Nghiên cứu tối ưu tái sinh in vitro cây dưa hấu (citrullus lanatus thumb)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Chanhsamone KONGSAVANH NGHIÊN CỨU TỐI ƢU TÁI SINH IN VITRO CÂY DƢA HẤU (Citrullus lanatus Thumb.) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI - 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Chanhsamone KONGSAVANH NGHIÊN CỨU TỐI ƢU TÁI SINH IN VITRO CÂY DƢA HẤU (Citrullus lanatus Thumb.) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Lê Hồng Điệp HÀ NỘI – 2016 Luận văn thạc sĩ khoa học - 2016 LỜI CẢM ƠN Lời xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Lê Hồng Điệp người hướng dẫn, thường xuyên quan tâm bảo tận tình suốt thời gian thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán Bộ môn Sinh lý thực vật Hóa sinh, cán giáo viên Khoa Sinh học, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc Gia Hà Nội suốt trình học tập Đồng thời, xin cảm ơn cán bộ, em sinh viên phòng thí nghiệm Công nghệ Vi tảo Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Trung Tâm Khoa học sống, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Cuối cùng, gia đình bạn bè nguồn động viên khích lệ lớn thời gian học tập Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến tình cảm quý báu Hà Nội, ngày 07 tháng 03 năm 2016 Học viên Chanhsamone KONGSAVANH DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH ẢNH Bảng 1.1: Sản lượng dưa hấu nước đứng đầu giới năm 2013………….6 Bảng 3.1: Kết khử trùng hạt dưa hấu chưa bóc vỏ…………………………….22 Bảng 3.2: Kết khử trùng hạt bóc vỏ……………………………………… 23 Bảng 3.3: Kết hình thành mô sẹo dưa hấu môi trường có NAA BAP 28 Bảng 3.4: Ảnh hưởng BAP đến hệ số nhân chồi………………………………31 Bảng 3.5: Ảnh hưởng KIN đến hệ số nhân chồi……………………………….32 Bảng 3.6: Kết hình thành rễ môi trường có bổ sung IBA……………… 34 Hình 3.1: Kết tạo mô sẹo môi trường có NAA……………………….25 Hình 3.2: Kết tạo mô sẹo môi trường có NAA BAP (sau tuần)…………… 27 Hình 3.3: Tái sinh chồi dưa hấu từ mô sẹo môi trường T4………………………29 Hình 3.4: Kết nhân chồi dưa hấu môi trường B2 sau tuần…………31 Hình 3.5: Kết nhân chồi với môi trường bổ sung KIN………………… ……33 Hình 3.6: Các chồi dưa hấu nuôi trê môi trường MS sau tuần…………….35 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Tên đầy đủ STT Tên viết tắt CT Công thức ĐC Đối chứng MS Murashige and Skoog NAA Naphtalene acetic acid IBA Indole-3-butyric acid BAP 6-Benzylaminopurine GA Gibberellin ABA Abscisic acid 2,4-D 2,4 diclorophenoxyacetic acid 10 IAA Indole-3-acetic acid Luận văn thạc sĩ khoa học - 2016 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Sơ lƣợc dƣa hấu 1.1.1 Nguồn gốc, phân loại 1.1.2 Giá trị dưa hấu 1.1.3 Tình hình trồng dưa hấu Việt Nam giới 1.2.Nhân giống thực vật 1.2.1 Nhân giống truyền thống 1.2.2 Nhân giống vô tính in vitro .8 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 17 2.1 Vật liệu 17 2.1.1 Giống dưa hấu 17 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ .17 2.1.3 Hóa chất 17 2.2 Phƣơng pháp 17 2.2.1 Phương pháp vô trùng mẫu 17 2.2.2 Phương pháp tạo mô sẹo 19 2.2.3 Phương pháp tái sinh chồi từ mô sẹo .18 2.2.4 Phương pháp nhân chồi 18 2.2.5 Phương pháp tạo rễ 19 2.2.6 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 19 2.2.7 Các điều kiện nuôi cấy .19 2.2.8 Xử lý số liệu .20 