báo cáo dna vaccine và công nghệ sản xuất plasmid dna

DNA VACCINE VÀ CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PLASMID DNA CBGD: PGS TS. Nguyễn Thúy Hương Lớp: HC07SH Nhóm: 1.Trần Tú Bửu 60700186 2.Lưu Ngọc Thanh Hương 60701035 3.Trần Hoàng Lâm 60701248 4.Bùi Vũ Ngọc Quỳnh 60702000 5.Nguyễn Xuân Quỳnh 60702005 NỘI DUNG A. Tổng quan B. Ứng dụng công nghệ gene trong DNA vaccine C. Công nghệ lên men sản xuất plasmid DNA A. TỔNG QUAN I. Sơ lược về vaccine II. DNA vaccine (cơ chế miễn dịch) I. Sơ lược về vaccine 1. Lịch sử hình thành - Năm 1776, bác sĩ Edward Jenner đã làm thực nghiệm để kiểm tra một quan niệm dân gian cho rằng người nào bị nhiễm bệnh gia súc thể nhẹ gọi là bệnh đậu bò sẽ không bị nhiễm bệnh đậu người. - Khi Jenner công bố kết quả thí nghiệm của mình, người ta chỉ hình dung là có các "mầm bệnh" gây nên sự truyền nhiễm. Tám mươi năm sau, Louis Pasteur nghiên cứu bệnh tả, Qua đó, Pasteur đã xác nhận các giả thuyết của Jenner và mở đường cho khoa miễn dịch học hiện đại. 2. Phân loại  Vaccine tiểu đơn vị  Vaccine giảm độc lực  DNA vaccine  Vaccine giảm độc lực - Vaccine chứa vi sinh vật đã bị làm yếu hay đã bị chết hoàn toàn. - Mặc dù có những thành công đáng kể trong việc tạo các vaccine hiệu quả chống lại các bệnh như ; viêm gan siêu vi A (virus bất hoạt), tả, uốn ván, đậu mùa… nhưng vẫn còn những hạn chế trong việc sản xuất vaccine hiện nay :  Không phải tất cả tác nhân lây nhiễm đều có thể nuôi cấy được.  Sản xuất vaccine có giá thành cao do sản lượng thấp và tốc độ sản xuất chậm.  Yếu tố an toàn trong sản xuất và tiêm phòng khó kiểm soát.  Thời gian sử dụng hạn chế, đòi hỏi bảo quản nghiêm ngặt.  Vaccine tiểu đơn vị - Khái niệm: vaccine dùng một phần kháng nguyên gây bệnh chứ không phải toàn bộ sinh vật gây bệnh. - Ưu điểm:  Chế phẩm bền và an toàn.  Không có các protein hay acid nucleic ngoại lai có thể gây phản ứng phụ. - Nhược điểm:  Giá thành cao trong việc tinh sạch protein.  Protein được phân lập có thể không cùng cấu trúc với loại in situ (ở vỏ ngoài hoặc capsid của virus) làm biến đổi tính kháng nguyên của protein đó.  DNA vaccine - Là thế hệ vaccine thứ ba. - Sự tiêm chủng DNA vaccine là một kỹ thuật giúp bảo vệ sinh vật chống lại những tác nhân gây bệnh bằng cách tiêm DNA mã hóa kháng nguyên gây bệnh nhằm tạo ra đáp ứng miễn dịch cho cơ thể. - DNA vaccine vừa mang tính chất của vaccine là tính chủng ngừa, vừa mang tính chất điều trị bệnh như một liệu pháp gen.  DNA vaccine Ưu điểm Nhượ c điểm  Không xảy ra sự hồi độc.  Kháng nguyên được trình diện bời cả MHC lớp I, II  Khả năng biệt hóa lympho T hỗ trợ theo 2 hướ ng Th1 và Th2, kích hoạt T độc tế bào.  Hiệu lực vaccine trong thời gian dài  Protein được dịch mã trong cơ thể sinh vật giống với cấu trúc thông thường của Eukaryote.  Không cần tổng hợp peptide, biểu hiện và tinh sạ ch protein tái tổ hợp, cũng như sử dụng các tá dược độ c  Dễ phát triển và sản xuất, ổn định trong bảo quản và vận chuyển  Hiệu quả kinh tế cao  Giới hạn trong nhữ ng bệnh gây ra bởi khá ng nguyên protein.  Nguy cơ tác động đế n bộ gen cơ thể sinh vật được tiêm chủng.  Có khả năng gây ra kháng thể kháng DNA (tự miễn dịch).  Có thể gây ra sự chị u thuốc (tolerance). II. DNA vaccine (cơ chế miễn dịch) Cơ chế hấp thu DNA Các nhà khoa học đưa ra 2 giả thuyết về cơ chế hấp thu DNA :  Cơ chế hấp thu không định hướng giống như cơ chế thực bào và ẩm bào (phagocytosis và pinocytosis)  Hoặc thông qua những thụ thể đặc biệt gắn trên màng (specific receptors). [...]