TRƯỜNG DAI HOC CAN THO
KHOA NONG NGHIEP VA SINH HOC UNG DUNG BO MON THU Y
LE PHUC NHU AN
Trang 2TRUONG DAI HQC CAN THO
KHOA NONG NGHIEP VA SINH HOC UNG DUNG BO MON THU Y
LUAN VAN TOT NGHIEP NGANH THU Y
SO SANH KHA NANG KHANG KHUAN CUA CAC DONG CO CUT LON
(Ageratum conyzoides L.)
Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:
PGS.TS Huỳnh Kim Diệu Lê Phúc Như An
MSSV: 3092651
Lớp: Thú y K35
Cần Thơ, tháng 12/2013
Trang 3TRUONG DAI HQC CAN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y
Đề tài “So sánhkhá năng kháng khuẩn của các dòng Cỏ cứt lợn (Ageratum conyzoides L)”do sinh viên Lê Phúc Như An thực hiện tại phòng thí nghiệm Dược lý thú y, Bộ môn Thú y, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ từ tháng 8/2012 đến tháng 11/2012
Cần Thơ, ngày tháng năm Cần Thơ, ngày tháng năm Duyệt của Bộ Môn Duyệt của Giáo viên hướng dẫn
Cần Thơ, ngày tháng năm
Trang 4LỜI CÁM ƠN
Trải qua những năm tháng học tập và rèn luyện dưới mái trường Đại Học
Cần Thơ Thầy cô là người đã dành bao tâm huyết cho sự nghiệp trồng người,
đã trang bị những hành trang quí báu cho chúng tôi vững bước vào đời Nhờ sự yêu thương chỉ bảo của thầy cô cùng với sự phấn đấu cúa bản thân, hơm
nay tơi đã hồn thành luận văn tốt nghiệp
Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn thành kính nhất đến ba mẹ và gia đình
của tôi, những người đã vượt khó khăn để nuôi tôi khôn lớn và trưởng thành
như ngày hôm nay
Xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Cần Thơ, Ban
Chủ Nhiệm Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, quý thầy cô Bộ môn
Thú Y và Bộ môn Chăn nuôi - Thú y đã tận tình giảng dạy, giúp đỡ tôi trong
suốt thời gian học tập
Xin chân thành cảm ơn cô Huỳnh Kim Diệu, đã theo sát hướng dẫn tận tình trong quá trình thực hiện nghiên cứu, đã chỉ dẫn nhiệt tình, cung cấp
những kiến thức cần thiết để hoàn thành đề tài này Xin cảm ơn Cô Nguyễn
Thị Bé Mười, Cố vấn học tập lớp Thú Y K35B, người thầy luôn hết mình quan tâm, lo lắng và giúp đỡ sinh viên chúng tôi trong suốt quá trình học tập
Xin cảm ơn các anh chị học viên cao khóa 18, cảm ơn Chị Nguyễn Thị
Hàn Niđã nhiệt tình giúp đỡ, chia sẽ, động viên tôi thực hiện đề tài
Các bạn lớp Thú Y K35 đã nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ nhau trong quá
trình thực hiện nghiên cứu
Lời cuối, xin được chúc các Thay, Cô của Bộ Môn Thú Y và Bộ Môn
Chăn Nuôi - Thú Y luôn công tác tốt và tìm được niềm vui trong công
việc.Chúc các bạn lớp Thú Y K35A, Thú Y K35B, Thú Y LT37 sẽ thành công
sau khi tốt nghiệp
Xin chân thành cảm ơn
Trang 5MỤC LỤC TRANG DUYỆTT 55-25-44 HH TH H001471414104 144180130 i LOI CAM ON ii MỤC LỤC se viii DANH SÁCH HÌNH uv DANH SÁCH BANG vi DANH SACH TU VIET T TÓM LƯỢC viii CHUONG 1 DAT VAN DE 1 CHUONG 2 CO SO Li LUAN 2 2.1 SO LUGC VE CAY CO CUT LON 2 2.1.1 Phân loại -. - 2 2.1.2 Đặc điểm hình thái 2 2.1.3 Phân bố sinh thái 3 2.1.4 Bộ phận dùng 3 2.1.5 Thành phần hóa học c¿+22EEE2222+++222EE2222222222221222e tre 3 2.1.6 Tac ion 3 2.1.7 Tính vỊ 3
2.1.8 Công dụng và liều dùng 22222cc+222E12222.22211112e 11 Xe, 2.1.9 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nưỚC - - 55s 5++x+c++
2.2 GIGI THIEU MOT SO VI KHUAN GÂY BỆNH
2.2.1 Nhóm vi khuân Gram đương -+++22222EEEEEE222222222zerrrrrrre
2.2.2 Nhóm vi khuẩn Gram âm -2-©22+2+2EEE22EEEE22EE1E222E12222152222152Exe2 7
2.2.3 Nhém vi khuan Edwardsiella se
CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 3.1 THỜI GIAN, ĐỊA ĐIÊM VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 13
3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU -2- 2 -2+s+Ex+zxz+rzrse 3.3 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
kE6ÑÐ 0i +“—.LHĂHĂ) 3.3.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 13
3.3.3 Các giống vi khuẩn dùng trong nghiên cứu -se 13
3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU -2¿©2£©S2+£E+££Ez+Exzzrszzrx 14
3.4.1 Điều chế cao thô -+22EE+222++222EEE222222222EEEEeccee 14 3.4.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của Cỏ cứt lợn 16 3.5 CHỈ TIÊU THEO DÕI TH HH HH HH ng
3.6 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SÓ LIỆU
CHƯƠNG 4 KÉT QUÁ THẢO LUẬN -2222222222222vcccccrrrrrree
Trang 7DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1 Cay Co cttt lon(Ageratum conyzoides L.) -.-cc-ceccccceceereerkere 2 Hình 3.2 Quy trình chuẩn độ vi khuẩn
Hình 3.3 Sơ đồ qui trình xác định MIC cao chiết thơ 2 2- 22 ©se+xezz+ 19
Hình 4.1 Mẫu đối chứng của 6 chủng vi khuẩn
Hình 4.2 Mẫu đối chứng của 2 chủng vi khuẩn gây bên trên thủy sản
Hình 4.3 Kết quả nồng độ ức chế MIC = 128 g/ml cua vi khuan Edwardsiella ictaluri (7) va Edwardsiella tarda (8) ecc«ccseeeeerreeeerierrriirrrirrke 28 Hình 4.4 Kết quả nồng độ ức ché MIC = 512 pg/mlvi khuan Staphylococcus
aureus(2)
Hinh 4.5 Kết quả nông độ ức chê MIC = 1024 ng/mlvi khuân S/aphyÏococcus
Trang 8DANH SÁCH BÁẢNG
Bảng 4.1 Hiệu suất chiết xuất cao Cỏ cứt 0
Bang 4.2 Nong độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với vi khuẩn của dòng CCL 1 Bang 4.3 Nong độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với vi khuẩn của dòng CCL 2 Bảng 4.4 Nồng độ ức chế tối thiêu (MIC) đối với vi khuẩn của dòng CCL 3
Bang 4.5 So sánh nồng độ ức chế tôi thiểu của Cỏ cứt lợn - Bảng 4.6 So sánh khả năng kháng khuẩn của 3 dòng Cỏ cút lợn
Bảng 4.7 So sánh hiệu quả Cỏ cứt lợn trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm
Trang 9Chữ viết tắt DMSO ĐC MIC MHA NA DM RAPD CFU CCL A hydrophila E coli E ictaluri E tarda P aeruginosa S aureus S faecalis Sal spp DANH SÁCH TU VIET TAT Giai thich Dimethyl sulfoxide Đối chứng
Minimum Inhibitory Concentration
Muller Hinton Agar Nutrient Agar Dry matter
Random Amplified Polymorphic DNA
Trang 10TÓM LƯỢC
Đề tài “So sánh khả năng kháng khuẩn của các dòng Có cút lợn (Ageratum
conyzoides L.)” 3 dòng Cỏ cứt lợn được ly trích bằng methanol 5 ngày (lần 1 trong 3 ngày, lần 2 thực hiện trong 1 ngày, lần 3 thực hiện trong 1 ngày)thu
cao để thử khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp pha loãng trên thạch, xác định nồng độ ức chế tối thiéu MIC (Minimum Inhibitory Concentration)
trên 8 chủng vì khuẩn gây bệnh trên gia súc, gia cẩm và thủy sản
(Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Escherichia coli, Salmonella
spp., Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Edwardsiella ictaluri, Edwardsiella tarda) Sau thời gian nghiên cứu, chúng tôi thu được kết quả
sau:hiệu suất chiết xuất của Cỏ cứt lợn cao nhất ở dòng 3 là 4,02% và thấp