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 3.1 Tạo nguồn vật liệu khởi đầu .21 3.2 Kết tạo mô sẹo mẫu dƣa hấu 21 3.3 Ảnh hƣởng phytohormone đến tái sinh chồi từ mô sẹo 23 3.4 Ảnh hƣởng phytohormone đến nhân chồi từ mô sẹo 30 3.5 Kéo dài chồi 33 3.6 Tạo rễ cho dƣa hấu in vitro 34 3.7 Thử nghiệm đưa dưa hấu giá thể .36 3.8 Thử nghiệm đƣa dƣa hấu giá thể 36 KẾT LUẬN 37 KIẾN NGHỊ 38 Tài liệu tham khảo……………………………………………………………… 39 Luận văn thạc sĩ khoa học - 2016 Phụ Lục ……………………………………………………………………… ….41 Luận văn thạc sĩ khoa học - 2016 MỞ ĐẦU Dưa hấu (Citrullus lanatus Thumb.) ăn có nguồn gốc từ châu Phi Nam châu Á Cây dưa hấu sinh trưởng phát triển nhiều loại đất trồng khác vùng nhiệt đới Trái dưa hấu chứa nhiều thành phần dinh dưỡng giá trị, dùng ăn trực tiếp, làm salad, nước ép… Ngoài ra, số giống dưa hấu sử dụng để sản xuất hạt dưa dùng cho cưới hỏi lễ hội truyền thống Giá trị dưa hấu không đươ ̣c đánh giá b ởi vị ngọt, mát mà dưa hấu chứa hàm lượng lớn chất xơ, nhiều loại vitamin khác khoáng chất [5,11,15] Do có giá trị kinh tế dinh dưỡng cao nên có nhiều công trình nghiên cứu giới dưa dấu, chủ yếu tập trung vào cải tạo chất lượng nguồn giống Một số công trình điển nghiên cứu nhân giống in vitro từ đoạn thân Keng Hoong (2005), nghiên cứu tái sinh chồi trực tiếp từ mẫu Compton Gray (2000), Chaturvedi cộng (2001), Sultana đồng nghiệp (2003) Ở Việt Nam, trồng dưa hấu nói chung nhiều hạn chế kỹ thuật canh tác, suất chất lượng quả, chưa đáp ứng yêu cầu thị trường Một nguyên nhân dẫn đến tình trạng khô hạn nhiều loại sâu bệnh gây hại ảnh hưởng đến suất chất lượng dưa hấu Ngoài ra, việc không chủ động chọn tạo giống tốt nguyên nhân khiến giống dưa hấu thương mại lai F1 có nguồn gốc từ nước Điều làm tăng chi phí sản xuất dẫn đến tình trạng khó chủ động nguồn giống tốt cho trồng trọt đại trà Nhiều giải pháp áp dụng tiến hành lai tạo giống, nhân giống in vitro dòng ưu tú Nguyễn Thị Phương Thảo cộng (2010), tái sinh trực tiếp từ mô dưa hấu, nghiên cứu chuyển gen vào dưa hấu Nguyễn Thị Thanh Nga đồng nghiệp (2012)… nhằm cung cấp nguồn giống có suất ổn định, chất lượng tốt cho sản xuất Tuy nhiên, chọn tạo dòng hay nhân giống qua tái sinh từ mô sẹo chưa thực quan tâm, phần dưa hấu tương đối khó tái sinh gián tiếp Luận văn thạc sĩ khoa học - 2016 Xuất phát từ lý trên, tiến hành đề tài “Nghiên cứu tối ưu tái sinh in vitro dưa hấu (Citrulus lanatus Thumb.)” nhằm mục đích xây dựng môi trường tái sinh hiệu từ mô sẹo dưa hấu, qua đóng góp thêm hướng cho trình nhân giống in vitro, đồng thời sở cho nghiên cứu dựa mô sẹo chọn dòng tế bào, gây đột biến, chuyển gen vào dưa hấu… Luận văn thạc sĩ khoa học - 2016 CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lƣợc dƣa hấu 1.1.1 Nguồn gốc, phân loại 1.1.1.1 Nguồn gốc Dưa hấu cho có nguồn gốc Nam Phi, nơi người ta tìm thấy nhiều loài mọc hoang dại với vị đắng, chua, ngọt, nhạt [15] Nhiều tài liệu cho dưa hấu tiêu thụ rộng rãi từ thời cổ đại, đặc biệt Địa Trung Hải Ai Cập, xảy khô hạn hay thiếu nước dưa hấu lúc loại đóng vai trò quan trọng hàng đầu [16] Nhiều chứng tìm thấy trồng trọt dưa hấu thung lũng sông Nile từ thiên niên kỷ thứ hai trước Công nguyên Đồng thời hạt giống dưa hấu tìm thấy lăng mộ Pharaoh Tutankhamun [20] Dưa hấu đề cập Kinh Thánh loại thực phẩm cổ xưa người dân Do Thái [14] Đến kỷ thứ 