sọ (Colocasia esculenta) bằng tạo củ in vitro trên thế giới và ở Việt Nam
3.1. Tình hình nghiên cứu tạo củ in vitro ở khoai môn sọ trên thế giới
1. Năm 1992, Yamamoto đã công bố tạo được củ khoai môn sọ in vitro khi thêm 8% sucrose vào môi trường MS lỏng.
2. Năm 1999 nhóm tác giả: Su P.Zhou, Ye K.He & Shi J.Li của trường Đại học nông nghiệp Nam Kinh đã thực hiện đề tài “ Induction and characterization of in vitro corm of diploid-taro” tại phòng thí nghiệm Di truyền học phân tử thực vật Quốc gia, Viện Sinh lý học thực vật Thượng Hải, Viện Hàn lâm Khoa học Trung Quốc, Thượng Hải, Trung Quốc.
Đề tài được tiến hành trên đối tượng là giống khoai môn (lưỡng bội 2n = 28) được trồng phổ biến ở Trung Quốc.
Trong đề tài này đã nghiên cứu được những vấn đề sau:
3.1.1. Giới thiệu
Ở khoai môn sọ các củ con chính là những củ giống để trồng vụ sau. Tuy nhiên ở khoai môn sọ đặc biệt là khoai môn số củ con rất ít (5-6 củ con/cây). Do đó hệ số nhân giống tự nhiên rất thấp nên nguồn củ giống hạn
chế việc mở rộng qui mô trồng khoai môn sọ. Bởi vậy một phương pháp tạo củ giống kinh tế và hiệu quả là rất cần thiết.
Việc nhân giống trong ống nghiệm rất thuận lợi để có hệ số nhân cao, tạo ra số lượng lớn chồi.
Chất điều hòa sinh trưởng ở thực vật rất hiệu quả trong điều khiển sự phát sinh hình thái thông qua sự tác động vào các quá trình sinh hóa.
Cytokinin (chất điều hòa sinh trưởng) và sucrose đã được biết là có ảnh hưởng đến sự hình thành củ bi ở khoai tây (Suping và cộng sự, 1988) .
3.1.2. Phương pháp:
Có 3 phương pháp tạo củ - Phương pháp Deep-layer:
Theo phương pháp này thì các chồi được chuyển trực tiếp từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo củ.Bình chứa môi trường tạo củ có dung tích 250ml chứa 100ml môi trường tạo củ. Sau khi chồi được cấy vào bình được nuôi cấy trên máy lắc ở tốc độ 100 vòng/phút.
- Phương pháp Thin-layer:
Theo phương pháp này 10 chồi được chuyển từ môi trường nhân nhanh sang môi trường ra rễ (để tạo rễ) đựng trong bình tam giác có dung tích 50ml chứa 20ml môi trường MS không bổ sung phytohoocmon (trong khoảng 25 ngày) trước khi cấy chuyển sang môi trường tạo củ. Sau khi chồi cấy đã hình thành rễ và cao khoảng 3-5cm thì tiến hành cắt phía trên rễ và cấy chuyển sang môi trường tạo củ. Bình chứa môi trường tạo củ có dung tích 250ml, chứa 25ml môi trường . Bình được nuôi tĩnh (không nuôi trên máy lắc).
Môi trường tạo củ ở 2 phương pháp nuôi cấy Deep-layer và Thin-layer là môi trường MS lỏng bổ sung 0-15% đường sucrose và 0-44 μM BAP.
Theo phương pháp này bước đầu tương tự phương pháp Thin layer: 10 chồi được chuyển từ môi trường nhân nhanh sang môi trường ra rễ (để tạo rễ) đựng trong bình tam giác có dung tích 50ml chứa 20ml môi trường MS không bổ sung phytohoocmon (trong khoảng 25 ngày) trước khi cấy chuyển sang môi trường tạo củ. Sau khi chồi cấy đã hình thành rễ và cao khoảng 3-5cm thì tiến hành cắt phía trên rễ và cấy chuyển sang môi trường tạo củ.
