Khi cây con trong môi trường ra rễ đạt chiều cao từ 3-5cm thì cắt bỏ rễ và cấy chuyển sang môi trường MS không chất kích thích sinh trưởng. Sau khoảng từ 15-20 ngày mới chuyển các cây in vitro vào các loại môi trường MS bổ sung đường, thạch và chất kích thích sinh trưởng ở nồng độ
(a) : Khoai sọ Cụ Cang (b) : Khoai Mán
(c) : Khoai sọ thơm (d) : Khoai sọ núi
Hình 6 (a,b,c,d): Bộ rễ mọc từ cây in vitro các giống khoai môn sọ trên môi trường thí nghiệm bổ sung NAA
khác nhau để nghiên cứu sự cảm ứng hình thành củ của chồi cấy. Mục đích của việc chuyển cây in vitro sang môi trường MS không chất kích thích sinh trưởng trước khi đưa vào tạo củ là để ổn định sinh trưởng của cây và giảm nồng độ hoocmon sinh trưởng tích tụ trong cây từ môi trường ra rễ. Từ đó đánh giá được chính xác hiệu quả tạo củ trong các môi trường có bổ sung đường và nồng độ hoocmon sinh trưởng khác nhau.
Bảng 6: Khả năng tạo củ trên các môi trường tạo củ ở 4 giống khoai môn sọ
Công thức
Thành phần các chất bổ sung vào môi trường MS
Khả năng tạo củ của các giống khoai sọ Đường (%) BAP (mg/l) NAA (mg/l) Cụ Cang Khoai Mán Sọ thơm Sọ núi 1 0 0 0
Không tạo được củ
2 3 1 0 3 3 0,1 4 7 0 - Gốc phình to - - 5 5 1 0 - Tạo được củ nhỏ - 6 3 0,1 7 5 0 Tạo được củ in vitro,củ to và nhiều 8 7 0 9 7 1 0 - Tạo được củ nhỏ - 10 3 0,1 11 5 0 Tạo được được củ Củ nhỏ, một số cây vàng úa - 12 7 0 - Tạo được củ 13 9 1 0
Cây in vitro héo dần và chết
14 3 0,1
15 5 0
16 7 0
Ghi chú: (-) không tạo củ
Tiến hành đánh giá tỉ lệ tạo củ và xác định khối lượng tươi trung bình của củ invitro được hình thành trên các công thức môi trường tạo được củ có kết quả thể hiện ở bảng 7
Bảng 7: Kết quả tạo củ in vitro và xác định công thức tạo củ thích hợp
Giống Công thức môi trường Các chỉ tiêu Tổng số chồi cấy Số củ tạo thành Tỉ lệ tạo củ(%) AFW (g) Cụ Cang CT11 30 10 33,33 0,232 Sọ núi CT12 30 8 26,67 0,186 Khoai Mán CT5 30 10 33,33 0,243 CT6 30 12 40,00 0,321 CT7 30 18 60,00 0,523 CT8 30 20 66,67 0,612 CT9 30 16 53,33 0,214 CT10 30 14 46,67 0,300 CT11 30 9 30,00 0,241 CT12 30 7 23,33 0,223 Khoai sọ thơm CT5 30 9 30,00 0,193 CT6 30 14 46,67 0,432 CT7 30 23 76,67 0,527 CT8 30 19 63,33 0,522 CT9 30 19 63,33 0,465 CT10 30 15 50,00 0,321 CT11 30 13 43,33 0,300 CT12 30 7 23,33 0,232
Kết quả ở bảng 6 và bảng 7 cho thấy: hàm lượng đường và nồng độ BAP có vai trò quan trọng trong tạo củ in vitro.
Đối với 2 giống: khoai Mán và sọ thơm Lạng Sơn, khi môi trường bổ sung 5% hoặc 7 % sucrose sẽ cảm ứng hình thành củ in vitro. Củ nhiều và đạt kích thước lớn khi bổ sung thêm 5mg/l hoặc 7mg/l BAP. Đặc biệt ở giống khoai sọ thơm tỉ lệ tạo củ rất cao (76,67%), có những chồi tạo được cụm củ.
