ĐỀ TÀI: Nghiên cứu quy trình tạo củ in Vitro ở một số giống khoai môn sọ địa phương (Colocasia Esculenta)

Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu PHẦN I: MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Khoai môn sọ (Colocasia esculenta (L.) Schott) loại trồng thích nghi cao với vùng nhiệt đới, nguồn lương thực an toàn nhiều quốc gia giới Đây loại trồng lấy củ quan trọng, không nguồn lương thực nước quần đảo Thái Bình Dương mà cịn nguồn lương thực, thực phẩm nhiều quốc gia giới tập trung Châu Phi, Tây Ấn Độ, Nam Mỹ Châu Á [2][11] Cả củ, thân khoai môn sọ sử dụng làm lương thực,thức ăn chăn ni cơng nghiệp chế biến Trong củ khoai môn sọ chứa hàm lượng hydratcacbon cao, hàm lượng chất béo thấp nhiều chất khoáng Củ dùng để chế biến thành nhiều ăn ngon như: khoai chiên, khoai hầm xương, bánh khoai…Củ khoai mơn cịn dùng công nghiệp chế biến bột dinh dưỡng trẻ em [11] Có thể sử dụng tinh bột khoai mơn sọ thay số tinh bột phải nhập từ nước để chế biến loại bánh tươi, xúc xích, giị, chả… Tinh bột khoai mơn sọ có kích thước nhỏ loại tinh bột biết nên chúng thay tinh bột ngơ sản xuất plastic sinh học, có khả chống thấm khí cao bao gói thực phẩm bảo vệ môi trường Lá dọc chứa hàm lượng caroten khoáng chất canxi, photpho, kali sử dụng làm thực phẩm thức ăn chăn nuôi[7] Khoai môn sọ trồng khắp nơi đất nước ta, từ vùng đất thấp có nước đến nơi có địa hình cao m đến 1800 m so với mặt biển điều kiện môi trường khác Những năm gần đây, diện tích trồng khoai môn sọ hàng năm lên tới khoảng 15.000 ha, xếp thứ tư diện tích trồng sau cà chua, sắn khoai lang Các tỉnh trồng nhiều khoai môn sọ Sơn La, Thái Nguyên, Tuyên Quang, Thanh Hóa, Bắc Giang, Quảng Ninh Hịa Bình [2] Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu Đặc biệt trồng khoai mơn sọ có ưu điểm tận dụng đất ven suối, chân đồi, đất lầy thụt Hơn khoai mơn sọ lại bị sâu bệnh nhờ mà tiết kiệm chi phí nâng cao hiệu kinh tế Nếu trồng kĩ thuật cho hiệu kinh tế cao gấp lần trồng lúa Vì phương hướng mục tiêu năm tới tập trung đầu tư cho khoai môn sọ phát triển vùng khó khăn có điều kiện thích hợp thuộc vùng Trung du, miền núi Tây Nguyên Để thực mục tiêu phải tăng diện tích đôi với việc nâng cao sản xuất, xác định cấu giống thích hợp với vùng sinh thái, tập trung nghiên cứu tốt đồng thời nhanh chóng ứng dụng tiến khoa học mới[2] Tuy nhiên khoai môn sọ chủ yếu trồng củ chồi mắt ủ nảy mầm từ củ có hệ số nhân giống thấp, lượng củ làm giống cần nhiều mà chất lượng giống không đồng Hơn khoai mơn sọ có thời gian ngủ nghỉ ngắn, dễ bị ảnh hưởng điều kiện ngoại cảnh khó để giữ giống Việc nhân giống bảo tồn nguồn gen giống khoai môn sọ đặc sản gặp nhiều khó khăn giống địa phương cho suất không cao,thời gian sinh trưởng dài dễ bị sâu bệnh[11][2] Nguồn giống thiếu hạn chế lớn để trồng đại trà với quy mơ lớn Vì u cầu đặt phải xây dựng quy trình kĩ thuật sản xuất giống đảm bảo chất lượng cung cấp đủ nguồn giống bệnh, có độ đồng cao đáp ứng yêu cầu sản xuất Hiện công nghệ sinh học ngày phát triển,để bảo tồn cung cấp đủ nguồn giống bệnh nhiều nước áp dụng phương pháp nhân giống in vitro Phương pháp vi nhân giống tạo củ in vitro tiến hành đạt kết tốt nhiều đối tượng Tạo củ in vitro có nhiều ưu điểm, tạo số lượng giống bệnh,có độ đồng cao thời gian ngắn, củ in vitro dễ dàng vận chuyển bảo quản Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu thời gian dài[8][10] Tuy giới