Nghiên cứu tối ưu tái sinh in vitro cây dưa hấu (citrullus lanatus thumb)

Nhiều giải pháp đã được áp dụng như tiến hành lai tạo giống, nhân giống in vitro đối với các dòng ưu tú của Nguyễn Thị Phương Thảo và cộng sự 2010, tái sinh trực tiếp từ mô lá cây dưa h

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Chanhsamone KONGSAVANH

NGHIÊN CỨU TỐI ƯU TÁI SINH IN VITRO CÂY DƯA HẤU (Citrullus lanatus Thumb.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI - 2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Chanhsamone KONGSAVANH

NGHIÊN CỨU TỐI ƯU TÁI SINH IN VITRO CÂY DƯA HẤU (Citrullus lanatus Thumb.)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Lê Hồng Điệp

HÀ NỘI – 2016

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Lê Hồng Điệp là người đã hướng dẫn, thường xuyên quan tâm và chỉ bảo tôi tận tình trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ trong Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh, cũng như các cán bộ và giáo viên Khoa Sinh học, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc Gia Hà Nội trong suốt quá trình tôi học tập tại đây Đồng thời, tôi xin cảm ơn các cán bộ, các em sinh viên của phòng thí nghiệm Công nghệ Vi tảo và Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Trung Tâm Khoa học sự sống, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Cuối cùng, gia đình và bạn bè chính là nguồn động viên khích lệ lớn nhất đối với tôi trong thời gian học tập Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến những tình cảm quý báu đó

Hà Nội, ngày 07 tháng 03 năm 2016

Học viên

Chanhsamone KONGSAVANH

Bảng 1.1: Sản lượng dưa hấu các nước đứng đầu trên thế giới năm 2013………….6

Bảng 3.1: Kết quả khử trùng hạt dưa hấu chưa bóc vỏ……….22

Bảng 3.2: Kết quả khử trùng hạt đã bóc vỏ……… 23

Bảng 3.3: Kết quả hình thành mô sẹo dưa hấu trên môi trường có NAA và BAP 28

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của BAP đến hệ số nhân chồi………31

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của KIN đến hệ số nhân chồi……….32

Bảng 3.6: Kết quả hình thành rễ trên môi trường có bổ sung IBA……… 34

Hình 3.1: Kết quả tạo mô sẹo trên môi trường chỉ có NAA……….25

Hình 3.2: Kết quả tạo mô sẹo trên môi trường có NAA và BAP (sau 6 tuần)……… 27

Hình 3.3: Tái sinh chồi dưa hấu từ mô sẹo ở môi trường T4………29

Hình 3.4: Kết quả nhân chồi của dưa hấu trên môi trường B2 sau 4 tuần…………31

Hình 3.5: Kết quả nhân chồi với môi trường bổ sung KIN……… ……33

Hình 3.6: Các chồi dưa hấu được nuôi trê môi trường MS sau 3 tuần……….35

STT Tên viết tắt Tên đầy đủ

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1.Sơ lược về cây dưa hấu 3

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại 3

1.1.2 Giá trị của cây dưa hấu 4

1.1.3 Tình hình trồng dưa hấu ở Việt Nam và trên thế giới 5

1.2.Nhân giống ở thực vật 7

1.2.1 Nhân giống truyền thống 7

1.2.2 Nhân giống vô tính in vitro 8

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17

2.1 Vật liệu 17

2.1.1 Giống dưa hấu 17

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 17

2.1.3 Hóa chất 17

2.2 Phương pháp 17

2.2.1 Phương pháp vô trùng mẫu 17

2.2.2 Phương pháp tạo mô sẹo 19

2.2.3 Phương pháp tái sinh chồi từ mô sẹo 18

2.2.4 Phương pháp nhân chồi 18

2.2.5 Phương pháp tạo rễ 19

2.2.6 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 19

2.2.7 Các điều kiện nuôi cấy 19

2.2.8 Xử lý số liệu 20

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

3.1 Tạo nguồn vật liệu khởi đầu 21

3.2 Kết quả tạo mô sẹo của mẫu dưa hấu 21

3.3 Ảnh hưởng của phytohormone đến tái sinh chồi từ mô sẹo 23

3.4 Ảnh hưởng của phytohormone đến nhân chồi từ mô sẹo 30

3.5 Kéo dài chồi 33

3.6 Tạo rễ cho cây dưa hấu in vitro 34

3.7 Thử nghiệm đưa cây dưa hấu ra giá thể 36

3.8 Thử nghiệm đưa cây dưa hấu ra giá thể 36

KẾT LUẬN 37

KIẾN NGHỊ 38

Tài liệu tham khảo……… 39

Phụ Lục ……… ….41

1

MỞ ĐẦU

Dưa hấu (Citrullus lanatus Thumb.) là cây ăn quả có nguồn gốc từ châu Phi và

Nam châu Á Cây dưa hấu có thể sinh trưởng và phát triển được trên nhiều loại đất trồng khác nhau của các vùng nhiệt đới Trái dưa hấu chứa nhiều thành phần dinh dưỡng giá trị, có thể dùng ăn trực tiếp, làm salad, nước ép… Ngoài ra, một số giống dưa hấu còn được sử dụng để sản xuất hạt dưa dùng cho cưới hỏi và các lễ hội truyền thống Giá trị dưa hấu không chỉ được đánh giá b ởi vị ngọt, mát của nó mà dưa hấu chứa một hàm lượng lớn chất xơ, nhiều loại vitamin khác nhau và khoáng chất [5,11,15]