Đối với 2 giống: khoai sọ Cụ Cang và sọ núi hình thành củ in vitro trong điều kiện môi trường đòi hỏi hàm lượng đường và BAP cao (7% đường, 5mg/l BAP với giống sọ Cụ Cang và 7mg/l BAP với giống sọ núi). Tuy vậy số lượng củ không nhiều, kích thước nhỏ.
Hàm lượng đường thấp (3%) hoàn toàn không tạo được củ, hàm lượng đường quá cao (9%) lại ức chế sinh trưởng của cây in vitro.
Một số hình ảnh củ in vitro tạo được
(a) : Khoai sọ Cụ Cang (b) : Khoai Mán
(c) : Khoai sọ thơm (d) : Khoai sọ núi
(a) : Khoai sọ Cụ Cang (b) : Khoai Mán
(c) : Khoai sợ thơm (d) : Khoai sọ núi
Hình 8 (a,b,c,d) : Củ in vitro thu được của các giống khoai môn sọ
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I. Kết luận
Nhìn chung hai giống Cụ Cang và Sọ núi có khó khăn hơn trong việc nhân nhanh và tạo củ in vtro, hiệu quả nuôi cấy thấp. Trong khi giống khoai Mán và khoai sọ thơm Lạng Sơn cho hiệu quả cao hơn.
- Khử trùng kép mẫu bằng HgCl2 0,1 % , giữa các lần khử trùng được tráng bằng nước cất vô trùng mang lại hiểu quả cao đối với cả bốn giống. Thời gian khử trùng cần thiết với giống khoai sọ Cụ Cang và khoai sọ núi, khoai sọ thơm (Lạng Sơn), khoai Mán (Lạng Sơn) tương ứng lần lượt là 8 phút, 7 phút, 6 phút trên mỗi lần.
- Môi trường MS có bổ sung 3%sucrose, 0,1mg/lNAA, 3mg/lBAP thích hợp để tái sinh chồi in vitro ở giống khoai Mán (84,35%) và khoai sọ Cụ cang (80,11%). Với giống khoai sọ thơm chỉ bổ sung BAP ít hơn (2mg/l), nhưng với giống khoai sọ núi cần bổ sung hàm lượng BAP cao hơn (5mg/l)
- Môi trường MS có bổ sung 3% sucrose, 0,1 mg/l NAA, 2mg/l BAP là thích hợp nhất để nhân nhanh chồi, môi trường MS bổ sung 3% sucrose, 0,2 mg/l NAA thích hợp cho tạo rễ cây in vitro ở cả 4 giống nghiên cứu.
- Môi trường MS có 70g/l sucrose và bổ sung thêm 5mg/l BAP thích hợp để tạo củ in vitro ở giống khoai sọ Cụ Cang. Lượng BAP cần bổ sung cao hơn (7mg/l) để tạo củ in vitro ở giống khoai sọ núi. Với giống khoai Mán và khoai sọ thơm Lạng sơn, nhu cầu về đường sucrose trong quá trình tạo củ thấp hơn (50g/l).
II. Đề nghị
Do thời gian làm đề tài có hạn, thời gian sinh trưởng của khoai môn sọ lại khá dài nên chúng tôi mới dừng lại ở các bước trong phòng thí nghiệm,
chưa theo dõi được giai đoạn củ in vitro ở ngoài đồng ruộng và hiệu quả tạo củ của giống khoai sọ Cụ Cang và khoai sọ núi chưa cao. Vì vậy để đề tài đạt kết quả tốt hơn chúng tôi có một số đề nghị sau:
- Tiếp tục những nghiên cứu trồng củ in vitro ngoài đồng ruộng để hoàn thiện quy trình tạo củ in vitro cho 4 giống khoai sọ trên
- Đặc biệt giống khoai sọ Cụ Cang là giống khoai sọ ngon nhưng hiệu quả tạo củ in vitro chưa cao. Do đó cần có thêm những nghiên cứu để phục tráng và sử dụng củ in vitro trong các nghiên cứu cải tiến nguồn gen.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Sách, tạp chí và các đề tài
[1]. Nguyễn Thị Ngọc Huệ, Nguyễn Văn Viết, 2004.Tài nguyên di truyền
khoai môn sọ ở Việt Nam. NXB Nông Nghiệp.