Việt Nam có báo cáo tạo củ khoai môn sọ Xuất phát từ lý hướng tới mục đích tạo số lượng lớn giống khoai môn sọ bệnh phục vụ cho sản xuất, cung cấp nguyên liệu cho công tác bảo tồn, tiến hành đề tài “ Nghiên cứu quy trình tạo củ in vitro số giống khoai môn sọ địa phương (Colocasia esculenta (L.) Schott) ” Mục đích mục tiêu 2.1 Mục đích Xác lập quy trình tạo củ in vitro từ chồi đỉnh số giống khoai môn sọ nhằm tạo nguồn củ giống chất lượng cao, đồng bệnh phục vụ cho sản xuất đại trà 2.2 Mục tiêu - Xác lập điều kiện khử trùng mẫu thích hợp, cơng thức tái sinh nhân nhanh chồi, công thức rễ nhằm tạo in vitro hồn chỉnh - Xác định mơi trường tạo củ in vitro giống khoai môn sọ nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu giống khoai môn sọ quý nước ta:Khoai sọ Cụ Cang (Sơn La), khoai sọ núi (Bắc Giang), khoai Mán khoai sọ thơm (Lạng Sơn) Các giống khoai môn sọ thu thập từ tỉnh Sơn La, Bắc Giang Lạng Sơn Địa điểm thời gian nghiên cứu - Địa điểm: + Phịng ni cấy mơ – Bộ môn Công nghệ vi sinh Trường ĐHSP Hà Nội + Phịng thí nghiệm Bộ mơn Di truyền học – ĐHSP Hà Nội - Thời gian: từ tháng 3/2010 – 5/2011 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu - Cung cấp số sở lý thuyết cho điều khiển tạo củ - Đặt sở để hồn thiện qui trình tạo củ giống in vitro cung cấp nguồn củ giống chất lượng cao số lượng lớn cho sản xuất đại trà PHẦN II: NỘI DUNG CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Đặc điểm chung khoai môn sọ(Colocasia esculenta (L.) Schott) 1.1 Phân loại khoai môn sọ Trong hệ thống phân loại thực vât , lồi khoai mơn sọ có vị trí phân loại sau Giới (Kingdom) : Thực vât (Plantae) Ngành (division) : Thực vât hạt kín (Magnoliophyta) Lớp (class) : Một mầm ( Monocotyledoneae ) Phân lớp : Cau (Araceace) Bộ (oder) : Trạch tả (Alismatales) Họ (family) : Ráy (Araceace) Phân họ (subfamily) : Aroideae Chi (genus) : Khoai mơn (Colocasia) Lồi (species) : Colocasia esculenta Cây khoai môn sọ thuộc chi Colocasia lồi trồng phổ biến có giá trị kinh tế Hai loài chi Colocasia Linnes mô tả năm 1753 Arum Colocasia Arum esculentum (Hill, 1952) Năm 1789, hệ thống phân loại học họ Ráy Heinrich Wilhelm Schott thức đưa ra, ơng đặt tên cho hai loài Colocasia esculenta Colocasia antiquorum Cho đến kỉ XX có nhiều cơng trình nghiên cứu phân loại lồi chi khoai mơn sọ dựa đặc điểm hình thái hoa quan sinh dưỡng Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu có lịch sử lâu dài nhân giống vơ tính nên vấn đề phân loại thực vật chi nhiều điểm chưa thống Ở Việt Nam, năm gần đây, thực định Thủ tướng Chính phủ “Kế hoạch hành động đa dạng sinh học Việt Nam”, dự án “Thành lập ngân hàng gen quốc gia loài thực vật hữu ích” Bộ Nơng nghiệp Phát triển nơng thôn triển khai Viện Khoa học Kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam Kết thu thập loài trồng lấy củ bước đầu có tập đồn giống lớn, đáng ý tập đồn giống khoai mơn sọ (Colocasia esculenta) với 290 mẫu giống (chiếm 2/3 tập đoàn giống thu thập bảo tồn nghiên cứu Trung tâm Tài nguyên di truyền thực vật Việt Nam) [5] Hiện theo điều tra viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật Việt Nam họ Ráy Việt Nam có 23 chi 120 lồi, chi Khoai mơn (Colocasia) có lồi Tuy nhiên, nghiên cứu phân loại chủ yếu sử dụng tài liệu có từ trước hay dừng lại mức độ nhận dạng chi Cho đến nay, chưa có khóa định loại lồi họ Ráy nói chung chi Khoai mơn (Colocasia) nói riêng [2] Số