Nghiên cứu quy trình tái sinh in vitro cây dưa hấu

Tạp chí Công nghệ Sinh học 8(3B): 1353-1359, 2010 1353 NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁI SINH IN VITRO CÂY DƯA HẤU (CITRULLUS LANATUS THUMB.) Nguyễn Thị Thanh Nga 1,2 , Nguyễn Tường Vân 2 , Chu Hoàng Hà 2 , Lê Trần Bình 2 1 Trường Đại học Tây Bắc 2 Viện Công nghệ sinh học TÓM TẮT Quy trình tái sinh cây in vitro hiệu quả cho cây dưa hấu thông qua mô sẹo hoặc trực tiếp từ lá mầm đã được thử nghiệm trong nghiên cứu này. Vật liệu khởi đầu được sử dụng là lá mầm 4-5 ngày tuổi. Các mảnh lá mầm được kích thích tạo mô sẹo hoặc hình thành chồi và cụm chồi trên môi trường MS có bổ sung các chất kích thích sinh trưởng với nồng độ khác nhau. 2.4D không có khả năng kích thích tạo mô sẹo từ mảnh lá mầm dưa hấu. Tỷ lệ tạo cụm chồi cao nhất thu được trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l IBA và 1,5 mg/l BAP. Sau 6 tuần các cụm chồi tái sinh được chuyển sang môi trường kéo dài chồi (MS bổ sung 580 mg/l MES, 0,1mg/l IBA, 0,5 mg/l GA3) trong 2 tuần. Những chồi có kích thước >1cm sẽ hình thành rễ sau 3 đến 4 tuần trên môi trường tạo rễ (MS, 0,1mg/l IBA). Các cây hoàn chỉnh sau giai đoạn tạo rễ sẽ được chuyển ra bầu trấu hun để thích ứng dần với điều kiện môi trường. Từ khóa: dưa hấu, tái sinh cây in vitro, lá mầm, cụm chồi MỞ ĐẦU Dưa hấu (Citrullus lanatus Thumb.) là cây trồng quan trong thuộc họ bầu bí, có nguồn gốc từ châu Phi và Nam châu Á. Quả dưa hấu có giá trị dinh dưỡng và thương mại cao, có thể dùng ăn trực tiếp, làm salad, nước ép, kẹo và ăn hạt. Ở vùng sa mạc, người ta sử dụng dưa hấu như một nguồn cung cấp nước cho cơ thể (Sultana et al., 2003). Giá trị dinh dưỡng của dưa hấu không chỉ bởi vị ngọt, mát của nó mà còn vì quả dưa hấu chứa một hàm lượng lớn chất xơ, nhiều loại vitamin khác nhau và khoáng chất, hạt dưa hấu rất giàu chất béo và protein (Wehner et al., 2008; Sultana et al., 2003; Compton, 2004). Hiện nay, dưa hấu được trồng phổ biến ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, trong đó quá nửa diện tích được trồng ở vùng Đông Nan Á, châu Phi, vùng biển Caribê và miền Nam nước Mỹ (Sultana et al., 2003; Wehner et al., 2008; Wehner et al., 2003) Việc xây dựng quy trình tái sinh cây in vitro là rất cần thiết cho việc ứng dụng công nghệ sinh học trong cải tiến giống dưa hấu, đặc biệt trong việc nâng cao khả năng chống sâu bệnh hại. Đã có một vài nghiên cứu thông báo về quy trình tái sinh cây dưa hấu để tạo giống sạch bệnh cũng như tạo nguyên liệu cho chuyển gen. Nhìn chung các quy trình đều bao gồm 3 giai đoạn: giai đoạn tạo chồi bằng cách nuôi cấy các mảnh lá mầm trên môi trường nuôi cấy có bổ sung cytokinin, giai đoạn kéo dài chồi bằng cách chuyển các chồi hoặc cụm chồi sang môi trường có nồng độ cytokinin thấp; giai đoạn thứ 3 là giai đoạn tạo rễ cho chồi bằng cách chuyển các mồi sang môi trường có nồng độ auxin thấp hoặc môi trường không có chất kích thích sinh trưởng (Sultana et al., 2003, 2004; Ganasan et al., 2010; Krug et al., 2005; Pirinc et al., 2003; Chaturvedi et al., 2001). Tuy