Tuy nhiên trong phương pháp này môi trường tạo củ là môi trường MS bổ sung 0-66 μM BAP, 0-1700 μM PP333(Paclobutrazol) hoặc 0-630 μM CCC và 8% đường sucrose.
Điều kiện nuôi cấy ở cả 3 phương pháp là: - Ánh sáng yếu: 10-15μM/m2/s
- Nhiệt độ: 280C - Thời gian: 4-6 tuần
3.1.3 Phương pháp thu củ và thống kê
Các củ được tạo ra theo phương pháp Thin-layer được thu hoạch sau các khoảng thời gian khác nhau 10, 15, 20, 25, 30 và 40 ngày. Sau đó được nhóm theo trọng lượng tươi (<0,1; 0,1-0,2; 0,2-0,3; 0,3-0,5; 0,5-1; >1g)
Phương pháp tách chiết và xác định hàm lượng protein của củ: Sử dụng dung dịch chiết mẫu của Laemmli. Thành phần của dung dịch chiết mẫu này gồm: 65μM Tris-HCl (pH=8); 2% (w/v) SDS; 5% (v/v) 2- mercaptoethanol; 2mM EDTA và 0,1 Triton X-100. Để ở 40C sau 1 đêm.
Mẫu được li tâm ở tốc độ 10000 vòng/phút trong 10 phút.Thu lấy phần dịch trong và bổ sung thêm 1%SDS, 1%2-mercaptoethanol và 5%(w/v)sucrose được sử dụng để điện di SDS-PAGE theo phương pháp của Hermann(1987) với đệm điện cực pha theo công thức của Leammli (1970).
Các củ sau khi được phân loại theo trọng lượng thì được đựng trong các bình thủy tinh khác nhau và đậy kín, được bảo quản trong kho lạnh ở 40C trong 10 tháng. Sau thời gian bảo quản thì đem trồng tỉ lệ sống sót được xác định dựa vào số củ mọc mầm sau 20 ngày trồng vào đất.
3.1.5. Kết quả
3.1.5.1. Ảnh hưởng của môi trường tạo củ lên sự hình thành củ trong ống nghiệm ống nghiệm
Sự ảnh hưởng của nồng độ BAP và sucrose lên sự tạo củ và sự sinh trưởng của củ:
- Nếu thiếu sucrose sẽ không tạo thành củ kể cả có mặt BAP
- Khi tăng hàm lượng sucrose lên 5-10% sẽ thúc đẩy sự tạo củ nhưng điều đó chỉ xảy ra khi thêm đồng thời 22-44 μM BAP
- Khi kết hợp 8-10% sucrose với 22-44 μM BAP tỉ lệ củ được tạo ra từ các chồi cấy vào đạt 100%.
- Khi nồng độ sucrose đạt 15% sự sinh trưởng của củ bị ức chế, tỉ lệ củ được tạo thành chỉ còn lại 50%.
- AFW(khối lượng tươi trung bình) của các củ được trồng trong môi trường có tỉ lệ 8 - 10% sucrose, 22-44 μM BAP là cao nhất so với các môi trường khác. Khi tăng hoặc giảm hai thành phần trên đều làm giảm chất lượng và khối lượng củ tạo thành.
CCC không có ảnh hưởng rõ rệt lên sự hình thành các củ: - Khi nồng độ CCC dưới 315 μM lá có màu xanh.
- Tăng nồng độ lên 630 μM CCC làm cho lá ngả sang màu nâu trong khoảng 20 ngày.
Ảnh hưởng của PP333 lên sự tạo củ có liên quan mật thiết với nồng độ BAP:
- Thêm 170-850 μM PP333 vào môi trường chứa 22-44 μM BAP làm tăng sự tạo củ và AFW của củ. Nhưng nếu kết hợp với 66 μM BAP lại làm giảm sự tạo củ.