nhất là dòng 1 là 3,81% Hoạt tính kháng khuẩn của cao Có cứt lợn tốt nhất
trên 2 chủng Edwardsiella ictaluri và Edwardsiella tarda (128 ug/ml < MIC <
512 ug/ml), ức chế tốt nhất là dòng 2 và dòng 3 Kế đến, trên vi khuẩn
Staphylococcus aureus (512 ug/ml < MIC < 1024 ug/ml), tot nhat la dong 1
va dong 3 Trén Streptococcus faecalis, Cé ctet lon tec ché voi nong độ trong
khoảng 1024 ug/ml < MIC < 4096 ug/ml (ec ché tốt nhất là dòng 3) Trên 2
chủng vi khuẩn, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila với nông độ
trong khoảng 2048 ug/ml < MIC < 4096 ug/ml (déng 2 va dòng 3 ức chế tot nhất, dòng 1 ức chế yếu nhất) Dòng 2 và dòng 3 cao Cỏ cứt lợn ức chế
totnhat đối với Escherichia coli ở nông độ MIC = 2048 pg/ml va Salmonella spp 6 néng d6 MIC = 4096 ngíml, và dòng 1 không ức chế 2 vi khuẩn ở nỗng
độ 4096 ug/ml Trong 3 dòng Cỏ cứt lợn thì dòng 3 có hoạt tính kháng khuẩn tot nhất, tiếp theo là dòng 2 và yếu nhất là dòng 1
Từ khóa: Có cứt lợn, khả năng kháng khuẩn
Trang 11CHƯƠNG 1
DATVANDE
Xã hội ngày càng phát triển, cuộc sống ngày càng được nâng cao, nên con người phải cần nhiều yếu tố dé đáp ứng chất lượng cuộc sống, trong đó
các sản phẩm từ ngành chăn nuôi đóng vai trò quan trong Vi vậy ngành chăn
nuôi cũng phải phát triển tương xứng với sự phát triển của xã hội.Để ngành
chăn nuôi đạt hiệu quá thì việc phòng trị bệnh là không thê thiếu.Từ thực tế
đó, các nhà khoa học đã tìm ra nhiều phương pháp để nâng cao hiệu quả
phòng và trị bệnh ở vật nuôi, điều đó không thể không kế đến việc sử dụng
kháng sinh Việc lạm dụng kháng sinh để chữa bệnh và kích thích tăng trưởng dẫn đến sự tồn dư lượng kháng sinh trong sản phâm chăn nuôi, thủy sản cũng
như hiện tượng kháng thuốc là một vấn đề nan giải Sự tồn dư kháng sinh
trong sản phẩm động vật gây thiệt hại rất lớn đối với việc xuất khẩu ở nước ta và quan trọng là ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe con người Do đó, một hướng
đi mới là sử dụng thảo dược phòng trị bệnh thay thế việc sử dụng kháng sinh, trong đó có cây Cỏ cứt lợn có được tính kháng khuẩn tự nhiên
Cỏ cứt lợn là một trong những cây có vị thuốc dùng đề điều trị bệnh trong dân gian như trị viêm xoang, chống viêm, chống dị ứng, chống phù nề
Trang 12CHƯƠNG 2 CƠ SỞ LÍ LUẬN 2.1 SO LUGC VE CAY CO CUT LON
2.1.1 Phan loai
Tén khoa hoc: Ageratum conyzoides L Ho: Asteraceae (Clic)
Tên khác: câu bù xích, cỏ hôi, cúc hôi, cỏ cứt heo (Đỗ Tất Lợi, 2004)
Tên nước ngoài: white weed, goat weed, bastard arimony (Anh), agérate
conyzoide (Phap)
2.1.2 Dac diém hinh thai
Cỏ sống hàng năm, thân có nhiều lông nhỏ, mềm, cao chừng 25 — 50 em Lá đối xứng hình trứng hoặc ba cạnh, dài 2 — 6 em, rộng l — 3 cm, mép có hình răng cưa tròn, hai mặt đều có lông Hoa nhỏ, màu tím xanh.Quả màu đen, có năm sống dọc (Đỗ Tắt Lợi, 2004)
Theo Đỗ Huy Bichva ctv.(2004), than Co cứt lợn có lông mềm, màu lục
hoặc tím đỏ.Hai mặt lá có lông mịn, vò lá có mùi đặc biệt Cụm hoa hình đầu xếp thành ngũ ở ngọn thân hoặc đầu cành, cụm hoa có lông mềm, tổng bao
hình đầu gồm những lá bắc xếp thành hai đầu, đầu nhỏ chứa toàn hoa hình ống
Trang 132.1.3 Phân bố sinh thái
Chi Ageratum L có khoảng 45 loài trên thế giới, hầu hết là cây nhỏ,
phân bố ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới.Cỏ cứt lợn có nguồn gốc ở châu Mỹ, sau phát tán ra khắp các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới.Ở Việt Nam, cây phân bố khắp nơi từ vùng núi cao trên 1500m đến các tỉnh vùng trung du và cả ở
đồng bằng.Cây thường mọc ở các nương ngô, bãi sông, ven đường và trong
vườn Cây con được mọc lên từ hạt, hạt có tũm lông và phát tán nhờ gió (Đỗ
Huy Bich va ctv., 2004)
2.1.4 Bộ phận dùng
Toàn cây, lá và rễ (Đỗ Huy Bích và c#., 2004)
2.1.5 Thành phần hóa học
Cỏ cứt lợn Việt Nam chứa tỉnh đầu (0,7 — 2%), carotenoid, phytosterol (íÐ, tannin, đường khử saponin (hàm lượng trong thân và lá là 4,7%), chất uronic Ngoài ra một số hợp chất hóa học chứa alkaloid, flavonoid, chromenes, benzofurans và tepenoid cũng được phân lập từ loài này (Đỗ Huy Bích và c#.,
2004)
Theo Adowole (2002), lượng tỉnh dầu có trong lá (0,11 — 0,58%), rễ
(0,03 — 0,18%), nước chưng cất từ hoa tươi (0,20%), chiết xuất ether của hạt giống (0,26%).Tinh dầu có 51 thành phần, trong đó thành phần chủ yếu là
precocene Ï, precocene II và caryophyllen (có hiệu quả chống lại hai loại nắm Penicillin chrysogenum va Penicillin jaanicum và ức chễ sự phát triển của vi
khuẩn) Ba thành phần này chiếm 77% tỉnh dầu (Ling Chau Ming, 1999)
2.1.6 Tác dụng dược lý
Cỏ cứt lợn có tác dụng chữa viêm xoang mũi dị ứng (Đã Tat Loi, 2004)
Trên một số động vật thí nghiệm có tác dụng chống viêm ở giai đoạn cấp tính
và bán cấp tính, giảm phủ, gây teo tuyến ức Những thí nghiệm chứng tỏ Cỏ
cứt lợn có tác dụng gây teo tuyến ức ở chuột và đối kháng với tác dụng gây co bóp ruột cô lập của histamin trên chuột lang Ở nồng độ thấp, Cỏ cứt lợn có tác dụng gây giãn mạch ngoại biên, nồng độ cao có tác dụng co mạch nhẹ (Đỗ
Huy Bich va ctv., 2004) 2.1.7 Tinh vi
Theo Đông y, Cỏ cứt lợn có vị cay, đắng, tính mát, tác dụng thanh nhiệt, giải độc, sát trùng, tiêu thũng, trục ứ, dùng chữa cảm mạo, mụn nhọt
Trang 142.1.8 Công dụng và liều dùng
Theo Đỗ Tắt Lợi (2004), Cỏ cứt lợn có các công dụng sau: lá và ngọn non vò kỹ, rửa sạch tới khi hết bọt, luộc bỏ nước, vắt kiệt nước, xào hoặc nấu canh với mắm tôm, cá Phần cây trên mặt đất có tinh dầu chứa phenol được sử
dụng làm thuốc Thường chống phù nề, chống dị ứng trong các trường hợp: số mũi, viêm xoang mũi dị ứng cấp và mãn, chảy máu ngoài do chấn thương, bi
thương sưng đau, mụn nhọt, ngứa lở, eczema Liều dùng: 15 - 30 cây sắc nước uống, hoặc dùng cây tươi giã đắp vết thương chảy máu, mụn nhọt,
eczema hoặc nấu nước tắm ghẻ, chốc đầu
Theo Đỗ Huy Bích và c# (2004), nghiên cứu:Cỏ cứt lợn có tác dụng điều trị viêm mũi, xoang mãn và viêm mũi xoang dị ứng Không gây tác dụng
phụ gì đối với cơ thể người bệnh, trừ tác dụng gây sốt trong thời gian ngắn khi
nhỏ mũi.Nhân dân thường dùng cây Co cut lon lam thuốc chữa bệnh phụ nữ bị rong huyết sau khi sinh nở Liều dùng: hái chừng 30 — 50g cây tươi, rửa sạch, giã nát, vắt lấy nước, chia 3 lần uống trong ngày Uống liên tục 3 - 4
ngày.Ngoài ra còn có thể phối hợp với bồ kết gội đầu vừa thơm vừa sạch gàu, trơn tóc Lá Cỏ cứt lợn làm thuốc đắp chữa vết thương phần mềm.Ở Ấn Độ, lá Cỏ cứt lợn được dùng làm thuốc chữa vết đứt, vết thương và lở loét.Trong y học dân gian Nepan, nước ép rễ cây Cỏ cứt lợn được dùng đề chữa bệnh sỏi
thận Lá làm thuốc săn da, chữa vết thương lở loét
