ánh được mức độ độc tính của Tartrazine trên phôi cá ngựa vằn. Đề tài hướng tới những mục đích chính như sau: • Nghiên cứu tìm ra khoảng nồng độ trong đó Tartrazine thể hiện ảnh hưởng độc tính tới phôi cá ngựa vằn. 5 • Nghiên cứu các kiểu biến dạng chính mà Tartrazine gây ra cho phôi cá ngựa vằn. • Tìm được các giá trị LC 50 , EC 50 , TI là những giá trị thể hiện cho mức độ độc hại của Tartrazine lên phôi cá ngựa vằn. III.1.2. Vật liệu và dụng cụ III.1.2.1. Vật liệu Bảng 1. Danh sách hóa chất sử dụng trong thí nghiệm Hóa chất Công ty Nồng độ dung dịch gốc Công thức hóa học chất Sử dụng Tartrazine Sigma Aldrich (Cas No:1934-21-0) 50g/l (trong nước) Phụ gia Dung dịch gốc (stock solution) được chuẩn bị bằng việc pha trộn hóa chất tinh khiết với dung dịch E3 được pha với methylene blue nồng độ 10 -4 % mục đích làm dung môi pha chế có tính diệt khuẩn (không gây ảnh hưởng tới phôi). Dung dịch gốc sau đó cũng sẽ được pha loãng trong E3 tới các nồng độ mong muốn. III.1.2.2. Dụng cụ thí nghiệm Bảng 2. Danh sách dụng cụ sử dụng trong thí nghiệm Dụng cụ Nơi sản xuất Micropipette 10-1000µL Gilson (Hoa Kì) Pipet bán tự động Sigma Aldrich (Hoa Kì) Đĩa Petri Corning (Hoa Kì) Đĩa 24-giếng Corning (Hoa Kì) 6 Kính hiển vi soi nổi Carl Zeiss (Đức) III.1.3. Phương pháp tiến hành Dựa theo hướng dẫn của OECD về việc thực hiện thí nghiệm thử độc tính trên phôi cá ngựa vằn vào 2013, thực nghiệm được tiến hành theo các bước sau: • Ghép cá bố mẹ để cho sinh sản • Thu nhận và rửa phôi • Chọn phôi đang phát triển • Phơi nhiễm phôi trong hóa chất • Đánh giá các biến đổi hình thái phôi và xác định tỷ lệ phôi chết • Phân tích kết quả III.1.3.1 Nuôi dưỡng cá ngựa vằn trưởng thành Tập hợp và chọn cá trưởng thành: Ấu trùng cá ngựa vằn được giữ trong bể nuôi, nhiệt độ 26 - 28°C, theo chu kì 14h sáng/10h tối trong 1 ngày, cho ăn hàng ngày và hút chất thải 2h sau khi cho ăn. Đến khi cá trưởng thành (sau 5 - 6 tháng), cá đực và cá cái được tách riêng vào các bể khác nhau. Các con trưởng thành được chia thành các cặp, giao phối theo cặp, mỗi cặp từ 3 đến 4 lần. Nếu kết quả tốt thì cá được tách nhau ra. Ngược lại, tráo các cặp và giao phối lại để chọn những con đực và cái có khả năng sinh sản tốt. Những cặp tốt sẽ có những đặc tính sau: trung bình khoảng 100 trứng mỗi lần sinh sản (3 - 4 ngày), tỷ lệ thụ tinh cao (trên 90%), tỷ lệ phôi thụ tinh nở cao hơn 75%, tỷ lệ phôi dị dạng nhỏ hơn 10%. 7 Hình 1. Bể nuôi cá ngựa vằn trưởng thành Sinh sản: Trước ngày sinh sản, thả cá đực và cá cái vào cùng một bể chứa được ngăn cách bởi một tấm lưới. Cá bắt đầu quá trình thụ tinh ở đầu chu kì sáng vào ngày hôm sau. Lưới được bỏ và đưa một tấm lưới khác trong bể để tránh cá ăn phôi. Thời gian thụ tinh kéo dài 25 – 30 phút, sau đó cá bố mẹ được chuyển trả về bể nuôi. Phôi được hút vào khay, rửa bằng nước sạch để loại bỏ chất bẩn và phôi không thụ tinh, sau đó được bảo quản trong đĩa nước cất. Thời điểm này được tính là 0dpf tức 0 ngày sau thụ tinh Chọn phôi: Ở 2 giờ sau thụ tinh ( 2hpf), phôi được chọn dưới kính hiển vi. Ở giai đoạn này, thường các phôi sẽ có 32, 