So sánh khả năng kháng khuẩn của các dòng lược vàng (callisia fragrans lindl )

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÀN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

SO SANH KHA NANG KHANG KHUAN

CUA CAC DONG LUQC VANG

(Callisia fragrans Lindl.)

LUAN VAN TOT NGHIEP

NGANH THU Y

Trang 2

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÀN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN TÓT NGHIỆP

NGÀNH THÚ Y Tên đề tài:

SO SANH KHA NANG KHANG KHUAN

CUA CAC DONG LUQC VANG

(Callisia fragrans Lindl.)

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiên:

PGs TS HUỲNH KIM DIỆU VÕ HỮU VUI

MSSV: 3092649 Lớp: Thú Y K35

Cần Thơ, 2013

Trang 3

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÀN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y

Đề tài: “So sánh khả năng kháng khuẩn của các dòng Lược vàng

(Callisia fragrans Lindl.)”

Sinh viên thực hiện: Võ Hữu Vui, thực hiện tại phòng Dược lý Thú y và phịng thí nghiệm Vi sinh — Miễn dịch Thú y, Bộ môn Thú y, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại học Cần Thơ, từ tháng

08/2012 đến tháng 11/2013

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

Duyệt Bộ môn Duyệt Giáo viên hướng dẫn

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

Trang 4

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết

quả được nêu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ cơng trình nào cùng cấp khác trước đó

Sinh viên thực hiện

Võ Hữu Vui

Trang 5

LOI CAM TA

Đề đạt được thành tựu như ngày hơm nay, ngồi sự nỗ lực cố gắng của bản

thân cịn có sự giúp đỡ vô cùng quan trọng của gia đình, thầy cơ và bạn bè

Con xin chân thành gửi đến cha mẹ lòng biết ơn sâu sắc, những người đã

vượt qua bao nhiêu khó nhọc để nuôi con khôn lớn và đã luôn an ủi động viên giúp con vượt qua những khó khăn trong cuộc đời

Em xin chân thành cảm ơn cô Huỳnh Kim Diệu đã tận tình hướng dẫn, động

viên và giúp đỡ tơi trong suốt q trình làm luận văn đề tôi có thể hồn thành tốt

luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thu Tâm đã luôn động viên, chỉ bảo và quan tâm tôi suốt 5 năm đại học

Chân thành cảm ơn quý thầy cô bộ môn Thú y, Bộ môn Chăn ni đã truyền đạt tận tình những kiến thức quý báu trong suốt thời gian qua

Cảm ơn chị Phan Thị Tư cao học KI8 cùng các bạn trong và ngoài lớp đã giúp đỡ và chia sẽ khó khăn với tơi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận

văn này

Xin chân thành cảm ơn!

Trang 6

MỤC LỤC

TRANG DUYỆỆT 2-22 ©2<2SE9EE192E12E111211271127112112T1E T15 0.T1.T11 11 T11 1e i

I9) 09.\ 69.908 .ố ii

LOI CAM TA iii

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT V

DANH MUC BANG vi

DANH MỤC HÌNH Vii

TĨM LƯỢC viii

CHUONG 1 DAT VAN DE `

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .2

2.1 Giới thiệu cây Lược vàng 2

PN No n—PƯỤIdÝŸ

2.1.2 Mô tả đặc điỂm ©5+cs E2 E22112712111271211211111211211 11.1111 eee 2.1.3 Phân bó, sinh thái

P N: 0 ion

2.1.5 Thành phần hóa học .-2 2-©+£+2E+£+2EEEE+2EEE22211271122221127112222122222Xe2 3

2.1.6 Tác dụng dược lý 2.1.7 Công dụng

2.2 Các loại vi khuẩn dùng trong thí nghiệm

2.2.1 Nhóm vi khuẩn Gram đương

2.2.2 Nhóm vi khuẩn Gram âm se

CHƯƠNG 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điỂm . -¿-©cccerxerrrerrrxee

3.2 Nội dung nghiên cứu “ 3.3 Phuong tién nghién COU oe 3.3.1 Nguyén LiGU oe cceeseseeseseeseseeceseeeeseeeeesceecseeeeseaeeesaeeesaeaeeecaeeasaeeeeaeeeeseeeeaees

3.3.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất chính + 3.3.3 Vi khn thí nghiệm 2-22¿©++22EE+212E1112221122711222211271122221222221.e

3.4 Phương pháp nghiên cứu 3.4.1 Điều chế cao thô

3.4.2 Xác định nồng độ ức chế

3.4.3 Chỉ tiêu theo dõi

CHƯƠNG 4 KÉT QUẢ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả chiết xuất của 4 dòng Lược vàng : -c:+

4.2 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với vi khuẩn của 4 dòng Lược vàng

CHƯƠNG 5 KÉT LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ 5.1 Kết luận 29 5.2 Đề nghị 20

KHẢO TÀI LIỆU THAM K 30

)›0009:1019)6 217 “1 34

Trang 7

DANH MỤC CHỮ VIẾT TÁT

Viết tắt Nguyên chữ

CFU Colony forming unit DM Dry matter

DMSO Dimethyl sulfoxide EMB Eosinmethylen Blue MHA Muller Hinton Agar

MIC Minimum inhibitory concentration MMA Mastitis — Metritis - Agalactia

MRSA methicillin resistant Staphylococcus aureus NA Nutrient agar

TSA Trypticase Soy Agar TSB Trypticase Soy Broth LV Luge vang

Trang 8

DANH MỤC BÁNG

Tựa bảng Trang Hiệu suất chiết xuất cao 4 dòng Lược vàng 24 So sánh nồng độ ức chế tối thiểu của cao lá các dòng Lược vàng 25 So sánh khả năng kháng khuẩn của các dòng Lược vàng 26 So sánh khả năng kháng khuẩn của cao Lược vàng trên các chủng 27 vi khuẩn thử nghiệm

Trang 9

DANH MỤC HÌNH

Hình Tên hình Trang

1 Cây Lược vàng 2

2 Khuẩn lạc của 6 vi khuẩn đều mọc trên mơi trường có cao ở 34

nong d6 256 pg/ml

3 Khuẩn lạc của 2 chủng vi khuẩn gây bệnh trên cá E4 farda, — 34

Ed ictaluri moc trén mdi trường có cao ở nồng độ 512 pg/ml

4 Khuan lac vi khuan Sta aureus không mọc trên môi trường 34 có cao 6 néng dé 512 pg/ml

5 Khuan lạc vi khuan E coli va Sal spp mọc trên môi trường có 34 cao ở nồng độ 4096 pg/ml

Trang 10

TÓM LƯỢC

So sánh khá năng kháng khuẩn của 4 dòng Lược vàng trên 8 chúng vi khuẩn thí nghiệm Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp, Aeromonas hydrophila, Edwardsiella ictaluri, Edwardsiella tarda được thực hiện bằng cách sấy khơ lá 4 dịng cây Lược vàng và được li trích riêng bằng methanol trong 5 ngày (lần 1: 3 ngày, lần 2 và 3: cách nhau I ngày) và dùng phương pháp pha lỗng trong thạch

(xác định nơng độ ức chế tối thiểu MIC) để thử khả năng kháng khuẩn của cao

thô Kết quả cho thấy hiệu suất chiết xuất cao của 4 dòng Lược vàng chênh lệch nhau khơng đáng kể (nhóm LVI là 1,67%, nhóm LV2 là 1,05%, nhóm LV3 là

1,43%, nhóm LV4 là 1,0) Về khả năng kháng khuẩn: đối với Staphylococeus

aureus ca 4 dịng cao Lược vàng có hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất voi 512 ug/ml < MIC < 1024 ug/ml, trong đó đạt hiéu qua cao nhat voi MIC= 512 pg/ml là

dong LVI, LV3 va LV4 Trén 3 chung Strep faecalis, Pseu aeruginosa, Aero hydrophila hoạt tính kháng khuẩn của 4 dòng cao Lược vàng là như nhau (2048

ug/ml < MIC < 4096 pg/ml) Trén 2 chung E coli va Samonella spp thi hoat tinh

kháng khuẩn của 4 dòng cao Lược vàng khơng có hiệu quả tốt, ở nỗng độ MIC= 4096 ugíml vẫn khơng ức chế được 2 chủng vi khuẩn này Trên 2 chúng gây bệnh trên cd Ed tarda va Ed ictaluri thi hoạt tính kháng khuẩn của 4 dòng Lược

vàng là khá tot (1024 ug/ml < MIC < 2048 pg/ml) và đạt hiệu quả tốt nhất với

dong LVI (MIC=1024 ug/ml) Với các kết quá thu được như trên, sau khi được xử lý thông kê chúng tôi nhận thấy dòng LV4 là có khá năng kháng khuẩn tốt

nhất trong 4 dòng Lược vàng được khảo sát

Từ khóa: cây Lược vàng, khá năng kháng khuẩn

Trang 11

CHƯƠNG I DAT VAN DE

Trong xã hội ngày nay dân số mỗi lúc càng đông, khoa học kĩ thuật phát triên khơng ngừng thì bên cạnh đó thì bệnh tật cũng phát triển đa dạng và theo

hướng khó điều trị và chân đoán hơn Phần lớn các bệnh hiện nay được điều trị bằng thuốc tây y, mặc dù có hiệu quả khá tích cực nhưng cũng mang lại nhiều rủi ro do hiện tượng kháng thuốc, sốc thuốc và nhiều tác dụng phụ khác khi sử dụng