Ngoài ra còn có cách dùng: chọn lấy cây tươi về ngâm rửa sạch rồi để ráo, giã nát, vắt lấy nước tâm vào bông Dùng bông này nhét vào lỗ mũi bên
đau khoảng 15 - 20 phút.Rút bông ra đề dịch mủ từ trong xoang và mũi được giải phóng ra ngoài rồi xì nhẹ nhàng Tránh xì mũi mạnh vì lúc đó, mủ từ
trong mũi xong có thể đi qua đường nối thông giữa mũi và tai (gọi là vòi nhĩ)
gây viêm tai giữa cấp (http://www.khoahoc.com.vn/doisong/yhoc/suc-
khoe/469 1 Chua-viem-xoang-bang-cay-hoa-cut-lon.aspx)
Cỏ cứt lợn có tác dụng giãn cơ, giảm đau hiệu quả và được sử dụng phổ
biến trong điều trị bệnh thấp khớp.Tại Brazil, chiết xuất Cỏ cứt lợn đượcthử
nghiệm trên các bệnh nhân bị viêm khớp: 66% giảm đau và giảm viêm; 24% cải thiện khả năng vận động sau một tuần điều trị mà không có tác dụng phụ
(http://www.rain-tree.com/ageratum.htm#.UqPh4NL30¢e0) 2.1.9 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
Precocene I và precocene II (thành phần chính trong tinh dầu Cỏ cứt lợn) có hiệu quả chống lại hai loại nắm Penicillin chrysogenum va Penicillin
jaanicum và ức chễ sự phát triển của vi khuân (Adowole, 2002)
Trang 15Theo Osho et al (2011), sử dụng phương pháp khuyếch tán và nồng độ ức chế tối thiểu để nghiên cứu sự nhạy cảm của vi khuẩn và nắm men với tinh
dầu từ thân, lá, rễ của Cỏ cứt lợn Các nồng độ ức chế tối thiểu dao động từ 2,0
— 4,0 mg/ml cho thấy các vi khuẩn thử nghiệm (Bacillus subiilis, Klebsiella
pneumoniae, Staphylococcus aureus, Candida albicans) déu nhạy cảm với tinh dau tir thân, lá, rễ của Cỏ cứt lợn, trừ vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
là không nhạy cảm với tinh dầu từ thân, lá, rễ của Cỏ cứt lợn
Theo Lin Chau Ming (1999), chiết xuất Cỏ cứt lợn từ ether và
chloroform ttc ché su phat trién in vitro cha vi khuan Staphylococcus aureus Chiết xuất toàn cây Cỏ cứt lợn từ methanol ức chế sự phát triển của
Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli
Nghiên cứu in vitro da ching minh rang chiết xuất của Cỏ cứt lợn có khả
năng kháng khuẩn chống Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, va Pseudomonas aeruginosa Cac nha khoa hoc cting da phat
hiện ra rằng Cỏ cứt lợn có tác dụng diệt côn trùng bằng cách can thiệp vào chu kỳ sinh sản của nhiều lồi cơn trùng Nghiên cứu độc tính cấp và mãn tính đã
được thực hiện ở Brazil với chuột và các nhà nghiên cứu báo cáo rằng Có cứt
lợn không độc ở tất cả các liều thử nghiệm(Saxena et al., 1992) 2.2GIOI THIEU MOT SO VI KHUAN GAY BỆNH
2.2.1 Nhóm vi khuẩn Gram dương
2.2.1.1 Vikhuan Staphylococcus aureus (S aureus)
Tụ cầu khuẩn là vi khuẩn hình cầu, tụ lại từng đám giống hình chùm nho,
có đường kính 0,7 — 1m, không di động, không sinh nha bào, vi khuẩn có thể
gây nhiều biểu hiện khác nhau như các nhiễm trùng của da, tổ chức dưới da,
hoặc trong các cơ quan nội tạng, gây mưng mủ điển hình, một số trường hợp
chuyền sang chứng huyết nhiễm trùng, chứng bại huyết (Nguyễn Vĩnh Phước,
1977) S aureuslà loài gây bệnh thường gặp nhất, khi có những tổn thương
trên da và niêm mạc hoặc những rối loạn về chức năng thì các nhiễm trùng do
S aureusdé dang xuất hiện.S aureus là nguyên nhân gây viêm xoang, viêm
amydale, viêm vú cho người (Trần Thị Phận, 2000)
Sức đề kháng: do vikhuẩn không sinh nha bào nên có sức đề kháng kém với tác nhân lý hóa Vi khuẩn chết ở 70°C trong 1 giờ, ở 80°C trong vòng 10 —
30 phút, đun sôi 100°C vài phút vi khuẩn mới chết Vi khuẩn chết với tác dụng
của thuốc sát trùng: axit fenic 3 — 5% giết vi khuẩn trong 3 — 15 phut, HgCl,
Trang 161/300000 có thể ngăn được tạp vi khuẩn phát triển (Nguyễn Vĩnh Phước,
1977)
Tính kháng thuốc: đa số tụ cầu kháng lai penicillin G do vi khuẩn này
sản xuất được men penicillinase Một số còn kháng lại được methicillin (MRSA: methicillin resistantStaphylococcus awreus) do nó tạo được các protein gắn vào vị trí tác dụng của kháng sinh (Lê Huy Chính, 2007).Theo
Nguyễn Thị Kê và c (2006), khảo sát tính đề kháng kháng sinh tại Thành
phố Hồ Chí Minh năm 2005 cho thấy các chủng S.zure„s phân lập từ bệnh
phẩm có đến 94,1% chủng kháng penicillin, 52,9% kháng ciprofloxacin, 52% kháng amoxillin và 12,5% kháng getamicin
Tinh sinh độc tố: vikhuân có thể sinh các loại độc tố như độc tố dung
huyết, diệt bạch cầu, gây hoại tử, độc tố đường ruột Ngoài các nhân tố trên
còn thấy những nhân tố gây bệnh sau: men đông huyết tương, chất làm tan tơ
huyết, nhân tố khuyếch tán (Lưu Hữu Mãnh, 2010)
Tính gây bệnh: trong tự nhiên, vi khuẩn làm mưng mủ các vết thương,
nơi xây sát trên da, làm cáctỗổ chức bị sưng, tạo thành ổ mủ (áp xe) Một số
trường hợp gây chứng huyết nhiễm mủ.Trong phòng thí nghiệm, thỏ cảm nhiễm nhất Tiêm canh trùng tụ cầu khuẩn vào tĩnh mạch thỏ thì thỏ chết trong
vòng 1 — 2 ngày vì chứng huyết nhiễm mủ Mổ khám thấy nhiều 6 áp xe trong
phú tạng (Trần Thị Phận, 2000)
2.2.1.2 Vi khuan Streptococcus faecalis (S faecalis)
Liên cầu khuẩn là các cầu khuẩn Gram dương có dạng hình cầu hoặc
hình bầu dục, xếp thành chuỗi đài hoặc ngắn, chiều dài chuỗi tùy thuộc vào điều kiện môi trường, đường kính có khi đến lụ, đôi khi có vỏ, bắt màu Gram
dương, không di động, hiếu khí tùy nghi (Lưu Hữu Mãnh, 2010)
Sức đề kháng: liên cầu khuân có sức đề kháng kém với nhiệt độ và hóa chất Ở 70°C liên cầu chết trong 35 — 40 phút, ở 100°C chết trong 1 phút Chất sát trùng thông thường dễ tiêu diệt được liên cầu khuẩn (Nguyễn Như Thanh
va ctv., 1997)
Tính kháng thuốc: Streptococcus faecaliskhang gentamicin (7%),
streptomycin (21%), gentamicin + streptomycin (22%), tất cả các chung S
faecalis déu nhay cam véi ampicillin (Jonhson et al., 1998).S faecalis duge phân lập ở vết thương cho thấy mức độ mẫn cảm cao với các kháng sinh: ofloxacin (83,7%), penicillin (42,9%), streptomycin (57%), ampicillin
(71,4%), tetracycline (28,6%), amtyo (85,7%) (Vũ Như Quán, 2010)
Tính sinh độc tố: liên cầu khuẩn nhóm A tiết ra độc tố bản chất protein gây ra nốt ban đỏ (liên cầu nhóm B,C ít tiết ra độc tố này) (Nguyễn Như
Trang 17Thanh vd ctv., 1997) S faecalis sinh ngoại độc tố có khả năng dung huyết,
diệt bạch cầu, gây hoại tử, làm tan tơ huyết, gây khuếch tán (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977)
Tinh gây bệnh:liên cầu khuẩn có khắp cơ thể người và động vật, thường
cư trú ở trong họng và ruột Ở người, vi khuẩn gây những chứng nhiễm trùng như mưng mủ ở phủ tạng, tương mạc, bại huyết, mẫn đỏ Ở động vật, vi khuẩn
gây những chứng mưng mủ, bệnh viêm buồng trứng truyền nhiễm (bò sữa),
bại huyết (bê) Trong phòng thí nghiệm, thỏ là động vật dễ cảm thụ nhất Nếu