10, loại bắt đầu trồng Trung Quốc, nơi mà ngày nước có sản lượng cao giới Vào năm đầu kỷ 16, dưa hấu bắt đầu trồng rộng rãi nước Mỹ, khoảng thời gian đó, dưa hấu lan rộng sang nước Anh Như vậy, dưa hấu xuất từ thời xa xưa cách khoảng 4000 năm người biết hóa, để biến dưa hấu hoang dại thành giống cung cấp thực phẩm thiết yếu cho nhu cầu đời sống hàng ngày [15] Ngày người ta tìm thấy loài coi tổ tiên dưa hấu Châu Phi, có tên gọi Tsamma melon Còn Citrullus colocynthis xem tổ tiên dưa hấu có đặc điểm nhỏ, thịt màu trắng, có vị đắng hạt màu nâu [14] Do trình thích nghi tác động người khiến cho đặc điểm loài dưa hấu tổ tiên khác với loại dưa hấu Luận văn thạc sĩ khoa học - 2016 A B C D E Hình 3.2 Kết tạo mô sẹo môi trường có NAA BAP (sau tuần nuôi cấy) A: môi trường đối chứng C0b; B: môi trường C5; C: môi trường C6; D: môi trường C7; E: môi trường C8 27 Luận văn thạc sĩ khoa học - 2016 Bảng 3.3 Kết hình thành mô sẹo dưa hấu môi trường có NAA BAP tuần tuần MT Nồng độ NAA (mg/l) C0b 20 0,0 Không tạo mô sẹo 0,0 Không tạo mô sẹo C5 0,5 20 65,0 Màu trắng sữa, xốp 87,5 Màu trắng vàng, xốp C6 1,0 20 87,5 Màu trắng sữa, xốp 100,0 Màu trắng vàng, xốp C7 1,5 20 85,0 Màu trắng sữa, xốp 100,0 Màu trắng vàng, xốp C8 2,0 20 63,63 Màu trắng sữa, xốp 100,0 Màu trắng vàng, xốp Số Tỷ lệ tạo mẫu mô sẹo (%) Đặc điểm mô sẹo Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) Đặc điểm mô sẹo 3.3 Ảnh hƣởng phytohormone đến tái sinh chồi từ mô sẹo Để thu nhận chồi in vitro từ mô sẹo trình tái sinh chồi cần thực môi trường auxin Tuy nhiên, theo tác giả Li cộng (2011), môi trường tái sinh dưa hấu từ mầm có phối hợp BAP loại hormone thuộc nhóm auxin cho kết tạo chồi tốt dùng BAP riêng rẽ [19] Do IAA auxin bền nhiệt, bị giảm hoạt tính hấp vô trùng môi trường nhiệt độ cao Vì vậy, để không giảm hoạt tính chuẩn bị môi trường thí nghiệm tái sinh, sử dụng NAA (0,05 mg/l) kết hợp BAP thay đổi nồng độ khác để đánh giá hiệu tái sinh chồi Để đạt hiệu tối đa giai đoạn này, tiến hành cắt khối mô sẹo thành 2-3 phần, mục đích để tăng diện tích tiếp xúc mô sẹo với môi trường tái sinh, làm cho chất điều hòa sinh trưởng hấp thụ tốt vào cấu trúc mô sẹo Các khối mô sẹo nuôi điều kiện ánh sáng đầy đủ với môi trường sau: T0: MS + 0,05mg/l NAA + 30g/l đường + 50ml/l nước dừa + 7g/l agar Các môi trường thí nghiệm khả tái sinh chồi T1, T2, T3, T4, T5 có công thức dựa công thức môi trường đối chứng T0 bổ sug thêm BAP nồng độ tương ứng 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 mg/l để đánh giá mức độ ảnh hưởng 28 Luận văn thạc sĩ khoa học - 2016 BAP trình tái sinh, qua lựa chọn nồng độ thích hợp cho giai đoạn Sau tuần nuôi cấy khối mô sẹo môi trường tái sinh, nhận thấy môi trường có kết hợp auxin cytokinin có khả kích hình thành chồi Khả bật chồi từ mô sẹo nuôi cấy xảy môi trường T3, T4, T5 có nồng độ BAP tương ứng 3, mg/l, môi trường T4 có tỷ lệ cao nhất, nhanh hình thành chồi nhất, với tuần nuôi cấy, chất lượng chồi tốt nhất, chồi xanh, thể sức sống tốt (hình 3.3) Ở môi trường T3, chồi có đặc điểm tốt giống môi trường T4, thời gian hình thành chồi chậm nhiều với tuần nuôi cấy Với môi trường T5, chồi có kích thước bé, có ảnh hưởng nồng độ BAP cao Cho nên, lựa chọn môi trường T4 làm môi trường tái sinh chồi gián tiếp Tuy nhiên, tỷ lệ tái sinh chồi môi trường