nhiên, so với các loại cây trồng khác trong họ bầu bí như dưa chuột, … thì việc nuôi cấy mô ở dưa hấu ít được quan tâm hơn (Dong, Jia, 1991; Sultana et al., 2003). Ở Việt Nam, những nghiên cứu về dưa hấu tập trung chủ yếu vào các biện pháp nông học nhằm nâng cao năng suất, chất lượng dưa hấu (Trần Đình Nguyễn, Trần Thị Ba, 2008), so sánh các chỉ tiêu năng xuất, chất lượng của các giống dưa hiện có tại Việt Nam (Trần Thị Ba, Võ Thị Bích Thủy, 2004), nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thu hoạch và bảo quản dưa hấu (Lê Văn Việt Mẫn, Trần quốc Huy, 2008). Một vài nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô trong việc nhân nhanh các giống dưa hấu tam bội hoặc dưa hấu lai F1 phục vụ cho công tác giống cũng đã được tiến hành (Nguyễn Thị Phương Thảo et al., 2010; Lâm Ngọc Phương et al., 2005; 2006). Tuy nhiên, việc tái sinh cây dưa hấu thông qua nuôi cấy mô ở Việt Nam hiện nay vẫn chưa được quan tâm nghiên cứu nhiều. Vì thế, nghiên cứu này được thực hiện với mục đích xây dựng được quy trình tái sinh in vitro để phục vụ cho công tác nhân giống và chuyển gen vào cây dưa hấu. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu nghiên cứu Hạt dưa hấu dùng trong thí nghiệm của chúng tôi được thu từ Dòng 1 có nguồn gốc địa phương (Bình Thuận), quả có vỏ đen, tròn, to, ruột đỏ và Dòng 2 có nguồn gốc từ giống F1-Tiểu Long – Thăng Long, quả có vỏ xanh, hình oval, to, ruột đỏ và con lai ở thế hệ F9 (cho tự thụ phấn) của hai dòng trên. Chuẩn bị mẫu cấy Hạt dưa hấu được khử trùng bề mặt bằng cồn 70% trong 1 phút, sau đó ngâm trong dung dịch Javel 40% trong 15 phút rồi rửa lại 3 lần bằng nước cất khử trùng. Hạt đã khử trùng bề mặt được bóc vỏ rồi tiếp tục khử trùng bằng cồn 70% trong 1 phút, Javel 5% trong 5 phút rồi cho nảy mầm trên môi trường MS trong tối ở 28 0 C. Cảm ứng đa chồi và tái sinh cây Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường nuôi cấy MS có bổ sung các chất kích thích sinh trưởng khác nhau, được trình bày trong bảng 1. Lá mầm 3 - 7 ngày tuổi được cắt với kích thước khoảng 1 – 2 mm 2 (chỉ lấy phần gần gốc lá mầm) và đặt lên môi trường cảm ứng tạo mô sẹo hoặc môi trường tái sinh. Sau 6 tuần, các chồi đơn hoặc các cụm chồi tái sinh được chuyển sang môi trường kéo dài chồi hoặc môi trường ra rễ (đối với những chồi có kích thước lớn, khỏe mạnh). Sau khi tạo rễ, các cây hoàn chỉnh sẽ được chuyển ra giá thể trấu hun nuôi cấy trong buồng sinh trưởng và chuyển ra nhà lưới. Hiệu quả của các giai đoạn được đánh giá dựa trên tỷ lệ (%) tạo mô sẹo, tái sinh chồi, số chồi trên mảnh lá. Bảng 1. Thành phần môi trường thử nghiệm. Tên môi trường Thành phần môi trường Môi trường cảm ứng tạo mô sẹo MS bổ sung: 0,0; 2,0 và 2,5 mg/l 2,4-D Môi trường tái sinh chồi MS bổ sung: 0,5 mg/l IBA và BAP với các nồng độ khác nhau: 0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 7,0; 9,0 mg/l. Và MS bổ sung 0,5 mg/l IBA, 1,5 mg/l BAP và NAA với các nồng độ 0,1; 0,2 mg/l. Môi trường kéo dài chồi MS bổ sung 0,1 mg/l IBA, 580 mg/l MES và GA3 với các nồng độ: 0,0; 0,3; 0,5; 0,7 