so sánh trình tự gen lipid transfer protein (ltp) của giống lúa cạn thuộc nhóm chịu hạn tốt với giống lúa cạn thuộc nhóm chịu hạn kém

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN TRÀ MY SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN LIPID TRANSFER PROTEIN (LTP) CỦA GIỐNG LÚA CẠN THUỘC NHÓM CHỊU HẠN TỐT VỚI GIỐNG LÚA CẠN THUỘC NHÓM CHỊU HẠN KÉM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2011 `` Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên htt p ://www.lr c -t n u . e du. v n ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN TRÀ MY SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN LIPID TRANSFER PROTEIN (LTP) CỦA GIỐNG LÚA CẠN THUỘC NHÓM CHỊU HẠN TỐT VỚI GIỐNG LÚA CẠN THUỘC NHÓM CHỊU HẠN KÉM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên - 2011 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên htt p ://www.lr c -t n u . e du. v n LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố. Tác giả Nguyễn Trà My Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên htt p ://www.lr c -t n u . e du. v n LỜ I CẢ M Ơ N Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin cảm ơn ThS Nguyễn Thị Ngọc Lan và các thầy cô giáo, cán bộ Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, khoa Sinh – KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Tôi xin cảm ơn TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh và các cán bộ Bộ môn Sinh học phân tử & Công nghệ gen, Viện khoa học sự sống - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ tôi thực hiện các thí nghiệm của đề tài luận văn. Tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu trƣờng THPT ATK Tân Trào - Tỉnh Tuyên Quang đã tạo điều kiện cho tôi để hoàn thành khoá học cao học này. Tôi xin cảm ơn sự động viên, khích lệ của gia đình, bạn bè và đồng nghiệp trong suốt thời gian làm luận văn. Công trình đƣợc thực hiện với sự tài trợ kinh phí của dự án TRIG. Tác giả luận văn Nguyễn Trà My MỤC LỤC Trang bìa phụ Lờ cam đoan Lời cảm ơn Trang Mục lục i Danh mục các chữ viết tắt iii Danh mục các bảng iv Danh mục các hình v MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. CÂY LÚA CẠN 4 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại 4 1.1.2. Đặc điểm sinh học 6 1.1.3. Tình hình sản xuất lúa cạn trên thế giới và ở Việt Nam 8 1.2. ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY LÚA CẠN 12 1.2.1. Hạn và tác động của hạn đối với cây lúa 12 1.2.2. Cơ sở sinh lý, hóa sinh và phân tử của tính chịu hạn ở cây lúa 15 1.2.3. Một số nghiên cứu về đặc tính chịu hạn của cây lúa cạn 20 1.3. PROTEIN VẬN CHUYỂN LIPID (LTP) VÀ GEN LTP (LIPID TRANSFER PROTEIN) 21 Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 25 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 25 2.1.1. Vật liệu 25 2.1.2. Hóa chất và thiết bị 26 2.2. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 26 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.3.1. Phƣơng pháp sinh lí, hóa sinh 27 2.3.2. Ph ƣ ơng pháp sinh học phân tử 30 i Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC GIỐNG LÚA CẠN NGHIÊN CỨU 39 3.1.1. Tác động của hạn đến cây lúa cạn ở giai đoạn mạ 39 3.1.2. Hàm lƣợng prolin của các giống lúa cạn ở giai đoạn mạ 48 3.2. ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN LTP PHÂN LẬP TỪ HỆ GEN CỦA CÂY LÚA CẠN 50 3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số 50 3.2.2. Đặc điểm của trình tự gen LTP của hai giống lúa NA3 và NA6 51 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 61 NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT 1. Chữ viết tắt ABA Chữ viết đầy đủ Axit abscisic 2. AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism 3. ASTT Áp suất thẩm thấu 4. ATPase Adenosin triphosphatase (Enzym phân giải ATP giải phóng năng lƣợng) 5. bp base pair = cặp bazơ nitơ 6. cs Cộng sự 7. DNA Deoxyribose Nucleic Axit 8. EDTA Axit Ethylene Diamin Tetraaxetic 9. FAO Food Agriculture Orgnization (Tổ chức nông lƣơng thế giới) 10. HSP Heat shock protein (Protein sốc nhiệt) 11. IPTG Isopropyl- β -D-thiogalactopyranoside 12. IRRI International Rice Research Institute (Viện nghiên cứu lúa quốc tế) 13. kb Kilobase 14. LEA Late Embryogenesis Abundant protein 15. LTP Lipid transfer protein 16. MGPT Môi giới phân tử 17. PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) 18. RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Phân tích chiều dài các phân đoạn DNA cắt hạn chế) 19. RNase Ribonuclease 20. Sn Chỉ số chịu hạn tƣơng đối 21. SSR Simple Sequence Repeats (trình tự lặp lại đơn giản) 22. TAE Tris - Acetate – EDTA 23. Tris Trioxymetylaminometan 7 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Tình hình sản xuất và xuất khẩu lúa gạo của Việt Nam Giai Trang đoạn 1990 - 2009 9 Bả ng 2.1. Các giống lúa cạn sử dụng làm vật liệu nghiên cứu 25 Bảng 2.2. Danh mụ c cá c thiế t bị sƣ̉ dụ ng 26 Bảng 2.3. Mồ i nhân gen LTP ở lúa 32 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng nhân gen LTP 33 Bảng 3.1. Tỷ lệ thiệt hại ở giai đoạn cây mạ trong điều kiện gây hạn nhân tạo 40 Bảng 3.2. Khả năng giữ nƣớc của các giống lúa trong điều kiện gây hạn nhân tạo 43 Bảng 3.3. Chiều dài rễ tại các thời điểm gây hạn của các giống lúa ở giai đoạn mạ 44 Bảng 3.4. Chỉ số chịu hạn tƣơng đối của các giống lúa ở giai đoạn mạ 46 Bảng 3.5. Hàm lƣợng prolin của các giống lúa ở giai đoạn mạ 49 Bảng 3.6. Thống kê các nucleootit sai khác giữa giống NA3 với NA6 và Yukihikari-Nhật Bản 56 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Sơ đồ mô tả quá trình hình thành cây lúa 6 Hình 2.1. Hạt của 9 giống lúa cạn nghiên cứu 25 Hình 2.2. Mô hình khái quát quá trình nghiên cứu đề tài 27 Hình 2.3. Cấu trúc của vector pTZ57R/T 34 Hình 3.1. Ảnh các giống lúa ở giai đoạn mạ ở thời điểm trƣớc và sau khi xử lý bởi hạn 40 Hình 3.2. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ thiệt hại do hạn gây ra sau 3, 5, 7 ngày hạn 41 Hình 3.3. Chiều dài rễ của các giống lúa cạn nghiên cứu ở thời điểm sau 7 ngày hạn 45 Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn khả năng chịu hạn của các giống lúa cạn ở giai đoạn mạ 47 Hình 3.5. Sự biến động hàm lƣợng prolin của các giống lúa ở giai đoạn mạ 49 Hình 3.6. Kết quả điện di DNA tổng số của giống lúa cạn NA3 và NA6 50 Hình 3.7. Kết quả điện di đoạn gen LTP đƣợc nhân lên bằng kỹ thuật PCR 51 Hình 3.8: Kết quả điện di DNA thu đƣợc từ kỹ thuật thôi gel 52 Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR 53 Hình 3.10. Kết quả điện di plasmid tinh sạch chứa đoạn gen LTP 54 Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzym EcoRI 55 Hình 3.12. Trình tự gen LTP của giống NA3, NA6 và giống Yukihikari - Nhật Bản 58 Hình 3.13. So sánh trình tự amino acid trong protein của gen LTP ở giống lúa cạn NA3, NA6 và Yukihikari - Nhật Bản 59 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Lúa (Oryza sativa L.) là một trong những cây lƣơng thực quan trọng nhất của con ngƣời. Năm 2004 đã đƣợc tổ chức Nông Lƣơng Liên Hợp Quốc (FAO) chọn là năm quốc tế về lúa gạo, với khẩu hiệu “Lúa là cuộc sống” đã thêm khẳng định về vai trò của lúa gạo trong cuộc sống của con ngƣời. Ở Việt Nam, lúa là cây nông nghiệp có vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc dân. Nghề trồng lúa ở Việt Nam có từ cổ xƣa, hiện nay hơn 60% dân số nƣớc ta sống bằng nghề trồng lúa, nên lúa không chỉ có ý nghĩa về mặt an ninh lƣơng thực và còn có giá trị kinh tế. Lúa là loài cây trồng rất mẫn cảm với các điều kiện ngoại cảnh và là cây chịu hạn kém [15]. Những