- Khi thêm 1700 μM PP333 vào môi trường chứa 22-44 μM BAP làm giảm sự tạo củ. Nhưng khi tăng dần nồng độ BAP sẽ làm tăng dần sự hình thành củ.
- Nhìn chung ở sự kết hợp 170-850 μM PP333 và 22-44 μM BAP là sự kết hợp tối ưu nhất đối với sự hình thành củ. AFW của củ là 1,0-1,5g và MFW là 3g.
3.1.5.2. Ảnh hưởng của phương pháp nuôi cấy lên sự hình thành củ
- Trong phương pháp Deep-layer sự tạo củ đạt tối đa 100% khi kết hợp 22-44 μM BAP với 5-10% sucrose.
- Theo phương pháp Thin-layer thì chỉ đạt được điều đó khi tăng hàm lượng đường lên 8-10%.
- Khi không thêm BAP vào môi trường tạo củ thì củ tạo ra theo phương pháp Thin-layer lớn hơn theo phương pháp Deep-layer.
- Khi thêm BAP vào môi trường tạo củ thì củ tạo ra bằng phương pháp Deep-layer lớn hơn bằng phương pháp Thin-layer.
3.1.5.3. Sự phát triển của củ trong ống nghiệm
- Hàm lượng khô chứa trong một đơn vị khối lượng tươi của những củ từ 0,2g trở lên cao hơn ở các củ có khối lượng dưới 0,2g. Các củ có khối lượng từ 0,2g xuất hiện những đốm màu thẫm phân bố rải rác. Điều đó cho thấy sắc tố chỉ xuất hiện khi củ phát triển đến mức độ nhất định.
- Từ bản gel SDS-PAGE điện di protein hòa tan đã chỉ ra rằng có 6 nhóm (CP1-CP6) protein và chúng thay đổi trong quá trình phát triển của củ. Trong đó các băng CP4, CP5, CP6 xuất hiện ở những củ nhỏ hơn (0,1-
0,2g); CP1, CP2, CP3 bắt đầu xuất hiện ở củ có khối lượng từ 0,3-0,5g. Ở những củ này băng CP4, CP5, CP6 đậm hơn.
3.1.5.4. Bảo quản và trồng ra vườn
- Khi bảo quản ở 40C củ trên 0,2g giữ nguyên thành phần của nó và tỉ lệ sống sót là 99-100%. Những củ nhỏ hơn 0,2g bị mất nước trong quá trình bảo quản và bị chết khi trồng.
Kết quả nghiên cứu này chỉ ra rằng trong môi trường tạo củ MS lỏng bổ sung 8-10% sucrose và 22-44 μM BAP thì tất cả các chồi có thể tạo củ trên 0,3g. Các củ đều sống sót trong thời gian bảo quản và đem trồng.
- Phương pháp nuôi cấy Thin-layer với môi trường MS lỏng bổ sung 8- 10% sucrose và 22-44 μM BAP là phương pháp kinh tế hơn cả và có thể áp dụng để sản xuất đại trà.
Tuy đề tài đã hoàn thiện qui trình tạo củ in vitro ở giống khoai môn sọ trồng phổ biến ở Trung Quốc nhưng các nghiên cứu tiếp tục là cần thiết vì mỗi giống khoai môn sọ có đặc trưng di truyền riêng và thích nghi với điều kiện sống khác nhau, bởi vậy khi đưa vào nuôi cấy in vitro nó cũng đòi hỏi điều kiện nuôi cấy khác nhau.
3.2. Tình hình nghiên cứu tạo củ in vitro khoai môn sọ ở Việt Nam
Năm 2010, đề tài “bước đầu nghiên cứu tạo củ in vitro ở cây khoai môn tía Lạng Sơn (Colocasia esculenta (L.) Schott) của sinh viên Nguyễn Kim Hương-k56C khoa sinh học- ĐHSPHN mới cung cấp một số cơ sở lý thuyết cho tạo củ ở, giống khoai môn tía Lạng Sơn. Kết quả của đề tài cho thấy đối với giống khoai môn tía Lạng Sơn, môi trường MS có bổ sung 60g/l sucrose và 7mg/l BAP sẽ cảm ứng tạo củ tốt nhất.