[2]. Nguyễn Thị Nga, 2008. Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của tia Gamma nguồn Co60
đến chồi in vitro tái sinh từ chồi đỉnh của một số giống khoai môn sọ địa phương. Luận văn thạc sĩ Trường ĐHSP Hà
Nội.
[3]. Nguyễn Quang Thạch (chủ biên), Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo, 2005. Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp. NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
[4]. Nguyễn Đức Thành, 2000. Nuôi cấy mô tế bào thực vật- nghiên cứu và
ứng dụng. NXB Nông Nghiệp.
[5]. Nguyễn Thị Anh Minh, 2010. Nghiên cứu nhân giống in vitro và bước đầu ứng dụng kĩ thuật đột biến thực nghiệm nhằm cải tiến một số giống khoai sọ địa phương. Luận văn thạc sĩ Trường ĐHSP Hà Nội.
[6]. Nguyễn Kim Hương, 2010. Bước đầu nghiên cứu tạo củ in vitro ở cây
khoai môn tía Lạng Sơn (Colocasia esculenta (L.) Schott). Khóa luận tốt
nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội.
[7]. ThS. Nguyễn Phương (Trung tâm công nghệ sinh học & Công nghệ thành phố Hà Nội), PGS.TS Lê Thị Cúc, GS.TS. Hoàng Đình Hòa (Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội, 2009. Nghiên cứu tính chất lí hóa của tinh bột của
một số giống khoai môn sọ (Colocasia esculenta (L.) Schott) phổ biến có ở miền Bắc Việt Nam.
[8]. Su P. Zhou – Ye K.He – Shi. J. Li, 1999. Introduction and
characterization of in vitro corms of diploid – taro, Plant cell tissue and organ culture , pp 173 – 178. NXB Springer Nertherlands.
[9]. Phan Thị Thanh Tâm, Nghiên cứu sự đa dạng di truyền trong loài khoai
môn sọ (Colocasi esculenta (L.) Schott) ở một số tỉnh vùng Đông Bắc Bộ. Luận văn thạc sĩ trường ĐHSP Hà Nội.
II. Các trang web
[10]. http: // www.ebook.edu.vn [11]. http: // www.fao.org.vn
[12]. http: // www.khoahoc.com.vn [13]. http: // www.khuyennongvn.gov.vn
PHỤ LỤC
Bảng 1: Một số đường hướng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy
Nồng độ phytohoocmon Sự phát sinh hình thái của
mẫu cấy
IAA Kinetin
2.10-5 10-6 Callus
2.10-5 10-7 Rễ
2.10-7 5.10-6 Chồi
Bảng 2: Sự phụ thuộc thời gian khử trùng vào lượng môi trường
Lượng môi trường trong bình nuôi cấy (ml)
Thời gian khử trùng tối thiểu ở 1210C (phút) 20 – 50 75 250 – 500 1000 1500 2000 15 20 25 30 35 40
Bảng 3: Thành phần môi trường MS (Murashige – Skoog) , 1962
Nhóm nguyên tố Tên hóa chất Nồng độ(mg/l môi
trường) 1. Đa lượng NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCl2.2H2O 440 MgSO4.7H2O 500 KH2PO4 170
2. Vi lượng H3BO3 6,2 MgSO4.4H2O 22,3 ZnSO4 8,6 KI 0,83 Mo4Na2.2H2O 0,25 CoCl2.6H2O 0,025 CuSO4.5H2O 0,025 3. Dung dịch sắt FeSO4.7H2O 27,8 Na2EDTA 37,3 4. Inositol Myo-Inositol 100 5. Vitamin Acid Nicotinic 0,5 Pyrydocin HCl 0,5 Thiamine HCl 0,5
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU SỬ DỤNG TRONG KHÓA LUẬN
Viết là Đọc là
AFW Average fresh weight
MFW Maximum fresh weigh
BAP 6-benzyl amino purin
CT Công thức
CCC Cycocel
ĐBSH Đồng bằng sông Hồng
ĐC Đối chứng
ĐHSP Đại học sư phạm
FAO Tổ chức nông lương thế giới
MS Murashige - Skoog
NAA α-naphthyl acetic acid
PP333 Paclobutrazol
MôC LôC Trang PHẦN I: MỞ ĐẦU ... 1 1. Lý do chọn đề tài ... 1 2. Mục đích và mục tiêu ... 3