thấp, bước sử dụng phương pháp nhân nhanh chồi để tăng số lượng chồi cách nhanh chóng Hình 3.3 Tái sinh chồi dưa hấu từ mô sẹo môi trường T4 29 Luận văn thạc sĩ khoa học - 2016 3.4 Ảnh hƣởng phytohormone đến nhân chồi từ mô sẹo Do tái sinh chồi dưa hấu từ mô sẹo cần tới tuần nuôi cấy môi trường tái sinh, đồng thời tỷ lệ chồi thu từ khối mô sẹo thấp, để thu số lượng chồi lớn cho thí nghiệm khác cần phải tiến hành nhân chồi có nguồn gốc từ mô sẹo Các chất thuộc nhóm cytokinin có hoạt tính phân bào mạnh mẽ, kích thích trình hình thành chồi mới, làm gia tăng hệ số nhân chồi nuôi cấy in vitro Trong thí nghiệm này, sử dụng riêng rẽ hai phytohormone phổ biến BAP kinetin nồng độ khác để kiểm tra ảnh hưởng đến trình phát sinh chồi dưa hấu Theo tác giả Khatun đồng nghiệp, môi trường có kết hợp BAP hay KIN nồng độ khác với NAA IBA cho hệ số nhân chồi cao so với môi trường bổ sung BAP, KIN [22] Trước tiên, tiến hành thử nghiệm ảnh hưởng BAP đến nhân nhanh chồi dưa hấu có nguồn gốc từ mô sẹo Trong thí nghiệm này, môi trường đối chứng có thành phần sau: B0: MS + 0,1mg/l NAA + 30g/l đường + 50ml/l nước dừa + 7g/l agar Các môi trường thí nghiệm B1, B2, B3 B4 chuẩn bị môi trường đối chứng B0 bổ sung thêm BAP nồng độ: 0,5; 1,0; 1,5 2,0mg/l Các chồi dưa hấu hình thành từ mô sẹo dùng để cấy vào môi trường nhân chồi có BAP tính toán hệ số nhân chồi sau tuần nuôi cấy Kết quan sát cho thấy, số lượng chồi thu tăng lên gấp nhiều lần so với lượng chồi ban đầu đưa vào môi trường Ở môi trường đối chứng BAP, hệ số nhân chồi sau tuần thấp đạt khoảng 1,66 Trên môi trường B1 (0,5 mg/l BAP), hệ số nhân chồi tăng đáng kể, lên tới 4,33 so sánh với 1,66 môi trường đối chứng Ở môi trường B2 có nồng độ 1,0mg/l BAP từ số lượng chồi ban đầu 30 hình thành tổng số 196 chồi sau nuôi cấy tuần đạt hệ số nhân chồi 6,53 lần (bảng 3.4) Ở giai đoạn nhân chồi, hệ số nhân chồi cao đáp ứng yêu cầu thí nghiệm đặt số lượng chồi Với môi trường B4 có nồng độ BAP 2,0 đạt hệ số nhân chồi cao 5,16 lần, nhiên nhiều chồi có kích 30 Luận văn thạc sĩ khoa học - 2016 thước nhỏ khó quan sát rõ hình thái chồi, môi trường B2 có nồng độ BAP 1,0mg/l lựa chọn làm môi trường nhân nhanh chồi có nguồn gốc từ mô sẹo, tạo chồi có hình thái rõ ràng với kích thước tương đối đồng (hình 3.4) Bảng 3.4 Ảnh hưởng BAP đến hệ số nhân chồi Nồng độ Số chồi BAP (mg/l) ban đầu B0 0,0 B1 MT Sau tuần nuôi cấy Số chồi thu đƣợc Hệ số nhân (lần) 30 50 1,66 0,5 30 130 4,33 B2 1,0 30 196 6,53 B3 1,5 30 146 4,86 B4 2,0 30 155 5,16 Hình 3.4 Kết nhân chồi dưa hấu môi trường B2 sau tuần 31 Luận văn thạc sĩ khoa học - 2016 Để đánh giá ảnh hưởng Kinetin (KIN) đến khả hình thành chồi có nguồn gốc từ mô sẹo, dùng môi trường đối chứng B0 có thành phần giống môi trường đối chứng nghiên cứu ảnh hưởng BAP B0: MS + 0,1mg/l NAA + 30g/l đường + 50ml/l nước dừa + 7g/l agar Các môi trường thí nghiệm K1, K2, K3 K4 có thành phần tương tự môi trường B0 bổ sung thêm KIN nồng độ tương ứng 0,5; 1,0; 1,5 2,0mg/l Khả hình thành chồi môi trường có KIN đánh giá sau tuần nuôi cấy (bảng 3.5) Bảng 3.5 Ảnh hưởng KIN đến hệ số nhân chồi Sau tuần nuôi cấy Nồng độ KIN (mg/l) Số chồi ban đầu Số chồi thu đƣợc Hệ số nhân (lần) B0 30 50 1,66 K1 0,5 30 73 2,43 K2 1,0 30 79 2,63 K3 1,5 30 87 2,9 K4 2,0 30 54 1,8 MT Các số liệu tính toán cho thấy, môi