lượng NST NST lưỡng bội giống khoai môn sọ nghiên cứu là: 2n = 22, 26, 28, 38, 42, phổ biến hai dạng 2n = 28 2n = 42 Sự sai lệch số lượng NST giống khoai mơn sọ phát sinh đột biến đa bội trì thuân lợi nhờ sinh sản sinh dưỡng[9] 1.2 Nguồn gốc phân bố Các chứng phân loại thực vật cho thấy khoai mơn sọ có nguồn gốc Nam Trung Á, có lẽ Ấn Độ bán đảo Mã Lai Dạng hoang dại phát sinh vùng khác Đông Nam Á (Purseglove, 1972) Từ nơi khoai mơn sọ lan phía đơng, tới phần cịn lại Đơng Nam Á Trung Quốc, Nhật Bản, quần đảo Thái Bình Dương Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu Một số tác giả cho đảo New Guinea trung tâm phát sinh khoai môn sọ, khác biệt với trung tâm châu Á Từ châu Á, khoai mơn sọ lan rộng phía tây tới Ả Rập Saudi vùng Địa Trung Hải Hơn 100 năm trước công nguyên, khoai môn sọ bắt đầu trồng Trung quốc Ai cập Cây khoai môn sọ du nhập đến châu Phi khoảng 2000 năm trước, bắt đầu Tây Phi sau theo tàu nơ lệ đến Caribe Ngày khoai môn sọ phân bố trồng chủ yếu vùng nhiệt đới Tỉ lệ canh tác cao đóng góp khoai mơn sọ vào chế độ ăn người dân cao quần đảo Thái Bình Dương Tuy nhiên, diện tích canh tác lớn lại vùng Tây Phi, chiếm sản lượng lớn Cây khoai môn sọ trồng chủ yếu vùng ẩm ướt châu Á 1.3 Đặc điểm hình thái Cây khoai mơn sọ (Colocasia esculenta (L.) Schott) thân thảo, cao từ 0,5- 2,0m Cây có củ giữa, phát triển lên trên, rễ phát triển xuống dưới, củ (cormels), củ nách (daughter corms) dải bò (stolons) phát triển sang ngang Rễ chùm, ngắn mọc từ đốt mầm xung quanh thân củ, có nhiều tầng phụ thuộc vào số Phần gốc phình to thành củ thân củ chứa tinh bột Củ cấu trúc thân cây, có nhiều đốt, đốt có mầm phát triển thành nhánh Mỗi dọc lụi thân củ có thêm đốt Đỉnh củ điểm sinh trưởng cây, kích thước hình dạng củ khác phụ thuộc vào kiểu gen giống yếu tố sinh thái Lá phần nhìn thấy mặt đất, toàn phần dọc tạo nên thân giả Mỗi cấu tạo cuống thẳng phiến Phiến hình khiên, gốc hình tim, có rốn gần (điểm nối cuống phiến lá) Trên phiến có tia gân chính, gân chạy từ rốn Líp: K57A - Khoa Sinh học Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu đến đỉnh phiến lá, hai gân lại chạy ngang đỉnh thùy Từ gân có nhiều gân nhỏ tỏa tạo thành hình mắt lưới Cuống (dọc lá) xốp, nhu mơ có nhiều khoảng trống Dọc mập có bẹ ơm chặt phía gốc tạo nên thân giả Bẹ dọc có chiều dài khoảng 1/3 chiều dài dọc Hoa thuộc loại đơn tính, hoa đực hoa thuộc trục Cụm hoa cấu tạo cuống ngắn, trục hoa bao mo dài khoảng 20 cm Hoa bao, hoa đực màu vàng có nhị tụ nhiều cánh, hạt phấn tròn, bao phấn nứt rãnh Hoa có bầu ơ, vịi ngắn Hình thức thụ phần khoai mơn sọ chủ yếu nhờ gió Quả mọng có đường kính khoảng 3-5cm chứa nhiều hạt Hạt thuộc loại có nội nhũ Tuy nhiên tự nhiện sinh sản hạt khoai môn sọ xảy ra[4] 1.4 Sinh trưởng phát triển Từ trồng đến thu hoạch khoai môn sọ trải qua thời kỳ sinh trưởng: rễ mọc mầm, sinh trưởng thân lá, phình to thân củ * Giai đoạn rễ mọc mầm: Ngay sau mọc mầm, rễ hình thành phát triển nhanh chóng, tiếp phát triển nhanh chồi (mầm) củ Chồi mầm khỏi mặt đất rễ dài khoảng 3-5 cm Sự phát triển rễ tỷ lệ thuận với phát triển lá: lại sinh thêm lớp rễ * Giai đoạn sinh trưởng thân lá: Sự hình thành củ bắt đầu sau trồng khoảng tháng, sau hình thành củ Trong giai đoạn đẻ nhánh phụ Sự phát triển chồi giảm mạnh sau trồng khoảng 5-6 tháng * Giai đoạn phình to thân củ: Khi phát triển chồi giảm củ củ phát triển nhanh Cuối vụ (đầu vụ khơ) rễ chồi chết thời điểm thu hoạch củ Nếu củ không thu hoạch củ củ cho phép tồn qua mùa khô mọc thành vào vụ Nhữnxg vùng khơng có mùa khơ, sau thân tàn củ lại mọc mầm tiếp tục phát triển Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu * Quá trình hoa kết hạt khoai môn sọ thấy tự nhiên, xảy số kiểu gen Hoa quan sát thấy sớm với hình thành củ, hoa thụ phấn nhờ côn trùng Tuy nhiên, giống kết thúc vòng đời đồng ruộng mà khơng có thời kì hoa Ở Việt Nam điều kiện tự nhiên có giống khoai nước thường hoa, khoai sọ Từ bắt đầu hoa đến hoa bắt đầu lụi khoảng 20- 25 ngày 1.5 Điều kiện sinh thái Cây khoai môn sọ yêu cầu nhiệt độ trung bình ngày 21 0C Điều kiện nhiệt độ thấp sương mù làm giảm sinh trưởng cho suất thấp Cây có bề mặt nước lớn nên có yêu cầu độ ẩm cao, cần lượng mưa nước tưới khoảng 1500 – 2000mm suất tối ưu Cây khoai môn sọ đạt suất cao điều kiện cường độ ánh sáng cao suất giảm rõ rệt điều kiện khơ hạn Nhưng lại loại chịu bóng râm hầu hết loại khác Sự hình thành củ kích thích điều kiện ngày ngắn, hoa kích thích điều kiện ngày dài Cây cho suất hợp lý điều kiện che bóng, nơi trồng khác khơng thể phát triển Đây đặc tính ưu việt,vì khoai môn sọ coi trồng xen lý tưởng Cây khoai mơn sọ thích ứng với nhiều loại đất khác nhau, trồng nhiều loại đất chua (pH 5,5 – 6,5), thành phần đất nhẹ nhiều mùn Tuy nhiên, môn sọ phát triển tốt đất tương đối chua, số giống có tính chịu mặn cao Có lẽ Nhật Bản Ai Cập, khoai môn sử dụng tốt trồng tiên phong cải tạo đất mặn (Kay, 1973) Đây chắn mở khả cho việc sử dụng khoai môn để khai thác số nơi có điều kiện sinh thái khó khăn mà Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu trồng khác phát triển Cũng loại trồng lấy củ khác, môn sọ yêu cầu đất tốt đầy đủ NPK nguyên tố vi lượng suất cao Như vậy, khoai môn sọ loại chịu hạn, chịu đất chua, đất mặn, đất nghèo dinh dưỡng, phù hợp để khai thác vùng sinh thái khó khăn, nơi trồng khác khơng thể trồng phát triển Khoai môn sọ loại dài ngày, yêu cầu độ ẩm cao cho sinh trưởng phát triển[11] 1.6 Thành phần dinh dưỡng, giá trị kinh tế sử dụng * Thành phần dinh dưỡng: Phần có giá trị kinh tế khoai mơn sọ củ cái, củ số giống dọc Trong củ tươi, nước chiếm 63 - 65% , hydratcacbon chiếm 13 - 29%, protein chiếm 1,4 - 3,0% với nhiều axit amin cần thiết cho thể Tinh bột chiếm tới 77,9% lượng hydratcacbon với 4/5 amylopectin 1/5 amylose Hạt tinh bột khoai môn sọ nhỏ, dễ tiêu hố Chính yếu tố khiến khoai mơn sọ thay loại lương thực khác, ăn đặc biệt dành cho trẻ nhỏ bị dị ứng, người rối loạn dinh dưỡng người ăn chay Lá khoai môn sọ giàu protein, chứa khoảng 23% khối lượng khơ, ngồi chứa nhiều Ca, P, Fe, Vitamin C, thiamin, riboflavin * Giá trị kinh tế: Cây khoai môn sọ sử dụng làm lương thực thực phẩm phổ biến giới Các phận củ cái, củ con, dọc dải bị chế biến thành ăn Trồng khoai sọ lãi trồng lúa chăm sóc kĩ thuật, suất trung bình đạt - tấn/ ha, có nơi đạt đến 12 - 13 tấn/ với giá trung bình 5000 – 7000VNĐ/kg Mặt khác, người dân trồng khoai mơn sọ vùng đất xấu trồng xen với loại khác để tăng thu nhập Ngoài ra, số giống khoai môn sọ dùng làm thuốc để chữa bệnh đau đầu, kiết lỵ, tê phù,…và số giống lại trồng để làm cảnh[7] 1.7 Kĩ thuật trồng chăm sóc Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu Giống: Có nhiều giống khoai mơn tiếng khoai ruột đỏ, ruột tím Bắc Kạn; khoai sáp ruột vàng Ninh Bình, Lục Yên (Yên Bái), Văn Lâm, Khoái Châu (Hưng