ĐÁNH GIÁ độc TÍNH của SODIUM BENZOATE, PROPYL GALLATE, TARTRAZINE, AMARANTH, MONOSODIUM GLUTAMATE và FORMALDEHYDE TRÊN mô HÌNH PHÁT TRIỂN PHÔI cá NGỰA vằn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Vũ Anh Tuấn ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA SODIUM BENZOATE, PROPYL GALLATE, TARTRAZINE, AMARANTH, MONOSODIUM GLUTAMATE VÀ FORMALDEHYDE TRÊN MÔ HÌNH PHÁT TRIỂN PHÔI CÁ NGỰA VẰN Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Nguyễn Lai Thành TS Hoàng Thị Mỹ Hạnh Hà Nội – 2015 MỞ ĐẦU Phụ gia thực phẩm nhóm hợp chất sử dụng hàng ngày, thêm vào thực phẩm cách có chủ đích nhằm cải thiện màu sắc, hương vị, độ ngon; bổ sung dinh dưỡng bảo quản thực phẩm với thời gian lâu Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy số chất có mặt, góp phần gây ô nhiễm nguồn nước đặc biệt nghiên cứu McCann năm 2007 Bonnie năm 2017 cho thấy rằng, ảnh hưởng kết hợp chất phụ gia có liên quan đến hội chứng tăng động, giảm tập trung trẻ em người trưởng thành Sự cấp thiết việc đánh giá độc tính chất phụ gia thực phẩm đòi hỏi đời phương pháp kiểm nghiệm nhanh chóng, xác tốn Trong mô hình sử dụng để đánh giá độc tính hóa chất, mô hình sử dụng phôi cá ngựa vằn (Danio rerio) lên với nhiều ưu điểm Việc sử dụng phôi cá ngựa vằn không bị ràng buộc quy định nghiêm ngặt động vật thí nghiệm, phôi chủ động sản xuất với số lượng lớn, phát triển phôi sớm hình thành quan cá ngựa vằn giống với động vật có xương sống khác tốc độ phát triển nhanh hơn, phôi cá suốt cho phép quan sát ảnh hưởng hóa chất suốt trình phát triển phôi sớm Bộ gen cá ngựa vằn có nhiều điểm tương đồng cao với người Vì mô hình ngày nhận ý nhà khoa học thử nghiệm độc tính Do cần thiết việc đánh giá độc tính phụ gia thực phẩm ưu điểm bật mô hình phôi cá ngựa vằn nêu trên, thực đề tài: “Đánh giá độc tính sodium benzoate, propyl gallate, Tartrazine, amaranth, monosodium glutamate formaldehyde mô hình phát triển phôi cá ngựa vằn” nhằm mục tiêu đánh giá độc tính phụ gia thực phẩm sử dụng Sodium benzoate, Propyl gallate, Tartrazine, Amaranth, Monosodium glutamate với chất phụ gia bị cấm sử dụng Formaldehyde thông qua hình thái, sức sống nhịp tim CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Thực trạng sử dụng hóa chất Hóa chất sản xuất toàn cầu tăng lên nhanh chóng số hợp chất sản lượng tạo năm Cùng với lợi ích kinh tế, nhiều hóa chất mối nguy hại tiềm tàng với sức khỏe người môi trường Việc sử dụng chất chưa biết độc tính gây hậu nghiêm trọng việc sử dụng thalidomide dẫn đến hàng ngàn trường hợp chết non khuyết tật bẩm sinh hay việc sử dụng DDT đe dọa đến sức khỏe nhiều động vật hoang dã người Do đó, việc đánh giá ảnh hưởng hóa chất cần thiết, đòi hỏi phải có phương pháp kiểm định toàn diện nhiều mức độ 1.2 Phụ gia thực phẩm Phụ gia thực phẩm nhóm hợp chất sử dụng hàng ngày, thêm vào thực phẩm cách có chủ đích nhằm cải thiện màu sắc, hương vị, độ ngon; bổ sung dinh dưỡng bảo quản thực phẩm với thời gian lâu Ước