Với điều kiện khí hậu nhiệt đới có ẩm độ và nhiệt độ cao, Việt Nam là nước

có nền nông nghiệp phát triển mạnh trong khu vực và trên thế giới Trong thực tiễn nước ta đang dần hội nhập vào nền kinh tế chung của thế giới WTO, các sản phẩm được xuất khâu ra khắp các nước với thế mạnh là các sản phẩm nông

nghiệp Đây là một cơ hội lớn để thúc đầy nền kinh tế nước nhà Tuy nhiên nó

cũng tạo một áp lực cạnh tranh không nhỏ cho các mặt hàng trong nước do các

nước nhập khẩu đòi hỏi chất lượng sản phẩm mỗi lúc càng cao hơn, đặc biệt là

với các thị trường khó tính như Mỹ, Nhật

Sự phát triển của khoa học kĩ thuật giúp chúng ta phát hiện ra nhiều chất gây hại cho sức khỏe con người hiện diện trong các thực phẩm như chất bảo quản, chất kích thích tăng trưởng, chất tạo nạc và đặc biệt là dư lượng kháng sinh

trong các sản phẩm động vật tiêu thụ hàng ngày Nó ánh hưởng trực tiếp đến sức

khỏe người sử dụng cũng như sự phát triển của nền kinh tế Chính vì vậy, một

hướng mới để giảm các chất độc hại trên đang được con người hướng đến là sử

dụng các bài thuốc, loại thuốc có nguồn gốc đến từ thiên nhiên

Vài năm gần đây cây Lược vàng nổi lên như một “thần dược” đù chỉ mới được du nhập vào nước ta khoảng 10 năm Bước đầu nghiên cứu cây Lược vàng

đã đem lại một số lợi ích rõ rệt như: hỗ trợ và chữa trị nhiều bệnh như ung thư,

bỏng, viêm nhiễm, lao phổi, bệnh tim mạch nhưng các nghiên cứu này chưa được phổ biến và hiện nay hầu như chưa được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực thú

y Vì lý do đó, để góp phần vào nghiên cứu cây thuốc quý giá này chúng tôi thực

hiện đề tài: “So sánh khả năng kháng khuẩn của các dòng Lược vàng (Cailisia

ragrans Lindl.) ”

Mục tiêu của đề tài:

Xác định tính kháng khuẩn của các dòng Lược vàng trên 8 chủng vi khuẩn gây bệnh pho bién trén thuy san va trén gia stic, gia cam

Trang 12

CHƯƠNG 2

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu cây Lược vàng

Hình 1: Cây Lược vàng

(http://trongraulamyuon.com/cach-trong-rau/tac-dung-chua-benh-noi-troi-cua-cay- luoc-vang/)

2.1.1 Phan loai

Tén khoa hoc: Callisia fragrans Lindl

Tên khác: (địa) lan vòi, lan rũ, cây bạch tuộc, trái lá phất dũ, giả khóm Họ: Thài lài (commmelinaceae)

2.1.2 Mô tả đặc điểm

Cây thảo, sống lâu năm Thân đứng cao từ 15-40cm, có thân bò ngang trên

mặt đất Thân chia đốt và có nhánh Đốt ở phía thân dưới dài từ 1-2 em, ở nhánh

trên có thể dài tới 10 em

Lá đơn, mọc so le, phiến lá thng hình ngọn giáo (15-20 cm x 4-6 cm), bề mặt nhẫn, mặt trên xanh đậm hơn mặt đưới, mọng nước Bẹ lá ơm khít thân, mép

lá nguyên, thường có màu vàng khi về già Gân lá song song Lá thường có màu

Trang 13

Hoa hợp thành xim, sắp xếp ở ngọn một trục dài và cong thành chum Cụm hoa không cuốn, gồm 6-12 bông Hoa màu trắng, cuống hoa dài 1mm Lá bắc ngồi cụm hoa hình vỏ trấu (1 em x 1 cm), màu vàng Lá bắc ngồi có hình lịng

thuyền, kích thước 1,5 mm x 3 mm, phần dưới trắng, phần trên xanh, mép lá

nguyên Đài 3, hình trứng, rời nhau (3 em x 1,5 em) Phần dưới xanh, phần trên có màu tím, mép ngun, có lơng mịn phía dưới Tràng 3, hình trứng kích thước

khoảng I mm x 2,5 mm, màu trắng, mép nguyên Nhị 6, rời, chỉ nhị dài khoảng

1,5 mm, phần dưới đính vào cánh hoa, bao phấn hình hạt đậu, kích thước 1⁄3 x

1⁄4 mm, đính vào 2 bên trung đới Bầu trên 3 ô, cao khoảng 0,5 mm, vịi nhụy hình trụ, dài khoảng 1,5 mm, núm nhụy hình chối (http://thuocdongduoc.vn/cay-

thuoc-vi-thuoc/278-cay-thuoc-vi-thuoc/992-luoc-vang.html)

2.1.3 Phân bố, sinh thai

Cây Lược vàng có nguồn gốc xuất sứ từ Trung và Nam Mỹ Cây Lược vàng được trồng làm cảnh ở Nga hơn 100 năm trước Năm 2007, Lược vàng di thực từ

Nga vào Việt Nam dưới hình thức cây cảnh, lúc đầu ở Thanh Hóa, giờ đây cây

Lược vàng đã nhanh chóng lan ra các tỉnh thành trong cả nước

2.1.4 Bộ phận dùng

Theo Viện nghiên cứu Dược liệu Bộ Y tẾ, cây Lược vàng có tính mát

khơng độc, có thể dùng toàn bộ thân, lá, rễ làm thuốc Có thể dùng tươi hoặc

ngâm rượu xoa bop.(http://www.thaythuoccuaban.com/vithuoc/cayluocvang.htm)

2.1.5 Thành phần hóa học

Theo các nghiên cứu đến hiện tại về thành phần hóa học của cây Lược vàng người ta đã tìm được trong cây có chứa các hợp chất acid béo, glycol-

phospholipid, cholorophyll, các chất màu carotinoit, œ/-tocopherol và một số

chất vòng thơm như acid gallic, acid caffeic, quercetin và đã phân lập được hợp chất isoorientin, một flavon C-glucosit mang nhiều hoạt tính sinh học (Chemenko et al., 2007; Olemikov et al., 2008) Theo Cottiglia et al (2001), Becker et al (2005) va Liu et a (2009), hop chất isoorientin thể hiện hoạt tính kháng khuẩn với giá trị MIC= 100-200 ug/ml

Theo Dé Xuân Cẩm (2009) thì trong cây Lược vàng có các hoạt chất sinh học gồm nhóm flavonoid, steroid, các vitamin C, Ba, Ba, Bs và các chất khoáng như Cu, Fe, NI, Trong đó nhóm flavonoid có chứa hoạt chất quercetin và kaempferol có tác dụng tốt trong điều trị bệnh

Trang 14

2.1.6 Tác dụng dược lý

Cây Lược vàng đã được sử dụng rất rộng rãi ở Nga, Việt Nam hỗ trợ và chữa trị nhiều bệnh như ung thư, bỏng, viêm nhiễm, lao phôi, bệnh tim mạch

nhưng tác đụng được lý của cây này chưa được nghiên cứu nhiều (Chemenko e/

al., 2007; Shantanova et al., 2008) Gần đây, một nghiên cứu ở Viện Dược liệu

đã chỉ ra rằng với liều 50 g lá tươi/kg thể trọng, Lược vàng khơng có tác dụng chống viêm nhưng có khá năng kháng vi khuan Staphylococcus aureus Cao chiết

Lược vàng gây chết chuột ở liều tương đương 2100-3000 g được liệu tuoi/kg thé trọng Liều gây chết 50% số chuột là 2430 g dược liệu tươi/kg thể trọng (Trịnh

Thị Điệp, 2008)

Theo Susan et al., (2006) khang thể IgE trong huyết thanh của chó có thé

xảy ra sốc phản vệ khi tiếp xúc với nhựa cây Lược vàng Bằng phương pháp SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel) chiết lấy dịch chiết của

lá, hoa khi cho tiếp xúc với huyết thanh chó (huyết thanh này khơng có tiền sử, dấu hiệu đị ứng của kháng thể IgE với dịch chiết này) Kết quả không xảy ra sự

quá mẫn trực tiếp từ nhựa của lá nhưng nếu pha lỗng huyết thanh 1:200 thì huyết thanh chó gây chứng sốc phản vệ khi tiếp xúc với chất nhựa này Theo

Khoi et al., (2011) đánh giá hiệu quả từ dịch chiết của lá và thân cây Lược vàng gây ức chế hệ thống miễn dịch induced cyclophosphamid trên chuột Sử dụng với

các liều 0,1 g/kg, 0,4 g/kg, 0,023 g/kg và 0,092 g/kg mỗi ngày trong 9 ngày Tất

cả đều kích thích sinh miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào với việc gia ting

trọng lượng của lách và tuyến ức, số lượng các tế bào bạch cầu đồng thời phục

hồi sự suy giảm miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào

Tuy nhiên, các nhà khoa học Nga nhận thấy Lược vàng cũng có tác dụng

phụ như: gây tôn thương thanh quản, dị ứng nổi ban đỏ, phù nề tứ chi, phù toàn thân, Các phản ứng phụ đó hay gặp nhất ở những người có khả năng miễn dịch

yếu và cơ địa dị ứng Chính những nhược điểm đó đã hạn chế việc mở rộng ứng dụng Lược vàng trên lâm sàng, cây thuốc này không thấy đề cập trong các sách y

học dân tộc hay các sách tra cứu lớn về thảo dược ở Nga và xuất bản trong thời Liên Xô cũ Mặc dù hiện nay cây Lược vàng được quan tâm nhiều nhưng có rất ít

cơng trình khoa học được đăng trên các tạp chí khoa học Thơng tin về thành phần hóa học cũng như công dụng chữa bệnh của cây Lược vàng phần lớn chỉ được tham khảo qua các tài liệu phô biến khoa học (Nguyễn Văn Đậu và ctv.,