trường K1 có 0,5 mg/l KIN hệ số nhân chồi đạt 2,43 lần, cao không nhiều so với môi trường đối chứng Khi tăng nồng độ KIN lên 1,0mg/l môi trường K2 hệ số nhân đạt 2,63 Hệ số nhân chồi cao số môi trường thí nghiệm 2,9 đạt môi trường K3 có 1,5 mg/l KIN (hình 3.5) Có thể thấy hệ số nhân chồi môi trường có bổ sung KIN thấp môi trường có BAP Đồng thời môi trường có bổ sung KIN, quan sát trình tăng sinh chồi, thấy mô sẹo có hình thành phần tiếp xúc cụm chồi với môi 32 Luận văn thạc sĩ khoa học - 2016 trường nuôi cấy, gây ảnh hưởng tới việc hấp thụ chất có môi trường Vì lý môi trường có bổ sung BAP phù hợp cho trình nhân chồi có nguồn gốc từ mô sẹo, môi trường B2 có nồng độ BAP 1,0mg/l môi trường thích hợp Hình 3.5 Kết nhân chồi môi trường K3 sau tuần 3.5 Kéo dài chồi Kết thúc giai đoạn nhân nhanh chồi, có số lượng chồi lớn, để tạo thành hoàn chỉnh, phải tiến hành tạo rễ Tuy nhiên, chồi nhỏ dẫn tới hình thành có kích thước bé, gây bất lợi cho việc chuyển môi trường bên Vì thế, bước kéo dài chồi đóng vai trò bước đệm để tạo chất lượng tốt Cấy chồi vào môi trường MS có bổ sung 30g/l đường, 50ml/l nước dừa, 7g/l agar Sau tuần, chiều dài chồi đạt khoảng - cm, tiến hành chuyển vào môi trường rễ 33 Luận văn thạc sĩ khoa học - 2016 3.6 Tạo rễ cho chồi dƣa hấu in vitro Từ chồi dưa hấu nuôi cấy môi trường kéo dài chồi, lựa chọn chồi dài khỏe mạnh để thử nghiệm cho trình hình thành rễ in vitro Tạo rễ cho chồi dưa hấu giai đoạn quan trọng giúp cho sinh trưởng môi trường tự nhiên Để thử nghiệm trình tạo rễ cho chồi dưa hấu có nguồn gốc từ mô sẹo, sử dụng môi trường khoáng MS có hàm lượng giảm nửa, sau: Môi trường đối chứng R0: 1/2MS + 0,1 mg/l BAP + 30g/l đường +7g/l agar Các môi trường thí nghiệm R1, R2, R3, R4 có thành phần tương tự môi trường đối chứng R0 bổ sung thêm IBA nồng độ khác nhau: 0,1; 0,25; 0,50 1,0 mg/l Trong nhóm auxin, IBA với NAA hai phytohormone có hoạt tính mạnh kích thích tạo rễ nhiều loài thực vật, để thử nghiệm hình thành rễ chồi dă hấu, sử dụng IBA có dải nồng độ từ 0,1 – 1,0 mg/l Bảng 3.6 Kết hình thành rễ môi trường có bổ sung IBA Nồng MT độ IBA (mg/l) Sự hình thành rễ sau Số mẫu tuần cấy tuần Tỷ lệ (%) Số rễ TB/cây Tỷ lệ (%) Số rễ TB/cây R0 0,00 30 10,5 1,00 31,5 1,50 R1 0,10 30 46,7 2,75 75,0 3,50 R2 0,25 30 42,5 3,90 95,0 4,80 R3 0,50 30 43,3 3,50 86,7 4,20 R4 1,00 30 38,3 3,30 81,7 3,75 34 Luận văn thạc sĩ khoa học - 2016 Hình 3.6 Sự hình thành rễ môi trường R2 (có 0,25mg/l IBA) Từ bảng số liệu hình thành rễ chồi dưa hấu cho thấy tất môi trường thử nghiệm có bổ sung IBA cho tỷ lệ hình thành rễ cao so với môi trường IBA, môi trường đối chứng R0 có hình thành rễ tỷ lệ rễ thấp (10,5 31,5% sau tuần nuôi cấy) Tỷ lệ rễ nhiều chứng tỏ IBA chất kích thích rễ phù hợp chồi dưa hấu nuôi cấy in vitro Sau tuần nuôi cấy môi trường, nồng độ IBA tăng từ 0,1 mg/l lên 0,25 mg/l tỷ lệ hình thành rễ chồi dưa hấu tăng từ 75,0% lên 95,0% Tuy tăng cao nồng độ IBA từ 0,25 mg/l lên 0,5 mg/l tỷ lệ rễ giảm xuống 86,7 %, tiếp tục tăng nồng độ lên 1,0 mg/l tỷ lệ rễ giảm xuống 81,7% sau tuần nuôi cấy Đồng thời giống tỷ lệ rễ, số lượng rễ đạt cao 4,8 rễ/cây môi trường R2 có nồng độ 0,25 mg/l IBA (hình 3.6 ) Như vậy, đánh giá nồng độ IBA cao gây kìm hãm rễ dẫn đến làm giảm số lượng rễ Đối với môi trường đối chứng phytohormone rễ dinh