mg/l. Môi trường ra rễ MS bổ sung: 0,0; 0,1; 0,3; 0,5 mg/l IBA ½ MS bổ sung 0,1 mg/l IBA KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Khả năng cảm ứng tạo mô sẹo của lá mầm Khả năng cảm ứng tạo mô sẹo của lá mầm được khảo sát trước hết trên môi trường có bổ sung 2,4-D với 3 nồng độ khác nhau 0,0; 2,0 và 2,5mg/l. Kết quả cho thấy ở cả 3 công thức thí nghiệm, tất cả các mảnh lá mầm của cả 2 dòng dưa hấu đều không tạo được mô sẹo, các mảnh lá mầm có tăng trưởng về kích thước nhưng mức độ tăng trưởng không đáng kể, mẫu cấy có màu vàng và bị chết sau khoảng 3 – 4 tuần nuôi cấy. Ở nồng độ 2,0 mg/l và 2,5 mg/l, các mảnh lá mầm tăng trưởng chậm hơn và chết sớm hơn so với công thức đối chứng, hầu hết chúng chỉ đạt kích thước tương đương với ½ kích thước ở các mẫu đối chứng. Kết quả này hoàn toàn trái ngược với kết quả của Sultana và đồng tác giả (2004), khi thông báo có tới 75 và 100% mảnh lá tạo mô sẹo trên môi trường có 2,0 và 2,5mg/l 2,4-D. Theo các nghiên cứu của Compton và đồng tác giả (2004), Nikam và đồng tác giả (2009) về ảnh hưởng tác động của 2,4-D và BA hoặc Kn đến sự phát sinh callus và tái sinh chồi dưa hấu thì việc bổ sung thêm 2,4-D với một hàm lượng nhất định có tác dụng làm cho việc phát sinh mô sẹo được dễ dàng hơn nhưng những chồi thu được lại quá ngắn. Như vậy, khi bổ sung 2,4-D vào môi trường nuôi cấy các mẫu dưa hấu nói trên không những không tạo được mô sẹo mà còn kìm hãm sự phát triển của các mảnh cấy. Khả năng tái sinh chồi và cụm chồi Ảnh hưởng của tuổi lá mầm đến quá trình tái sinh chồi Trong quá trình nuôi cấy, bên cạnh việc bổ sung hợp lý các chất điều tiết sinh trưởng vào môi trường Tạp chí Công nghệ Sinh học 8(3B): 1353-1359, 2010 1355 (Krug et al., 2005) thì tuổi của lá mầm (Srisvastava et al., 1989) và phương pháp lấy mẫu cấy (Compton, Gray, 1993, Compton, 1999) cũng là những yếu tố quan trọng, quyết định đến khả năng tái sinh ở dưa hấu. Vì thế, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm trên tuổi lá mầm khác nhau. Mảnh lá mầm 3, 5, 7 và 9 ngày tuổi được đặt lên môi trường tái sinh có bổ sung 1,5 mg/l BAP và 0,5 mg/l IBA. Tỷ lệ lá mầm tái sinh chồi được quan sát sau 6 tuần, và được thể hiện trong bảng 4. Rõ ràng, có khác biệt khá rõ về ảnh hưởng của tuổi lá mầm đến khả năng tái sinh thành chồi. Lá mầm 5 ngày tuổi cho hiệu quả tái sinh thành chồi cao nhất. Phần gần gốc lá mầm cho số lượng chồi tái sinh nhiều hơn phần gần ngọn lá mầm. Kết quả này cũng phù hợp với các công bố trước đây về việc lựa chọn các lá mầm dưa hấu 5 ngày tuổi để tạo chồi in vitro (Pirinc et al., 2003; Dong, Jia, 1991). Tuy nhiên, theo nhiều tác giả thì việc nuôi cấy các mảnh lá mầm dưới 5 ngày tuổi mới cho hiệu quả tái sinh cao nhất, bởi chúng phản ứng tích cực và hiệu quả hơn đối với các kích tố ngoại sinh (Choi et al., 1994; Compton ,1999; Krug et al., 2005). Bảng 4. Ảnh hưởng của tuổi lá mầm tái sinh chồi. Tuổi lá mầm (ngày) Dòng 1 Dòng 2 Số mảnh cấy Số mảnh tái sinh thành chồi Tỷ lệ (%) Số mảnh cấy Số mảnh tái sinh thành chồi Tỷ lệ (%) 3 30 8 26,7 30 8 26,7 5 30 11 