Yên), khoai sọ núi Lai Châu, Hịa Bình, khoai Chũ (Bắc Giang),… Ở miền Bắc khoai môn chủ yếu trồng tỉnh miền núi trung du, trồng vùng đồng đất thấp bị ngập nước dễ sượng ngứa Giống khoai sọ núi củ to, nhiều tinh bột, ăn ngon trồng chủ yếu tỉnh miền núi n Bái, Lai Châu, Thái Ngun, Bắc Kạn, Hịa Bình… Ngược lại tỉnh phía Nam An Giang, Bến Tre, Cần Thơ… khoai môn trồng nhiều vùng đất bãi, đồng để bán cho sở xuất Tuy nhiên, giống khoai môn miền núi trồng đồng nên chọn vùng đất cao, tơi xốp, dễ thoát nước đặc biệt lên luống cao trồng khoai lang không bị sượng ngứa Cách nhân giống: Trước trồng tháng nên chọn củ nhánh nhỏ, đem giâm cát ẩm nơi góc nhà ánh sáng cho mọc mầm đem trồng ruộng tỷ lệ sống cao Thời vụ: Khoai mơn loại nhiệt đới nên trồng quanh năm Tuy nhiên thích hợp cho suất cao vụ đông xuân Với tỉnh phía Nam nên xuống giống từ tháng 10-12, thu hoạch từ tháng đến tháng năm sau Các tỉnh miền Bắc nhiều giống có thời gian sinh trưởng dài (thường từ 8-12 tháng), đặc biệt vùng ĐBSH có vụ trồng khoai mơn: vụ xn trồng tháng 3-4, vụ thu trồng tháng 8-9 Khoai sọ trồng tháng 11-12 tháng hàng năm Chuẩn bị đất trồng: Chọn đất tốt, tơi xốp, giàu mùn, cao ráo, dễ nước để trồng khoai mơn, khoai sọ Các loại đất thịt nhẹ, cát pha, đất vườn miền núi, trung du khai hoang thường cho suất cao, củ to chất lượng tốt, ăn không sượng, không ngứa Ngược lại đất thấp, dễ bị ngập nước, thời gian cho thu hoạch mà bị mưa nhiều đất ướt Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội 10 Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu khác để nghiên cứu cảm ứng hình thành củ chồi cấy Mục đích việc chuyển in vitro sang mơi trường MS khơng chất kích thích sinh trưởng trước đưa vào tạo củ để ổn định sinh trưởng giảm nồng độ hoocmon sinh trưởng tích tụ từ mơi trường rễ Từ đánh giá xác hiệu tạo củ mơi trường có bổ sung đường nồng độ hoocmon sinh trưởng khác Sau tuần theo dõi, thu kết bảng bảng Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội 54 Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu Bảng 6: Khả tạo củ môi trường tạo củ giống khoai môn sọ Công thức Thành phần chất bổ sung Đường môiBAP NAA vào trường MS (%) (mg/l) (mg/l) 7 Khả tạo củ giống khoai Cụ Khoaisọ Sọ Sọ 0 0,1 0 0,1 0 Tạo củ in vitro,củ to nhiều Tạo củ - 7 - nhỏ Tạo Củ nhỏ, số 12 13 14 15 16 - 11 núi Gốc phình Tạo to củ nhỏ - 0,1 thơm Mán Không tạo củ 10 Cang vàng úa củ 0 0,1 0 Tạo củ Cây in vitro héo dần chết Ghi chú: (-) không tạo củ Tiến hành đánh giá tỉ lệ tạo củ xác định khối lượng tươi trung bình củ in vitro hình thành cơng thức mơi trường tạo củ có kết thể bảng Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội 55 Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu Bảng 7: Kết tạo củ in vitro xác định cơng thức tạo củ thích hợp Giống Cơng thức mơi trường Các tiêu Tổng số chồi cấy Số củ tạo thành Tỉ lệ tạo củ(%) AFW (g) Cụ Cang CT11 30 10 33,33 0,232 Sọ núi CT12 30 26,67 0,186 Khoai CT5 30 10 33,33 0,243 Mán CT6 30 12 40,00 0,321 CT7 30 18 60,00 0,523 CT8 30 20 66,67 0,612 CT9 30 16 53,33 0,214 CT10 30 14 46,67 0,300 CT11 30 30,00 0,241 CT12 30 23,33 0,223 Khoai sọ CT5 30 30,00 0,193 thơm CT6 30 14 46,67 0,432 CT7 30 23 76,67 0,527 CT8 30 19 63,33 0,522 CT9 30 19 63,33 0,465 CT10 30 15 50,00 0,321 CT11 30 13 43,33 0,300 CT12 30 23,33 0,232 Kết bảng bảng cho thấy: hàm lượng đường nồng độ BAP có vai trị quan trọng tạo củ in vitro Đối với giống: khoai