tiêm liên cầu vào dưới da thỏ sẽ thấy áp xe tại nơi tiêm, nếu tiêm liên cầu vào tĩnh mạch hay phúc mạc, thỏ chết nhanh do nhiễm khuẩn huyết Ngoài ra cũng
có thể gây bệnh trên chuột(Nguyễn Như Thanh và cứ., 1997) 2.2.2 Nhóm vi khuẩn Gram âm
2.2.2.1 Vi khuẩn Escherichia coli (E coli)
Escherichia colila một trực khuân Gram âm, hình gậy ngắn, kích thước 2
—3x0,6 um, hai đầu tròn, trong cơ thể có hình cầu trực khuẩn, đứng riêng lẻ,
đôi khi xếp thành chuỗi ngắn, có lông ở xung quanh thân nên có thé di động,
không sinh nha bào, có thể có giáp mô (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977)
Sức đề kháng: Escherichia colikhông chịu được nhiệt độ, chết khi đun ở
55°C trong 1 giờ, đun sôi 100°C chết ngay Các chất sát trùng thông thường
axit phenic, biclorua thủy ngân, formol, hydropenoxit I”/¿„ diệt vi khuẩn sau 5 phút (Nguyễn Như Thanh và c#w., 1997) Theo Merchant and Packer (1967), trực khuẩn này thường bị phá hủy ở 60°C trong 30 phút, ngoại trừ những
chủng chịu nhiệt có thể tồn tại; 95% của các tế bào bị phá hủy trong 2 giờ bằng cách làm lạnh trong không khí lỏng
Tính kháng thuốc: theo nghiên cứu gần đây của Nguyễn Thị Minh Trang
va ctv (2011), thu hiện trên heo con 1 - 60 ngày tuôi tại tỉnh Trà Vinh đã cho
kết qua, vi khuẩn Escherichia colinhay cam manh voi imipeneme (97,06%),
nhạy cảm tương đối với gentamycin (46,03%), streptomycin (39,68%), ciprofloxacin (38,97%), enrofloxacin (32,35%), clavulanic acid (30,15%)
Theo Phan Trọng Hồ (2001), vi khuẩn đề kháng cao với nhiều loại kháng sinh gồm tetracycline (97,06%), trimethoprim/sulphamethazole (86,51%), colistin (86,51%), florfenicol (80,95%), streptomycin (60,32%), gentamycin (53,17%),
cephalothin (25%).E eoli có khả năng đề kháng với chloramphenicol (86,7%),
penicillin (83,02%), neomycin (11,32%), polymicin B (13,21%), furazolidon
(15,09%)
Tính sinh độc tố: E colicó thé sinh ra hai loại độc tố: nội độc tố phá hủy thành mạch máu, làm tăng huyết áp, ngộ độc thần kinh và ngoại độc tố làm
Trang 18phá hủy thành niêm mạc, hấp thu qua đường bạch huyết gây hoại tử và gây
nhiễm độc thần kinh (Nguyễn Như Thanh và cứv., 1997)
Tính gây bệnh: mặc dù có sẵn trong ruột động vật nhưng chỉ gây bệnh
khi sức đề kháng của con vật kém, chăm sóc quản lí chăn nuôi kém Vi khuẩn thường gây bệnh cho con vật mới đẻ 2 — 3 ngày, có khi từ 4 — 8 ngày, gây bệnh đường ruột cho ngựa, bê, cừu, heo con, gia cầm non Ở động vật lớn, Z coli có thé gây một số bệnh như viêm phúc mạc, viêm gan, thận, bàng quang, túi mật, buồng vú, khớp xương(Nguyễn Vĩnh Phước, 1977) Người ta gọi bệnh Colibacillosis là bệnh đường ruột do # cojj gây ra cho bê, cừu, heo, gia cầm Trong phòng thí nghiệm, tiêm dưới da vi khuân cho chuột bạch, chuột lang, thỏ có thể gây viêm cục bộ, nếu tiêm liều lớn có thể gây sinh ra bại huyết giết chết con vật (Nguyễn Thị Chính và Trương Thị Hòa, 2005)
2.2.2.2 Vi khuan Pseudomonas aeruginosa (P aeruginosa)
Pseudomonas aeruginosa la trực khuân hình gậy, kích thước trung bình 0,5 — 1,0 x 1,5 — 3um, hai đầu tròn, đứng riêng từng đơn vị hoặc từng đôi,
từng chuỗi ngắn, thỉnh thoảng có hình sợi hoặc hình dấu phây, di động, có I đến 3 lông ở đầu, không sinh nha bào, giáp mô, Gram âm, không kháng côn,
kháng toan (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977) P aeruginosa là vi khuẩn hiếu khí và
yếm khí không bắt buộc, mọc ở nhiệt độ từ 30 - 37°C, giới hạn nhiệt độ phát
triển 5 — 42°C, pH thích hợp là 6,6 — 7,0 (Trần Linh Thước, 2006)
Sức đề kháng: vi khuẩn sống rất lâu trong môi trường nuôi cấy và trong thiên nhiên, bị diệt sau khi đun 55°C trong 2 giờ, chết nhanh chóng ở 100°C (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977) Trong mơi trường âm, thống, khơng có ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp, chúng sống được hàng tuần; trong môi trường có
dinh dưỡng tối thiểu, ở 5°C chúng có thê sống hơn 6 tháng (Lê Huy Chính,
2007)
Tính kháng thuốc: P aeruginosa cé tinh kháng mạnh với cefoperazone và
nhóm aminoglycoside (65 — 70%) Khang sinh thông dụng như ceftazidime cũng chỉ còn nhạy cảm khoảng 50% Ngoài ra P aeruginosa cé mang
plasmid-R có khá năng truyền gen kháng thuốc qua trung gian plasmid (Hoàng
Kim Tuyến va ctv., 2005).Theo Tran Linh Thước (2005), Pseudomonas
aeruginosalà vi khuẩn kháng thuốc phô biến, do đó là một loài gây bệnh nguy
hiểm, chỉ còn một số ít kháng sinh có tác dụng với nó như: fluoroquinolone,
gentamycin va imipenem Theo Hossain et al (2013), 100% P aeruginosa
khang voi ampicillin, amoxicillin, tetracycline
Tính gây bệnh: P aeruginosa la nguyén nhan gay bệnh mủ xanh Trong
Trang 19hoại tử, bệnh viêm màng ngoài tim Trong phòng thí nghiệm, vi khuẩn không có độc lực cao đối với động vật thí nghiệm Thỏ, chuột có thể chết do bại huyết, chuột lang có thể có bệnh tích hoại tử hoặc hoại thư sau khi tiêm vi khuẩn dưới da (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977) Ngoài ra, P øeruginosa còn gây
bệnh viêm loét dạ dày trên rắn, viêm phôi và viêm dạ dày ở trăn Vi khuẩn còn
gây bệnh khi sức đề kháng cơ thể yếu như viêm phế quản, viêm màng não, viêm đường tiết niệu, viêm loét trên da, viêm mắt, nhiễm trùng máu (Trần Linh Thước, 2005)
2.2.2.3 Vi khuẩn Salmonella spp
Salmonella spp gây bệnh đường ruột cho người, gia súc và gia cầm gọi
là bệnh thương hàn và phó thương hàn (Nguyễn Như Thanh và c., 1997) Salmonella là một loại vi khuẩn Gram âm, hình gậy ngắn, hai đầu tròn,
kích thước 0,4 — 0,6 x 1,3 um, không hình thành giáp mô và nha bào Đa số
các loai Salmonella đều có khả năng di động mạnh do có tir 7 — 12 lông xung
quanh thân (trừ Salmonella gallinarum — pullorum) Vi khuan Salmonella spp
vừa hiểu khí, vừa yếm khí, dé nuôi, nhiệt độ thích hợp 1a 37°C, pH tir 7,2 — 7,6 (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977)
Stre dé khang: O 60°C truc khuanSalmonella spp bị tiêu diệt trong một
giờ, 70°C trong 20 phút, 75°C trong 5 phút, có thể sinh trưởng trong môi trường thạch ở nhiệt độ 10°C trong 115 ngày Ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp diệt vi khuẩn trong nước sau 5 giờ, trong nước đục sau 9 giờ (Nguyễn
Vĩnh Phước, 1977) Theo Nguyễn Như Thanh và cứ (1997), các chất sát trùng thông thường cũng dễ phá hủy vi khuẩn hoàn toàn: formol 5%, HgCI
1/500 diệt vi khuẩn trong 15 - 20 phút Nhưng đối với một số hóa chất như:
cristal violet, luc malachite, natrihyposunfit, dixitrat, muối mật với những nồng độ vừa đủ gây độc cho EZscherichia colithì không ảnh hưởng tới sự phát triển của Salmonella spp
Tính kháng thuốc: Salmonella spp có khả năng đề kháng với