tính thị trường có 2.500 chất phụ gia khác sử dụng thực phẩm chia thành sáu nhóm chất bảo quản, chất phụ gia bổ sung dinh dưỡng, chất tạo màu, chất điều vị, chất hỗ trợ chế biến nhóm chất khác Tuy nhiên, xét cho chúng có chất chất hóa học việc sử dụng nhóm chất gây nhiều tranh cãi Nhiều nghiên cứu cho thấy số chất có mặt, góp phần gây ô nhiễm nguồn nước Tác động số chất đến sức khỏe người tìm hiểu qua nghiên cứu McCann năm 2007 Bonnie năm 2017 Kết cho thấy rằng, ảnh hưởng kết hợp chất phụ gia có liên quan đến hội chứng tăng động, giảm tập trung trẻ em người trưởng thành Luận văn tiến hành đánh giá độc tính chất sodium benzoate, propyl gallate, tartrazine, amaranth, monosodium glutamate formaldehyde Sodium benzoate sử dụng thực phẩm với vai trò chất bảo quản, giúp chống lại ảnh hưởng vi sinh vật nhiên Nhiều nghiên cứu Sodium benzoate có tiềm thấp gây chứng mề đay, ảnh hưởng đáng kể đến sợi trục tế bào thần kinh nút thần kinh từ gây độc thần kinh ấu thể cá ngựa vằn Propyl gallate sử dụng với vai trò chất chống oxy hóa loại thực phẩm chứa hàm lượng chất béo cao nhiên nhiều nghiên cứu cho thấy gây ảnh hưởng xấu tới hệ thống tạo máu, đề nghị xếp vào nhóm gây độc cho sinh vật thủy sinh; khả gây ung thư, đột biến gây tranh cãi Tartrazine dùng để tạo màu vàng cho thực phẩm, đồ uống nhiên, nhiều báo cáo công bố việc Tartrazine gây số phản ứng tiêu cực sử dụng gây bệnh hen suyễn, đau nửa đầu lupus nhiều ý kiến trái ngược tác động gây đột biến Tartrazine Amaranth (E123) chất tạo màu đỏ cho thực phẩm; cho chuột mẹ uống Amaranth phôi chuột có dấu hiệu chậm phát triển với số bất thường tim, phổi xương; khả gây đột biết chất chủ đề bàn luận nhiều Monosodium glutamate (E621) có tác dụng làm tăng cường vị đặc trưng (vị Umami) cho ăn; lại bị cho gây thay đổi đáng kể hành vi chuột Formaldehyde (E240) sử dụng công nghiệp thực phẩm, giúp bảo quản thực phẩm khô, khử trùng hộp đựng phơi nhiễm với chất gây ảnh hưởng không nhỏ đến môi trường sức khỏe người: gây ung thư biểu mô vòm họng, bệnh bạch cầu tủy 1.3 Các mô hình đánh giá độc tính hóa chất Việc xác định độc tính hóa chất gặp phải nhiều thách thức Thứ nhất, số lượng lớn hóa chất đăng kí thị trường với hóa chất tổng hợp chưa đánh giá độc tính cách kĩ lưỡng, chưa kể đến khả tương tác chất gây ảnh hưởng kết hợp khó đoán trước, đòi hỏi đời phương pháp kiểm nghiệm nhanh chóng tốn Thứ hai, chưa có mô hình hoàn hảo để dự đoán tác động hóa chất thể người Mô hình gần với người thử nghiệm động vật có vú thực quy mô lớn vấn đề chi phí rào cản bảo vệ động vật Mô hình thực tế bào nuôi cấy lại không mang tính đại diện cho toàn thể phức tạp, không đánh giá ảnh hưởng sản phẩm chuyển hóa thể [12], thử nghiệm động vật không xương sống lại có khác biệt lớn với người mặt di truyền, sinh lý, chuyển hóa Trong mô hình sử dụng để đánh giá độc tính hóa chất, mô hình sử dụng phôi cá ngựa vằn (Danio rerio) lên với nhiều ưu điểm Phôi cá ngựa vằn 4-5 ngày sau thụ tinh chưa coi động vật không bị ràng buộc quy định nghiêm ngặt động vật thí nghiệm, phôi chủ động sản xuất với số lượng lớn, phát triển phôi sớm hình thành quan cá ngựa vằn giống với động vật có xương sống khác tốc độ phát triển nhanh nhiều: sau ngày từ phôi phát triển thành ấu thể; phôi cá suốt cho phép quan sát ảnh hưởng hóa chất suốt trình phát triển phôi sớm, gen cá ngựa vằn có nhiều điểm tương đồng với động vật có xương sống cao hơn, đặc biệt có 12 nghìn gen tương đồng với người Ngoài ra, mô hình phôi cá ngựa vằn không đưa dự đoán nguy sức khỏe người mà cho phép đánh giá ảnh hưởng đến môi trường nói chung Vì mô hình ngày nhận ý nhà khoa học thử nghiệm độc tính Do cần thiết việc đánh giá độc tính phụ gia thực phẩm ưu điểm bật mô hình phôi cá ngựa vằn nêu trên, thực đề tài: “Đánh giá độc tính sodium benzoate, propyl gallate, Tartrazine, amaranth, monosodium glutamate formaldehyde mô hình phát triển phôi cá ngựa vằn” nhằm mục tiêu đánh giá độc tính phụ gia thực phẩm sử dụng Sodium benzoate, Propyl gallate, Tartrazine, Amaranth, Monosodium glutamate với chất phụ gia bị cấm sử dụng Formaldehyde Kết đề tài góp phần bổ sung thông tin cho nguồn liệu độc tính chất nghiên cứu CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng Đối tượng nghiên cứu phôi cá ngựa vằn (Danio rerio) cá ngựa vằn trưởng thành lựa chọn qua - hệ phòng Công 2.1 nghệ Tế bào động vật – khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên đẻ Dụng cụ, thiết bị, hóa chất Luận văn sử dụng dụng cụ, thiết bị hóa chất từ hãng sản xuất lớn, đảm bảo chất lượng loại hóa chất thử nghiệm sử dụng từ dạng bột Sodium benzoate, Propyl gallate, Amaranth, Tartrazine, Monosodium glutamate từ dạng dung dịch Formaldehyde 2.2 2.3 Quy trình thí nghiệm Thí nghiệm xây dựng dựa theo hướng dẫn thử nghiệm độc tính hóa chất phôi cá ngựa vằn Tổ chức hợp tác phát triển kinh tế (OECD 236 công bố ngày 26/7/2013) hướng dẫn đánh giá chất lượng nước thải theo ISO 15088:2007 Quy trình gồm bước sơ đồ hình Hình 1: Quy trình thí nghiệm Sau thu rửa phôi, việc phơi nhiễm với hóa chất tiến hành sớm đĩa giếng, giếng chứa nồng độ Việc chọn phôi tiến hành kính hiển vi để lựa chọn phôi phát triển bình thường, phân cắt đồng phôi chọn chuyển sang phơi nhiễm đĩa 24 giếng có nồng độ tương ứng, đĩa chứa nồng độ, giếng cho phôi Cứ sau 24 giờ, phôi quan sát so sánh với hình thái đối chứng theo số tiêu chí hình thái sức sống Tỷ lệ phôi sống tỷ lệ phôi dị dạng xử lý hồi quy theo phương trình Sigmoidal: 𝑌 = 𝐵𝑜𝑡𝑡𝑜𝑚 + (𝑇𝑜𝑝 − 𝐵𝑜𝑡𝑡𝑜𝑚) + 10 (𝑙𝑜𝑔 𝑋𝐶50 )−𝐻𝑖𝑙𝑙𝑆𝑙𝑜𝑝𝑒 𝑋 để từ tính số độc học giá trị LC50 – nồng độ gây chết 50% phôi thí nghiệm EC50 – nồng độ gây ảnh hưởng đến 50% phôi ấu thể Ngoài ra, Chỉ số NOEC (No Observed Effect Concentration) cho biết nồng độ hóa chất thí nghiệm cao ảnh hưởng đáng kể đến phôi thí nghiệm số LOEC (Lowest observed effect concentration) cho biết nồng độ thấp tác động đáng kể đến phôi thí nghiệm theo tiêu chí hình thái rút từ nồng độ thí nghiệm