Trang 15

2.1.7 Công dụng

Theo Seyoum et al., (2006) quercetin có hoạt tính giống như vitamin P, là chất có tác dụng chống oxy hóa, lợi tiểu và chống co giật Có thể được sử dụng trong điều tri di ứng, viêm nội tạng, viêm thận, viêm khớp cũng như một số bệnh

tim mạch, mắt, nhiễm trùng Kaempferol có tác dụng làm tăng độ bền của mạch

máu, an thần, chống viêm, lợi tiểu mạnh giúp cho cơ thể bài tiết các chất độc hại ra ngoài Có thé str dung đề chữa trị các bệnh nhiễm khuẩn, bệnh dị ứng, rối loại chức năng bài tiết Theo Tim Cushnie et al., (2005) các hợp chất flavonoid có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm và kháng virus nên được sử dụng đề điều trị bệnh

cho người Theo Nguyễn Văn Đậu (2011) hợp chất steroid trong cây Lược vàng

có hoạt tính tương tự như nội tiết tố sinh dục, có tác dụng diệt khuẩn, chống xơ

vữa động mạch, kìm chế sự phát triển của các khối u và có thể sử dụng để điều trị một số dạng ung thư, cũng như một số bệnh tuyến tiền liệt, bệnh nội tiết, rối loạn

chuyển hóa Theo Đỗ Xuân Cẩm (2009) trong cây Lược vàng còn chứa beta-

sitosterol sitosterol có tác dụng giảm lượng cholesterol trong máu, làm sạch và săn chắc thành mạch máu, được dùng điều trị chứng xơ vữa động mạch, bệnh rồi

loạn biến dưỡng, hệ nội tiết, viêm tuyến tiền liệt

2.2 Các loại vi khuẩn dùng trong thí nghiệm

2.2.1 Nhóm vi khuẩn Gram dương

2.2.1.1 Vi khuẩn Staphylococcus aureus (Sta aureus) Giới: Procaryotae

Ngành: Firmicutes Lớp: Firmibacteria Ho: Micrococaceae Chi: Staphylococcus

Loài: Aureus Hiện tại có 32 loài (Merchant and Packer, 1967)

Tụ cầu khuẩn là các cầu khuân Gram dương không tạo nha bào, có đường

kính 0,7-1 um, không di động và sắp xếp theo mọi hướng và thường tạo thành cum (tu) trông giống như chùm nho, là một loại vi khuẩn sinh mủ điển hình, vết

Trang 16

chứng huyết nhiễm mủ và bại huyết Da và niêm mạc của người và động vật là

nơi khu trú chủ yếu của tụ cầu khuẩn (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977) $4 aureus là loại gây bệnh thường hay gặp nhất, nó có vai trò và ý nghĩa quan trọng đối với y học và thú y học Khoảng 30% người khỏe mạnh mang Sa aureus ở trên da và niêm mạc, khi có những tốn thương ở da và niêm mạc hoặc những rối loạn về chtre nang thi cdc nhiém tring do Sta aureus dé dang xuat hién Sta aureus 1a nguyên nhân gây viêm xoang, viêm amydale, viêm vu cho người (Trần Thị Phận,

2004)

Nhiệt độ thích hợp để phát triển của tụ cầu khuân từ 32-37°C, pH thích hợp

7,2-7,6 Sau 12-24 giờ khuẩn lạc trịn đường kính 2-4 mm, màu trắng, vàng, vàng

chanh, hơi ướt Phần lớn khuẩn lạc có màu vàng thẫm (Nguyễn Vĩnh Phước,

1977)

Vi khuẩn khơng có nha bào nên đối với tác nhân lí hóa đề kháng kém Nhiệt độ 70°C diệt vi khuẩn trong môi trường 1 giờ, 80°C làm chết vi khuẩn trong 10- 30 phút, đun sôi 100°C vài phút vi khuẩn mới chết (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977)

Tụ cầu khuẩn chịu đựng tốt các thay đổi của môi trường như khô hạn, ánh nắng,

thay déi pH, dé man Sta aureus khang duoc penicillin, tetracycline, trimethoprim-sulfamethazine, chloramphenicol, erythromycin (Anakalo Shitandi

and Milcah Mwangi, 2004)

Staphylococcus aureus kháng với nhiệt độ thấp Nhưng lại rất

nhạy cảm với môi trường có tính acid, các hợp chất hóa học và thuốc

kháng sinh Acid phenic 3-5% diệt vi khuẩn trong 3-5 phút Formol 1% diệt vi khuẩn trong 1 giờ (Nguyễn Như Thanh và c., 1997)

Sự kháng kháng sinh của $/aphylococcus aureus là một đặc điểm rất

dang chi y Da s6 Staphylococcus aureus khang penicillin G do vi khuẩn này

sản xuất được men penicillinase Mot số còn kháng lại được methicillin gọi là methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA), do nó tạo ra các protein

gắn vào các vị trí tác động của kháng sinh (Lê Huy Chính, 2007)

Trang 17

Một nghiên cứu khác về kiểm tra tính kháng thuốc của Staphylococcus aureus phan lap từ bệnh viêm vú bò cho kết quả đề kháng như sau: penicillin G (33,33%), ampicillin (16,67%), chloramphenicol (0,00%), chlortetracycline (13,30%), sulphonamide (13,33%), neomycIn (6,67%), furazodiol (20,00%), streptomycin (60,00%) (Bùi Thị Tho, 2003)

Đặc tính gây bệnh: trong phịng thí nghiệm thỏ cảm nhiễm nhất, tiêm vào tĩnh mạch thỏ 1-2 ml canh khuẩn tụ cầu, sau 36-48 giờ thỏ chết vì chứng huyết nhiễm mủ Mô khám thấy nhiều ổ áp xe trong phủ tạng Nếu tiêm canh khuẩn tụ cầu vào dưới da cho thỏ sẽ gây áp xe dưới da (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977) Tụ cầu ký sinh trên da, niêm mạc của người và gia súc Khi sức đề kháng của cơ thé

kém hoặc tổ chức bị tổn thương, vi khuẩn xâm nhập và gây bệnh Vi khuẩn có thé

gây những ổ mủ ở ngoài da, niêm mạc Một số trường hợp vi khuẩn vào máu gây nhiễm khuẩn huyết, huyết nhiễm mủ Ngoài ra, ở người cịn thấy độc tơ ruột do tụ

cầu tiết ra gây nên nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp tính (Nguyễn Như Thanh va ctv., 1997) Trong tự nhiên, ngựa cảm nhiễm nhất rồi đến chó, bị, heo, cừu

Gia cầm có sức đề kháng cao với tụ cầu khuẩn (Lưu Hữu Mãnh, 2010) 2.2.1.2 Vi khudn Streptococcus faecalis (S faecalis)

Streptococcus faecalis thuộc họ Enterococceace, sống chủ yếu trong ruột

của con người, vật nuôi Ở động vật liên cầu thường gây những chứng mưng mủ, những bệnh biến chung hay cục bộ như viêm vú (Nguyễn Như Thanh va ctv.,

1997)

Theo Trần Thị Phận (2004), liên cầu khuẩn gram dương, hiểu khí hoặc vi hiếu khí, phát triển tốt trên mơi trường có huyết thanh và máu Liên cầu khuẩn có hình cầu hoặc bầu dục, xếp thành chuỗi, uốn khúc, dài ngắn khác nhau, đường

kính có khi đến 1 um, đơi khi có vỏ, bắt màu Gram đương, không đi động Chiều

dài của chuỗi tùy thuộc vào điều kiện môi trường (Lưu Hữu Mãnh, 2010)

Hiếu khí hay yếm khí khơng bắt buộc, mọc tốt 6 tat cả môi trường Phần lớn

các liên cầu gây bệnh thích hợp ở 37°C Môi trường thạch thường sau 24 giờ nuôi

cấy: khuẩn lạc nhỏ, tròn, lồi, bóng, màu hơi xám (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977)

Liên cầu có sức đề kháng kém đối với nhiệt độ và hóa chất Ở 70°C liên cầu chết trong 35-40 phút, ở 100°C chết trong 1 phút Các chất sát trùng thông thường

Trang 18

Phần lớn các chủng Enerococeus faecalis đề kháng với cefaclor và các loại

cephalosporin khác Theo kiém tra tinh khang thuéc ctia Streptococcus faecalis phân lập từ bệnh viêm vú bò cho kết quả như sau: penicillin G (31,25%), ampicillin (26,67%), chloramphenicol (0,00%), chlortetracyclhine (18,75%), sulfonamide (12,50%), neomycin (0,00%), furazodiol (18,75%), streptomycin (37,50%) (Bùi Thị Tho, 2003)

Nguyễn Văn Phát và Lê Ngọc Thủy (2001) đã thực hiện một nghiên cứu

khác thực hiện trên mẫu sữa bò bị viêm vú Kết quả là Streptococcus faecalis nhay voi vancomycin (94,12%), chloramphenicol (79,42%), cephalexin (64,71%) Đề kháng mạnh với lincomycin (5,88%), ampicillin (11,76%) Riêng với penicillin (26,47%), ở mức trung gian do quá trình sử dụng lâu dài

Tính sinh độc tố: liên cầu khuẩn có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp Có rất nhiều loại kháng nguyên đã tìm thấy ở các liên cầu: nhóm A, B, C và D

(Nguyễn Vĩnh Phước, 1977) Liên cầu nhóm A có kháng nguyên protein M có khả năng tiết ra một ngoại độc tố là pyrogenic (erythrogenic toxin), độc tố này

tạo nên các nốt ban đỏ (liên cầu nhóm B, C rất ít khi có độc tố này), liên cầu trong nhóm A có khoảng 42 type, trong đó có 12 type rất quan trọng vì hay gây bệnh (Nguyễn Như Thanh và cv., 1997; Lưu Hữu Mãnh, 2010)

Ở người, thường gặp liên cầu trong nhiều bệnh nhiễm khuẩn như eczema,

gây mủ ở phủ tạng, viêm họng, mẫn đỏ Ở động vật, liên cầu thường gây nên những chứng mưng mủ, những bệnh chung hay cục bộ $ ƒø£cai¡s từ môi trường

vay nhiễm trên lơng và da chó, khi da chó có những tồn thương thì vi khuân này

sẽ gây viêm da kế phát (Merchant eí al., 1967) Trong phịng thí nghiệm: thỏ là

động vật thí nghiệm dễ cảm thụ nhất Nếu tiêm liên cầu vào dưới da cho thỏ sẽ

thấy áp xe tại nơi tiêm Nếu tiêm liên cầu vào tĩnh mạch hay phúc mạc thỏ chết nhanh do nhiễm trùng huyết, ngoài ra có thể dùng chuột nhất để gây bệnh (Nguyễn Nhu Thanh va ctv., 1997) Trong tự nhiên, liên cầu có ở khắp nơi trên

cơ thể người và động vật, bình thường chúng cư trú ở họng và ruột, một số liên

cầu có khả năng gây bệnh cho người và động vật (Lưu Hữu Mãnh, 2010)