dưỡng môi trường nuôi cấy bị giảm nửa cảm ứng kích thích tế bào hình thành rễ, giúp hấp thu đủ lượng chất dinh dưỡng cần thiết Tuy nhiên tỷ lệ rễ thấp số lượng rễ không nhiều không đồng so với môi trường có bổ sung IBA 35 Luận văn thạc sĩ khoa học - 2016 3.7 Thử nghiệm đƣa dƣa hấu giá thể Sau thời gian nuôi môi trường kích thích rễ, chồi dưa hấu khỏe mạnh có hệ rễ tốt lựa chọn cho thí nghiệm trồng giá thể đất thị đất mùn theo tỷ lệ pha trộn thể tích 1:1 Trước tiên loại bỏ agar chất dinh dưỡng bám rễ bàng cách rửa nhẹ nhàng nhiều lần nước, sau trồng giá thể nhân tạo Sau khoảng tuần giá thể, dưa hấu thể tăng trưởng rõ rệt, qua tăng chiều cao chồi bắt đầu hình thành thêm Điều chứng tỏ hệ rễ dưa hấu thu nhận đủ nước, với khoáng chất có giá thể nhân tạo cung cấp cho trình sinh trưởng Do điều kiện hạn chế thời gian nên thử nghiệm trồng loại giá thể chứng minh phù hợp với giai đoạn thích ứng ban đầu dưa hấu có nguồn gốc in vitro Những dưa hấu thể thích nghi với môi trường sống bên Như vậy, việc đưa dưa hấu từ bình nuôi cấy in vitro trồng giá thể đạt kết bước đầu 36 Luận văn thạc sĩ khoa học - 2016 KẾT LUẬN Khử trùng hạt dưa hấu bóc vỏ dung dịch NaOCl nồng độ 0,5% thời gian phút phù hợp, đạt tỷ lệ mẫu sống 100% Môi trường MS có bổ sung thêm 1,0 mg/l NAA 0,5 mg/l BAP môi trường thích hợp để kích thích hình thành mô sẹo từ mầm hạt dưa hấu cho tỷ lệ tạo mô sẹo 87,5 100% tương ứng sau tuần nuôi cấy Môi trường MS bổ sung 4,0 mg/l BAP thích hợp cho trình tái sinh chồi từ mô sẹo dưa hấu Môi trường MS có 0,1 mg/l NAA 1,0 mg/l BAP sử dung cho giai đoạn nhân nhanh chồi với hệ số nhân cao 6,55 lần Các chồi dưa hấu nuôi môi trường MS thời gian tuần trước cấy vào môi trường có thành phần khoáng 1/2MS 0,25mg/l IBA cho tỷ lệ rễ đạt 95% sau tuần nuôi cấy 37 Luận văn thạc sĩ khoa học - 2016 KIẾN NGHỊ Do điều kiện hạn chế thời gian, chưa thể tiến hành đưa dưa hấu bầu đất với số lượng lớn, chưa thử nghiệm số loại giá thể khác Vì vậy, kiến nghị tiếp tục nghiên cứu theo dõi trình sinh trưởng phát triển đưa vườn ươm, đồng thời tiếp tục hướng nghiên cứu loại giống dưa hấu khác với mục đích đáp ứng nguồn giống cách đa dạng 38 Luận văn thạc sĩ khoa học - 2016 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Dương Công Kiên (2003), nuôi cấy mô tế bào thực vật tập 2, Nhà xuất Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh Lê Văn Hoàng (2008), Công nghệ nuôi cấy mô & tế bào thực vật, giáo trình Đại học Đà Nẵng Lương Ngọc Toản – Phan Nguyên Hồng- Hoàng Thị Sản- Võ Văn Chi (2000), phân loại thực vật học, Tủ sách Đại học Sư phạm Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật – nghiên cứu ứng dụng, nhà xuất nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Hoàng Lộc – Lê Việt Dũng (2009), Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Viện Tài nguyên Môi trường Công nghệ Sinh học Đại học Huế Nguyễn Mạnh Chinh, Nguyễn Đăng Nghĩa (2006), Trồng – chăm sóc phòng trừ sâu bệnh, Nhà xuất Nông nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Minh Chơn (2008), Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật, Giáo trình Đại học Cần Thơ Nguyễn Nghĩa Thìn, Đặng Thị Sy (1998), Hệ thống học thực vật, Giáo trình Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội Nguyễn Thị Thanh Nga, Hồ Mạnh Tường, Phạm Thị Vân, Nguyễn Tường