Mán sọ thơm Lạng Sơn, môi trường bổ sung 5% % sucrose cảm ứng hình thành củ in vitro Củ nhiều đạt kích thước lớn bổ sung thêm 5mg/l 7mg/l BAP Đặc biệt giống khoai sọ thơm tỉ lệ tạo củ cao (76,67%), có chồi tạo cụm củ Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội 56 Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu Đối với giống: khoai sọ Cụ Cang sọ núi hình thành củ in vitro điều kiện mơi trường địi hỏi hàm lượng đường BAP cao (7% đường, 5mg/l BAP với giống sọ Cụ Cang 7mg/l BAP với giống sọ núi) Tuy số lượng củ không nhiều, kích thước nhỏ Hàm lượng đường thấp (3%) hồn tồn không tạo củ, hàm lượng đường cao (9%) lại ức chế sinh trưởng in vitro Một số hình ảnh củ in vitro tạo (a) : Khoai sọ Cụ Cang (c) : Khoai sọ thơm (b) : Khoai Mán (d) : Khoai sọ núi Hình (a,b,c,d) : Củ in vitro hình thành ống 57 nghiệm Líp: K57A - Khoa Sinh học Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu (a) : Khoai sọ Cụ Cang (b) : Khoai Mán (c) : Khoai sợ thơm (d) : Khoai sọ núi Hình (a,b,c,d) : Củ in vitro thu giống khoai mơn sọ Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội 58 Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I Kết luận Nhìn chung hai giống Cụ Cang Sọ núi có khó khăn việc nhân nhanh tạo củ in vtro, hiệu nuôi cấy thấp Trong giống khoai Mán khoai sọ thơm Lạng Sơn cho hiệu cao - Khử trùng kép mẫu HgCl2 0,1 % , lần khử trùng tráng nước cất vô trùng mang lại hiểu cao bốn giống Thời gian khử trùng cần thiết với giống khoai sọ Cụ Cang khoai sọ núi, khoai sọ thơm (Lạng Sơn), khoai Mán (Lạng Sơn) tương ứng phút, phút, phút lần - Mơi trường MS có bổ sung 3%sucrose, 0,1mg/lNAA, 3mg/lBAP thích hợp để tái sinh chồi in vitro giống khoai Mán (84,35%) khoai sọ Cụ cang (80,11%) Với giống khoai sọ thơm bổ sung BAP (2mg/l), với giống khoai sọ núi cần bổ sung hàm lượng BAP cao (5mg/l) - Mơi trường MS có bổ sung 3% sucrose, 0,1 mg/l NAA, 2mg/l BAP thích hợp để nhân nhanh chồi, môi trường MS bổ sung 3% sucrose, 0,2 mg/l NAA thích hợp cho tạo rễ in vitro giống nghiên cứu - Môi trường MS có 70g/l sucrose bổ sung thêm 5mg/l BAP thích hợp để tạo củ in vitro giống khoai sọ Cụ Cang Lượng BAP cần bổ sung cao (7mg/l) để tạo củ in vitro giống khoai sọ núi Với giống khoai Mán khoai sọ thơm Lạng sơn, nhu cầu đường sucrose trình tạo củ thấp (50g/l) II Đề nghị Do thời gian làm đề tài có hạn, thời gian sinh trưởng khoai môn sọ lại dài nên dừng lại bước phịng thí nghiệm, Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội 59 Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu chưa theo dõi giai đoạn củ in vitro đồng ruộng hiệu tạo củ giống khoai sọ Cụ Cang khoai sọ núi chưa cao Vì để đề tài đạt kết tốt có số đề nghị sau: - Tiếp tục nghiên cứu trồng củ in vitro đồng ruộng để hồn thiện quy trình tạo củ in vitro cho giống khoai sọ - Đặc biệt giống khoai sọ Cụ Cang giống khoai sọ ngon hiệu tạo củ in vitro chưa cao Do cần có thêm nghiên cứu để phục tráng sử dụng củ in vitro nghiên cứu cải tiến nguồn gen Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội 60 Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu TÀI LIỆU THAM KHẢO I Sách, tạp chí đề tài [1] Nguyễn Thị Ngọc Huệ, Nguyễn Văn Viết, 2004.Tài nguyên di truyền khoai môn sọ Việt Nam NXB Nông Nghiệp [2] Nguyễn Thị Nga, 2008 Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng tia Gamma nguồn Co60 đến chồi in vitro tái sinh từ chồi đỉnh số giống khoai môn sọ địa