chloramphenicol (37,4 — 68,1%), tetracycline (33,4 — 59,6%), streptomycin
(74,6 — 89,2%) Những kháng sinh dùng nhiều và rộng rãi thì tỉ lệ kháng thuốc
cao như ampicillin, sulfonamide (Bùi Thị Tho, 2003)
Tính sinh độc t6: Salmonella spp tiét hai loai độc tô đó là nội độc tố (gây
xuất huyết và mụn loét), ngoại độc tố (tác động vào thần kinh và ruột)
(Nguyễn Như Thanh vd ctv., 1997)
Tính gây bệnh: bình thường có thể phát hiện Sø#monelia trong ruột của
bò, lợn, vịt và một số động vật khỏe mạnh Khi điều kiện chăm sóc quản lí
không tốt làm cho sức đề kháng của con vật yếu kém thì vi khuẩn xâm nhập
Trang 20vào nội tạng gây bệnh (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977) Ngoài ra Saửnonella còn
gây nhiễm trùng huyết ở bò cái khi đẻ, gây còi ở bò trưởng thành đang cho sữa
(Soika eí ai., 1974) Trong phòng thí nghiệm, chuột bạch cảm nhiễm nhất, khi cho ăn hay tiêm đều gây bệnh được Chuột lang, thỏ sau khi tiêm dưới da phát sinh phù thủng (Nguyễn Như Thanh và cứy., 1997)
2.2.2.4 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila(A hydrophila)
Aeromonas hydrophila là trực trùng hình gậy ngắn, hai đầu hơi tròn, đầu
có tiên mao, kích thước khoảng 0,5 x 1,0 — 1,5 um, yếm khí tùy tiện (Bùi Quang Té, 2006) Theo Từ Thanh Dung va ctv (2005),Aeromonas hydrophilakhông sinh nha bao, không có giác mạc, di động, là vi khuan Gram
âm Vi khuẩn có tăng trưởng tối ưu ở 28°C, nhưng cũng có thê phát triển từ 4°C đến 37°C Sinh trưởng trong môi trường có độ pH thích hợp 7,1 - 7,2 Những chúng vi khuẩn này phân bố rộng rãi trong môi trường, có thể tim thay
trong đất, nước, thực phẩm và đường ruột của người và động vật (Marcel ,
2001)
Tinh kháng thuốc: 4eromonas hydrophila phân lập từ nước, thịt, cá có tỉ
lệ kháng cao với nhiều loại khang sinh manh nhu ampicillin (100%), tetracycline (26%), oxacillin (100%), bacitracin (100%), streptomycin (26%), clindamycin (43%), nalidixic acid (26%), novobiocin (87%), rifampicin (4%),
vancomycin (9%) (Orozoval et al., 2008) Theo Austin and Austin (1993) va Ti Thanh Dung vd ctv.(2005), diéu tri bằng thuốc doxycycline, hoặc
oxytetracycline; vi khuẩn Aeromonas hydrophila dé khang lai mét loat các
hợp chất kháng sinh, bao gồm ampicillin, chloramphenicol, erythromycin, nitrofurantoin, novobiocin, streptomycin, sulphonamides va tetracycline
Tính sinh độc tố: Aeromonas hydrophila c6 kha nang sinh cdc déc t6
như: độc tổ đường ruột (enterotoxins), độc tố dung huyết (hemolysins), phân
giải protein (proteinase), độc tố hoại tử đa (dermonecrotic), nội độc tố (Cahill,
1990)
Tinh gay bénh:A hydrophila thuong gay bénh nhiém tring 6 nhiéu loài
động vật thủy san nước ngọt Ở Việt Nam các loại cá nuôi lồng, bè, ao nước ngọt thường gặp bệnh đốm đỏ như trắm cỏ, cá chép, cá ba sa, cá tai tượng
Vi khuẩn có thê gây bệnh ở ba ba, cá sấu, bệnh đỏ chân ở ếch, đốm nâu ở tôm
càng xanh Tỷ lệ tử vong ở động vật thủy sản thường từ 30 — 70%, riêng ở cá
giống (ba ba, trê) có thê chết 100% (Bui Quang Té, 2006)
Trang 212.2.3 Nhóm vi khuẩn Edwardsiella
Giống Edwardsiella thuéc ho Enterobacteriaceae, b6 Enterobacteriales, lớp ỞŒœmmaproteobacteria, ngành Proteobacteria Thuong gặp hai loài Edwardsiella ictaluri, Edwardsiella tarda (Bui Quang Té, 2006)
2.2.3.1 Vi khuan Edwardsiella ictaluri
Edwardsiella ictalurilà vi khuân Gram âm, lên men, không oxi hóa, có
dạng hình que, có kích thước biến đổi 1 x 2 — 3 um, phát triển tốt ở 28°C (Từ
Thanh Dung va ctv., 2005) Theo Hawke et al (1981), Edwardsiella ictaluri di động chủ yếu ở 25 — 30°C, không di động ở nhiệt d6 cao hon Catalase duong tính, cytochrom oxidase âm tính và lên men glucose Không sinh HS và
indole 4m tinh
Sức đề khang: Vi khuẩn phát triển được ở độ muối 1,5%, vi khuẩn có
khả năng đề kháng tác động của muối mật Tuy nhiên, khả năng chịu đựng
nồng độ muối cao lại kém (Waltman e¿ ai., 1985) Theo Austin and Austin (1993), vi khuân bị ức chế bởi các loại thuốc bao gồm cefaperazone,
cinoxacin, kanamycin, moxalactam, neomycin, nitrofurantoin, axit oxolinic,
streptomycin, ticarcillin va trimethoprim Tuy nhién, qua trung gian plasmid đã kháng lại chất kháng khuẩn như tetracycline
Tinh khang thuéc: E ictalurinhay cam cao v6i oxacillin va kha nang kháng tự nhiên với benzylpenicillin Ching E ictaluri duoc chimg minh 1a dé
ức chế bởi benzylpenicillin hon hầu hết các loài vi khuẩn đường ruột khác
(Stocke a/., 2001) Vi khuẩn Edwardsiella ictaluriđã có hiện tượng kháng với
khang sinh streptomycin, oxytetracycline và trimethoprim Đặc biệt có 73%
tong số chủng đa kháng với ít nhất 3 loại kháng sinh và vi khuẩn này bắt đầu
có hiện tượng kháng với nhóm quinolone như: flumequin, oxolinic acid và enrofloxacin (Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, 2012)
Tính gay bénh: E ictaluri gây bệnh nhiễm khuẩn trong các cơ quan nội
tạng, tụy, thận của cá không vấy (cá tra, cá ba sa, cá nheo giống, cá thịt) (Bùi
Quang Tè, 2006) Là tác nhân chính gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam, chủ yếu ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long Bệnh thường xuất hiện vào mùa lũ cao điểm khoảng tháng 7 - 8 (Tu Thanh Dung vd ctv., 2005)
2.2.3.2 Edwardsiella tarda
Edwardsiella tarda la vi khuan Gram âm, kính thước 1 x 2 - 3 um, di
động bằng tiên mao, ky khí tùy nghỉ, nhiệt độ phát triển thích hợp là 25 —
30°C Catalase dương tinh, oxidase 4m tính Sinh H;S va indole dương tinh
(Heath, 2001)
Trang 22Sức đề kháng: Edwardsiella tardacó thê phát triển ở nồng độ muối từ 1,5 — 3% va nhiệt độ 25 - 35°C Ở nhiệt độ 37°C vi khuẩn có sức đề kháng kém (Bui Quang Té vd ctv., 2004)
Tinh khang thuéc: Edwardsiella tarda mẫn cảm với các chất kháng sinh
tetracycline, aminoglycoside, kháng sinh ÿ-lactam, quinolone, chloramphenicol Zdwardsiella tarda có khả năng kháng tự nhiên với benzylpenicillin, oxacillin, macrolides, lincosamides, sfreptogramins,
glycopeptides, rifampin Edwardsiella tarda ctingkhang colistin (Stock et al., 2001)
Tính gây bệnh: Edwardsiella tarda \a nguyén nhan gây bệnh nhiễm khuẩn ở cá nước ấm, đặc biệt là cá không vây, được phân lập từ cá trê giống
(Bui Quang Té vd ctv., 2004) Edwardsiella tarda gay viém dai tràng, bệnh ly,
viém da day, rudt, nhiém trùng vết thương, hoại tử niêm mạc, nhiễm trùng
huyết và bại não (Janda er ai., 1993) Ngoài ra, vi khuẩn có tính chất gây
ngưng kết hồng cầu (Sakai, 2003)
Trang 23_CHUONG3 | —
PHUONG TIEN VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU
3.1 THOI GIAN, DIA DIEM VA DOI TUQNG NGHIÊN CUU
Thời gian: từ tháng 8/2013 đến thang 11/2013