36,7 30 14 46,6 7 30 10 33,3 30 9 30,0 9 30 5 16,7 30 6 20,0 Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến quá trình tái sinh chồi Trên môi trường không có chất kích thích sinh trưởng, tất cả các mẫu nuôi cấy đều không tạo được mô sẹo hoặc tạo chồi và chết sau 4 tuần nuôi cấy. Sự có mặt của BAP và IBA với các nồng độ khác nhau kích thích tạo chồi với tỷ lệ khác nhau. Tỷ lệ tái sinh giao động từ 13,3%– 44,6% (Dòng 1) và từ 18,4% – 56,7% (Dòng 2). Tuy nhiên, tỷ lệ các mảnh lá mầm tái sinh tạo được chồi cao nhất ở cả 2 dòng dưa hấu lại ở công thức chứa 1,5 mg/l BAP (Bảng 2) và số chồi trung bình ở công thức 1,5 mg/l BAP cũng là cao nhất đối với cả 2 dòng dưa (4 hoặc 5 chồi/ mẫu). Kết quả này phù hợp với nhiều công bố khẳng định rằng việc tái sinh chồi từ các mảnh lá mầm dưa hấu là tốt nhất trên môi trường MS có bổ sung từ 1 – 2 mg/l BAP (Ganasan, Huyop, 2010; Pirinc et al., 2003; Wang Chun-xia et al., 1997; Choi et al.,1994; Park et al.,2005; Krug et al.,2005), nhưng lại trái ngược với kết quả tái sinh chồi của Nguyễn Thị Phương Thảo và đồng tác giả (2010). Theo tác giả này, khi sử dụng BAP (1,5 mg/l) thì 100% mẫu lá tạo mô sẹo nhưng lại không tạo được chồi. Điều này có thể là do ảnh hưởng của các giống sử dụng khác nhau. Khi nồng độ BAP tăng lên từ 4,0; 7,0 và 9,0 mg/l BAP, thì tỷ lệ các mảnh lá mầm tái sinh thành chồi giảm rõ rệt trong khi tổng số mảnh lá tái sinh vẫn rất cao. Như vậy, có thể thấy rằng nồng độ BAP cao sẽ kích thích các mảnh lá tái sinh thành cụm lá nhiều hơn tái sinh thành chồi. Ở các công thức tái sinh có bổ sung NAA, hầu hết các mảnh lá mầm đều tạo được mô sẹo nhưng mô sẹo cứng và có mầu trắng hơn so với công thức không có NAA. Thêm vào đó, 60 – 70% các mảnh lá tạo rễ to, sần sùi, cứng thay vì tạo chồi. Như vậy, sự kết hợp đồng thời giữa IBA, BAP và NAA đã kìm hãm quá trình tái sinh cây từ mô sẹo và kích thích quá trình tạo rễ, giống như kết quả nghiên cứu của Krug và đồng tác giả (2005). Srisvastava và đồng tác giả (1989) khẳng định khả năng tái sinh chồi từ các mảnh lá mầm dưa hấu giảm đáng kể khi bổ sung NAA hoặc IAA trong môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, theo Sultana và đồng tác giả (2004) khi nghiên cứu ảnh hưởng tác động của các chất kích thích sinh trưởng đến quá trình tái sinh chồi của dưa hấu Citrullus lanatus Thumb. thì việc kết hợp giữa 1,0 mg/l BAP và 0,2 mg/l NAA lại cho kết quả tái sinh cao nhất (70%) so với các công thức còn lại. Kết quả kích thích kéo dài chồi Việc chuyển các chồi dưa hấu tái sinh từ lá mầm sang môi trường kéo dài chồi ít được quan tâm nghiên cứu, có thể do chúng có thể có khả năng tự vươn cao trong môi trường MS như được đề cập trong một số nghiên cứu (Shalaby et al.,2008; Compton et al.,1996; Ganasan et al.,2010). Tuy nhiên, trong một vài công trình nghiên cứu về quy trình tái sinh và chuyển gen vào dưa hấu, vấn đề này được cho là cần thiết để có thể thu được các cây tái sinh có sức sống cao hơn (Wang Chun-xia et al.,1997; Compton et al.,1999). Các chồi tái sinh 6 tuần tuổi của dòng dưa hấu số 2 được