2.2.2 Nhóm vi khuẩn Gram âm

2.2.2.1 Vi khuẩn Escherichia coli (E coli)

Escherichia coli thuộc họ Enferobacteriaeceae Được xem là nguyên nhân

Trang 19

E coli là một trực khuẩn Gram âm hình gậy ngắn, kích thước 2-3 x 0,6 um,

hai đầu tròn, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn, có lông ở chung quanh thân nên có thể di động, khơng hình thành nha bào, thỉnh thoảng thấy hiện tượng

bat mau 6 2 dau E coli thường ở phần dạ dày ruột của heo nhưng gây bệnh đường ruột và ngoài đường ruột ở heo (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977)

Theo Merchant and Packer (1967) và Nguyễn Vĩnh Phước (1977), trực

khuẩn hiếu khí và hiếu khí tùy tiện có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ 15 dén 24°C,

nhiệt độ thích hợp 37°C, pH thích hợp 7,4 Nhưng sự tăng trưởng có thể xảy ra trong khoảng 15°C đến 45°C Phát triển tốt nhất ở mật độ pH = 7 nhưng phát triển trong phạm vi pH rộng hơn E coii không sinh nha bào, chịu được nhiệt độ đun

55°C trong 1 giờ, 60°C trong 30 phút và 100°C chết ngay Các chất sát trùng

thông thường: acid phenic, biclorua thủy ngân, formol, hydroperoxit 1%o diệt được vi khuẩn trong 5 phút (Nguyễn Như Thanh va ctv., 1997)

Theo Nguyễn Như Thanh và cv (1997), trên thạch thường sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạc trịn, ướt, khơng trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi,

đường kính 2-3 mm Nuôi lâu khuẩn lạc hình như nâu nhạt và mọc rộng ra Trong môi trường nước thịt E col¿ phát triển làm môi trường rất đục có cặn màu tro

nhạt lắng xuống đáy, đơi khi có máng màu xám nhạt trên mặt, môi trường có mùi thi

Trên mơi trường EMB, E coi hình thành những khuẩn lạc to trịn, hơi lồi,

bóng, màu tím bằm, có ánh kim (Trần Thị Phận, 2004)

Trên môi trường MC, E coli hinh thành khuẩn lạc to tròn đều, hơi lồi, màu hồng nhạt, kích thước 2 — 3 mm (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977)

Escherichia coli nhạy cảm với polymycin, dihydrostreptomycin, chlortetracycline, tetracycline, oxytetracycline 6 muc trung binh Penicillin, oleandomycin, furaltadone va nicroxyzone ít hiệu quả nhat (Merchant and Packer, 1967)

Nam 1999, Lé Van Tao da cho biét hién nay có 12% Escherichia coli da kháng với 7 loại thuốc, 32% đa kháng với 6 loại thuốc, 40% đa kháng với 5 loại

thuốc, 10% đa kháng với 4 loại thuốc và 6% đa kháng với 3 loại thuốc (Bùi Thị

Tho, 2003)

Trang 20

Mặc dù có sẵn trong ruột động vật nhưng chỉ gây bệnh khi sức đề kháng của

con vật kém, chăm sóc quản lý chăn nuôi kém E coi thường gây bệnh cho con vật mới đẻ 2-3 ngày, có khi từ 4-8 ngày, gây bệnh đường ruột cho ngựa, bê, cừu,

heo con, gia cầm non (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977) Ở heo trưởng thành, E coli còn là một trong những nguyên nhân gây viêm đường tiết niệu đưa đến viêm vú,

hội chứng MMA (Bertschinger, 1993) Trong phịng thí nghiệm, tiém E coli dudi da cho chuột bạch, chuột lang, thỏ có thé gây viêm cục bộ, nếu tiêm liều cao có sinh ra bại huyết, làm chết con vật Thường gọi Colibacillois là một bệnh đường

ruột: ngựa, bê, cừu, heo và gia cầm non do E coli gây ra Ở người cũng có thể

gây viêm phơi, viêm não, đặc biệt bệnh tiêu chảy ở trẻ em (Nguyễn Thị Chính và Trương Thị Hịa, 2005) Tính gây bệnh trong ruột, vi khuẩn gắn vào niêm mạc ruột nhờ tiêm mao, độc tố do vi khuẩn tạo ra được hấp phụ vào niêm mạc ruột

Độc tổ dễ bị nhiệt phá hủy kích thích men adenylcyclase làm biến đổi ATP thành

AMP Độc tố bền vững với nhiệt làm tăng sự tiết ion CÏ và ức chế sự hấp thu

Na? gây mất nước (Lưu Hữu Mãnh, 2010)

Theo nghiên cứu gần đây của Nguyễn Thị Minh Trang và cứ (2011), thực hiện trên heo con 1-60 ngày tuổi tại tỉnh Trà Vinh đã cho kết quả, vi khuẩn Escherichia coli nhạy cảm mạnh với imipeneme (97,06%), nhạy cảm tương đối với gentamycin (46,03%), streptomycin (39,68%), ciprofloxacin (38,97%), enprofloxacin (32,35%), amoxicllin/clavulanic acid (30,15%) Vi khuẩn đề kháng

cao với nhiều loại kháng sinh gồm tetracycline (97,06%),

trimethoprim/sulphamethoazole (86,51%), colisin (86,51%), florfenicol (80,95%), streptomycin (60,32%), gentamycin, cephalothin lần lượt là 53,17% và 25%

Theo Bùi Thị Tho (2003), kết quả kiểm tra tính kháng thuốc của vi khuẩn

phân lập từ heo con bệnh phân trắng của bộ môn Nội Chân Dược Độc chất học trường Đại học Nông nghiệp I (Hà Nội) từ năm 1976 đến nay cho thấy tý lệ

kháng thuốc của Eseherichia coli đối với chloramphenicol là 25,78%, với

chlortetracycline là 23,21%, với streptomycin và sulphonamide lần lượt là

71,07% , 89,97%

2.2.2.2 Vi khudn Pseudomonas aeruginosa (P aeruginosa)

Truc khudn mu xanh Pseudomonas aeruginosa con cé tén 1a Pseudomonas pyocyaneus, thuộc l6p Gamma Proteobacteria, chi Pseudomonadales 1a vi khuan có độc lực thấp, thường tìm thấy trong quá trình mưng mủ ở bò, heo và trong các

Trang 21

vết thương nhiễm trùng của người Trong tự nhiên vi khuẩn có trong đất, nước,

khơng khí, sống hoại sinh ở da và niêm mạc, phân người và gia cầm (Nguyễn

Vĩnh Phước, 1977)

Pseudomonas aeruginosa có dạng hình que mỏng, gram âm, kích thước 0,5-

1 um x 1,5- 4 um, hai đầu tròn, đứng riêng từng đơn vị hoặc từng đôi, từng chuỗi

ngắn và đơi khi cịn tồn tại dạng hình sợi, hình dấu phây, hình cầu, chuyển động

bằng tiên mao, không sinh bào tử và khơng có vỏ nhày (Nguyễn Vĩnh Phước,

1977)

Theo Kenneth Todar (2008), Pseudomonas aeruginosa là VI khuẩn hiếu khí và yếm khí không bắt buộc, mọc ở nhiệt độ từ 30-37°C, giới hạn nhiệt độ phát

triển 5— 42C, pH thích hợp là 6,6-—7,0

Môi trường nước thịt: đục đều, hình thành màng và cặn, canh trùng nhuộm màu xanh, màu vàng trở nên sậm khi lắc canh trùng Canh trùng già trở nên nhớt và thành sợi

Theo Trần Linh Thước (2006), trên thạch: khuẩn lạc khơng trịn, bóng, dẹt, to, ria khơng phẳng có dạng nhầy Lồi này có khả năng tăng trưởng trên môi trường nghèo dinh dưỡng với khoáng và nguồn carbon như: acetate, pyruvate, succinate, glucose

Trên môi trường dinh dưỡng khuẩn lạc trịn, bóng, mơi trường trở nên xanh, trên thạch máu gây dung huyết Canh khuẩn đục đều có màu vàng sau đổi sang xanh, canh trùng già trở nên nhớt và có sợi (Tơ Minh Châu và Trần thị Bích Liên,

2006)

Trong mơi trường dinh dưỡng dạng lỏng như NB, TSB, vi khuẩn làm đục mơi trường, hình thành màng và cặn, canh trùng già làm môi trường trở nên nhớt (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977)

Trên môi trường thạch dinh dưỡng như Trypticase Soy Agar (TSA), Nutrient Agar (NA) khuẩn lạc hơi trịn, rìa khơng phẳng, trong óng ánh, mơi trường xung quanh khuẩn lạc màu xanh, mùi trái cây (Carter G.R, 1978)

Trên môi trường thạch máu: có dung huyết Huyết thanh đông: tan chây một

phần sau 14 ngày và sữa đơng, sau đó pepton hố

Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1977), Pseudomonas aeruginosa sông rất lâu trong môi trường nuôi cấy và trong thiên nhiên, bị diệt sau khi dun 55°C trong 2

Trang 22

giờ và chết nhanh chóng ở 100%C Theo Lê Huy Chính (2007), trong mơi trường

ẩm, thống, khơng có ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp, chúng sống được hàng

tuần Trong môi trường có đinh dưỡng tối thiểu, ở 59C chúng có thể sống hơn 6

tháng

Pseudomonas aeruginosa là vì khuẩn duy nhất tiết ra pyocyanin Vì vậy bat cứ trực khuẩn gram âm nào tiết ra pyocyann chính 1a Pseudomonas aeruginosa (Botzenhart and Ruden, 1987)

Pseudomonas aeruginosa co duge tinh khang thuéc cao là do cấu tạo của màng tế bào làm giảm khả năng thắm của kháng sinh vào bên trong tế bào của vi khuẩn, một yếu tế khác là do Psewdomonas aeruginosa có mang plasmid — R có khả năng truyền gen kháng thuốc qua trung gian plasmid (Lê Huy Chính, 2007)

Pseudomonas aeruginosa 1a vi khuan khang thuéc phé bién, do dé la mét loài gây bệnh nguy hiểm, chỉ còn một số ít kháng sinh có tác dụng với nó như:

fluoroquinolone, gentamycin va imipenem (Tran Linh Thước, 2006) Theo

Bonfiglio et al., (1998), Pseudomonas aeruginosa khang mot số kháng sinh: Meropenem 9,1%, ceftazidime 13,4%, carbenicillin 27,3%, ticarcillin/clavulanic acid 22,8%, amikacin 10,6% và ciprofloxacin 31,9%