phương Luận văn thạc sĩ Trường ĐHSP Hà Nội [3] Nguyễn Quang Thạch (chủ biên), Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo, 2005 Giáo trình cơng nghệ sinh học nơng nghiệp NXB Nơng nghiệp, Hà Nội [4] Nguyễn Đức Thành, 2000 Nuôi cấy mô tế bào thực vật- nghiên cứu ứng dụng NXB Nông Nghiệp [5] Nguyễn Thị Anh Minh, 2010 Nghiên cứu nhân giống in vitro bước đầu ứng dụng kĩ thuật đột biến thực nghiệm nhằm cải tiến số giống khoai sọ địa phương Luận văn thạc sĩ Trường ĐHSP Hà Nội [6] Nguyễn Kim Hương, 2010 Bước đầu nghiên cứu tạo củ in vitro khoai mơn tía Lạng Sơn (Colocasia esculenta (L.) Schott) Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội [7] ThS Nguyễn Phương (Trung tâm công nghệ sinh học & Công nghệ thành phố Hà Nội), PGS.TS Lê Thị Cúc, GS.TS Hồng Đình Hòa (Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội, 2009 Nghiên cứu tính chất lí hóa tinh bột số giống khoai môn sọ (Colocasia esculenta (L.) Schott) phổ biến có miền Bắc Việt Nam [8] Su P Zhou – Ye K.He – Shi J Li, 1999 Introduction and characterization of in vitro corms of diploid – taro, Plant cell tissue and organ culture , pp 173 – 178 NXB Springer Nertherlands Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội 61 Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu [9] Phan Thị Thanh Tâm, Nghiên cứu đa dạng di truyền lồi khoai mơn sọ (Colocasi esculenta (L.) Schott) số tỉnh vùng Đông Bắc Bộ Luận văn thạc sĩ trường ĐHSP Hà Nội II Các trang web [10] http: // www.ebook.edu.vn [11] http: // www.fao.org.vn [12] http: // www.khoahoc.com.vn [13] http: // www.khuyennongvn.gov.vn Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội 62 Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu PHỤ LỤC Bảng 1: Một số đường hướng phát sinh hình thái mô nuôi cấy Nồng độ phytohoocmon Sự phát sinh hình thái IAA Kinetin mẫu cấy 2.10-5 10-6 Callus 2.10-5 10-7 Rễ 2.10-7 5.10-6 Chồi Bảng 2: Sự phụ thuộc thời gian khử trùng vào lượng môi trường Lượng mơi trường bình ni cấy (ml) Thời gian khử trùng tối thiểu 1210C (phút) 20 – 50 75 250 – 500 1000 1500 2000 15 20 25 30 35 40 Bảng 3: Thành phần môi trường MS (Murashige – Skoog) , 1962 1650 1900 CaCl2.2H2O 440 MgSO4.7H2O 500 KH2PO4 Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội Nồng độ(mg/l mơi trường) KNO3 Đa lượng Tên hóa chất NH4NO3 Nhóm nguyên tố 170 63 Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu H3BO3 MgSO4.4H2O 0,25 0,025 0,025 FeSO4.7H2O 27,8 Na2EDTA 37,3 Myo-Inositol 100 Acid Nicotinic 0,5 Pyrydocin HCl 0,5 Thiamine HCl Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội 0,83 CuSO4.5H2O Vitamin KI CoCl2.6H2O Inositol 8,6 Mo4Na2.2H2O Dung dịch sắt 22,3 ZnSO4 Vi lượng 6,2 0,5 64 Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU SỬ DỤNG TRONG KHÓA LUẬN Viết Đọc AFW Average fresh weight MFW Maximum fresh weigh BAP 6-benzyl amino purin CT CCC ĐBSH ĐC Công thức Cycocel Đồng sông Hồng Đối chứng ĐHSP Đại học sư phạm FAO Tổ chức nông lương giới MS Murashige - Skoog NAA α-naphthyl acetic acid PP333 Paclobutrazol NXB Nhà xuất Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội 65 Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu MôC LôC Trang PHẦN I: MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích mục tiêu 3 Đối tượng nghiên cứu Địa điểm thời gian nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài PHẦN II: NỘI DUNG CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Đặc