Do có giá trị kinh tế và dinh dưỡng cao nên đã có nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đối với cây dưa dấu, chủ yếu tập trung vào cải tạo chất lượng nguồn

cây giống Một số công trình điển hình như các nghiên cứu nhân giống in vitro từ

đoạn thân của Keng và Hoong (2005), nghiên cứu tái sinh chồi trực tiếp từ các mẫu

lá của Compton và Gray (2000), Chaturvedi và cộng sự (2001), Sultana và đồng nghiệp (2003)

Ở Việt Nam, trồng dưa hấu nói chung vẫn còn nhiều hạn chế về kỹ thuật canh tác, năng suất và chất lượng của quả, chưa đáp ứng được yêu cầu của thị trường Một trong những nguyên nhân chính dẫn đến tình trạng trên là do khô hạn và nhiều loại sâu bệnh gây hại ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng của dưa hấu Ngoài ra, việc không chủ động chọn tạo các giống tốt cũng là nguyên nhân khiến các giống dưa hấu thương mại hiện nay đều là các con lai F1 có nguồn gốc từ nước ngoài Điều đó làm tăng chi phí sản xuất và dẫn đến tình trạng khó chủ động về nguồn giống tốt cho trồng trọt đại trà Nhiều giải pháp đã được áp dụng như tiến hành lai

tạo giống, nhân giống in vitro đối với các dòng ưu tú của Nguyễn Thị Phương Thảo

và cộng sự (2010), tái sinh trực tiếp từ mô lá cây dưa hấu, nghiên cứu chuyển gen vào dưa hấu của Nguyễn Thị Thanh Nga và đồng nghiệp (2012)… nhằm cung cấp nguồn cây giống có năng suất ổn định, chất lượng tốt cho sản xuất Tuy nhiên, chọn tạo dòng hay nhân giống qua tái sinh từ mô sẹo chưa thực sự được quan tâm, một phần do dưa hấu là cây tương đối khó tái sinh gián tiếp

2

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu tối

ưu tái sinh in vitro cây dưa hấu (Citrulus lanatus Thumb.)” nhằm mục đích xây

dựng các môi trường tái sinh hiệu quả từ mô sẹo dưa hấu, qua đó đóng góp thêm

một hướng cho quá trình nhân giống in vitro, đồng thời là cơ sở cho các nghiên cứu

dựa trên mô sẹo như chọn dòng tế bào, gây đột biến, chuyển gen vào dưa hấu…

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược về cây dưa hấu

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại

1.1.1.1 Nguồn gốc

Dưa hấu được cho là có nguồn gốc ở Nam Phi, nơi người ta đã tìm thấy nhiều loài mọc hoang dại với các vị như đắng, chua, ngọt, nhạt [15] Nhiều tài liệu cho rằng dưa hấu đã được tiêu thụ rộng rãi từ thời cổ đại, đặc biệt là ở Địa Trung Hải và

Ai Cập, khi xảy ra khô hạn hay thiếu nước thì dưa hấu lúc đó là một loại quả đóng vai trò quan trọng hàng đầu [16] Nhiều bằng chứng đã được tìm thấy về trồng trọt dưa hấu trong thung lũng sông Nile từ thiên niên kỷ thứ hai trước Công nguyên Đồng thời hạt giống dưa hấu cũng được tìm thấy trong lăng mộ của Pharaoh Tutankhamun [20] Dưa hấu cũng được đề cập trong Kinh Thánh như một loại thực phẩm cổ xưa của người dân Do Thái [14] Đến thế kỷ thứ 10, loại cây này đã bắt đầu được trồng ở Trung Quốc, nơi mà ngày nay là nước có sản lượng cao nhất trên thế giới Vào những năm đầu của thế kỷ 16, dưa hấu đã bắt đầu được trồng rộng rãi

ở nước Mỹ, và cũng khoảng thời gian đó, dưa hấu lan rộng sang nước Anh Như vậy, dưa hấu đã xuất hiện từ thời xa xưa cách đây khoảng 4000 năm và con người

đã biết thuần hóa, để biến dưa hấu hoang dại thành một giống cây cung cấp thực phẩm thiết yếu cho nhu cầu đời sống hàng ngày [15]

Ngày nay người ta vẫn có thể tìm thấy những loài được coi là tổ tiên của dưa

hấu Châu Phi, có tên gọi là Tsamma melon Còn Citrullus colocynthis được xem là

một trong những tổ tiên của dưa hấu hiện nay có đặc điểm là quả nhỏ, thịt quả màu trắng, có vị đắng và hạt màu nâu [14] Do quá trình thích nghi và sự tác động của con người đã khiến cho những đặc điểm đó của loài dưa hấu tổ tiên khác với những loại dưa hấu hiện tại