Theo Hoang Kim Tuyén va ct (2005), nghiên cứu trên người cho thấy, Pseudomonas aeruginosa kháng mạnh với cefoperazone va nhóm

aminoglycoside (65-70%) Kháng sinh thông dụng như ceftazidime cũng chỉ còn nhạy cảm khoảng 50%

2.2.2.3 Vi khudn Salmonella spp

Vi khuan Salmonella thuéc b6 Enterobacteriales, ho Enterobacteriaceae

Nguyễn Vĩnh Phước (1977), giống Salmonella spp gồm trên 500 loài Loài

dai dién 1a Salmonella cholerasuis, truc khuan pho thương hàn heo, do Salmon va Smil phan lập ra từ nam 1885 tir heo mắc bệnh dịch tả Vi khuẩn có kích thước 0,4-0,6 um x 1-3 um, là vi khuẩn gram âm, hình gậy ngắn, hai đầu trịn, khơng sinh nha bào, khơng hình thành giáp mơ, có khả năng di động mạnh do trên thân có lông (7-12 lông chung quanh thân) trừ Saửnonella pullorum và Salmonella gallinarum Vi khuẩn dễ nhuộm với các thuốc nhuộm, khi nhuộm bắt màu đều toàn thân hoặc hơi đậm ở hai đầu

Vi khuẩn Salmonelia spp vừa hiếu khí, vừa yếm khí, dễ ni, nhiệt độ thích hợp là 37C, pH từ 7,2-7,6, vi khuẩn này sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí

Trang 23

kém hơn trong điều kiện yếm khí, phát triển tốt trong cơ thể, trong môi trường trung tính hay kiềm (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977)

Môi trường nước thit: cấy vi khuẩn vài giờ đã đục nhẹ, sau 18 giờ đã đục

đều, ni cấy lâu thì đáy ống nghiệm có cặn, trên bề mặt mơi trường có màng

mỏng (Nguyễn Như Thanh va ctv., 1997)

Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1977), vi khuân có sức đề kháng yếu với nhiệt

độ, bị tiêu diệt ở nhiệt độ 60°C trong 1 gid, 70°C bi diét trong 20 phút, 75C trong

5 phút Ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp diệt vi khuẩn trong nước sau 5 giờ, trong nước đục sau 9 giờ Các chất sát trùng thông thường cũng diệt vi khuân hoàn toàn: phenol 5%, formol 2% diệt vi khuẩn trong 15-20 phút Salmonella spp có thể tồn tại trong nước, nước thải, phân gia súc — gia cầm, thực phẩm, thức ăn gia súc một thời gian dài Trong xác động vật chết có thế sống 100 ngày, trong

đất bùn hoặc cát khô Trong thịt ướp muối nồng độ 29%, ở nhiệt độ 6 — 120C có

thể sống từ 4 — 8 tháng

Theo Bùi Thị Tho (2003), Salmonella spp có tỷ lệ kháng thuốc với nhiều loại kháng sinh: tetracycline va nalidixic acid (82,4%), amoxicillin (76,5%), sulfonamide (64,7%), chloramphenicol (58,8%), cotrimoxazole/bactrim (52,9%), kháng thấp với cefoxitine (5,9%), gentamycin va cephalothin (23,5%)

Theo Trần Thị Phận và ctv (2004), tir tháng 12 năm 2000 đến tháng 4 năm

2004 ở Tân Phú Thạnh, thành phố Cần Thơ trong 30 chủng Salmonella cé 11

chủng đề kháng với kháng sinh chiếm 36,6%, trong đó 7 chủng kháng với 1 loại kháng sinh và 4 chủng kháng với 2 loại kháng sinh Tỷ lệ kháng ampicillin (54,5%), chloramphenicol (36%), tetracycline (36%), cephalexin (9%)

Tính sinh déc t6: Salmonella tiết ra 2 loại độc tố đó là nội độc tố và ngoại

độc tố (Koupal, 1997)

Tính gây bệnh: tính gây bệnh trên con vật còn phụ thuộc vào độc lực của ching vi khuan Salmonella, strc dé khang cua cơ thể ký chủ, số lượng mầm bệnh

nhiễm vào va con đường xâm nhập của chúng (Wilcock, 1992) Vi khuẩn

Salmonella có thê gây bệnh đường ruột cho người, gia súc, gia cầm gọi là bệnh

thương hàn, phó thương hàn, nhiễm trùng huyết và viêm ruột Bình thường có thé phát hiện vi khuẩn Salmonella trong ruột của người, bò, heo, gà, vịt và một số

động vật khỏe mạnh Trong điều kiện sức đề kháng của động vật giảm sút, vi

Trang 24

2.2.2.4 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila (A hydrophila)

Ho Aeromonadaceae Bộ Aeromonadales

Lớp Gammaproteobacteria

Nganh Proteobacteria

Trong giống Aeromonas có hai nhóm:

Nhóm 1: Aeromonas không di động (A salmonicida) thường gây bệnh ở

nước lạnh

Nhóm 2: Là các lồi Aeromonas di động, bao gồm Aeromonas hydrophyla, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria (Bùi Quang Tả, 2006)

Bệnh đốm đỏ còn gọi là bệnh xuất huyết, nhiễm trùng máu, bệnh sởi Là bệnh do vi khuan Aeromonas hydrophila gay ra (Tw Thanh Dung va ctv., 2005)

Vi khuẩn hình que ngắn, hai đầu hơi tròn, Gram âm, ky khí, kích thước 0,5

x 1,0-1,5 um, di chuyên bằng tiên mao (Bùi Quang Tề, 2006).Vi khuẩn có tăng

trưởng tối ưu ở 28°C, nhưng cũng có thê phát triển từ 4°C đến 379C Sinh trưởng

trong mơi trường có độ pH thích hợp 7,1-7,2 Trên môi trường thạch, sau 24 giờ

khuẩn lạc trịn, rìa đều hơi lỗi, ướt, nhẫn bóng, màu vàng rất nhạt (Từ Thanh Dung va ctv., 2005) Khuẩn lạc màu kem, trịn, lớn lên, đường kính từ 2-3 mm phát triển trong vòng 48 giờ ở 25°C (Austin and Austin, 1993)

Sức đề kháng: Aeromonas hydrophila kháng nhiều kháng sinh mạnh như ampicillin (100%), tetracycline (26%), oxacillin (100%), bacitracin (100%), streptomycin (26%), clindamycin (43%), nalidixic acid (26%), novobiocin (87%), rifampicin (4%), vancomycin (9%) (Orozoval et al., 2008)

A hydrophila có khả năng sinh các độc tố như: độc tố đường ruột (enterotoxins), dung huyết (hemolysins), phân giải protein (proteinase), độc tố gây hoại tử da (dermonecrotic), đông máu (haemagglutinins) và nội độc tố (endotoxin) (Cahill, 1990)

Theo Bùi Quang T và cứ (2004), ở Việt Nam cá nuôi lồng, bè và ao hồ

nước ngọt đều có thê bị bệnh đốm đỏ do A hydrophila như: trắm cỏ, cá trôi, cá

chép, cá mè, cá basa, cá bỗng tượng, tôm càng xanh, tỷ lệ tử vong ở động vật

thủy sản thường 30-70%, nhưng ở giai đoạn giống của cá trê, basa có thể là

Trang 25

100% Theo Josh Martin (2004), ở người vi khuẩn được lây truyền qua đường

miệng do tiếp xúc với thức ăn, nước uống, chất thải, phân bị nhiễm khuẩn hoặc do ăn phải cá hay bò sát bị nhiễm bệnh và xâm nhập qua vết thương hở trong môi

trường nước có sự hiện diện của vi khuẩn Thời kỳ đầu người bệnh sốt va cam lạnh Sau đó vết thương bị nhiễm trùng gây buồn nơn, ói mửa, tiêu chảy Nếu

điều trị kịp thời với thuốc thích hợp thì kết quả rất tốt Trường hợp nặng hơn thường phải cắt bỏ vùng mô bị nhiễm trùng Khi điều trị có thể sử dụng một số

khang sinh nhu: chloramphenicol va tetracycline (http://www.web.mst.edu)

2.2.2.5 Vi khudn Edwardsiella ictaluri (E ictaluri)

Giống Edwardsiella ¡ictadluri thuộc họ Enterobacteriaceae, b6 Enmterobacteriales, lớp Gammaproteobacteria, ngành Proteobacteria, được công

bé 1981 (Hawke et al., 1981) E ictaluri la tac nhân chính gây bệnh gan thận mủ

trên cá tra Việt Nam, chủ yếu ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long (Từ Thanh Dung va ctv., 2005)

Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 1a vi khuan Gram âm, không di động, lên

men, khơng oxi hóa Cho phản ứng catalase dương tính, âm tính trong phản ứng

oxidase Vi khudn Edwardsiella ietaluri có dạng hình que, có kích thước biến

đổi Eawardsiella ictaluri phát triển tốt ở 28°C, kém phat triển ở 37°C (Từ Thanh Dung va ctv., 2005)

Theo Hawke eft al., (1981), Edwardsiella ictaluri 1a loài thuộc

Enterobacteriaceace, Gram âm, hình que ngắn, kích thước 0,75 x 1,5-2,5 um, di động chủ yếu ở 25-30°C không di động ở nhiệt độ cao hơn Catalase đương tính,

cytochrom oxidase âm tính va lén men glucose Khéng sinh H2S va indole 4m

tính Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phát triển trên môi trường TSA (trypticase soy agar), tir 36-48 gid tai 18-28°C

Vi khuẩn này có nhiệt độ tối ưu từ 25 - 31°C, phát triển tốt trên môi trường

thạch thường Ở 25°C, sau 24 giờ nuôi cấy vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc tròn nhỏ, màu trắng tro, bóng láng (Phạm Hồng Son, 2005) Edwardsiella ictaluri có khả năng gây dung huyết, nhưng dấu hiệu của sự dung huyết chỉ xuất hiện một vùng hẹp xung quanh khuân lạc

Edwardsiella ictaluri có khả năng tồn tại ở môi trường pH khoảng 3-4, di

động ở 25°C và phát triển được ở độ muối 1,5%, vi khuân có khả năng đề kháng

tác động của muối mật Tuy nhiên, khả năng chịu đựng nồng độ muối cao lại

Trang 26

kém, vi khuẩn không thể phát triển được ở môi trường dinh dưỡng có nồng độ muối khoảng 2-3% (Waltman et al., 1985)