64,hoặc 128 tế bào. Chỉ có các phôi hình thái bình thường ( trên thành phôi và trong noãn hoàng) và phân cắt đồng đều mới được chọn. 8 Hình 2. Đĩa chọn phôi III.1.3.2. Phơi nhiễm hóa chất và quan sát phôi Pha chế dung dịch: chuẩn bị hóa chất vào ngày trước , với các nồng độ thí nghiệm được xác định từ các thí nghiệm giới hạn trước đó Phơi nhiễm hóa chất: Sử dụng thí nghiệm giới hạn để xác định khoảng nồng độ thích hợp cho thí nghiệm. Thí nghiệm giới hạn là thí nghiệm nhằm xác định khoảng giới hạn nồng độ thí nghiệm cho thí nghiệm chính thức, trong đó nồng độ thấp nhất là nồng độ mà các phôi phơi nhiễm không bị chết hay dị dạng, còn nồng độ cao nhất là nồng độ làm tất cả các phôi phơi nhiễm đều bị chết trong vòng 24h phơi nhiễm. Xác định nồng độ hóa chất cần thí nghiệm và chuẩn bị đĩa chứa dung dịch hóa chất trước khi phơi nhiễm. Dung dịch E3 1X được sử dụng làm đĩa đối chứng âm. Tartrazine là chất phơi nhiễm. 9 Các nồng độ Tartrazine sử dụng trong thí nghiệm là: 0.2g/l, 0.5g/l, 1g/l, 2g/l, 4g/l, 8g/l, 16g/l. 1ml hóa chất được bơm vào từng giếng và mỗi đĩa chứa một nồng độ. Mỗi đĩa gồm 20 giếng phơi nhiễm hóa chất và 4 giếng đối chứng nội chứa dung dịch E3 1X. Mỗi giếng chứa 1 phôi. Mỗi ngày, hóa chất và E3 sẽ được thay thế 700 µl mỗi giếng. Phơi nhiễm kéo dài đến 4dpf (96hpf). Quan sát phôi: Đánh giá sự phát triển của phôi dựa trên các tiêu chuẩn sau: Bảng 3. Bảng đánh giá sự phát triển phôi III.1.3.3. Phương pháp đánh giá Mỗi thí nghiệm được làm lại ít nhất 3 lần 10 [...]... dị dạng của mỗi kiểu dị dạng: Biểu đồ 5 So sánh tỷ lệ các kiểu dị dạng của phôi cá ngựa vằn phơi nhiễm trong Tartrazine sau 96h gồm có phù đầu, phù noãn hoàng, dị tật đuôi, hoại tử cơ thể, tụ máu Từ biểu đồ trên có thể kết luận các kiểu dị dạng phổ biến mà Tartrazine gây nên cho phôi cá ngựa vằn là phù noãn và tụ máu 16 III.2.3 Ảnh hưởng của Tartrazine tới hình thái phôi cá ngựa vằn Sau 24h: A Phôi đối... quả sau: • Tartrazine chỉ thể hiện độc tính lên sự phát triển của phôi cá ngựa vằn ở khoảng nồng độ cao 0.2g/l tới 16g/l • Tartrazine có TI=6.16 >1 sau 96 giờ phơi nhiễm do đó ban đầu chúng tôi nhận định đây là chất chất gây quái thai ở nồng độ gây độc • Kiểu dị dạng đặc trưng mà Tartrazine gây ra là tụ máu và phù noãn hoàng IV.2 Dự kiến mở rộng đề tài • Tìm hiểu về cơ chế hoạt động của Tartrazine. .. Tartrazine trong cơ thể, thời gian phân hủy của Tartrazine qua đó dự đoán mức độ ảnh hưởng của Tartrazine lên cơ thể khi tiếp xúc với các loại thực phẩm có chứa Tartrazine trong thời gian dài • Nghiên cứu sự ảnh hưởng của Tartrazine lên các thế hệ con cháu của thế hệ ban đầu đã bị phơi nhiễm với Tartrazine • Nghiên cứu tác động của Tartrazine tới hoạt động chức năng của hệ tuần hoàn, thần kinh và cơ 20 THAM... ứng, hoặc tác dụng, đánh giá của một bài kiểm tra Các tiêu chí cơ bản nhất là sự sống còn và quan sát hình thái học trong và sau khi tiếp xúc với hóa chất ở các giai đoạn khác nhau Sau đó, tất cả các giá trị này sẽ được phân tích bằng phần mềm thống kê, các đường cong nồng độ phản ứng có thể được tạo ra và các chỉ số độc tính có thể thu