Vân, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2012), Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào dưa hấu (Citrullus lanatus Thumb.) Tạp chí Sinh học, 34(3): 389-396 10 Vũ Văn Vụ (1999), Sinh lý thực vật ứng dụng, Nhà xuất giáo dục Hà Nội 11 Vũ Văn Vụ (2000), Sinh lý thực vật, Nhà xuất giáo dục Hà Nội Tiếng Anh: 12 Candolle (1882) Origin of Cultivated Plants, sv "Water-melon", International scientific series (New York), D Appleton and Co, p.262 13 Chaturvedi R., Bhatnagar P (2001), High-frequency shoot regeneration from cotyledon explants of watermelon cv sugar baby In Vitro Cell Dev Biol.Plant, 37: 255-258 39 Luận văn thạc sĩ khoa học - 2016 14 Compton M.E (2000), Interaction between explant size and cultivar affects shoot organogenic competence of watermelon cotyledons Hort Science, 35(4): 749-750 15 Dane, Fenny; Liu, Jiarong (2006), Diversity and origin of cultivated and citron type watermelon (Citrullus lanatus) Genetic Resources and Crop Evolution, Vol.54, Issue 6, p.1255-1265 16 F.suratman, F.Huyop and G.K.A Parveez (2009), In vitro Shoot Regeneration of Citrullus vulgaris Schrad (Watermelon), biotechnology 8(4): p.393-404 17 Keng C.L., Hoong L.K (2005), In vitro planets regeneration from nodal segments of Musk melon (Cucumis melo L.) Biotechnol 4(4): 354-357 18 Khatun M M, Hossain M S, Haque M A and Khalekuzzaman M (2010), In vitro propagation of Citrullus lanatus Thumb.from nodal explants culture, J Bangladesh Agril Univ 8(2): p.203–206 19 Jules Janick, Harry S Paris, David C Parrish (2007), The Cucurbits of Mediterranean Antiquity: Identification of Taxa from Ancient Images and Descriptions, 100(7): p.1441–1457 20 Li J., Li X M., Qin Y G., Tang Y., Wang L., Ma C and Li H X (2011), Optimized system for plant regeneration of watermelon (Citrullus lanatus Thumb.) African Journal of Biotechnology Vol 10(48), pp 9760-9765 21 Sultana R.S., Bari M.A (2003), Effect of different plant growth regulators on direct regeneration of watermelon (Citrullus lanatus thumb.) Plant Tissue Cult., 13(2): 173-177 22 FAO http://faostat.fao.org 40 Luận văn thạc sĩ khoa học - 2016 PHỤ LỤC Môi trƣờng MS STT Tên hóa chất Nồng độ (mg/l) NH4NO3 1650 CaCl2 MgSO4.7H2O 370 KNO3 1900 KH2PO4 140 H3BO3 6,2 CoCl2 0,025 CuSO4.5H2O 0,025 Na2EDTA 37,3 10 FeSO4.7H2O 27,8 11 MnSO4.7H2O 16,9 12 KI 13 Na2MO4.7H2O 0,25 14 ZnSO4.7H2O 8,6 332,2 0,83 41 [...]... vào các môi trường tái sinh nhằm khảo sát khả năng tái sinh chồi Những môi trường này được bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BAP ở các nồng độ tương ứng là 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0mg/l phối hợp với 0,5mg/l NAA Khác với nuôi cấy tạo mô sẹo dưa hấu, quá trình nuôi cấy tái sinh được thực hiện khi có ánh sáng 2.2.4 Phƣơng pháp nhân chồi Các chồi dưa hấu hình thành trên môi trường tái sinh được sử dụng cho... của phytohormone đến tái sinh chồi từ mô sẹo Để thu nhận được các chồi cây in vitro từ mô sẹo thì quá trình tái sinh chồi cần thực hiện trên môi trường không có auxin Tuy nhiên, theo tác giả Li và cộng sự (2011), các môi trường tái sinh dưa hấu từ lá mầm có sự phối hợp giữa BAP và 1 loại hormone thuộc nhóm auxin cho kết quả tạo chồi tốt hơn khi dùng BAP riêng rẽ [19] Do IAA là auxin kém bền nhiệt, sẽ... phân bào Cytokinin giúp sự