4

Trái dưa hấu tương đối lớn, các giống dưa hấu trồng ở Việt Nam có trái nặng trung bình từ 2-3 kg nhưng cũng có giống dưa cho trái nặng tới 5-6kg Trên mặt phẳng cắt dọc, quả dưa hấu có các hình dạng như: tròn, bầu dục Vỏ trái khá cứng

và láng bóng, có nhiều sọc hoặc vân, màu sắc cũng khác nhau, từ đen đến xanh đậm, xạnh nhạt hoặc vàng Thịt trái thường có màu đỏ hoặc vàng chứa tới vài trăm hạt màu nâu hoặc đen

Trong các loại dưa dấu, dưa hấu ruột đỏ, hạt đen hiện nay là phổ biến nhất, sau

đó là dưa hấu ruột vàng, dưa hấu không hạt Mặc dù việc tạo ra dưa hấu không hạt hiện nay vẫn còn khó khăn, nhưng loại dưa hấu này đang được ưa chuộng trên thị trường và giá bán cũng khá cao

1.1.2 Giá trị của cây dƣa hấu

1.1.2.1 Giá trị dinh dưỡng

Dưa hấu có vai trò quan trọng trong đời sống con người, nó được sử dụng như một loại quả để ăn giải nhiệt vào mùa hè, được dùng để sản xuất siro, làm bánh kẹo, nước ép, mỹ phẩm Dưa hấu có giá trị dinh dưỡng cao, có lợi cho sức khỏe con người Ngoài thành phần nước chiếm khoảng 90%, trái dưa hấu có chứa protein, lipit, đường, caroten, canxi, phốt pho, sắt và các loại vitamin B1, B2, B3, C [6,16]

5

Trong Y học: Trái dưa hấu chứa vitamin C làm tăng sức đề kháng của cơ thể Thành phần lycopen có trong dưa hấu là chất chống oxy hóa, giúp chống lại các bệnh về tim mạch, giảm nguy cơ mắc bệnh nhồi máu cơ tim Chất citrulline trong trái dưa khi vào cơ thể người chuyển hóa thành arginine là amino acid có lợi cho tim mạch, tuần hoàn và miễn dịch [18] Trong trái dưa hấu còn chứa nhiều kali và enzim super oxide dismutase có khả năng chống oxy hóa, giúp tế bào cơ thể phát triển tốt hơn và con người ít bị tress hơn [17,18]

Trong Đông y: Dưa hấu có vị ngọt, tính hàn có công dụng giải khát, giải say nắng, có công năng thanh nhiệt tá hỏa, giải say rượu, lợi tiểu Dưa hấu tươi nghiền nát thoa nhiều lần trong ngày trị vết nẻ môi và những nốt mẩn đỏ ở da, đắp những lát mỏng dưa hấu lên mặt để trong nhiều giờ da dẻ mịn màng căng mọng không bị rộp trong mùa hè,… Trong vỏ dưa chứa nhiều vitamin có tác dụng giải nhiệt hết say nắng, còn ngăn chặn không cho cholesterol tích đọng ở thành mạch máu, có tác dụng chống xơ mỡ động mạch [21] Phần xanh của vỏ dưa hấu gọi là áo thủy của dưa hấu có thể chữa các chứng thử nhiệt, phiền khát, phù nề, tiểu tiện kém và miệng lưỡi viêm nhiệt

Ngoài ra dưa hấu còn có công dụng đặc biệt đối với phụ nữ, thường được dùng

để làm mát da, mịn da, cung cấp dưỡng chất chống lão hóa da vào mùa nắng nóng

1.1.2.2 Giá trị kinh tế

Dưa hấu là một loại cây trồng có thời gian sinh trưởng ngắn, năng suất cao Một vụ trong khoảng thời gian từ 70-85 ngày, cho thu hoạch 10-12 lứa quả với năng suất trung bình 20-25 tấn/ha Như vậy, chỉ tính riêng 1 mùa vụ trồng dưa hấu đã đạt được năng suất như thế, nếu người dân biết áp dụng các kỹ thuật canh tác, tính toán thời gian thu hoạch hợp lý, tăng vụ trồng thì dưa hấu sẽ mang lại nguồn thu nhập đáng kể [9]

1.1.3 Tình hình trồng dƣa hấu ở Việt Nam và trên thế giới

Dưa hấu là cây ưa nhiệt nên thường được trồng ở các vùng nhiệt đới, với khoảng 2% diện tích rau quả của thế giới, trong đó 50% là được trồng ở các quốc gia thuộc vùng Đông Nam Á Năm 2013, trên thế giới có khoảng 3,81 triệu ha diện

6

tích đất trồng dưa hấu, tăng 2,88% so với năm 2010 (34,7 triệu ha) Trung Quốc là nước sản xuất dưa hấu lớn nhất với khoảng 18,3 triệu ha (51,3%), thứ hai là Thổ Nhĩ Kỳ 150 nghìn ha, tiếp đó là Iran với 135 nghìn ha, Liên bang Nga 117 nghìn ha, Ukrane 63 nghìn ha, Ai Cập 57 nghìn ha, Mỹ 50 nghìn ha,…Cùng với diện tích đất trồng như trên, sản lượng dưa hấu của những quốc gia được biết trong năm 2013 như bảng dưới đây [22]