Địa điểm trồng để lấy mẫu phân tích: quận Ninh Kiều, thành phố Cần
Thơ
Địa điểm thực hiện thí nghiệm: Phòng thí nghiệm Dược Lý (E009) Khoa Nông Nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường ĐHCT
3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CUU
Điều chế cao thô
Hiệu suất chiết suất cao thô
Khả năng kháng khuẩn của 3 dòng Cỏ cút lợn
3.3 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
3.3.1 Nguyên liệu
Gồm 3 dòng cây Cỏ cứt lợn từ kết quả đánh giá sự đa dạng di truyền của cây Cỏ cứt lợn bằng phương pháp phân tích phổ điện di RAPD (Random
Amplified Polymorphic DNA, la phuong phap phan tich AND khuyéch dai ngẫu nhiên, và được dùng đề nghiên cứu sự khác biệt di truyền của loài khác
nhau) của Nguyễn Thị Hàn Ni (2013)
Bộ phận dùng: sử dụng lá
3.3.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
Thiết bị: tủ sấy dụng cụ thủy tinh (Classware Drying Oven), tủ ấm
(Incubator), may loc chan khéng, autoclave, máy cô quay chân không, tủ sấy,
cân điện tử
Dụng cụ: ống pipette, ống micropipette, đèn cồn, bình nón, phễu, đũa
thủy tỉnh, đĩa petri, que cấy, ống nghiệm, ống đong (100ml, 50ml, 10ml), chai nấu môi trường
Hóa chất: Methanol, dung môi DMSO, môi trường MHA (Muller Hinton
agar), NA (Nutrient agar); cồn 70°, cồn 90°; BaCl;.2H;O, H;SO„, NaCl 0,9%, nước cất
Trang 24Các chủng vi khuẩn dùng trong thí nghiệm có nguồn gốc từ Viện Pasteur
thành phô Hồ Chí Minh bao gôm:
Chung Staphylococcus aureus 081008
Ching Streptococcus faecalis 010408 Ching Escherichia coli101008
Chung Pseudomonas aeruginosa 111008
Ching Aeromonas hydrophila 011004
Chung Edwardsiella tarda 280208 Chung Salmonella spp 291003
Chủng Eđwardsiella icfaluriCFA 258 — An Giang, 2006 (thuộc bộ sưu
tap vi khuẩn của Bộ môn Sinh học và bệnh học thủy sản — Khoa Thủy sản —
Đại Hoc Can Tho)
3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1 Điều chế cao thô
3.4.1.1 Cách thu mẫu
Lá Cỏ cứt lợn được thu hái vào buổi sáng (khoảng 8 — I0 giò), rửa sạch đất bùn, vết sâu hại, nắm ký sinh và loại bỏ những tạp chất khác
3.4.1.2 Cách chiết xuất cao thô
Sau khi Cỏ cứt lợn được sấy khô ở 50°C cho đến khi khô giòn, mẫu khô
đem nghiền nhỏ và ngâm chiết bằng dung môi methanol ở nhiệt độ phòng
trong 3 ngày, lọc lấy dịch chiết, tiếp tục thêm dung môi methanol ngâm trong
1 ngày (lặp lại 2 lần) Sử dụng máy côquay chân không ở nhiệt độ 40°C để cô
đặc dịch chiết, tạo ra cao thô Sản phẩm thu được là cao thuốc sử dụng trong thí nghiệm thử hoạt tính kháng khuẩn (Nguyễn Văn Đàn và Nguyễn Viết Tựu,
1985)
Quy trình chiết xuất cao thô được mô hình hóa ở hình 3.1
Trang 25Mẫu tươi v Sấy 50°C, nghiền mịn Ngâm và chiết Ngâm và chiết Ngâm và chiết
methanol (lan 1) Methanol (lan 2) Methanol (lan 3)
Ngam methanol Ngam methanol Ngaém methanol trong 72 gid trong 24 gid trong 24 gid
Vv Vv Vv
Dich chiét Dich chiét Dich chiét
Trang 263.4.1.3 Tính hiệu suất chiết xuất cao
Cao Cỏ cứt lợn sau khi cô quay được tính hiệu suất theo công thức sau:
HS =—”®%—x100
THImẫu tươi
HS: hiệu suất chiết xuất (%)
m.¿o: khôi lượng cao sau cô quay (g)
mậu tượi: khôi lượng mâu tươi (ø)
3.4.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của Cỏ cứt lợn
Xác định nồng độ ức chế tối thiểu theo phương pháp pha loãng trong thạch (Nguyễn Thanh Bảo và c/v., 2005)
3.4.2.1 Chuẩn độ đục
Sử dụng thang độ đục Mac Farland 0,5 được pha chế như sau: cho 0,05 ml BaCl, 0,048M (1,175% BaCl;.2H;O) vào 9,95 mi H;SO¿, sau đó khuấy
liên tục đề tạo huyễn dịch
Điều chỉnh độ đục của huyễn dịch sao cho mật độ quang khi đo ở bước
sóng 625 nm nằm trong khoảng 0,08 — 1,10
Chọn ống nghiệm có cùng kích thước với các ống nghiệm đùng chuẩn độ
vi khuân, cho vào ống nghiệm đó 4 — 6 ml huyễn dịch, đậy nút chặt
Chuẩn độ đục được bảo quản ở nhiệt độ phòng và để trong bóng tối,
trước khi sử dụng phải lắc mạnh để huyén dich phan tan đều trở lại Nếu thấy
lợn cợn phải loại bỏ Hàng tháng phải kiểm tra lại độ hấp thu (Trương Công Quyén vd ctv., 1986)
3.4.2.2 Chuẩn độ vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn gốc được nuôi cấy tăng sinh riêng trên môi trường
NA Môi trường NA được pha, hấp vô trùng ướt và cho 15ml vào mỗi đĩa petri
đã được vô trùng 180°C, sau đó ủ ở nhiệt độ 28 — 30°C trong 24 — 48 giờ đối
với chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Edwardsiella tarda, ủ ở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ đối với chủng vi khuẩn: Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus faecalis,
Salmonella spp., Aeromonas hydrophila
Dung que cay đã được tiệt trùng, lay lần lượt từng khuẩn lạc mọc trên
đường cấy cho chúng vào các ống nghiệm chứa 9 ml dung dich NaCl 0,9% (đã hấp tiệt trùng ở 121°C trong 15 phút) Tiếp đó, lắc đều các ống này để vi
khuẩn phân bố đều trong dung dịch tạo nên dung dịch Điều chỉnh độ đục của các ống nghiệm bằng cách thêm từng khuẩn lạc sao cho giống độ đục của Ống
Trang 27MacFarland 0,5, được các ống canh khuẩn nồng độ 10CFU/ml Huyễn dịch vi
khuẩn được pha loãng 100 lần đề có mật độ vi khuẩn đạt 105 CFU/ml (Nguyễn Hữu Bảy và cứ., 1986)
Các ống chuẩn độ vi khuẩn này được dùng để xác định MIC của các loại cao thử nghiệm VI khuẩn sau khi điều chỉnh độ đục được sử dụng trong 15 phút, và được lắc lên trước khi sử dụng
Quy trình chuẩn độ vi khuẩn được tóm tắt ở hình 3.2
Vi khuẩn
Cây chuyền vi khuẩn
trong lọ giông chuân Vv Môi trường Nutrient Agar
Ủ 28 - 30°C trong 24 — 48 giờ đối với E icialuri và E tarda
U37C trong 24 giờ đôi với chủng khác
Sau đó chuân độ vi khuân so với Mac Farland 0,5 Ỳ Mật độ vi khuẩn 10CFU/ml Pha loãng huyễn dịch 100 lần bằng nước muối sinh lý N Mat d6 vi khuan 10° CFU/ml Hình 3.2 Quy trình chuẩn độ vi khuẩn 3.4.2.3 Chuẩn bị nồng độ chất thử
Lần lượt cân 800 mg mỗi loại cao vào beaker, thêm 10 ml dung môi
DMSO đã được tiệt trùng, tạo nên dung dịch gốc có nồng độ 80000 pg/ml Dung dịch gốc được sử dụng dé pha lỗng với mơi trường MHA tạo thành các dãy nồng độ khác nhau, khoảng nồng độ cần pha tùy thuộc vào MIC dự đoán
của chất thử Trong thử nghiệm này nồng độ sau được pha bằng 1⁄2 nồng độ
trước, ta có môi trường thử nghiệm với các nồng độ lần lượt là: 4096 pg/ml,
Trang 282048 pg/ml, 1024 pg/ml, 512 ug/ml, 256 pg/ml, 128 pg/ml, 64 pg/ml Khoang
nồng độ cần pha tùy thuộc vào MIC dự đoán của chất thử
Lần lượt trộn riêng các chất thử nghiệm này vào môi trường thach MHA đã nấu chảy và đề nguội đến 48 — 50°C, lắc để đảm bảo trộn đều chất thử trong
môi trường thạch, đồ vào đĩa petri đối với từng loại chất thir va dé cho thạch
đông lại (Nguyễn Thanh Bảo và cứ:., 2005)