gia tăng kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein Trong các nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật, tỷ lệ 15 Luận văn thạc sĩ khoa học - 2016 Auxin/Cytokinin (A/C) là một yếu tố rất quan trọng: A/C cao giúp sự tạo rễ, A/C thấp giúp sự tạo chồi Như vậy, cytokinin hỗ trợ auxin trong tăng trưởng nhưng đồng thời cũng có sự đối kháng giữa auxin (giúp ra rễ) và cytokinin (giúp tạo chồi);... nhân giống in vitro, tạo cây đa bội thông qua xử lý colchicine, nghiên cứu qúa trình hình thành cơ quan [4] - Nuôi cấy mô sẹo (callus) Khi sự cân bằng các chất kích thích sinh trưởng trong thực vật thay đổi, cụ thể các mô đỉnh sinh trưởng hay nhu mô được tách ra và nuôi cấy trên môi trường có tỉ lệ auxin và cytokinin thích hợp, thì mô sẹo được hình thành Đó là một khối các tế bào phát sinh ngẫu nhiên... đối với một bộ phận hoặc một mô của cây, nhân nhiều và nhanh cây trong điều kiện in vitro, tạo mô sẹo phục vụ cho các nghiên cứu cơ bản như chọn dòng tế bào, đột biến soma - Nuôi cấy mô phân sinh Đặc điểm của mô phân sinh là chứa các tế bào non trẻ, phân chia mạnh, lại không bị virut xâm nhập Nuôi cấy mô phân sinh được ứng dụng trong các trường hợp: tạo ra những giống cây sạch virut từ những giống bị... kiện in vitro Tuy nhiên phương pháp nào thì cũng có mặt hạn chế của nó Mặc dù nhân giống in vitro có hệ số nhân giống lớn nhưng cây giống tạo ra có kích thước nhỏ, cây giống được cung cấp nguồn hydratcacbon nên khả năng tự tổng hợp các chất hữu cơ của cây kém Đồng thời cây giống in vitro được nuôi cấy trong bình thủy tinh nên độ ẩm không khí bão hòa Do đó khi trồng ra điều kiện bên ngoài tự nhiên cây. .. năng nhân nhanh số lượng cây giống sạch virus Ngoài ra ưu điểm của phương pháp này là còn có thể chủ động điều chỉnh các tác nhân, điều chỉnh khả năng tái 13 Luận văn thạc sĩ khoa học - 2016 sinh của cây như thành phần dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt đô, chất điều hòa sinh trưởng theo ý muốn Phương pháp nhân giống in vitro có hệ số nhân giống cao nên có thể sản xuất số lượng lớn cây giống trong một khoảng... hoạt tính khi chuẩn bị môi trường thí nghiệm tái sinh, chúng tôi sử dụng NAA (0,05 mg/l) kết hợp cùng BAP thay đổi ở các nồng độ khác nhau để đánh giá hiệu quả tái sinh chồi Để đạt hiệu quả tối đa ở giai đoạn này, chúng tôi tiến hành cắt khối mô sẹo thành 2-3 phần, mục đích để tăng diện tích tiếp xúc của mô sẹo với môi trường tái sinh, làm cho chất điều hòa sinh trưởng có thể được hấp thụ tốt hơn vào... Vitamin: Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng Chúng cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau Khi tế bào và mô được nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn cho sự phát triển của chúng Các vitamin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic (B3), pyridoxine (B6) và myo-inositol... điều hòa sinh trưởng thực vật: Auxin tự nhiên là một hợp chất tương đối đơn giản: indol-3-acetic acid (IAA) Các chất có cấu trúc gần giống IAA và có vai trò với IAA trong vài cơ quan đều được gọi là Auxin (IBA; NAA; 2,4-D; 2,4,5-T và phenoxyaxetic acid) Auxin phối hợp với cytokinin giúp sự tăng trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mới mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô Tuy nhiên, ở nồng độ cao, auxin cản