Bảng 1.1 Sản lượng dưa hấu các nước đứng đầu trên thế giới năm 2013

STT Quốc gia Sản lượng (tấn) Tỷ lệ trên thế giới

Ở nước ta, dưa hấu được trồng rải rác khắp vùng miền, từ Bắc đến Nam Năm

2011, ước tính diện tích trồng dưa hấu khoảng 27,2 nghìn ha, năng suất trung bình đạt 14,25 tấn/ ha, tổng sản lượng vào khoảng 388 nghìn tấn, đứng thứ 5 trong các loại hoa quả xuất khẩu với 194085 tấn [22] Vài năm gần đây diện tích trồng dưa hấu có xu hướng tăng lên nhiều, chủ yếu là tăng vụ trên đất trồng lúa ở đồng bằng sông Cửu Long Ở đây, cây dưa hấu được coi như một loại cây góp phần xóa đói giảm nghèo, tăng thu nhập cho nông dân ở vùng chuyên trồng lúa Trồng dưa hấu trên đất lúa có tác dụng cải tảo đất, trở thành công thức luân canh rất có lợi và đem lại hiệu quả kinh tế cao Tại các tỉnh phía Bắc trước đây dưa hấu thường chỉ trồng một vụ Xuân hè (gieo tháng 3-4, thu hoạch tháng 5-6) trên một số vùng đất cát cao của đồng bằng trung du Bắc bộ và hiện nay còn có một số loại giống mới có thể trồng được vụ Đông

7

1.2 Nhân giống ở thực vật

1.2.1 Nhân giống truyền thống

Khi công nghê, khoa học kĩ thuật chưa phát triển, thì các hình hình thức thủ công truyền thống được áp dụng để nhân giống các giống cây Nhân giống là biện pháp kỹ thuật mà con người dùng để tái tạo các cá thể cần thiết thông qua hệ thống sinh sản hữu tính hoặc vô tính, tuỳ vào mục đích cũng như các loại cây trồng

1.2.1.1 Nhân giống cây trồng bằng phương pháp hữu tính

Nhân giống bằng phương pháp hữu tính là hình thức cây con được hình thành

từ hạt Hạt được hình thành do kết quả thụ phấn giữa giao tử đực (hạt phấn) với giao

tử cái (noãn) Từ hạt sẽ hình thành một cây mới mang đặc tính của cả cây bố và cây

mẹ (trong trường hợp thụ phấn chéo) hoặc nghiêng hẳn về cây bố hoặc cây mẹ (trong trường hợp vô phối) Hạt được hình thành do quá trình tự thụ phấn của hoa

hoặc do thụ phấn nhân tạo

Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, không cần sử dụng thiết bị phức tạp, hạt giống có thể bảo quản được trong thời gian dài, dễ dàng vận chuyển và phân phối hạt giống từ nơi sản xuất đến nơi tiêu thụ Tuy nhiên, nhược điểm là cây con được sinh ra từ hạt sẽ có những tính trạng thay đổi so với cây mẹ, mỗi sự thay đổi là đại diện của một tổ hợp gen mới được hình thành trong quá trình phân bào giảm nhiễm dẫn đến biểu hiện các tính trạng không đồng đều và không mang các tính trạng như cây mẹ

1.2.1.2 Nhân giống vô tính nhân tạo trong điều kiện tự nhiên

Đây là hình thức có sự tác động của các biện pháp cơ học, hóa học,… để điều khiển sự phát sinh cơ quan, bộ phận của cây như rễ, chồi, lá… hình thành một cây hoàn chỉnh có khả năng sống độc lập, và mang đặc tính di truyền như cây mẹ, chịu ảnh hưởng từ các yếu tố tự nhiên của môi trường

- Chiết ghép

Chiết ghép là hình thức sinh sản vô tính ở thực vật, tức là tạo ra một hay nhiều

cá thể mới từ bố hoặc mẹ không qua giao phối Chiết là hình thức tạo rễ trên một

8

đoạn của cành khi còn gắn với cây, sau đó cắt rời cành có rễ để được một cây nguyên vẹn Ở thực vật, ghép cây là một kĩ thuật quan trọng trong nghề làm vườn, trong đó một phần (cành ghép) của một cá thể này được đem phối hợp (ghép áp, ghép nối, ghép nêm, ghép dưới vỏ gần gốc) với một phần cây khác (gốc ghép) có thể cùng loài hoặc khác loài Sau một thời gian chỗ ghép sẽ liền lại và gốc ghép sẽ nuôi cành ghép lớn lên thành một cá thể mới mang đặc tính chung của hai cá thể gốc ghép và cành ghép Ưu điểm phương pháp chiết cành là cây con giữ nguyên đặc tính di truyền của bố mẹ, thời gian có cây giống nhanh, cây sớm ra hoa, kết quả Mặc dù vậy, nhược điểm là hệ số nhân thấp

- Giâm cành

Giâm cành là cắt một đoạn thân hoặc cành của cây mẹ rồi cắm hoặc vùi xuống cát hoặc đất pha cát để kích thích mọc rễ, đâm chồi thành một cây mới Đây là phương pháp trồng chủ yếu đối với các cây sắn, mía, dâu tằm, rau muống, khoai lang… Ưu điểm của phương pháp giâm cành là kỹ thuật đơn giản cho hệ số nhân cao, cây con giữ nguyên đặc tính di truyền của bố mẹ và sớm ra hoa, nhưng yêu cầu chăm sóc chu đáo trong thời gian đưa từ vườn ươm vào sản xuất đại trà