Qui trình trên có thể phù hợp với giống này mà không phù hợp với các giống khác. Vì vậy cần thiết phải có những nghiên cứu tìm ra qui trình
tạo củ các giống khoai môn sọ đặc sản của nước ta góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen khoai môn sọ.
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu nghiên cứu
Đề tài sử dụng 4 giống khoai môn sọ quý của địa phương. Đây là những giống khoai môn sọ thơm ngon và được người tiêu dùng ưa chuộng.
1. Giống khoai sọ Cụ Cang – Sơn La
Dọc lá và phiến lá màu xanh nhạt có hình tròn, rốn lá màu trắng. Củ hình tròn, thịt củ có màu hơi tím, khi nấu chín có mùi thơm đặc trưng, bở, dẻo.
2. Giống khoai sọ Mán – Lạng Sơn
Có dọc lá màu tím, phiến lá màu xanh đậm có hình tim, rốn lá màu trắng, thân cây có màu tím sẫm.
3. Giống khoai sọ thơm Lạng Sơn
Dọc lá màu xanh nhạt, phiến lá màu xanh đậm có hình tim, rốn lá có màu tím . Củ hình tròn, thịt củ có màu trắng, có vị hơi ngứa, có dải bò.
4. Giống khoai sọ núi – Bắc Giang
Dọc lá và phiến lá màu xanh nhạt, rốn lá màu trắng. Củ tròn, phần vỏ ngoài có màu hơi tím, thịt củ màu trắng.
Các giống khoai sọ được thu thập, bảo quản và lưu giữ tại phòng thí nghiệm bộ môn Di truyền học trường Đại học sư phạm Hà Nội.
2. Phương pháp nghiên cứu
2.1. Thí nghiệm xác định công thức khử trùng thích hợp cho mẫu nuôi cấy
Giai đoạn khử trùng là giai đoạn vô cùng quan trọng trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật. Đặc biệt đối với khoai môn sọ mẫu cấy là đỉnh sinh trưởng nằm trong đất hoặc sát mặt đất nên khả năng nhiễm thường cao hơn nhiều các mẫu cấy khác nằm trên mặt đất. Vì vật hóa chất thường được sử dụng là loại hóa chất độc (HgCl2) ở nồng độ cao, thời gian xử lý lâu hơn so với các đối tượng khác.
Nhằm xác định ảnh hưởng của thời gian khử trùng mẫu bằng HgCl2
0.1% đến khả năng sống của mẫu sạch đưa vào nuôi cấy, các thí nghiệm đã được bố trí với 5 công thức, được lặp lại 3 lần, mỗi lần 20 mẫu cho mỗi công thức.
Công thức khử trùng 1 (CT1): khử trùng kép bằng HgCl2 0,1% trong 10 phút Công thức khử trùng 2 (CT2): khử trùng kép bằng HgCl
(d) : Khoai sọ núi (c) : Khoai sọ thơm
Hình 1(a,b,c,d) : Hình thái cây khoai môn sọ của các giống nghiên cứu
Công thức khử trùng 3 (CT3): khử trùng kép bằng HgCl2 0,1% trong 14 phút Công thức khử trùng 4 (CT4): khử trùng kép bằng HgCl2 0,1% trong 16 phút Công thức khử trùng 5 (CT5): khử trùng kép bằng HgCl2 0,1% trong 18 phút
* Phương pháp tiến hành:
- Chọn cây khoai môn sọ có chiều cao khoảng 30cm. Cắt lấy phần chồi đỉnh (sâu khoảng 1cm xuống phần củ và 2 – 3cm phần thân giả). Rửa sạch dưới vòi nước chảy, ngâm trong nước xà phòng loãng khoảng 10 phút rồi rửa sạch xà phòng dưới vòi nước chảy. Sau đó đưa mẫu vào box cấy vô trùng và tiến hành các thao tác khử trùng.