chuyển sang môi trường kéo dài chồi có chứa 0,1 mg/l IBA và các nồng độ khác của GA3 trong 2 tuần. Nhìn chung với các chồi khỏe (cao >1cm, mập mạp) khi chuyển sang môi trường MS không có chất kích thích sinh trưởng vẫn phát triển rất tốt, cây lớn nhanh, khỏe, xanh tốt. Còn những chồi có kích thước nhỏ (<1cm), khi đưa sang các môi trường kéo dài chồi khác nhau thì sự kích thích kéo dài có sự khác biệt khá rõ rệt. Kết quả được thể hiện qua bảng 5. Đối với công thức môi trường chỉ có MS thì hầu hết chồi phát triển chậm hơn so với trên môi trường có bổ sung GA3. Ở nồng độ 0,5 mg/l GA3, các chồi phát triển về chiều cao khá đồng đều, cây xanh tốt, một số cây có rễ, còn đối với nồng độ 0,7 mg/l GA3, dù thống kê về sự kéo dài chồi không khác biệt so với nồng độ 0,5 mg/l GA3 nhưng các chồi phát triển không đồng đều, lá cây có mầu vàng và số chồi có rễ ít hơn. Kết quả trên cũng phù hợp với kết quả mà Cho et al., (2008) đã công bố rằng chồi được kéo dài tốt nhất trên môi trường có bổ sung 0,1 mg/l IBA, 0,5 mg/l GA 3 và 580 mg/l MES. Bảng 2. Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến quá trình phát sinh chồi. Môi trường: MS + 0,5 IBA Số mảnh lá mầm Số mảnh tái sinh Tỷ lệ tái sinh (%) Tỷ lệ số mảnh cho chồi (%) Số chồi trung bình D1 D2 D1 D2 D1 D2 D1 D2 D1 D2 +0,0 BAP 38 39 0 0 0 0 0 0 0 0 +0,5 BAP 80 47 22 11 22,5 23,4 25,0 23,4 3 3 +1,0 BAP 94 80 31 30 33,0 37,5 31,9 35,0 3 5 +1,5 BAP 73 69 29 33 39,7 47,8 38,4 45,0 4 5 +2,0 BAP 97 60 37 34 38,1 56,7 36,1 41,7 4 4 +2,5 BAP 94 59 38 25 40,4 42,4 35,1 30,5 3 3 +3,0 BAP 99 102 39 45 39,4 44,1 31,3 31,4 2 4 +3,5 BAP 68 71 27 29 39,7 40,1 29,4 28,1 2 2 +4,0 BAP 92 77 41 28 44,6 36,4 26,1 24,7 2 2 +7,0 BAP 47 36 16 11 34,0 30,6 10,6 22,2 2 1 +9,0 BAP 39 47 7 11 17,9 23,4 7,7 11,4 2 2 + 1,5 BAP + 0,1 NAA 30 44 5 10 16,7 27,2 10,0 20,5 3 3 + 1,5 BAP + 0,2 NAA 30 38 4 7 13,3 18,4 10,0 18,4 2 3 Ghi chú: Những mảnh tái sinh là những mảnh đã tái sinh thành chồi hoặc tái sinh thành cụm lá. Những mảnh tái sinh thành cụm lá thì không hình thành chồi trên môi trường kéo dài chồi nên không có ý nghĩa trong nuôi cấy In vitro. Bảng 5. Ảnh hưởng của GA3 và IBA đến sự kích thích kéo dài chồi có kích thước < 1 cm. GA3 Số chồi cấy Số chồi được kéo dài Số chồi 2 – 3 cm Số chồi 3 – 5 cm Số chồi >5 cm 0,0 30 27 19 5 3 0,3 30 30 5 17 8 0,5 30 30 3 23 4 0,7 30 30 3 22 5 Tạp chí Công nghệ Sinh học 8(3B): 1353-1359, 2010 1357 Kết quả ra rễ của chồi tái sinh Các chồi dưa hấu được biết có thể tạo rễ trên môi trường MS (Park et al.,2005; Choi et al.,1994; Akashi et al.,2005) tuy nhiên tốc độ phát triển chiều cao của chồi vẫn có thể nhanh hơn tốc độ ra rễ của chúng. Vì thế, sau 2 tuần trên môi trường kéo dài các chồi sẽ được chuyển sang môi trường tạo rễ. Trong các công thức thí nghiệm, công thức môi trường MS bổ sung 0,3 và 0,5 mg/l IBA có tỷ lệ tạo rễ là rất cao (83,3% và 90,5%), tuy nhiên lá bị vàng, rễ to, sần sùi, giòn và hầu hết bị gãy khi chuyển từ môi trường thạch ra môi trường bên ngoài, vì thế 100% cây đều bị chết trong giai đoạn thích ứng với môi trường. Ở môi