1.2.2 Nhân giống vô tính in vitro

Những năm 70 của thế kỷ XX là thập niên của sự bùng nổ công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật Đây là công cụ nghiên cứu của rất nhiều nhà khoa học Trong vòng 30 năm trở lại đây, kỹ thuật này đã làm nên một cuộc cách mạng lớn trong nhân giống thực vật và hiện nay người ta đang hướng tới mục tiêu áp dụng kỹ thuật này để sản xuất cây giống thương mại Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã trở thành một phương pháp nhân giống chuẩn và phổ biến đối với nhiều loại cây trồng như: cây công nghiệp, cây lâm nghiệp, cây cảnh, cây dược liệu, cây ăn trái và rau xanh Những kiến thức về công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật ngày càng được củng cố và có nhiều bước tiến

rõ rệt Với phương pháp này người ta có thể nhân giống rất nhiều loài cây từ các vùng khí hậu khác nhau trên thế giới mà các phương pháp nhân giống truyền thống không thể thực hiện được Một vài nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô trong việc

9

nhân nhanh các giống dưa hấu phục vụ cho công tác giống cũng đã được tiến hành trên thế giới cũng như trong nước [4, 13, 19]

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng

nhân tạo, trong điều kiện vô trùng Nhân giống vô tính cây trồng in vitro hay vi

nhân giống (Micropropagation) là một lĩnh vực ứng dụng có hiểu quả nhất trong công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Đây là phương pháp nhân giống hiện đại được thực hiện trong phòng thí nghiệm, thường được tiến hành nuôi cấy trong ống

nghiệm nên có tên là phương pháp nhân giống in vitro

Khác với phương pháp nhân giống truyền thống như giâm, chiết cành hoặc

ghép mắt, phương pháp nhân giống in vitro có khả năng trong một thời gian ngắn có

thể tạo ra một số lượng lớn chất lượng tốt như nhau mà các phương pháp nhân giống khác không thể thay thế được [10] Ngoài ra phương pháp này không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên nên có thể tiến hành quanh năm Đây đang là hướng được ứng dụng rộng rãi Ở Việt Nam hiện nay có nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy

mô, nhiều trung tâm sản xuất giống cây trồng, hàng năm đã cung cấp một lượng đáng kể cây giống có chất lượng cao cho sản xuất như chuối, dứa, khoai tây, các loại lan, cây cảnh, cây lâm nghiệp

1.2.2.1 Nguyên tắc của phương pháp nuôi cấy in vitro

+ Tính toàn năng của tế bào:

Mỗi tế bào đều mang đầy đủ lượng thông tin di truyền của cơ thể và có khả năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi Năm 1922, Kotte và Robbins đã nuôi được đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hòa thảo trong 12 ngày Năm 1967, Bourgin và Nitsch tạo cây đơn bội từ hạt phấn thuốc lá Kết quả này chứng minh đầy đủ tính toàn năng của tế bào [4,10]

+ Khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào

Biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phôi cho đến khi thể hiện một chức năng nào đó Các tế bào dùng trong nuôi cấy đều đã biệt hóa về cấu trúc

và chức năng từ tế bào phôi Trong những điều kiện thích hợp, có thể làm cho

10

những tế bào này quay trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng - tế bào phôi và quá trình đó gọi là quá trình phản biệt hóa Trong cùng một cơ thể, mỗi loại

tế bào đều có khả năng biệt hóa, phản biệt hóa Tuy nhiên, những tế bào càng chuyên hóa về một chức năng nào đó (đã biệt hóa sâu) thì càng khó xảy ra qúa trình phản biệt hóa, như các tế bào mạch dẫn của hệ thống mạch dẫn ở thực vật, tế bào thần kinh động vật Người ta đã kết luận, những tế bào càng gần với trạng thái của

tế bào phôi bao nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu Đối với các loài thực vật thì các tế bào phôi non, các tế bào mô phân sinh, các tế bào của cơ quan sinh sản (hạt phấn, noãn) rất dễ xảy ra quá trình phản biệt hóa Vì vậy nói một cách hình tượng như Galson (1986) và Murashige (1974) thì khả năng hình thành

cơ quan hay cơ thể của các tế bào thực vật là giảm dần theo chiều hướng từ ngọn xuống gốc [4]

1.2.2.2 Các kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật in vitro

Nuôi cấy mô - tế bào thực vật là công nghệ hiện đại trong nhân giống vô tính

ở thực vật Mục đích chung của nuôi cấy mô - tế bào thực vật là sử dụng các điều kiện như: nhiệt độ, ánh sáng, thành phần dinh dưỡng, các chất điều hoà sinh trưởng thực vật… để điều khiển quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào, mô nuôi cấy theo mục tiêu và yêu cầu đặt ra.Trong mấy thập kỷ qua công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã phát triển mạnh mẽ ở nhiều quốc gia trên thế giới Nuôi cấy mô - tế bào thực vật là một công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học Nhờ áp dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh, mô sẹo… con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần tốc độ vốn

có trong tự nhiên và tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng di truyền của

cơ thể mẹ, rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất ở quy mô lớn Hơn nữa dựa vào kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào đã duy trì và bảo quản được nhiều giống cây trồng qúy hiếm hoặc loại bỏ được nhiều mầm bệnh [2, 4]

- Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời

Năm 1946, Wetmore đã khởi đầu nuôi cấy mô và cơ quan tách rời bằng thí nghiệm nuôi cấy đỉnh chồi, sau đó đã nuôi cấy cả những bộ phận khác của cây như

11

lá, hoa, thân Nhu cầu dinh dưỡng của nuôi cấy mô hoặc cơ quan tách rời đều có điểm chung: nguồn cacbon (đường), các nguyên tố đa lượng (N, P, K, Ca), vi lượng (Mg, Fe, Mn, Zn, Co,…) và các vitamin Tuy nhiên nuôi cấy mô đòi hỏi cao hơn nuôi cấy cơ quan tách rời, như phải bổ sung thêm các chất hữu cơ chứa N (axit amin) và đặc biệt là chất điều hòa sinh trưởng phải đầy đủ, vì mô tách rời không có khả năng tổng hợp những chất này [2]

Trong nghiên cứu nuôi cấy mô và cơ quan tách rời, việc chọn mẫu có tầm quan trọng đặc biệt: mẫu phải ở tình trạng sinh lý tốt và đang phát triển, đó là những phần non của cây hoặc phôi hợp tử trưỏng thành như mầm, phần trên lá mầm, chồi bên của lá thứ nhất hay thứ hai, nơi chứa nhiều tế bào mô phân sinh Nuôi cấy mô

và cơ quan tách rời được ứng dụng trong nghiên cứu điều kiện sinh trưởng đối với

một bộ phận hoặc một mô của cây, nhân nhiều và nhanh cây trong điều kiện in

vitro, tạo mô sẹo phục vụ cho các nghiên cứu cơ bản như chọn dòng tế bào, đột biến

soma

- Nuôi cấy mô phân sinh

Đặc điểm của mô phân sinh là chứa các tế bào non trẻ, phân chia mạnh, lại không bị virut xâm nhập Nuôi cấy mô phân sinh được ứng dụng trong các trường hợp: tạo ra những giống cây sạch virut từ những giống bị bệnh (phục tráng giống),

nhân giống in vitro, tạo cây đa bội thông qua xử lý colchicine, nghiên cứu qúa trình

hình thành cơ quan [4]

- Nuôi cấy mô sẹo (callus)

Khi sự cân bằng các chất kích thích sinh trưởng trong thực vật thay đổi, cụ thể các mô đỉnh sinh trưởng hay nhu mô được tách ra và nuôi cấy trên môi trường có tỉ

lệ auxin và cytokinin thích hợp, thì mô sẹo được hình thành Đó là một khối các tế bào phát sinh ngẫu nhiên và có hình dạng không nhất định với màu vàng, trắng hoặc hơi xanh Nguyên liệu để tạo mô sẹo là các phần non của cây, được đưa vào môi trường nuôi cấy Trong quá trình nuôi cấy tạo mô sẹo, mẫu được nuôi cấy trong tối Tạo mô sẹo có thể coi là quá trình giải biệt hóa, khi hình thành sẽ gồm hai loại:

12

+ Loại xốp: chứa nhiều tế bào xốp với nhân nhỏ, chất tế bào loãng và không bào to

+ Loại cứng thì ngược lại: các tế bào chắc, nhân to, chất tế bào đậm đặc và không bào nhỏ

Từ các khối mô sẹo có thể đưa vào môi trường nhân sinh khối để thu lượng lớn mô sẹo Nuôi cấy mô sẹo được ứng dụng trong nhiều trường hợp như: Nhân

giống in vitro ở những loài thực vật mà phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy

đỉnh sinh trưởng ít có hiệu quả hoặc không thực hiện được; làm nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào đơn, thu nhận các chất có hoạt tính sinh học; nguyên liệu cho chọn dòng tế bào: đột biến, chọn dòng tế bào có khả năng chống chịu cao; nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan [4]

- Nuôi cấy phôi

Năm 1924 Dieterich trên cơ sở các nghiên cứu của mình đã đi đến kết luận là

phôi nuôi cấy in vitro hoàn toàn có thể nảy mầm không qua giai đoạn nghỉ Vì thế

môi trường nuôi cấy ở các giai đoạn khác nhau cần các thành phần môi dinh dưỡng khác nhau Đối với phôi non cần môi trường giàu dinh dưỡng hơn Nuôi cấy phôi

vô tính hiện nay được xem như một kỹ thuật mang lại nhiều hiệu quả hơn trong nhân giống cây trồng, trong khi nhân giống vô tính theo phương pháp cổ điển còn nhiều hạn chế Ngoài ra nuôi cấy phôi vô tính còn dùng để thử sức sống của phôi hạt, duy trì phôi yếu và cứu phôi lai xa, sản xuất hạt nhân tạo mà bản chất là tế bào phôi được bọc trong vỏ đặc biệt [4]

- Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn

Các thí nghiệm nuôi cấy bao phấn đầu tiên được thực hiện vào năm 1966, tiến hành ở cây cà độc dược và đã thu được cây đơn bội Nuôi cấy bao phấn, hạt phấn có