3. Đối tượng nghiên cứu ... 3
4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ... 3
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ... 3
PHẦN II: NỘI DUNG ... 4
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ... 4
1. Đặc điểm chung của cây khoai môn sọ(Colocasia esculenta (L.) Schott) .. 4
1.1. Phân loại cây khoai môn sọ ... 4
1.2. Nguồn gốc và phân bố ... 5
1.3. Đặc điểm hình thái ... 6
1.4. Sinh trưởng và phát triển ... 7
1.5. Điều kiện sinh thái ... 8
1.6. Thành phần dinh dưỡng, giá trị kinh tế và sử dụng ... 9
1.7. Kĩ thuật trồng và chăm sóc ... 9
2. Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật trong công tác giống cây trồng 11 2.1. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật ... 11
2.1.1. Định nghĩa ... 11
2.1.2. Khả năng sử dụng nuôi cấy mô và tế bào thực vật vào công tác giống cây trồng ... 12
2.1.3. Cơ sở sinh học của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật ... 12
2.1.3.2. Sự phản phân hóa và phân hóa của tế bào ... 13
2.2. Nhân giống vô tính in vitro ... 16
2.2.1. Ý nghĩa ... 16
2.2.2. Quy trình nhân giống vô tính in vitro ... 17
2.2.3. Các phương thức nhân giống in vitro ... 19
2.3. Môi trường nuôi cấy ... 20
2.3.1.Thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy ... 20
2.3.2 Chuẩn bị môi trường ... 24
3. Tình hình nghiên cứu qui trình nhân giống vô tính khoai môn sọ (Colocasia esculenta) bằng tạo củ in vitro trên thế giới và ở Việt Nam ... 26
3.1. Tình hình nghiên cứu tạo củ in vitro ở khoai môn sọ trên thế giới .... 26
Trong đề tài này đã nghiên cứu được những vấn đề sau: ... 26
3.1.1. Giới thiệu... 26
3.1.2. Phương pháp ... 27
3.1.3 Phương pháp thu củ và thống kê ... 28
3.1.4. Bảo quản và trồng củ ... 28
3.1.5. Kết quả ... 29
3.1.5.1. Ảnh hưởng của môi trường tạo củ lên sự hình thành củ trong ống nghiệm ... 29
3.1.5.2. Ảnh hưởng của phương pháp nuôi cấy lên sự hình thành củ ... 30
3.1.5.3. Sự phát triển của củ trong ống nghiệm ... 30
3.1.5.4. Bảo quản và trồng ra vườn ... 31
3.2. Tình hình nghiên cứu tạo củ in vitro khoai môn sọ ở Việt Nam ... 31
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 33
1. Vật liệu nghiên cứu ... 33
2.1. Thí nghiệm xác định công thức khử trùng thích hợp cho mẫu
nuôi cấy ... 34
2.2. Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp của mẫu cấy. ... 36
2.3. Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hệ số nhân nhanh chồi. ... 37
2.4. Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự ra rễ ... 37
2.5. Thí nghiệm xác định môi trường thích hợp cho tạo củ in vitro ... 38
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 40
1. Kết quả nghiên cứu xác định công thức khử trùng thích hợp ... 40
2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp của mẫu cấy ... 43
3. Nghiên cứu sự ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hệ số nhân nhanh chồi ... 47
4. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự ra rễ của cây in vitro ... 50
5. Kết quả nghiên cứu môi trường tạo củ in vitro thích hợp ... 53
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ... 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO ... 61