trường MS bổ sung 0,1 mg/l IBA, cây vẫn phát triển rất nhanh và tỷ lệ tạo rễ thấp hơn, nhưng cây xanh tốt, rễ mảnh, dai, ít bị đứt gãy khi rút ra khỏi bề mặt thạch. Còn ở công thức 1/2MS + 0,1 mg/l IBA thì tỷ lệ ra rễ thấp và cây phát triển chậm, còi cọc, lá bị vàng. Có thể khẳng định MS + 0,1 mg/l IBA là công thức tốt nhất để tạo rễ cho các dòng dưa hấu nghiên cứu, kết quả này cũng phù hợp với một vài nghiên cứu đã công bố trước đây (Compton et al., 1996, 2004; Krug et al., 2005; Ganasan, 2010). Các cây hoàn chỉnh sẽ được chuyển sang giá thể trấu hun để thích ứng dần với điều kiện môi trường. Bảng 6. Khả năng tạo rễ trên môi trường thử nghiệm. Môi trường Số chồi cấy Số chồi tạo được rễ Tỷ lệ (%) Số rễ /chồi MS 24 13 54,2 1-4 MS + 0,1 IBA 27 21 77,8 1-4 MS + 0,3 IBA 30 25 83,3 1-5 MS + 0,5 IBA 21 19 90,5 1-5 1/2MS + 0,1 IBA 16 9 56,3 1-2 Hình 1. Quy trình tái sinh cây dưa hấu. A: Phôi nảy mầm trên môi trường MS; B: Mảnh lá mầm 4-5 ngày tuổi được cấy lên môi trường tái sinh; C: Chồi được hình thành sau 2 tuần nuôi cấy; D: Cụm chồi sau 5 – 6 tuần nuôi cấy; E: Các cụm chồi cần chuyển sang môi trường kéo dài chồi; F: Các cụm chồi sau 2 tuần trên môi trường kéo dài chồi; G: Tạo rễ cho chồi; H: Thích ứng cây với môi trường. KẾT LUẬN Qua nghiên cứu này, chúng tôi đã tạo được quy trình tái sinh cây hiệu quả từ lá mầm của cây dưa hấu (Hình 1). Mảnh lá mầm 5 ngày tuổi là thích hợp cho việc tái sinh ở dưa hấu. Các vùng khác nhau trên lá mầm cho hiệu quả tái sinh cũng khác nhau, vùng gần gốc lá mầm cho hiệu quả tái sinh cao hơn các vùng khác. Môi trường thích hợp để tái sinh chồi là MS bổ sung 3% sucrose, 0,8% agarose, 0,5 mg/l IBA, 1,5 A B C E F G H D mg/l BAP. Các chồi tạo thành có thể được kéo dài trên môi trường MS bổ sung 3% sucrose, 0,8% agarose, 0,1 mg/l IBA, 580mg/l MES và 0,5 mg/l GA3 và được ra rễ trên môi trường MS bổ sung 3% sucrose, 0,8% agarose, 0,1 mg/l IBA. Các cây hoàn chỉnh sẽ được chuyển ra bầu trấu hun để thích nghi với điều kiện môi trường. Việc sử dụng 2,4-D để cảm ứng tạo mô sẹo trước khi tạo chồi không những không tạo được mô sẹo mà còn kìm hãm sự phát triển của lá mầm. TÀI LIỆU THAM KHẢO Chaturvedi R, Bhatnagar SP (2001) High – frequency shoot regeneration from cotyledon expalnts of watermelon cv. Sugar Baby. In Vitro Cell Dev Biol Plant 37: 255-258. Cho MA, Moon CY, Liu JR, Choi PS (2008) Agrobacterium-mediated transformation in Citrullus lanatus, BP 52(2): 365-369. Choi PS, Soh WY, Kim YS, Yoo Ook J and Liu JR (1994) Genetic transformation and plant regeneration of watermelon using Agrobacterium tumefaciens. PCR 13: 344-348. Compton ME, Gray DJ and Gaba VP (2004) Genetic transformation of watermelon, I.S.Curtis (ed), Transgenic crops of the world – Essential Protocols: 425-433. Compton M E (1999) Dark pretreatment improves adventitious shoot organogenesis from cotyledons of diploid watermelon, Plant Cell Tissue Organ Cult 58 : 185-188. Compton ME, Gray DJ, Elmstrom GW (1996) Identification of tetraploid regenerants from cotyledons of dipoid watermelon cultured in vitro, Euphytica 