ưu điểm là đơn giản về thao tác kỹ thuật và môi trường nuôi cấy, nhưng lại có thể tạo ra cả cây lưỡng bội từ mô soma của thành bao phấn, do vậy sẽ khó phân biệt với cây tự lưỡng bội từ cây đơn bội Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn được dùng cho tạo các dòng thuần để nghiên cứu gen lặn vì chúng không biểu hiện ở cơ thể dị hợp tử, chọn các dòng đột biến [4, 5]

13

- Nuôi cấy tế bào đơn và tế bào trần

Melcher và Bergman (1959) là người đầu tiên tách, nuôi cấy tế bào đơn thực vật Tiếp theo nhiều tác giả khác đã nghiên cứu nuôi cấy tế bào đơn nhưng các thí nghiệm điển hình nhất là của Street (1970), ông nuôi cấy và duy trì được sự sinh trưởng liên tục của huyền phù tế bào Các tế bào đơn tách từ mô thực vật bằng phương pháp nghiền hoặc xử lý enzyme Sau đó chúng được nuôi cấy dịch lỏng, có khuấy hoặc lắc tạo điều kiện thuận lợi cho sự trao đổi khí và tiếp xúc với các chất dinh dưỡng Yêu cầu dinh dưỡng cho nuôi cấy tế bào đơn khá phức tạp, do chúng bị mất nhiều chất cần thiết cho sinh trưởng, khi tách rời khỏi quần thể tế bào Vì thế việc lựa chọn môi trường dinh dưỡng và điều khiển nuôi cấy phù hợp là việc nghiên cứu đầu tiên trong nuôi cấy tế bào đơn Ứng dụng nuôi cấy tế bào đơn cho các mục đích: Nghiên cứu sự sinh trưởng, phát triển và phân hóa tế bào trong những điều kiện khác nhau, chọn dòng tế bào, thu nhận các chất trao đổi thứ cấp [2, 4]

Nuôi cấy tế bào trần (protoplast) được bắt đầu từ những công trình của Cooking (1960) ông đã thu được protoplast từ tế bào rễ cà chua bằng phương pháp enzym.Mô hay dùng để tách protoplast là nhu mô thịt lá, ngoài ra có thể dùng mô sẹo hay tế bào đơn Sau khi xử lý enzyme thì thành tế bào bị loại bỏ, chỉ còn màng

tế bào bao bọc tất cả các cấu trúc của tế bào Do vậy protoplast là đối tượng lý tưởng cho các nghiên cứu:

+ Tạo con lai soma nhờ phương pháp dung hợp protoplast

+ Chuyển các bào quan (ty thể, lạp thể) hoặc cả nhân vào tế bào

+ Quá trình sinh tổng hợp màng tế bào

1.2.2.3 Ưu nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro

Phương pháp nuôi cấy in vitro có ưu điểm là có khả năng hình thành được số

lượng lớn cây giống từ mô, cơ quan của cây với một kích thước nhỏ khoảng 10mm Đồng thời phương pháp này tiến hành hoàn toàn trong điều kiện vô trùng nên cây giống tạo được sẽ không bị nhiễm bệnh, sử dụng vật liệu sạch virus và có khả năng nhân nhanh số lượng cây giống sạch virus Ngoài ra ưu điểm của phương pháp này là còn có thể chủ động điều chỉnh các tác nhân, điều chỉnh khả năng tái

1-14

sinh của cây như thành phần dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt đô, chất điều hòa sinh

trưởng theo ý muốn Phương pháp nhân giống in vitro có hệ số nhân giống cao nên

có thể sản xuất số lượng lớn cây giống trong một khoảng thời gian ngắn, đồng thời

có thể tiến hành quanh năm mà không chịu sự ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh của mùa vụ Nếu chưa có nhu cầu sử dụng thì có thể bảo quản được trong thời gian

dài ở điều kiện in vitro Tuy nhiên phương pháp nào thì cũng có mặt hạn chế của

nó Mặc dù nhân giống in vitro có hệ số nhân giống lớn nhưng cây giống tạo ra có

kích thước nhỏ, cây giống được cung cấp nguồn hydratcacbon nên khả năng tự tổng

hợp các chất hữu cơ của cây kém Đồng thời cây giống in vitro được nuôi cấy trong

bình thủy tinh nên độ ẩm không khí bão hòa Do đó khi trồng ra điều kiện bên ngoài

tự nhiên cây dễ bị mất cân bằng nước, gây hiện tượng héo và chết Vì vậy trước khi

chuyển cây từ điều kiện in vitro ra điều kiện bên ngoài cần phải trải qua giai đoạn

huấn luyện để cây thích nghi dần Và phương pháp này đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, kỹ thuật viên phải có trình độ chuyên môn cao [2, 4, 5]

1.2.2.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy in vitro

- Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy

Một trong những yếu tố quan trọng nhất đối với sự tăng trưởng và phát sinh hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trường Thành phần này thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm mà thành phần môi trường cũng thay đổi Môi trường còn thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của mẫu cấy Tuy nhiên tất cả các môi trường nuôi cây đều bao gồm năm thành phần: khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật [4, 7]

Khoáng đa lượng: nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là N, P, K, Ca, Mg và Fe