Bên cạnh đó, thí nghiệm đánh giá tác động đến nhịp tim tiến hành Sau phơi nhiễm đĩa giếng, nhịp tim ghi lại dạng video sau đếm so sánh Phần mềm GraphPad Prism 6.07 sử dụng cho tất phép so sánh thống kê hồi quy CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Sự ảnh hưởng đến hình thái sức sống 3.1.1 Sự ảnh hưởng đến hình thái Hai đại diện nhóm chất tạo màu Amaranth Tartrazine gây kiểu dị dạng phù noãn hoàng, phù đầu, cong vẹo trục thể, hoại tử tụ máu Hiện tượng thú vị quan sát nồng độ thấp gây mức độ dị dạng cao nồng độ cao Tartrazine gây tụ máu nhiều từ thời điểm 48 sau thụ tinh 96 giờ, tượng phù tim cong đuôi quan sát ảnh hưởng nồng độ cao dải Amaranth gây tụ máu (Hình 2) Hình Phôi phơi nhiễm với Tartrazine (trái) Amaranth (phải) Ngoài vài kiểu dị dạng thường gặp phù màng tim, phù màng noãn hoàng, cong đuôi hai đại diện nhóm chất bảo quản Sodium benzoate Propyl gallate gây tượng hoại tử nhiều Propyl gallate gây hoại tử nhiều nồng độ cao dải thí nghiệm từ thời điểm 24 sau thụ tinh Sodium benzoate nồng độ cao không gây biến đổi nhiều đến hình thái phôi giai đoạn (Hình 3) Hình Phôi sau 24 phơi nhiễm với Sodium benzoate Propyl gallate Ở thời điểm 24 giờ, Monosodium glutamate chất số chất thử nghiệm có dấu hiệu làm chậm phát triển phôi thí nghiệm nồng độ cao dải Sau 96 phơi nhiễm, phôi bị cong nhẹ trục thể, hoại tử phù màng bao tim (Hình 4) Hình Phôi phơi nhiễm với Monosodium glutamate Sau 24 phơi nhiễm, Formaldehyde làm hình thành lớp màng kín sát lấy phôi, lớp màng thường vỡ 48 chuyển động phôi Sau 96 giờ, phôi thường bị hoại tử noãn hoàng xù xì (Hình 5) Hình Phôi cá ngựa vằn phơi nhiễm với Formaldehyde Sự ảnh hưởng đến sức sống Các chất gây ảnh hưởng định đến sức sống phôi So với thời điểm 24 sau thụ tinh, phơi nhiễm tiếp tục đến thời điểm 96 giờ, chất làm tăng tỷ lệ phôi chết nhiên thời điểm làm tăng nhiều chất có khác biệt Propyl gallate Formaldehyde làm tăng tỷ lệ chết qua thời điểm quan sát (hình 6), Sodium benzoate Amaranth làm tăng nhiều từ thời điểm 72 sau thụ tinh (Hình 7) tartrazine Monosodium glutamate thời điểm ghi nhận có tăng nhiều 96 (Hình 8) 3.1.2 10 Hình Tỷ lệ phôi sống sau phơi nhiễm với Propyl gallate Formaldehyde Hình Tỷ lệ phôi sống sau phơi nhiễm với Sodium benzoate Amaranth 11 Hình Tỷ lệ phôi sống sau phơi nhiễm với tartrazine Monosodium glutamate 3.2 Sự ảnh hưởng đến nhịp tim Các chất gây ảnh hưởng định đến nhịp tim phôi/ấu thể cá ngựa vằn Formaldehyde Tartrazine hai chất làm tăng nhịp tim hầu hết nồng độ thí nghiệm, Sodium benzoate làm tăng nhịp tim nồng độ thấp làm giảm nhịp tim nồng độ cao chất lại gây giảm nhịp tim nồng độ cao (Hình 9) 12 Hình Ảnh hưởng chất đến nhịp tim ấu thể 3.3 Độc tính chất Các giá trị độc học tính phần mềm giá trị LC50 – nồng độ gây chết 50% phôi thí nghiệm EC50 – nồng độ gây ảnh hưởng đến 50% phôi ấu thể số NOEC (No Observed Effect Concentration) cho biết nồng độ hóa chất thí nghiệm cao ảnh hưởng đáng kể đến phôi thí