87: 165- 172. Compton M E, Gray D J (1993) Somatic embryogenesis and plant regeneration from immature cotyledons of watermelon, Plant Cell Rep12: 61-65. Compton ME, Gray DJ, Gaba VP (2004) Use of tissue culture and biotechnology for the genetic improvement of watermelon. Plant Cell Tissue Organ Cult 77: 231-43. Dong JZ, Jia SR (1991) High efficiency plant regeneration from cotyledons of Watermelon (Citrullus lanatus Schrad.), Plant Cell Rep v9: 559-562. Ganasan K, Huyop F (2010) In vitro Regeneration of Citrullus lanatus cv. Round Dragon, J Biol Sci 10 (2): 131- 137. Akashi K, Morikawa K, Yokota A (2005) Agrobacterium- mediated transformation system for the drought and excess light stress-tolerant wild watermelon (Citrullus lanatus), Plant Biotechnol 22 (1): 13-18. Krug MGZ, Stipp LCL, Rodriguez APM (2005)In vitro organogenesis in watermelon cotyledons, Pesq Agropec bras Brasília 40(9): 861-865 Lâm Ngọc Phương, Nguyễn Bảo Vệ, Đỗ Thị Trang Nhã (2005) Nhân chồi dưa hấu tam bội (Citrullus vulgaris Schrad.) từ chồi đỉnh trên môi trường MS có cytokinin và auxin, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn 2: 30, 31&35. Lâm Ngọc Phương, Nguyễn Bảo Vệ (2006) Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật IBA, BA và than hoạt tính đến sự tạo rễ của chồi dưa hấu tam bội in vitro (Citrullus vulgaris Schrad)., Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn 2: 39-44. Lê Văn Việt Mẫn, Trần Quốc Huy (2008) Nghiên cứu kéo dài thời gian bảo quản dưa hấu tươi cắt miếng bằng phương pháp xử lý ozone, Tạp chí phát triển Khoa học và Công nghệ (11)9: 77-82. Nguyễn Thị Phương Thảo, Ninh Thị Thảo, Vũ Thị Hà (2010) Nghiên cứu nhân nhanh In vitro cây dưa hấu (Citrullus lanatus), Tạp Chí Khoa học và Phát triển, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội (8)3: 418-425. Nikam TD, Ghane SG, Nehul JN, Barmukh RB (2009) Induction of morphogenic callus and multiple shoot regeneration in Monordica cymbalaria Fenzl., Indian J Biotechnol 8: 442-447. Pirinc V, Onay A, Yildirim H, Adiyaman F, Isikalan C and Basaran D (2003) Adventitious shoot organogenesis and plant regeneration from cotyledons of Diploid Diyarbakir Watermelon (Citrullus lanatus cv. “Surme”), Turk J Biol 27: 101-105. Park SM, Lee JS, Jegal S, Jeon BY, Jung M, Park YS, Han SL, Shin YS, Her NH, Lee JH, Lee MY, Ryu KH, Yang SG, Harn CH (2005) Transgenic watermelon rootstock resistant to CGMMV (Curcumber green mottle mosaic virus) infection, Plant Cell Rep 24: 350-356. Shalaby TA, Omran SA, Baioumi YA (2008) In vitro propagation of two triploid hybrids of watermelon through adventitious shoot organogenesis and shoot tip culture, Acta Biol Szege v52(1): 27-31. Srisvastava DR, Andrianov VM and Piruzian ES (1989) Tissue culture and plant regeneration of watermelon (Citrullus vulgaris Schrad. cv. Melitopolski), Plant Cell Rep v8: 300-302. Sultana RS, Bari MA, Rahman MH, Rahman MM, Siddique NA and Khatun N (2004) In vitro Rapid Regeneration of Plantles from Leaf Explant of Watermelon (Citrullus lanatus Thumb.), Biotechnology 