Theo Austin and Austin (1993), vi khuẩn bị ức chế bởi các loại thuốc bao gồm cefaperazone, cinoxacin, kanamycin, moxalactam, neomycin, nitrofurantoin, acit oxolinic, streptomycin, ticarcillin va trimethoprim Tuy nhién, qua trung gian

plasmid da khang lai chat khang khuẩn như tetracycline Một ý kiến khác của

Stock (2001), Edwardsiella ictaluri man cảm tự nhiên với oxacillin và benzyl

penicillin nhưng cũng kháng tự nhiên với benzyl penicillin So với hầu hết các

loài khác trong họ Enterobacteriaceae thi Edwardsiella ictaluri man cam với

benzyl penicillin hon

Vi khuan Edwardsiella ictaluri đã có hiện tượng kháng với kháng sinh

streptomycin, oxytetracycline và trimethoprim Đặc biệt có 73% tổng số chủng đa

kháng với ít nhất 3 loại kháng sinh và vi khuẩn này bắt đầu có hiện tượng kháng với nhóm quinolone như: flumequin, oxolinic acid và enrofloxacin (Dang Thi

Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, 2012)

Vi khuẩn này gây bệnh gan thận mủ trên cá da trơn, một bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng cho các hộ nuôi cá tra, basa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long Tý lệ

xuất hiện bệnh này trên cá tra khoảng 61% Tý lệ chết cao nhất (60-80%) làm giảm năng suất dang ké cho các hộ nuôi Đây là một bệnh gây chết hàng loạt và

rất khó điều trị (Từ Thanh Dung, 2003)

Đầu năm 2006, Khoa Thủy Sản Trường Đại học Cần Thơ công bố kết qua

nghiên cứu tìm kiếm các loại kháng sinh thay thế các loại thuốc cắm, đã công nhận florfenicol là kháng sinh đặc trị bệnh này Sử dụng thuốc florfenicol liều 10

g/1 tấn cá từ 7-10 ngày sẽ cho hiệu quả tốt (Lê Thị Oanh Kiều, 2010)

2.2.2.6 Vì khuẩn Edwardsiella tarda (E tarda)

Edwardsiella tarda thuộc họ Enterobacteriaceae Edwardsiella tarda 1a vi

khuẩn gây bệnh nhiễm trùng huyết ở cá tra, bệnh thường xảy ra ở cá lớn (Bùi

Quang Tễ và c., 2004)

Tương tự như Edwardsiella ictaluri, Edwardsiella tarda cũng có dạng hình

que mảnh, Gram âm, kích thước 1 x 2-3 xm, không sinh bào tử, chuyển động nhờ vành tiêm mao, ky khí (Bùi Quang Té va ctv., 2004)

Theo Bui Quang TẾ và ctv (2004), Meyer and Bullock (1973), nuôi cấy Edwardsiella tarda trên môi trường TSA ở nhiệt độ 30°C thì khuẩn lạc thường

Trang 27

nhỏ phát triển sau 24 - 48 giờ Tăng trưởng chậm trên môi trường nuôi cấy và vi

khuẩn tăng trưởng rất chậm hoặc không tăng trưởng khi ủ ở 37°C

Edwardsiella tarda phát triên được trong môi trường muối 3% và ở nhiệt độ 40°C nên có thê tách riêng được với Edwardsiella ictaluri Edwardsiella tarda cũng mẫn cảm với các chất sát tring nhu: ethanol 70%, iodine, formaldehyde

Edwardsiella tarda c6 thé phat triển ở nồng độ muối từ 1,5-3% và nhiệt độ 25 -

35°C Ở nhiệt độ 37°C vi khuẩn có sức đề kháng kém (Bùi Quang Té va crv.,

2004)

E tarda là nguyên nhân gây nhiễm khuẩn ở cá nước ấm, đặc biệt là cá da

trơn (bệnh đốm trắng trên cá da trơn), ngồi ra vi khuẩn cịn cảm nhiễm ở cơ thé

một số động vật máu lạnh khác như: rắn, cá sấu, bò sát, lưỡng cư và một số động vật thủy sản khác (Bùi Quang Té va ctv., 2004)

E tarda gây bệnh ở cá với các triệu chứng: xuất hiện các vết thương nhỏ 3-

5 mm trên da (nằm ở mặt lưng và hai bên cơ thể), những vết thương này sẽ phát

triên thành các vùng áp xe bên trong cơ thể, sưng lên rat dé nhận biết, da cá mắt

đi sắc tổ bình thường Cá mắc bệnh sẽ mắt dần khả năng vận động do đuôi bị tua

rách, có thể xuất hiện những vết thương bên dưới biểu bì, cơ, khi ấn vào có mùi

hơi thối do hoại tử Quan sát mô bệnh học cho thấy các vết thương tốn được đặc trưng bởi hoại tử, thường phát triển ở mô cơ, mô tạo máu và mô gan (Bùi Quang

Té va ctv., 2004) Người ta đã phân lập được E :arda gây bệnh ở nhiều loài cá

nước ngọt như: cá tré song (Ictalurus punctata), cá hồi (Oncorhynchus), cá rô phi (Tilapia nilotica) (Tu Thanh Dung va ctv., 2005) E.tarda 1a loai nguy hiém cua Edwardsiella, gay bệnh trên cá da trơn, động vật thủy sản, người, động vat lớn, động vật hoang dã, động vật máu lạnh, chuột và chim (Manchanda, 2006)

Trang 28

CHƯƠNG 3

NOI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian: Từ 08/2012 đến 11/2012

Địa điểm trồng mẫu để phân tích: 15 mẫu cây được trồng trên 15 chậu tại

quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ

Địa điểm tiến hành thí nghiệm: phịng thí nghiệm Dược lý-Bộ môn Thú y

thuộc khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại học Cần Thơ

3.2 Nội dung nghiên cứu

- Điều chế cao thô

- Hiệu suất chiết xuất cao thô

- Khả năng kháng khuẩn của 4 dòng Lược vàng 3.3 Phương tiện nghiên cứu

3.3.1 Nguyên liệu

Gồm 4 dòng Lược vàng từ kết quả phân tích đa dạng di truyền bằng kỹ

thuật dấu phân tử RAPD cây Lược vàng (Phan Thị Tư, 2013): bộ phận dùng lá

3.3.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất chính

Tủ sấy dụng cụ thủy tỉnh (Classware Drying Oven), tủ ấm (Incubator), máy

lọc chân không, Autoclave, máy cô quay chân không, tủ sấy, cân điện tử, micropipette, pipet, bình nón, phéu, đũa thủy tỉnh, đĩa petri, que cấy, ống nghiệm,

ống đong (100 ml, 50 ml và 10 ml), chai nấu mơi trường

Hóa chất: methanol, dung môi DMSO, môi trường MHA (Mueller Hinton

agar), NA (Nutrient agar), nước muối sinh lý 9%o, nước cất, cồn 709, cồn 90°,

BaCl:.2H:O, H;SOa

3.3.3 Vi khuẩn thí nghiệm

Các chủng vi khuẩn dùng trong thí nghiệm có nguồn gốc từ Viện Pasteur

thành phố Hồ Chí Minh bao gồm:

- Ching Staphylococcus aureus 081008

Trang 29

Chung Streptococcus faecalis 010408 Chung Escherichia coli 101008

Chung Pseudomonas aeruginosa 1110008 Chung Salmonella spp 291003

Ching Aeromonas hydrophila 011004 va Edwardsiella tarda 280208 Chung Edwardsiella ictaluri CFA 258 - An giang, 2006 (thuộc bộ sưu tap vi khuẩn của Bộ môn Sinh học và Bệnh học Thủy sản-Khoa Thủy sản-Đại học

Can Tho)

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Điều chế cao thô 3.4.1.1 Cách thu mẫu

Lá cây Lược vàng làm thí nghiệm được hái vào buổi sáng (khoảng 8-10 giờ), loại bỏ những lá bị sâu ăn, lá màu vàng và rửa sạch

3.4.1.2 Cách chiết xuất cao thô

Tiến hành thu hoạch khoảng 300g lá (ở mỗi dòng, chiều dài lá tối thiểu 20cm) Sau đó rửa sạch và sấy khô ở 50°C, sấy cho đến khi khơ giịn Mẫu khô

đem nghiền nhỏ và ngâm chiết trong methanol (tỉ lệ mẫu và methanol là 1:1) ở

nhiệt độ phòng trong 3 ngày, chiết lấy dịch chiết rồi tiếp tục ngâm lại với methanol trong 2 ngày (chiết 1 ngày/lần) Loại dung môi dịch chiết và cô đặc

bằng máy cô quay chân không ở nhiệt độ 40°C đến cắn, được cao thô sử dụng thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn (Nguyễn Văn Đàn và Nguyễn Viết Tựu, 1985)

3.4.1.3 Tính hiệu suất chiết xuất

Cao Lược vàng sau khi cô quay được tính hiệu suất theo công thức sau:

Mecao

HS = THmấẫu tươi xI00

HS: hiệu suất chiết xuất (%)

Meao: trọng lượng cao sau cô quay (g)

mmậu tơi: trọng lượng mẫu tươi (g)

Trang 30

3.4.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cây Lược vàng

Xác định nồng độ ức chế tối thiểu áp dụng theo phương pháp pha loãng liên tiếp trong thạch (Nguyễn Thanh Bảo và cv., 2005)

3.4.2.1 Chuẩn độ đục

Độ đục chuẩn McFarland 0,5 dugc sit dung để điều chỉnh độ đục của huyễn

dịch nuôi cấy vi khuẩn cho thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh Độ đục chuân MeFarland 0,5 phải được chuẩn bị và kiểm định chất lượng trước khi làm thử

nghiệm

Độ đục MacFarland 0,5 được pha ché nhw sau: cho 0,05 ml BaCh 0,048M

(1,175% BaClz.2H›O) vào 9,95 ml H2SOu, sau dé lac déu dé tao huyén dich cé

mau trang đục Điều chỉnh độ đục của huyễn dịch sao cho mật độ quang khi đo ở bước sóng 625 nm nằm trong khoảng 0,08 - 0,10