3.4.2.4 Tiến hành cấy vi khuẩn
Dung micropipette cấy lần lượt 1 wl huyễn dịch các vi khuẩn đã chuẩn độ đục lên bề mặt môi trường thạch có chứa chất thử nghiệm
Bắt đầu cấy từ nồng độ thấp nhất Mỗi chủng vi khuẩn được cấy thành I chấm Ở mỗi nồng độ cấy 2 chủng Edwardsiella ictaluriva Edwardsiella
tardatrên 1 đĩa và 6 chủng vi khuân còn lại trên 1 dĩa Khi thay đổi các chủng
vi khuẩn thì thay đổi đầu cấy, thay đổi môi trường đầu cấy cũng được thay đầu
khác Mỗi thí nghiệm lập lại 3 lần
Tiến hành cấy trên đĩa đối chứng, đĩa đối chứng không chứa cao thử
nhưng có chứa dung mơi pha lỗng (DMSO)
Dé n 15 phut cho vết thấm khô Lật ngược hộp thạch đã cấy, sau đó
đem ủ ở nhiệt độ 28 - 30°C trong 24 - 48 giờ đối với chủng vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri và Edwardsiella tarda, ủ 37°C trong 24 giờ đối với chủng
vi khuan Staphylococcus aureus,Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,
Streptococcus faecalis, Salmonella spp., va Aeromonas hydrophila
3.4.2.5 Doc két qua
Doc két quả dựa vào quan sát sự mọc hay không mọc của các khuẩn lạc
trên môi trường chứa chất thử nghiệm ở nồng độ thấp đề xác định MIC
Sơ đồ qui trình xác định MIC được tóm lược ở hình 3.3
Trang 29Nước cất (ml) + MHA (g)
- Hấp 121°C, 15 phút
- 40 — 50°C
- Cho dung dich gôc vào
Pha thach véi dung dich cao géc (chứa 80000ug/ml) Đỗ đĩa với các nồng độ ‘ 4096ug/ml 2048 pg/ml 64ug/ml Cấy các chủng vi khuẩn lên đĩa cao đã pha ở cácnông độ trên Dé yên 15 phút U 28 — 30°C trong 24 — 48 giờ đối với E ictaluri va E tarda
U 37°C trong 24 gid đối với chủng khác
Doc két qua khuẩn lạc trên đĩa thạch pha cao đã cây
Hình 3.3 Sơ đồ qui trình xác định MIC cao chiết thô
Trang 303.5 CHi TIEU THEO DOI
Hiệu suất chiết xuất cao giữa các đòng Cỏ cứt lợn
Nồng độ ức chế tối thiểu trên các chủng vi khuẩn thí nghiệm của cao Cỏ
cứt lợn
3.6 PHUONG PHAP XU LY SO LIEU
Ung dung phan mém Excel va Minitab 16, phan tich phuong sai str dung
ANOVA, General Linear Model, so sánh xử lý thống kê các số liệu trong thí
nghiệm
Trang 31CHƯƠNG4
KẾT QUA THAO LUAN
4.1 HIEU SUAT CHIET XUAT CAO CO CUT LON
Hiệu suất chiết xuất cao Cỏ cứt lợn được trình bay qua Bang 4.1
Bảng 4.I Hiệu suất chiết xuất cao Cô cứt lợn Dòng CCL P tươi(g) P cao(g) Hiệu suất (%) 1 500 19,05 3,81 2 150 5,85 3,90 120 4,82 4,02
Ghi chú: P: khối lượng; CCL: Cỏ cứt lợn
Qua kết quả Bang 4.1 cho thay: hiệu suất chiết xuất của dongCCL 1 la
thấp nhất 3,81%, kế tiếp 1a dong CCL 2 1a 3,90% va dong CCL 3 1a cao nhat
4,02%
Điều này có thể giải thích là do sự đa dạng di truyền giữa các dòng nên hàm lượng hoạt chất chứa trong từng dòng cũng khác nhau
4.2 NÒNG BO UC CHE TOI THIEU (MIC) CUA CAO CO CUT LON
4.2.1 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với vi khuẩn của dòng cao
Cỏ cứt lợn 1
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của dòng Cỏ cứt lợn 1 (CCL 1) được
trình bày qua Bảng 4.2
Trang 32Bảng 4.2Nồng độ ức chế tối thiêu (MIC) đối với vi khuẩn của dòng CCL 1 , CCcL1 Vi khuan MIC (pg/ml) S aureus 512 S faecalis 4096 E coli - Sal spp - P aeruginosa 4096 A hydrophila 4096 E ictaluri 512 E tarda 512
Ghi chi: “-“ thé hiện nong d6 >4096ug/ml;MIC (Minimum Inhibitory Concentration)
S aureus (Staphylococcus aureus), S faecalis (Streptococcus faecalis),E coli (Escherichia coli), P aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa), Sal.spp (Salmonella spp.), A hydrophyla (Aeromonas hydrophila), E tarda (Edwardsiella tarda), E ictaluri (Edwardsiella ictaluri)
Qua kết quả cho thấy dòng CCL 1 có khả năng ức chế 6 chúng vi khuẩn thí nghiệm Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Pseudomonas
aeruginosaAeromonas hydrophila, Edwardsiella ictaluri va Edwardsiella
tarda (512ug/mI<MIC<4096 ug/ml), va khong ttc chế 2 chủng vi khuẩn đường
rut Escherichia coli, Salmonella spp 6 néng 46 4096 ug/ml
Edwardsiella ictaluri va Edwardsiella tarda, Staphylococcus aureus bi
te ché manh nhat (MIC = 512ug/ml), ké dén 1a Streptococcus faecalis,
Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila (MIC = 4096y1g¢/ml)
4.2.2 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với vi khuẩn của dòng cao
Cỏ cứt lợn 2
Nông độ ức chế tối thiểu (MIC) của dòng Cỏ cứt lợn 2 (CCL 2) được
trình bày qua Bảng 4.3
Trang 33Bảng 4.3Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với vi khuẩn của dòng CCL 2 CCL 2 Vi khuan MIC (ng/ml) S aureus 1024 S faecalis 4096 E coli 2048 Sal spp 4096 P aeruginosa 2048 A hydrophila 2048 E ictaluri 128 E tarda 128
Ghi chu:S aureus (Staphylococcus aureus), S faecalis (Streptococcus faecalis),E coli (Escherichia coli), P aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa), Sal spp (Salmonella spp.), A hydrophyla (Aeromonas hydrophila), E tarda (Edwardsiella tarda), E ictaluri (Edwardsiella ictaluri)
Từ kết quả ghi nhận được, CCL 2 ức chế tám chủng vi khuẩn thí nghiệm rất tốt CCL 2 ức chế mạnh nhất trên Edwardsiella ictaluri va Edwardsiella
tarda (MIC = 128yg/ml), kế đến là Staphylococcus aureus bị ức chễ ở MIC = 1024ug/ml, tiếp theo là Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila (MIC = 2048ug/ml), va yéu nhất làStreptococcus
faecalis, Salmonellaspp & néng d6 MIC = 4096 pg/ml
4.2.3 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với vi khuẩn của dòng cao
Có cứt lợn 3
Nông độ ức chế tối thiêu (MIC) của dòng Cỏ cứt lợn 3 (CCL 3) được trình bày
qua Bảng 4.4
Trang 34Bảng 4.4Nông độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với vi khuẩn của dòng CCL 3 , CCL 3 Vi khuan MIC (ug/ml) S aureus 512 S faecalis 1024 E coli 2048 Sal spp 4096 P aeruginosa 2048 A hydrophila 2048 E ictaluri 128 E tarda 128
Ghi chi:S aureus (Staphylococcus aureus), S faecalis (Streptococcus faecalis),E coli (Escherichia coli), P aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa), Sal spp (Salmonella spp.), A hydrophyla (Aeromonas hydrophila), E tarda (Edwardsiella tarda), E ictaluri (Edwardsiella ictaluri)
Từ kết quả bảng 4.4, cho thay CCL 3 có khả năng ức chế tốt nhất trên
Edwardsiella ictaluri va Edwardsiella tarda (MIC = 128ug/ml), tiếp theo 1a
Staphylococcus aureus (MIC = 512 pg/ml), Streptococcus faecalis bi ite ché ở nồng
dé MIC = 1024ug/ml, Escherichia coli, Aeromonas hydrophila, Pseudomonas aeruginosa bị CCL 3 ức chế ở nồng độ MIC = 2048ug/ml, và cuối cùng là
Salmonellaspp ở nồng độ MIC = 4096 ug/ml
4.2.4 So sánh nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với vi khuẩn của 3
dòng Cỏ cứt lợn
Kết quả khảo sát hiệu quả kháng khuẩn của cao Cỏ cứt lợn trên 8 chủng vi khuân được ghi nhận qua Bảng 4.5