được Có 3 chỉ số quan trọng trong nghiên cứu của chúng tôi: LC50:... khó có thể quan sát được các ảnh hưởng biến dạng một cách chính xác nên nhóm đã bỏ đường đồ thị biểu hiện tỷ lệ phôi dị dạng ở 72h Sau khi xử lý số liệu bằng phần mềm thu được LC50= 9.701g/l Biểu đồ 3 Đường cong nồng độ thể hiện mức độ phản ứng của phôi cá ngựa vằn với Tartrazine ở các nồng độ sau 72h Đường màu đen thể hiện tỷ lệ sống Sau 96h: Tất cả ấu trùng đối chứng đều phát triển ổn định ở lô đối... ứng của phôi cá ngựa vằn với Tartrazine ở các nồng độ sau 48h Đương màu đỏ thể hiện tỷ lệ dị dạng, đường màu đen thể hiện tỷ lệ sống Sau 72h: Tất cả các mẫu đối chứng đều không có các phôi chết hay dị dạng Từ khoảng nồng độ 0.2g/l đến 4g/l, không có phôi nào bị chết Ở các nồng độ cao hơn, tỷ lệ sống giảm xuống, cụ thể: trên 70% ở nồng độ 8g/l và 0% ở nồng độ 16g/l 13 Ở giai đoạn 72h do các phôi bước vào... biến dạng được quan sát một cách rõ ràng tại thời điểm này Từ khoảng nồng độ 0.2g/l đến 4g/l, không có phôi nào bị chết Ở các nồng độ cao hơn, tỷ lệ sống giảm xuống, cụ thể: trên 50% ở nồng độ 8g/l và 0% ở nồng độ 16g/l Sau khi xử lý số liệu bằng phần mềm, thu được LC50= 9.803g/l Biểu đồ 1 Đường cong nồng độ thể hiện mức độ phản ứng của phôi cá ngựa vằn với Tartrazine ở các nồng độ sau 24h Đường màu... Tanguay (2004) “Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish” 5 Nguyen Duc Hieu (2014) “Undergraduate thesis” 6 Vũ Anh Tuấn (2013) Đánh giá ảnh hưởng của Ethanol, DMSO và Acetone lên quá trình phát triển phôi cá ngựa vằn , Undergraduate thesis 7.http://webarchive.nationalarchives.gov.uk/20100817075455/http:/www.food.gov.uk/f oodindustry/guidancenotes/ 21 22 ... cả các mẫu đối chứng đều không có các phôi chết hay dị dạng 12 Từ khoảng nồng độ 0.2g/l đến 4g/l, không có phôi nào bị chết Ở các nồng độ cao hơn, tỷ lệ sống giảm xuống, cụ thể: trên 70% ở nồng độ 8g/l và 0% ở nồng độ 16g/l Tỷ lệ dị dạng tăng chậm theo các nồng độ song không rõ rệt Sau khi xử lý số liệu bằng phần mềm thu được LC50= 9.858g/l Biểu đồ 2 Đường cong nồng độ thể hiện mức độ phản ứng của phôi. .. dạng tăng đều theo chiều tăng dần của nồng độ Từ xấp xỉ 0% ở 0.2g/l tỷ lệ dị dạng tăng dần và vượt ngưỡng 50% từ nồng độ 1g/l Kết quả xử lý số liệu: LC50=9.533g/l EC50=1.546g/l TI=LC50/EC50=6.16 Với TI=6.16>1 nên có thể kết luận rằng Tartrazine là chất gây quái thai nặng Biểu đồ 4 Đường cong nồng độ thể hiện mức độ phản ứng của ấu trùng cá ngựa vằn với Tartrazine ở các nồng độ sau 96h Đường màu đỏ thể . của Tartrazine lên phôi cá ngựa vằn. Do đó chúng tôi chọn đề tài Đánh giá độc tính của Tartrazine lên sự phát triển của phôi cá ngựa vằn . PHẦN II: TỔNG QUAN II.1. Tartrazine Tartrazine được kí hiệu. tới việc tìm hiểu ảnh hưởng độc tính của Tartrazine lên phôi cá ngựa vằn để đưa ra những số liệu để phản ánh được mức độ độc tính của Tartrazine trên phôi cá ngựa vằn. Đề tài hướng tới những. độc tính Phôi cá ngựa vằn có nhiều đặc điểm ưu việt để trở thành mẫu thử độc tính ngày càng được ưa chuộng ở các phòng thí nghiệm. Thứ nhất, phôi cá ngựa vằn là một cá thể sống tách biệt và độc