... falciparum thực hiện ở Phase I/IIa  2010, vaccine ngừa sởi tiến hành thử nghiệm trên trẻ sơ sinh ở vùng Sahara, Châu Phi B Ứng dụng công nghệ gene trong DNA vaccine Thiết kế plasmid DNA II Chuyển giao plasmid (Delivery methods) III.Tá dược (Genetic Adjuvants) I I Thiết kế plasmid DNA 1 2 3 4 5 Yêu cầu Xây dựng plasmid DNA Thiết kế vector đa cistron Tối ưu thiết kế plasmid vector Tối ưu thiết kế gen... đoạn gen kháng sinh như penicillin hay β-lactam… Những loại kháng sinh này có thể gây dị ứng ở cơ thể người  1 Yêu cầu Yêu cầu trong sản xuất:  Cho sản lượng cao thông qua một quy trình sản xuất đơn giản Thường sử dụng Escherichia coli là vật chủ trong sản xuất plasmid, nên đòi hỏi vector phải có vùng sao chép hoạt động mạnh ở prokaryote  Chứa đoạn gen đánh dấu để dễ dàng chọn lọc dòng tái tổ... dựng plasmid DNA Chuẩn bị gen đích  Chuẩn bị plasmid  Chèn gen đích vào plasmid  Biến nạp và thu nhận pDNA  Kiểm tra kết quả chèn  Kiểm tra biểu hiện  Chọn plasmid pVAX1 là vector mang đoạn gen kháng nguyên  Chuẩn bị gen đích  Thiết kế mồi PCR : Chọn 2 vị trí giới hạn với điều kiện: 2 đoạn này có mặt trong vector pVAX1 và không có mặt trong đoạn gen đích Chọn NheI và XhoI và gắn lần lượt vào... đáp ứng kháng thể khá chậm, nhưng DNA vaccine gây đáp ứng sản xuất ra lượng kháng thể có chất lượng cao, tức là có ái lực với epitope mạnh nhất so với các loại vaccine khác  Ngoài ra sự đáp ứng kháng thể còn chủ yếu xảy ra theo cơ chế phụ thuộc T lympho cụ thể là T hỗ trợ  Những bước tiến triển thử nghiệm lâm sàng trong vài năm trở lại đây  1/2009, vaccine AS04 ngừa HPV 16/18 thực hiện... nhiễm  Một ưu điểm của DNA vaccine là có thể điều khiển sự biệt hóa theo hướng Th1 hay Th2  T hỗ Đáp  Một ứng T độc tế bào (CTL) trong những ưu điểm quan trọng nhất của DNA vaccine là khả năng gây ra đáp ứng CTL mà không gây ra những nguy hiểm như loại vaccine truyến thống sử dụng toàn bộ tác nhân lây nhiễm còn sống  Nhiều nghiên cứu nhằm tăng đáp ứng này II DNA vaccine (cơ chế miễn dịch)... dương tính 100%  1/2009, vaccine ngừa HIV có kết hợp và không kết hợp GM-CSF thực hiện ở Phase I với 80 tình nguyện viên  11/2009 vaccine thế hệ mới kích hoạt đáp ứng Th ngừa HIV thử nghiệm phase I  2009, DNA vaccine BHT-3021 ngừa bệnh tiểu đường type-1 thực hiện phase I/II  3/2010, vaccine ngừa cúm A gây ra bởi virus H5 hemaghluyinin thực hiện ở phase I  9/2010, vaccine ngừa sốt rét PfCS102... chất bằng cách tủa với ethanol  Chuẩn bị plasmid Cắt pVAX1 với NheI và XhoI và tinh sạch bằng điện di gel agarose  Thu nhận đoạn vector bằng bộ kit QIAquick Gel Extraction   Chèn gen đích vào plasmid  Thực hiện phản ứng nối gen đích vào vector với tỉ lệ (6-10):1 Phản ứng được thực hiện nhờ bộ kit Roche Rapid Ligation  Biến nạp và thu nhận pDNA Ủ hỗn hợp sau phản ứng nối với tế bào... Thiết kế plasmid đa cistron Sử dụng cặp plasmid pCI-1 và pCI-2 đều có sẵn đoạn gen kháng sinh ampicilin, CMV promoter và enhancer, yếu tố IRES (yếu tố cho phép quá trình dịch mã diễn ra ở giữa phân tử mRNA)  Ứng dụng các vị trí cắt giới hạn chuyên biệt trên vector để cắt, chèn và nối các đoạn gen đích với nhau  3 Thiết kế plasmid đa cistron 3 Thiết kế plasmid đa cistron 3 Thiết kế plasmid. ..II DNA vaccine (cơ chế miễn dịch) Trình diện kháng nguyên bởi APCs thông qua phân tử MHC  Việc trình diện kháng nguyên được thực hiện bởi DCs (dendritic cells), đại thực bào (macrophages), và những tế bào B chuyên biệt Các tế bào này được gọi là pro-APCs  Có 2 hướng trình diện kháng nguyên theo MHC I hay II  Ngoài ra còn có hiện tượng “cross-priming” (hay “cross-presentation”) II DNA vaccine. .. 10% FCS, 4mM L-glutamine, 100 µg/mL penicilin, và 100 µg/mL streptomycin Nuôi ở 37oC, 6% CO2 trong 24h Chuyển plasmid vào tế bào nhờ CellPhect Transformation kit Sau 5h, xử lý với 15% glycerol trong PBS (phosphate buffered saline_, pH 7.2, trong 2.5 phút để tăng cường hiệu quả chuyển plasmid Nuôi tiếp tục trong 48-72h Thu nhận và hòa tan tế bào trong dung dịch đệm Định lượng hàm lượng protein . quan B. Ứng dụng công nghệ gene trong DNA vaccine C. Công nghệ lên men sản xuất plasmid DNA A. TỔNG QUAN I. Sơ lược về vaccine II. DNA vaccine (cơ chế miễn dịch) I. Sơ lược về vaccine 1. Lịch. DNA VACCINE VÀ CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PLASMID DNA CBGD: PGS TS. Nguyễn Thúy Hương Lớp: HC07SH Nhóm: 1.Trần Tú Bửu 60700186 2.Lưu. nhân lây nhiễm đều có thể nuôi cấy được.  Sản xuất vaccine có giá thành cao do sản lượng thấp và tốc độ sản xuất chậm.  Yếu tố an toàn trong sản xuất và tiêm phòng khó kiểm soát.  Thời