- Khử trùng sơ bộ bằng cồn ethanol 70oC trong 45 giây, tráng rửa cồn 3 lần bằng nước cất vô trùng.
- Đưa mẫu vào khử trùng bằng hóa chất khử trùng chính theo các công thức thí nghiệm (lưu ý khi khử trùng hai thì giữa các lần khử trùng của công thức tráng bằng nước cất vô trùng). Sau khi lấy mẫu ra khỏi dung dịch khử trùng, tráng lại 3 lần bằng nước cất vô trùng (lần thứ nhất 45 giây, lần thứ hai 30 giây, lần cuối 45 giây).
Trong khi khử trùng phải luôn đổ nước, cồn, hoặc dung dịch HgCl2 0,1% ngập mẫu và trong quá trình khử trùng luôn lắc nhẹ bình để đảm bảo hiệu quả khử trùng.
- Mẫu sau khi khử trùng được cắt thành những mảnh nhỏ. Các mảnh cắt của chồi đỉnh được đưa vào môi trường MS để theo dõi trong 2 tuần, loại bỏ những mẫu chết, mẫu nhiễm bệnh, những mẫu sạch tiếp tục được đưa vào các môi trường thí nghiệm khác nhau để tìm môi trường tái sinh thích hợp.
٭ Chỉ tiêu theo dõi
Tỷ lệ mẫu sạch(%) = Số mẫu sạch
x 100 Số mẫu đưa vào nuôi cấy
Tỷ lệ mẫu sống (%) =
Số mẫu sống
x 100 Số mẫu đưa vào nuôi cấy
Tỷ lệ mẫu chết (%) =
Số mẫu chết
x 100 Số mẫu đưa vào nuôi cấy
2.2. Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp của mẫu cấy. sinh chồi trực tiếp của mẫu cấy.
* Mục đích: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến quá trình tái sinh chồi trực tiếp từ mô cấy.
* Tiến hành: Các mẫu sạch bệnh được chọn sau khoảng 2 tuần vào mẫu đưa vào các môi trường tái sinh chồi khác nhau để tìm công thức tái sinh chồi thích hợp (tỉ lệ tái sinh chồi cao, số lượng chồi/ mẫu nuôi cấy lớn, chồi phát triển tốt). Sau đó sử dụng môi trường tái sinh thích hợp để tạo đủ số lượng chồi cần thiết cho các thí nghiệm sau.
* Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 6 công thức, mỗi công thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần 20 mẫu
Công thức 1 (ĐC) : MS + 0,1 mg/l NAA
Công thức 2 : MS + 0,1mg NAA + 1mg/l BAP Công thức 3 : MS + 0,1mg NAA + 2mg/l BAP Công thức 4 : MS + 0,1mg NAA + 3mg/l BAP Công thức 5 : MS + 0,1mg NAA + 4mg/l BAP Công thức 6 : MS + 0,1mg NAA + 5mg/l BAP * Chỉ tiêu theo dõi
- Tỷ lệ tái sinh (%) = X 100
∑ Số mẫu tái sinh ∑ Số mẫu sống
2.3. Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hệ số nhân nhanh chồi. nhân nhanh chồi.
* Mục đích: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh chồi.
* Tiến hành: Mẫu nuôi cấy đưa vào môi trường tái sinh chồi tối đa là 8 tuần. Các chồi từ môi trường tái sinh chồi được cấy chuyển sang các môi trường nhân nhanh chồi khác nhau để tìm môi trường thích hợp nhất (là môi trường mà ở đó có hệ số nhân chồi cao và chồi phát triển tốt). Sau đó sử dụng môi trường nhân nhanh thích hợp để tạo đủ số lượng chồi cần thiết cho các thí nghiệm tạo củ.
* Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 5 công thức, mỗi công thức 5