3(2): 131-135. Sultana RS, Bari MA (2003) Effect of Different Plant Growth Regulators on Direct Regeneration of Watermelon (Citrulus lanatus Thumb.). Plant Tissue Cult 13(2): 173- 177. Tạp chí Công nghệ Sinh học 8(3B): 1353-1359, 2010 1359 Trần Đình Nguyễn, Trần Thị Ba (2008) Nghiên cứu biện pháp kỹ thuật tạo trái dưa hấu hình vuông phục vụ chưng tết, Tạp chí Khoa học Công nghệ Trường Đại học Cần Thơ 9: 128-135. Trần Thị Ba, Võ Thị Bích Thủy (2004) So sánh năng suất và phẩm chất một số giống dưa hấu tại ngoại thành thành phố Cần Thơ từ năm 2001 – 2003, Tạp chí Khoa học Công nghệ Trường Đại học Cần Thơ 2: 131-137. Wang Chun-xia, Jian Zhi-ying, Liu Yu, Zou Qi, Bai Yong- yan and Mao Hui-zhu (1997) Genetic transformation and plant regeneration of watermelon using Agrobacterium tumefaciens, website: http://en.cnki.com.cn/Article_en/ CJFDTOTAL-ZWXB199705009.htm Wehner TC (2008) Watermelon. (p. 381-418). In: J. Prohens and F. Nuez, eds. Handbook of Plant Breeding; Vegetables I: Asteraceae, Brassicaceae, Chenopodiaceae, and Cucurbitaceae. Springer Science+Business LLC, New York, NY, 426 p.17. Wehner TC, Maynard DN (2003) Cucurbitaceae (vine crops). In: Encyclopedia of Life Sciences. Nature Publishing. Website: http://cuke.hort.ncsu.edu/cucurbit/ wehner/articles/book14.pdf. IN VITRO REGENERATION OF WATERMELONS (CITRULLUS LANATUS THUMB.) Nguyen Thi Thanh Nga 1,2 ∗ ∗∗ ∗ , Nguyen Tuong Van 2 , Chu Hoang Ha 2 , Le Tran Binh 2 1 Tay Bac University 2 Institute of Biotechnology SUMMARY This study focused on the development of an efficient plant regereration in vitro protocol for watermelon cultivars of Vietnam. Cotyledon (4-5 days old) was used as initial explants. The ability to produce callus or buds from cotyledon was tested on MS medium supplemented with different plant growth regulators. 2.4D had no effect on the callus induction and plant regeneration of watermelon. The highest number of shoot buds was obtained on medium having 0,5 mg L -1 and 1,5 mg L -1 BAP. After 6 weeks, multiple shoot buds were elongated on MS medium containing 580 mg L -1 MES, 0.1 mg L -1 IBA, 0.5 mg L -1 GA3 in 2 weeks. The shoots longer than 1 cm after elongation were transfered onto MS medium containing 0,1mg L -1 IBA for rooting in 3 weeks. After rooting, plants were transferred to rice husk substrate for acclimatization Keywords: watermelons, in vitro plant regeneration, cotyledons, shoot buds ∗ Author for correspondence: E-mail: ngantt253@gmail.com . Bắc 2 Viện Công nghệ sinh học TÓM TẮT Quy trình tái sinh cây in vitro hiệu quả cho cây dưa hấu thông qua mô sẹo hoặc trực tiếp từ lá mầm đã được thử nghiệm trong nghiên cứu này. Vật liệu khởi. việc tái sinh cây dưa hấu thông qua nuôi cấy mô ở Việt Nam hiện nay vẫn chưa được quan tâm nghiên cứu nhiều. Vì thế, nghiên cứu này được thực hiện với mục đích xây dựng được quy trình tái sinh. Tạp chí Công nghệ Sinh học 8(3B): 1353-1359, 2010 1353 NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁI SINH IN VITRO CÂY DƯA HẤU (CITRULLUS LANATUS THUMB.) Nguyễn Thị Thanh Nga 1,2 ,