Trang 35Bảng 4.5 So sánh nồng độ ức chế tối thiểu của Cỏ cứt lợn MIC (ng/ml) Vi khuẩn Dòng 1 Dòng 2 Dòng 3 S aureus 512 1024 512 S faecalis 4096 4096 1024 E coli - 2048 2048 Sal.spp - 4096 4096 P aeruginosa 4096 2048 2048 A hydrophila 4096 2048 2048 E ictaluri 512 128 128 E tarda 512 128 128
Ghi chii: “-“ thé hién nong d6 >4096.g/ml
Qua két qua Bang 4.5cho thay:
Cả 3 dòng Có cứt lợn tác đều ức chế Staphylococcus aureus,Streptococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas
hydrophila, Edwardsiella ictaluriva Edwardsiella tarda(128
ug/ml<MIC<4096 pg/ml)
Dòng 2, dòng 3 ức chế 8 chủng vi khuẩn laStaphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Escherichia coli, Salmonellaspp., Pseudomonas
aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Edwardsiella ictaluri va Edwardsiella tarda(128 ug/ml<MIC<4096 g/ml) Trong khi dong 1 ttc ché sau chung vi
khuẩn là Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Edwardsiella ictaluri va Edwardsiella
tarda (512ug/mISMIC<4096 ug/ml)
Khả năng kháng khuẩn của Cô cứt lợn trên 2 chủng gây bệnh động vật
thay sinhEdwardsiella ictaluri va Edwardsiella tardalà tốt nhất trong 8 chủng
Trang 36Trén Streptococcus faecalisdong 3 we ché 6 néng d6 1024 pg/ml, dong
Iva dong 2 tre ché yéu hon 6 nong d6 4096 pg/ml
Déi véi Escherichia coli, Salmonellaspp.dong 2 va dong 3 te ché lần
lượt 6 néng dé MIC 1a 2048 ug/ml va 4096 pg/ml, trix dong 1 khéng te ché 6 nong dé 4096 ug/ml
Dong 2 va dong 3 te ché Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophilaở nồng độ là 2048 ug/ml, còn đòng 1 ức chế yếu hơn ở nồng độ
4096 ug/ml
Cỏ cứt lợn có khả năng ức chế sự phát triển của các chủng vi khuẩn Vi
khuẩn bị Cỏ cứt lợn ức chế mạnh nhất là Edwardsiella icfaluri và Edwardsiella tarda (128 pg/ml<MIC<4096 ug/ml) Theo Stock (2001),
Edwardsiella tarda khangbenzyl penicillin, colistin, licomycin Theo Bui Quang Té (2006), đây là vi khuẩn gây bệnh đốm trắng phô biến trên cá, gây
nhiều thiệt hại cho ngành chăn nuôi thủy sản E /arđz còn gây viêm nhiễm bên trong và bên ngoài đường tiêu hóa của con người.E ¿c/ziuzi là ví khuẩn
gây bệnh gan thân mủ trên cá tra, cá trê (Bùi Quang Tẻ, 2006) Vi khuẩn này có khả năng kháng lại colistin, streptomycin, oxytetracycline, (Truong Ngoc
Loan va ctv., 2007)
Staphylococcus aureus 1a vi khuẩn có khả năng kháng penicillin G, một
số còn kháng lại được methicillin.S/zphylococeus aureus gây ra nhiều bệnh nhiễm trùng, tạo mủ và gây độc ở người, gây ra nhiều bệnh viêm nhiễm
nghiêm trọng như viêm phổi, viêm vú, viêm tĩnh mạch, viêm màng não, nhiễm
trùng tiêu và những bệnh nguy hiểm khác như viêm xương tủy, viêm màng trong tim (Kenneth Todar, 2005), Cô cứt lợn cũng ức chế vi khuẩn này ở nồng
d6 MIC = 512 ug/ml
Cỏ cứt lợn ức chế vi khuânPseudomonas aeruginosa ở nồng độ (2048 ug/ml<MIC<4096 ug/ml), đây là vi khuân gây bệnh mủ xanh, có khả năng tiết
độc tố và nội độc tố gây viêm bàng quang, viêm âm đạo, viêm vú (Taylor, 1992) P aeruginosa khang dugc tobramycin, penicillin, gentamycin
Vikhuẩn Aeromonas hydrophila bi ức chế bởi Cô cứt lợn (2048
ug/ml<MIC<4096 pg/ml), day là ví khuẩn gây bệnh đốm đỏ trên cá nước ngọt, tôm càng xanh (Bùi Quang Té, 2006) A hydrophila kháng lại colistin,
tetracycline, oxacyllin (Orozova et al., 2008)
Tiếp theo, Cỏ cứt lợn ức chế ở nồng độ 1024 ug/ml<MIC<4096 ug/ml
trén Streptococcus faecalis la vi khuan gây mủ ở phủ tạng, mẫn đỏ
Trang 37(Merchant, 2007) Theo Johnson et al (1998), vi khuẩn này kháng
gentamycin, streptomycin, vancomycin
Kết quả bảng 4.5 1a phu hop voi Dé Huy Bich vd ctv.(2004), Cd ett lon
điều trị các bệnh viêm xoang, viêm mũi dị ứng, các bệnh ngoài da và lở loét
Bên cạnh đó, kết quả cũng phủ hợp với những ứng dụng dân gian trong chữa
bệnh viêm mũi, viêm xoang dị ứng, cảm mạo, mụt nhọt, Ở Ấn Độ, Cỏ cứt lợn được dùng để trị vết thương, vết loét
Nghiên cứu Osho e/ ai (201 1) về hoạt tính của Cỏ cứt lợn được chiết xuất từ
methanol ở nông độ 2,0 mg/ml có thê ức chê được vi khuan Staphylococcus aureus Ket qua sự ức chê của chiết xuât này được so sánh tương đương với thuộc kháng sinh
chuan ampicillin (10 mg) va ketoconazole (10 1g)
Nghién ctru khac cua Okwori et al ( 2007), Elimian et al (2013), nghién
cứu về hoạt tính kháng khuẩn của lá Cỏ cứt lợn được chiết xuất từ methanol
Kết quả cho thấy địch chiết này cd kha nang tre ché vi khudn Staphylococcus
aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli 6 néng 46 25 mg/ml véi đường kính vòng vô khuẩn lần lượt là 9 mm, 7mm, 8 mm
Hình 4.1 Mẫu đối chứng của 6 chủng vi khuẩn
Ghi chi: 1 (Salmonella spp.), 2 (Staphylococcus aureus), 3 (Streptococcus faecalis),
4 (Pseudomonas aeruginosa), 5 (Escherichia coli), 6 (Aeromonas hydrophila)
Trang 38
Hình 4.2 Mẫu đối chứng của 2 chủng vi khuẩn gây bên trên thủy sản
Ghi cha: 7 (Edwardsiella ictaluri), 8 (Edwardsiella tarda)
Hình 4.3 Kết quả nồng độ ức ché MIC = 128 pg/ml cua vi khuan
Edwardsiella ictaluri (7) va Edwardsiella tarda (8)
Trang 39
Hình 4.4 Kết quả nồng độ ức chế MIC = 512 ig/mlvi
khuan Staphylococcus aureus(2)
Hình 4.5 Kết quả nồng độ ức chế MIC = 1024 pg/mlvi khuan
Staphylococcus aureus(2) va Streptococcus faecalis(3)
Trang 404.2.5 So sánh hoạt tính kháng khuẩn của 3 dòng Có cứt lợn
Sự khác nhau về hoạt tính kháng khuẩn của 3 dòng Cỏ cút lợn được trình bày qua bảng 4.6 Bảng 4.6 So sánh khả năng kháng khuẩn của 3 dòng Cỏ cứt lợn Dòng Dòng 1 Dòng 2 Dòng 3 P MIC 2752+336,8° 1952+275,0° 1504+275,0° 0,043 (ug/ml)
Ghi chi: MIC (minimum inhibitory concentration), p: mic ÿ nghĩa
Qua kết quả MIC của 3 dòng Cỏ cứt lợn cho thấy tính kháng khuẩn của
dong 1 thấp nhất 2752 pg/ml va cao nhat là hoạt tính kháng khuẩn của dòng 3
ở nồng độ 1504 g/ml va su sai khác này có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,05)
So sánh hoạt tính kháng khuẩn của dòng 1 và dòng 2 là tương đương
nhau (sai khác không có ý nghĩa thống kê P>0,05), tiếp theo là đòng 2 và dòng
3 gần giống nhau (sai khác không có ý nghĩa thống kê P>0,05) Hoạt tính
kháng khuẩn của dòng 1 và dòng 3 là khác nhau và có ý ngĩa thống kê
(P<0,05)
Từ kết quả trên có thé chọn lọc ra từ 3 đòng Cỏ cút lợn thì đòng 3 là có
tính ức chế vi khuẩn tốt nhất, có thể tiến hành giữ giống, nhằm tiếp tục thí
nghiệm tìm ra hoạt chất kháng khuẩn chính trong cây, có khả năng ứng dụng vào thực tế
4.2.6 So sánh hiệu quá của Có cứt lợn trên 8 chúng vi khuẩn thir
nghiệm
Kết quả so sánh hiệu quá của Cỏ cứt lợn trên 8 chủng vi khuẩn thử
nghiệm được thể hiện qua bảng 4.7