điểm chung khoai môn sọ(Colocasia esculenta (L.) Schott) 1.1 Phân loại khoai môn sọ 1.2 Nguồn gốc phân bố 1.3 Đặc điểm hình thái 1.4 Sinh trưởng phát triển 1.5 Điều kiện sinh thái 1.6 Thành phần dinh dưỡng, giá trị kinh tế sử dụng 1.7 Kĩ thuật trồng chăm sóc Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật công tác giống trồng 11 2.1 Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật 11 2.1.1 Định nghĩa 11 2.1.2 Khả sử dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật vào công tác giống trồng 12 2.1.3 Cơ sở sinh học kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật 12 2.1.3.1.Tính tồn tế bào 12 Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội 66 Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu 2.1.3.2 Sự phản phân hóa phân hóa tế bào 13 2.2 Nhân giống vơ tính in vitro 16 2.2.1 Ý nghĩa 16 2.2.2 Quy trình nhân giống vơ tính in vitro 17 2.2.3 Các phương thức nhân giống in vitro 19 2.3 Môi trường nuôi cấy 20 2.3.1.Thành phần môi trường nuôi cấy 20 2.3.2 Chuẩn bị môi trường 24 Tình hình nghiên cứu qui trình nhân giống vơ tính khoai môn sọ (Colocasia esculenta) tạo củ in vitro giới Việt Nam 26 3.1 Tình hình nghiên cứu tạo củ in vitro khoai mơn sọ giới 26 Trong đề tài nghiên cứu vấn đề sau: 26 3.1.1 Giới thiệu 26 3.1.2 Phương pháp 27 3.1.3 Phương pháp thu củ thống kê 28 3.1.4 Bảo quản trồng củ 28 3.1.5 Kết 29 3.1.5.1 Ảnh hưởng mơi trường tạo củ lên hình thành củ ống nghiệm 29 3.1.5.2 Ảnh hưởng phương pháp ni cấy lên hình thành củ 30 3.1.5.3 Sự phát triển củ ống nghiệm 30 3.1.5.4 Bảo quản trồng vườn 31 3.2 Tình hình nghiên cứu tạo củ in vitro khoai môn sọ Việt Nam 31 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 Vật liệu nghiên cứu 33 Phương pháp nghiên cứu 34 Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội 67 Trường ĐHSP Hà Khóa luận tốt nghiệp Hà Phạm Thị Thu 2.1 Thí nghiệm xác định cơng thức khử trùng thích hợp cho mẫu ni cấy 34 2.2 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi trực tiếp mẫu cấy 36 2.3 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng nồng độ BAP đến hệ số nhân nhanh chồi 37 2.4 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng nồng độ NAA đến rễ 37 2.5 Thí nghiệm xác định mơi trường thích hợp cho tạo củ in vitro 38 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 Kết nghiên cứu xác định công thức khử trùng thích hợp 40 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ BAP đến khả tái sinh chồi trực tiếp mẫu cấy 43 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ BAP đến hệ số nhân nhanh chồi 47 Ảnh hưởng nồng độ NAA đến rễ in vitro 50 Kết nghiên cứu mơi trường tạo củ in vitro thích hợp 53 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC 63 Líp: K57A - Khoa Sinh học Nội 68 Trường ĐHSP Hà ... thức tái sinh nhân nhanh chồi, công thức rễ nhằm tạo in vitro hồn chỉnh - Xác định mơi trường tạo củ in vitro giống khoai môn sọ nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu giống khoai môn sọ quý... [3][4] Tình hình nghiên cứu qui trình nhân giống vơ tính khoai môn sọ (Colocasia esculenta) tạo củ in vitro giới Việt Nam 3.1 Tình hình nghiên cứu tạo củ in vitro khoai môn sọ giới Năm 1992,... đích tạo số lượng lớn giống khoai môn sọ bệnh phục vụ cho sản xuất, cung cấp nguyên liệu cho công tác bảo tồn, tiến hành đề tài “ Nghiên cứu quy trình tạo củ in vitro số giống khoai môn sọ địa phương