nghiệm số LOEC (Lowest observed effect concentration) cho biết nồng độ thấp tác động đáng kể đến phôi thí nghiệm rút từ dải nồng độ thực nghiệm chất thể Hình 10 Kết cho thấy 13 Propyl gallate chất có tất số thấp chứng tỏ chất có độc tính cao nhất; Monosodium glutamate có số cao chứng tỏ chất có độc tính thấp Hình 10 Các số độc học thu Từ giá trị NOEC thu chất, số ADI (Acceptable Daily Intake – lượng phụ gia phép sử dụng hàng ngày) tính cách chia NOEC thu từ thí nghiệm động vật cho số phù hợp để giảm rủi ro xảy cho người thông thường, số 100 (giả thuyết người nhạy cảm động vật thí nghiệm 10 lần chênh lệch mức độ nhạy cảm với hóa chất quần thể người 10 lần) Kết thể bảng 14 Hóa chất NOEC (mg/l) ADI (mg/kg/ngày) E211 E310 E102 E123 E621 E240 25 15 500 100 2000 140 0,25 0,15 20 1,4 KẾT LUẬN Từ kết thu được, đưa số kết luận sau:  Các phụ gia thử nghiệm ảnh hưởng đến hình thái phôi Các dị dạng quan sát phù màng bao tim, phù màng noãn hoàng, phù đầu, hoại tử đầu, hoại tử noãn hoàng, tụ máu cong vẹo trục thể  Tartrazine Formaldehyde làm tăng nhịp tim nồng độ thí nghiệm, Amaranth Monosodium glutamate làm giảm nhịp tim nồng độ cao Sodium benzoate Propyl gallate vừa làm tăng, vừa làm giảm nhịp tim  Độc tính chất theo thứ tự giảm dần Propyl gallate > Formaldehyde > Sodium benzoate > Amaranth > Tartrazine > Monosodium glutamate  Giá trị ADI thu Sodium benzoate, Propyl gallate, Tartrazine, Amaranth Monosodium glutamate 0,25; 0,15; 5; 20 mg/kg/ngày 15 KIẾN NGHỊ Từ kết trên, đưa số kiến nghị sau:  Cần có quy định nghiêm ngặt liều lượng sử dụng Propyl gallate thực phẩm  Với chất có tiềm độc tính thực mức độ chuyên sâu tác động đến hành vi ấu thể hay biểu gen, protein Với chất có mức độ độc tính không cao tiến hành đánh giá tác động phối hợp với chất khác thực phẩm thường chứa nhiều loại phụ gia  Nghiên cứu chuyên sâu chế ảnh hưởng chất đặc biệt Tartrazine Tiến hành thử nghiệm phôi loại bỏ lớp màng phôi để việc đánh giá xác 16 [...]... Sodium benzoate Propyl gallate vừa làm tăng, vừa làm giảm nhịp tim  Độc tính của các chất theo thứ tự giảm dần lần lượt là Propyl gallate > Formaldehyde > Sodium benzoate > Amaranth > Tartrazine > Monosodium glutamate  Giá trị ADI thu được của Sodium benzoate, Propyl gallate, Tartrazine, Amaranth và Monosodium glutamate lần lượt là 0,25; 0,15; 5; 1 và 20 mg/kg/ngày 15 KIẾN NGHỊ Từ những kết quả trên, ... động đáng kể đến phôi thí nghiệm được rút ra từ dải nồng độ thực nghiệm của các chất được thể hiện ở Hình 10 Kết quả cho thấy rằng 13 Propyl gallate là chất có tất cả các chỉ số thấp nhất chứng tỏ đây là chất có độc tính cao nhất; Monosodium glutamate có các chỉ số cao nhất chứng tỏ đây là chất có độc tính thấp nhất Hình 10 Các chỉ số độc học thu được Từ giá trị NOEC thu được của các chất, chỉ số ADI... quan sát (hình 6), Sodium benzoate và Amaranth làm tăng nhiều từ thời điểm 72 giờ sau thụ tinh (Hình 7) còn tartrazine và Monosodium glutamate thời điểm ghi nhận có sự