Chuẩn độ đục được bảo quản ở nhiệt độ phòng và để trong bóng tối, trước

khi sử dụng phải lắc mạnh dé làm tan các hạt BaSO¿ kết tủa trong ống nghiệm

3.4.2.2 Chuẩn độ vi khuẩn

Các chủng vi khuân gốc được nuôi cấy tăng sinh riêng trên môi trường NA

Sau đó ủ ở nhiệt độ 2§-30°C trong 24-48 giờ đối với chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri va Edwardsiella tarda U 6 nhiét độ 37°C trong 24 giờ đối

voi ching vi khuan: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus faecalis, Salmonella spp, Aeromonas hydrophila

Ding que cay đã được tiệt trùng, lay lần lượt từng khuẩn lạc mọc trên đường cấy cho chúng vào các ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch NaCl 0,9% (đã hấp tiệt trùng ở 121°C trong 15 phút) Tiếp đó, lắc đều các ống này để vi khuẩn

phân bố đều trong dung dịch tạo nên dung dịch Điều chính độ đục của các ống nghiệm bằng cách thêm từng khuẩn lạc sao cho giống độ đục của ống

MacFarland 0,5 Ta được các ống canh khuẩn nồng do 108 CFU/ml

Sau dé, ding pipette hut 0,1 ml ở nồng độ 108 CFU/ml, cho vào từng ống

nghiệm chứa sẵn 9,9 ml NaCI 0,9% để tạo ra canh khuân có nồng độ vi khuẩn là 10° CFU/ml Thực hiện lần lượt với 8 vi khuẩn, mỗi vi khuẩn sử dụng | pipette Vi khuẩn sau khi điều chỉnh độ đục được sử dụng trong vòng l5 phút và được lắc lên trước khi sử dụng

Trang 31

Quy trình chuẩn độ vi khuẩn được tóm tắt qua sơ đồ 3.1 Vi khuẩn Ỷ Cây Môi trường NA Ủ ở28-37°C từ 24-48 giờ Mật độ vi khuẩn 108 CEU/ml | Pha loãng 100 lần Mật độ vi khuẩn 105 CFU/ml

Sơ đồ 3.1: Quy trình chuẩn độ vi khuẩn

3.4.2.3 Chuẩn bị nông độ chất thử

Lần lượt cân 0,8 g mỗi loại cao vào beaker, thêm 10 ml dung môi DMSO đã được tiệt trùng, tạo nên dung dịch gốc có nồng độ 80000 ug/ml Dung dịch gốc được sử dụng để pha lỗng với mơi trường MHA tạo thành các dãy nồng độ khác nhau, khoảng nồng độ cần pha tùy thuộc vào MIC dự đoán của chất thử

Trong thử nghiệm này nồng độ sau được pha bằng 1⁄2 nồng độ trước, ta có mơi trường thử nghiệm với các nồng độ lần lot 1a: 4096 pg/ml, 2048 pg/ml, 1024

ug/ml, 512 ug/ml, 256 pg/ml, 128 ug/ml, 64 hg/ml, 32 pg/ml

Sử dụng beaker cân thạch một cách chính xác theo hướng dẫn của nhà sản

xuất Merck: 34 g MHA trong 1000 ml nước cất Sau khi tính tốn, cân lượng phù

hợp với từng nồng độ MIC, sau đó hịa tan vào lượng nước cất tương ứng

Hấp tiệt trùng môi trường MHA ở 121°C/15 phút, để ngudi dén 80°C

Dùng pipette thêm lượng dung dịch gốc tương ứng với từng nồng độ MIC, mỗi

nồng độ cần làm 2 đĩa và thêm 2 đĩa đối chứng ở nồng độ 4096 ug/ml Lắc đều

để đảm bảo dung dịch gốc tan đều trong MHA Tiến hành đồ vào đĩa petri đối với

nồng độ chất thử, đánh dấu phía trên và phía dưới đĩa thạch ngay sau khi đỗ đĩa,

để nguội cho thạch đông lại Thay dung dịch gốc là thay ống pipette

Trang 32

Dùng ngay các đĩa thạch trong ngày, nếu chưa dùng ngay thì gói kín và

bảo quản ở trong tủ lạnh (2-8°C) trong vòng 2 tuần Khi sử dụng, nếu mặt thạch

ướt thì phơi khô mặt các đĩa thạch trong tủ ấm (35-37°C) khoảng 15-30 phút

Không mở nắp đĩa thạch khi phơi đề tránh bị nhiễm khuẩn

3.4.2.4 Cay vi khuẩn

Chia đều đĩa petri thành 6 phần, đánh đấu từng phần tương ứng từng chủng

vi khuẩn Dùng micropipette cấy lần lượt 1 ul canh khuẩn nồng d6 10° CFU/ml lên bề mặt đĩa thạch cao Lược vàng

Cấy lần lượt 6 vi khuẩn $/aphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp va Aeromonas

hydrophila trén cing 1 dia, déi chủng vi khuẩn thì thay đổi đầu cấy Hai vi

khuẩn Edwardsiella ictaluri và Edwardsiella tarda cây trên cùng 1 đĩa (đĩa được

chia thành 2 phần)

Song song tiến hành cấy trên đĩa đối chứng, đĩa đối chứng là đĩa mà thê tích dung dịch gốc được thay thế bởi dung môi DMSO Sau khi cấy vi khuẩn, để yên

15 phút cho vết chấm khô Lật ngược đĩa thạch đã cấy, sau đó đem ủ ở nhiệt độ 28-30°C trong 24 - 48 giờ đối với chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri,

Edwardsiella tarda, i 6 37°C trong 24 giờ đối với chủng vi khuẩn

Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus faecalis, Salmonella spp, va Aeromonas hydrophila

3.4.2.5 Doc két qua

Doc két quả dựa vào quan sát sự không mọc của các khuẩn lạc trên môi trường chứa chất thứ nghiệm ở nồng độ thấp nhất đề xác định MIC Nồng độ chất

thử ở đó vi khuẩn khơng mọc, đó chính là nồng độ vi khuẩn bị ức chế

Quy trình chuẩn bị cao Lược vàng và xác định MIC được mô hình hóa ở sơ

đồ 3.2

Trang 33

Pha môi trường MHA Dung dịch gốc (80000 ug/ml)

Hấp 121°C 15 phút Dé dia | | | 4096 ug/ml 2048 ug/ml 32 pg/ml Dé yén 15 phút U 28-37°C Sau 24 — 48 gid Doc két qua | Loo 4

Sơ đồ 3.2 Quy trình xác định MIC 3.4.3 Chỉ tiêu theo dõi

- Hiệu suất chiết cao thô

- Nôồng độ ức chế tối thiêu (MIC) của cao thô

Trang 34

CHƯƠNG 4

KET QUÁ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả chiết xuất của 4 dòng Lược vàng

Hiệu suất chiết xuất cao của 4 dòng Lược vàng được trình bày qua Bảng 4.1

Bảng 4.1 Hiệu suất chiết xuất cao 4 dòng Lược vàng

Dòng Trọng lượng lá tươi(g) Trọng lượng cao(g) Hiệu suất (%) LV1 300 5,01 1,67

LV2 300 3,15 1,05 LV3 300 4,29 1,43 LV4 300 3,0 1,0

LV: cay Lugc vang

Qua bang 4.3 nhận thấy: hiệu suất chiết xuất của cao Lược vàng tương đối

thấp Hiệu suất đạt cao nhất ở dòng LVI là 1,67% và thấp nhất ở dòng LV4 là

1,0% Điều này cho thấy hoạt chất giữa các dòng trong cây Lược vàng tương đối

giống nhau

4.2 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với vi khuẩn của 4 dòng Lược vàng

Bằng phương pháp khuếch tán trên thạch, kết quá khảo sát hiệu quả kháng

khuẩn của cao Lược vàng trên 8 chủng vi khuẩn Sa aureus, Sirep ƒaecalis, E coli, Pseu aeruginosa, Salmonella spp, Aero hydrophila, Ed ictaluri, Ed tarda

được ghi nhận qua bảng 4.2

Trang 35

Báng 4.2 So sánh nồng độ ức chế tối thiểu của cao lá các dòng Lược vàng Vi khuẩn MIC (pg/ml) LV1 LV2 LV3 LV4 Sta aureus 512 1024 512 512 Strep faecalis 4096 2048 2048 4096 E coli 6400 6400 6400 6400 Pseu aeruginosa 4096 4096 2048 2048 Sal spp 6400 6400 6400 6400 Aero hydrophila 4096 2048 4096 2048 Ed ictaluri 1024 2048 2048 1024 Ed tarda 1024 2048 2048 2048

Ghi chi: Sta aureus (Staphylococcus aureus), Strep faecalis (Streptococcus faecalis), E coli (Escherichia coli),

Pseu aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa), Sal spp (Salmonella spp), Aero hydrophyla (Aeromonas hydrophila),

Ed tarda (Edwardsiella tarda), Ed ictaluri (Edwardsiella ictaluri) MIC (Minimum Inhibitory Concentration) LV:

cây Lược vàng

Từ kết quả bảng 4.2 cho thấy:

Đối với Staphylococcus aureus cao ca 4 dịng Lược vàng có hoạt tính

kháng khuẩn tốt nhất đối với vi khuẩn này ở nồng độ MIC từ 512 ug/ml đến 1024 ug/ml Trong đó nổi bật nhất là các dòng LV1, LV2, LV3 có cùng MIC= 512

ug/ml

Trén ching Strep ƒaecalis thì hoạt tính kháng khuẩn của cao các dòng

LV2 và LV3 là như nhau ở mức MIC= 2048 ug/ml, ở LVI và LV4 là MIC= 4096 g/ml

Trén 2 ching E coli va Salmonella spp thi hoat tinh kháng khuẩn của cao

4 dịng Lược vàng khơng có hiệu quả tốt khi ở nồng độ MIC 4096 pg/ml van không ức chế được 2 chủng vi khuẩn này (ở nồng độ cao nhất trong dãy nồng độ

là 4096 ug/ml nhưng không ức chế được 2 chủng vi khuẩn trên Chúng tôi pha thêm 2 nồng độ 5120 ug/ml và 6400 ug/ml Khi đó nhận thấy cao có khả năng ức chế được 2 chủng này & néng d6 6400 pg/ml)