Khoáng vi lượng: nhu cầu khoáng vi lượng trong nuôi cấy mô thực vật in vitro

là lĩnh vực còn ít được nghiên cứu Trước đây, khi kỹ thuật nuôi cấy mô mới ra đời

15

người ta không nghĩ đến việc bổ sung khoáng vi lượng vào môi trường nuôi cấy Các nguyên tố vi lượng cần cung cấp cho tế bào là: Mn, Zn, B, Cu, Co, I, Mo…

Cacbon và nguồn năng lượng: Trong nuôi cấy in vitro, nguồn cacbon giúp mô

và tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ để tế bào phân chia, tăng sinh khối không phải từ quá trình quang hợp mà chính là nguồn carbon bổ sung vào môi trường dưới dạng đường Hai dạng đường thường gặp nhất là glucose và sucrose Các nguồn carbonhydrate khác cũng được tiến hành thử nghiệm nhưng hiệu quả kém hơn Nồng độ sucrose ban đầu có thể ảnh hưởng đến một số tham số nuôi cấy như tốc độ tăng trưởng và sản lượng hợp chất thứ cấp trong tế bào nuôi cấy [1] Vitamin: Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng Chúng cần vitamin để xúc tác các quá trình biến

dưỡng khác nhau Khi tế bào và mô được nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở

thành yếu tố giới hạn cho sự phát triển của chúng Các vitamin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic (B3), pyridoxine (B6) và myo-inositol

- Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật:

Auxin tự nhiên là một hợp chất tương đối đơn giản: indol-3-acetic acid (IAA) Các chất có cấu trúc gần giống IAA và có vai trò với IAA trong vài cơ quan đều được gọi là Auxin (IBA; NAA; 2,4-D; 2,4,5-T và phenoxyaxetic acid) Auxin phối hợp với cytokinin giúp sự tăng trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mới mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô Tuy nhiên, ở nồng độ cao, auxin cản trở sự phát triển của các chồi nách Auxin (IAA, IBA) ở nồng độ cao kích thích sự ra rễ, nhưng cũng cản trở sự tăng trưởng của các rễ mới hình thành này 2,4-D và NAA thường được sử dụng trong nuôi cấy tạo mô sẹo [7]

Cytokinin gồm kinetin, BAP, zeatin và 2iP là một loại hormone thực vật kích thích tế bào phân chia Các hợp chất này xuất phát từ purine adenine Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào với điều kiện có auxin, nó tác động lên cả hai bước của phân chia tế bào: phân nhân và phân bào Cytokinin giúp sự gia tăng kích thước

tế bào và sinh tổng hợp protein Trong các nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật, tỷ lệ

16

Auxin/Cytokinin (A/C) là một yếu tố rất quan trọng: A/C cao giúp sự tạo rễ, A/C thấp giúp sự tạo chồi Như vậy, cytokinin hỗ trợ auxin trong tăng trưởng nhưng đồng thời cũng có sự đối kháng giữa auxin (giúp ra rễ) và cytokinin (giúp tạo chồi);

sự cân bằng giữa hai loại hormone này là một trong những yếu tố kiểm soát sự phát triển ở thực vật [7]

17

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu

2.1.1 Giống dưa hấu

Các thí nghiệm được tiến hành trên giống dưa hấu lưỡng bội F1 Hắc Mỹ Nhân (Syngenta, Thái Lan) Đây là con lai F1 có thể sinh trưởng ở nhiều vùng sinh thái khác nhau, cho năng suất cao và tính chống chịu tốt

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ

- Thiết bị: Nồi khử trùng ALP, tủ ấm Memmert, tủ sấy Memmert, máy cất nước

2 lần Aquatron, cân kỹ thuật Satorius, cân phân tích Pressica XT 220A, máy

đo pH Navi, tủ lạnh LG, tủ cấy vô trùng

- Dụng cụ thủy tinh: Đĩa Petri, bình tam giác, ống nghiệm

- Các dụng cụ khác: Dao cắt mẫu, kéo, panh, kẹp, khay đựng

2.1.3 Hóa chất

Các hóa chất trong thành phần môi trường cơ bản MS (Muashige Skoog, 1962) (ghi ở phần phụ lục), và các chất kích thích sinh trưởng như BAP, NAA, IBA, KIN và các hỗn hợp hữu cơ khác

2.2 Phương pháp

2.2.1 Phương pháp vô trùng mẫu

Để khảo sát phương pháp khử trùng mẫu, các hạt giống dưa hấu được chia làm 2 lô: lô hạt để nguyên vỏ và lô hạt đã loại vỏ cứng bên ngoài Cả 2 lô đều được tiến hành các bước khử trùng như nhau: rửa trước trong cồn 70oC khoảng 5 phút, sau đó hạt được ngâm 5 phút và 10 phút trong dung dịch HgCl2 hoặc dung dịch NaOCl theo các nồng độ như sau:

Dung dịch HgCl2 ở các nồng độ: 0,025; 0,05; 0,075 và 0,1%

Dung dịch NaOCl ở các nồng độ: 0,25; 0,50, 0,75 và 1,0%

Sau khi ngâm trong dung dịch HgCl2 hoặc dung dịch NaClO, các hạt dưa hấu được rửa từ 3 - 5 lần trong nước cất vô trùng (mỗi lần khoảng 10 phút) nhằm loại bỏ