tăng nhiều là 96 giờ (Hình 8) 3.1.2 10 Hình 6 Tỷ lệ phôi còn sống khi sau khi phơi nhiễm với Propyl gallate và Formaldehyde Hình 7 Tỷ lệ phôi còn sống khi sau khi phơi nhiễm với Sodium benzoate và Amaranth 11 Hình 8 Tỷ lệ phôi còn sống... tartrazine và Monosodium glutamate 3.2 Sự ảnh hưởng đến nhịp tim Các chất đều gây ảnh hưởng nhất định đến nhịp tim phôi/ ấu thể cá ngựa vằn Formaldehyde và Tartrazine là hai chất làm tăng nhịp tim ở hầu hết các nồng độ thí nghiệm, Sodium benzoate làm tăng nhịp tim ở nồng độ thấp và làm giảm nhịp tim ở nồng độ cao trong khi các chất còn lại chỉ gây giảm nhịp tim ở nồng độ cao (Hình 9) 12 Hình 9 Ảnh hưởng của các.. .Hình 5 Phôi cá ngựa vằn phơi nhiễm với Formaldehyde Sự ảnh hưởng đến sức sống Các chất đều gây ảnh hưởng nhất định đến sức sống của phôi So với thời điểm 24 giờ sau thụ tinh, khi phơi nhiễm tiếp tục đến thời điểm 96 giờ, các chất đều làm tăng tỷ lệ phôi chết tuy nhiên thời điểm làm tăng nhiều của các chất có sự khác biệt Propyl gallate và Formaldehyde làm tăng đều tỷ lệ chết qua các thời điểm... của các chất đến nhịp tim ấu thể 3.3 Độc tính của các chất Các giá trị độc học tính bằng phần mềm là giá trị LC50 – nồng độ gây chết 50% phôi thí nghiệm và EC50 – nồng độ gây ảnh hưởng đến 50% phôi hoặc ấu thể cũng như các chỉ số NOEC (No Observed Effect Concentration) cho biết nồng độ hóa chất thí nghiệm cao nhất không có ảnh hưởng đáng kể đến phôi thí nghiệm và chỉ số LOEC (Lowest observed effect... 1 20 1,4 KẾT LUẬN Từ các kết quả thu được, chúng tôi đưa ra một số kết luận như sau:  Các phụ gia thử nghiệm đều ảnh hưởng đến hình thái phôi Các dị dạng quan sát được là phù màng bao tim, phù màng noãn hoàng, phù đầu, hoại tử đầu, hoại tử noãn hoàng, tụ máu và cong vẹo trục cơ thể  Tartrazine và Formaldehyde làm tăng nhịp tim ở các nồng độ thí nghiệm, Amaranth và Monosodium glutamate làm giảm nhịp... lượng sử dụng Propyl gallate trong thực phẩm  Với những chất có tiềm năng độc tính thì thực hiện ở mức độ chuyên sâu hơn như sự tác động đến hành vi ấu thể hay sự biểu hiện gen, protein Với những chất có mức độ độc tính không cao thì tiến hành đánh giá tác động phối hợp với các chất khác vì trong thực phẩm thường chứa nhiều loại phụ gia  Nghiên cứu chuyên sâu hơn về cơ chế ảnh hưởng của các chất đặc... hợp với các chất khác vì trong thực phẩm thường chứa nhiều loại phụ gia  Nghiên cứu chuyên sâu hơn về cơ chế ảnh hưởng của các chất đặc biệt là Tartrazine Tiến hành thử nghiệm trên phôi đã được loại bỏ lớp màng phôi để việc đánh giá chính xác hơn 16 ... chỉ số ADI (Acceptable Daily Intake – lượng phụ gia được phép sử dụng hàng ngày) có thể tính bằng cách chia NOEC thu được từ những thí nghiệm trên động vật cho một số phù hợp để giảm rủi ro có thể xảy ra cho con người thông thường, số đó là 100 (giả thuyết rằng con người nhạy cảm hơn động vật thí nghiệm 10 lần và sự chênh lệch mức độ nhạy cảm với hóa chất trong quần thể người là 10 lần) Kết quả được