Trang 36

Trên chủng Pseu aeruginosa thi khả năng kháng khuẩn của 2 dòng LV3, LV4 là giống nhau với MIC= 2048 qg/ml và tốt hơn so với 2 dòng LVI,

LV2 (MIC= 4096 g/ml)

Trên ching Aero hydrophila thi dong LV2, LV4 co kha nang ức ché vi

khuan nay 6 MIC= 2048 pg/ml va tét hơn so với 2 dòng LV1, LV3 (MIC= 4096

ug/ml)

Trên 2 chủng gay bénh trén ca Ed tarda va Ed ictaluri thi hoat tinh kháng khuẩn của 4 dòng Lược vàng là khá tốt ở nồng độ MIC từ 1024 ug/ml đến 2048 ug/ml Trong đó hoạt tính kháng khuẩn của dòng LV1 là tốt nhất với MIC=

1024 ug/ml

Sự khác nhau về hoạt tính kháng khuẩn của cao 4 dịng Lược vàng được trình bày qua bảng 4.3

Bảng 4.3 So sánh khả năng kháng khuẩn của các dòng cao Lược vàng

Dòng LVI LV2 LV3 LV4 P/SE MIC 3456 3264 3200 3072 0,820/288,7 (ug/ml)

Ghỉ chú: MIC (minimum inhibitory concentration), p: mức ý nghĩa, SE: sai số chuẩn LV: cây Lược vàng

Mặc dù có sự khác biệt về khả năng kháng khuẩn trên từng chủng vi khuẩn

thí nghiệm nhưng qua bảng 4.3 cho thấy khơng có sự khác nhau về hoạt tính kháng khuẩn của 4 dòng cây Lược vàng, tính kháng khuẩn của dòng LVI thấp

nhất trung bình 3456 pg/ml và cao nhất là hoạt tính kháng khuẩn của dòng LV4 ở nồng độ trung bình 3072 pg/ml, su sai khác không có ý nghĩa về mặt thống kê (P > 0,05)

Kết quả so sánh khả năng kháng khuẩn của cao Lược vàng trên 8 chủng vi

khuẩn thử nghiệm được thể hiện qua bảng 4.4

Trang 37

Bảng 4.4 So sánh khả năng kháng khuẩn của cao Lược vàng trên các chủng vi

khuẩn thử nghiệm

VK E.coli Sal Strep Pseu Aero Ed Ed Sta spp faecalis aeruginosa hydrophila tarda ictaluri aureus MIC 6400* 6400* 30725 3072» 3072» 1792" 1536" 640° pg/ml

P/SE (0,00/408,3)

Ghi chi: Sta aureus (Staphylococcus aureus), Strep faecalis (Streptococcus faecalis), E coli (Escherichia coli), Pseu aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa), Sal spp (Salmonella spp), Aero hydrophila (Aeromonas hydrophila), Ed tarda (Edwardsiella tarda), Ed ictaluri (Edwardsiella ictaluri MIC (minimum inhibitory concentration), VK (vi

khuan)

Các chữ số trong cùng một hàng nếu khác nhau thì sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức 5% (p<0,05)

Qua kết quả thống kê ở bảng 4.4 cho thấy: khả năng kháng khuẩn của cao

Lược vàng trên 8 chủng vi khuẩn được thử nghiệm khác nhau rất có ý nghĩa thống kê (P=0,00)

Hoạt tính kháng khuẩn của cao Lược vàng trên 2 chung E coli, Salmonella spp sai khác rất có ý nghĩa thống kê so với các chủng còn lại (P < 0,01) Như vậy,

trong số 8 chủng vi khuẩn được thử nghiệm thì cao Lược vàng ức chế thấp nhất

trên 2 chủng này Trên các chủng vi khuẩn S/rep faecalis, Pseu aeruginosa,

Aero hydrophila hoạt tính kháng khuẩn của cao Lược vàng là như nhau và sai

khác khơng có ý nghĩa thống kê (P > 0,05) đối với 2 ching vi khuan Ed ictaluri

va Ed tarda; nhưng 3 chủng vi khuẩn này sai khác rất có ý nghĩa thống kê so với

chung Sta aureus (P=0,007 < 0,01) Hoat tinh khang khuẩn của cao Lược vàng là như nhau trên 2 chủng Ed ictaluri va Ed tarda Mat du, cao lược vàng ức chế 2 chủng này yếu hơn so với chủng 9/4 aureus nhưng sự sai khác khơng có ý nghĩa

thống kê ở mức 5% (P > 0,05)

Từ các kết quá trên cho thấy Cao Lược vàng tác động tốt trên chủng S4 aureus 0 nong độ 512 ug/ml Theo nghiên cứu của Trịnh Thị Điệp (2008) cao

chiết lá, thân Lược vàng ở nồng độ tối thiểu 0,171 g/ml và 0,1557 g/ml có tác

dụng kháng khuẩn với chủng Sta aureus tương đương với kháng sinh

azithromicin ở nồng độ 0,2 Iig/ml và 0,21 ng/ml Như vậy kết quả MIC chúng tôi

có được tốt hơn và nó cũng phủ hợp với các nghiên cứu về thành phần có trong cây Lược vàng khi nó chứa nhiều chất có tác dụng kháng khuẩn như hợp chất

Trang 38

flavonoid có chứa hoạt chất quercetin và kaempferol có tác dụng kháng khuẩn

kháng nam va khang virus (Tim Cushnie et al., 2005 ), hợp chất teroide có tác dụng diệt khuẩn, chống xơ vữa động mạch, kìm chế sự phát triển của các khối u

(Nguyễn Van Dau, 2011)

Trang 39

CHƯƠNG 5

KÉT LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ 5.1 Kết luận

Hiệu suất chiếc xuất cao của 4 dòng Lược vàng chênh lệch nhau khơng

đáng kế (nhóm LV1 là 1,67%, nhóm LV2 là 1,05%, nhóm LV3 là 1,43%, nhóm

LV4 là 1,0%) Do điều kiện hạn chế nên giống và chủng vi khuẩn thí nghiệm cịn ít, làm cho kết quả thí nghiệm chưa toàn diện Tuy nhiên, qua q trình thí

nghiệm cho thấy cây Lược vàng có tính ức chế vi khuẩn khá tốt Cao của 4 dòng

Lược vàng tác dụng tốt nhất trên vi khuẩn Staphylococcus aureus VỚI nồng độ 512 ug/ml < MIC < 1024 ug/ml Trén 3 chung Strep faecalis, Pseu aeruginosa, Aero hydrophila hoạt tính kháng khuẩn của 4 dòng cao Lược vàng là như nhau

(2048 pg/ml < MIC < 4096 ug/ml) Cao cua 4 dong Luge vang khéng cé tac

dung trén 2 chung vi khuan E coli va Salmonella spp khi & nồng độ MIC= 4096 ug/ml vẫn không ức chế được vi khuẩn này Trên 2 chủng vi khuẩn gây bệnh trên cá là E4 tarda và Ed ictaluri thì hoạt tính kháng khuẩn của 4 dòng Lược vàng là

kha t6t 6 1024 pg/ml < MIC < 2048 pg/ml va đạt hiệu quả tốt nhất là dòng LV1

(MIC= 1024 g/ml) Trong 8 chung vi khuẩn được dùng trong thí nghiệm thì cao 4 dịng Lược vàng có khả năng kháng khuẩn tốt nhất trén ching Staphylococcus

aureus Đạt hiệu quả kháng khuẩn tốt nhất trên cá 8 ching vi khuẩn thử nghiệm là dòng LV4

5.2 Đề nghị

Nên có những hướng nghiên cứu tiếp trên nhiều giống hơn, nhiều chủng

hơn, tiễn hành thí nghiệm xác định hoạt chất chính ức chế vi khuẩn, thử độc lực, xác định khả năng ứng dụng của cây Lược vàng trong điều trị bệnh do vi khuẩn gây ra trên gia súc, gia cầm, thủy sản

Trang 40

KHẢO TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu trong nước

1 Bùi Thị Tho, 2003 Thuốc kháng sinh và nguyên tắc sử dụng trong

chăn nuôi, NXB Nông Nghiệp Hà Nội, Tr 3-11, 110-118, 134-137,162

2 Bùi Quang Té (2006), Bénh hoc thuy san, Phan 2, Viện nghiên cứu nuôi trồng thúy sản 1, tr.173-175,161-165

3 Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, 2012 Thử nghiệm điều trị vỉ khuẩn Edwardsiella iclalui trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) bằng thuốc kháng sinh Erythromycin Thiocyanate, Tạp chí khoa

học, Trường Đại Học Cần Thơ, số 22c : 146-154

4 Đỗ Xuân Cẩm, 2009 Một vài dẫn liệu sinh học về cây Lược vàng,

Tạp chí nghiên cứu và phát triển, số 3(74):55-58

5 Hoang Kim Tuyến, Vũ Kim Cương, Đặng Mỹ Hương, 2005 Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh phân lập tại bệnh viện thống nhất 2002-2005 Hội nghị khoa học 2005

6 Lưu Hữu Mãnh (2010), Giáo trình vi sinh thú y, trường Đại học Cần Thơ, tr 4-20

1 Lê Huy Chính, 2007 Vi sinh vật y hoc, NXB Y hoc, Tr 7 -15

8 Lê Thị Oanh Kiều, 2010 Tình hình nhiễm bệnh xuất huyết và gan

thận mú trên cá tra giống tại huyện Thới Lai TpCT Luận văn thạc sỹ chuyên ngành Thú Y, Trường Đại Học Cần Thơ

9 Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiền và Trần Thị Lam Hương, 1997 Vi sinh thi y Nhà xuất bản Nông nghiệp 215-239

10 Nguyễn Văn Đàn và Nguyễn Viết Tựu, 1985 Phương pháp nghiên

cứu hóa học cây thuốc, Thanh Phé Hồ Chí Minh, NXB Y Học, tr.8-41

11 Nguyễn Thanh Bao (2003), Vi khuẩn học, Đại học y dược, TP Hồ Chí Minh

12 Nguyễn Vĩnh Phước (1977) Vi sinh vật thú y, tập II, NXB Đại học