yếu tố sinh thái bất lợi tác động lên quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây lúa nhƣ lƣợng mƣa, nhiệt độ, ánh sáng…, trong đó khô hạn là yếu tố quan trọng nhất ảnh hƣởng đến năng suất và nó có thể làm giảm tới 70% năng suất của lúa. Trong những năm gần đây, có nhiều nghiên cứu ứng dụng các biện pháp kỹ thuật nhằm nâng cao năng suất, chất lƣợng và khả năng chống chịu của cây trồng, trong đó các nghiên cứu về tính chịu mất nƣớc ở mức độ phân tử đã đƣợc các nhà khoa học đặc biệt quan tâm. Nghiên cứu tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu hạn bằng công nghệ tế bào thực vật của Nguyễn Thị Tâm (2006) [16]; đánh giá khả năng chịu hạn thông qua hàm lƣợng đƣờng, protein, enzyme trong hạt của của các giống lúa chịu hạn khác nhau của Chu Hoàng Mậu (2005) [10]. Nhiều nhóm gen liên quan đến khả năng chịu mất nƣớc của tế bào đã đƣợc xác định trình tự và công bố bởi một số tác giả [6], [14], [8]. Gen mã hóa lipid transfer proteins (LTP) thuộc họ gene pathogenesis – relate, có khả năng tổng hợp protein thúc đẩy quá trình vận chuyển phospho 10 [...]... thạc sĩ là: "So sánh trình tự gen lipid transfer protein (LTP) của giống lúa cạn thuộc nhóm chịu hạn tốt với giống lúa cạn thuộc nhóm chịu hạn kém" 2 Mục tiêu nghiên cứu Xác định đƣợc sự sai khác về trình tự gen LTP và trình tự amino acid của LTP của giống lúa thuộc nhóm chịu hạn tốt và giống lúa thuộc nhóm chịu hạn kém 3 Nội dung nghiên cứu 3.1 Đánh giá khả năng chịu hạn của những giống lúa nghiên cứu... điều kiện hạn nhân tạo 3.2 So sánh hàm lƣợng prolin ở giai đoạn mạ giữa thời điểm trƣớc và sau khi xử lí bởi hạn Thiết lập mối tƣơng quan giữa khả năng chịu hạn và hàm lƣợng prolin 3.3 Phân lập, tách dòng và xác định trình tự gen LTP liên quan đến khả năng chịu hạn của cây lúa cạn 3.4 So sánh trình tự gen LTP và trình tự amino acid của LTP của giống lúa chịu hạn tốt với giống lúa chịu hạn kém Chƣơng... biệt của cây lúa cạn, khác với các cây trồng khác giúp lúa cạn đƣợc phân bố rộng hơn Qua nhiều nghiên cứu về lúa cạn cho thấy lúa cạn đƣợc hình thành từ lúa Indica, phát triển theo hƣớng chín sớm, có khả năng chống chịu tốt với hạn nhất là hạn cuối mùa vụ, chống chịu sâu bệnh và chịu đất nghèo dinh dƣỡng, thích nghi cao với điều kiện sinh thái khó khăn Đây là nguồn gen quý trong lai tạo và chọn giống lúa. .. sánh sự thể hiện gen giữa giống lúa nƣớc và giống lúa cạn trong điều kiện bị stress do khô hạn, sử dụng phƣơng tiện cDNA microarray Giống lúa cạn IRAT 109, Haogelao, Han 297 và giống lúa nƣớc Zhongzuo 93, Yuefu, Nipponbare đã đƣợc sử dụng Sau khi đọc chuỗi trình tự DNA, có 64 unique ESTs thể hiện ở mức độ cao ở giống lúa cạn và 79 ở giống lúa nƣớc Tác giả dự đoán sự thể hiện của các gen mục tiêu ở mức... giàu lipit bảo quản không tốt để lâu có mùi “khét” do các sản phẩm oxy hóa của lipit sinh ra Vì vậy nghiên cứu hàm lƣợng lipit trong hạt có vai trò quan trọng, để tìm ra biện pháp bảo quản hạt tốt nhất đối với từng giống 1.2 ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY LÚA CẠN 1.2.1 Hạn và tác động của hạn đối với cây lúa 1.2.1.1 Khái niệm về hạn Hạn là hiện tƣợng thƣờng xuyên xảy ra trong tự nhiên dẫn đến tình trạng... Loài phụ Javanica chỉ đƣợc trồng ở một vài nơi thuộc Indonesia [25] Theo nghiên cứu của nhiều tác giả [14], [4], [18] thì lúa cạn có nguồn gốc từ lúa nƣớc, giữa lúa cạn và lúa nƣớc vẫn mang những vết tích giống nhau, giải phẫu thân, bẹ lá của cây lúa cạn thấy có nhiều tổ chức thông khí (giống lúa nƣớc) nhƣng không phát triển Những giống lúa cạn (trồng ở đất cạn) vẫn sinh trƣởng bình thƣờng trên ruộng... hiện tƣợng mất dần nguồn gen cây lúa cạn trong một vài năm gần đây đã có một số công trình sƣu tập, đánh giá khả năng chịu hạn, nghiên cứu đặc điểm hóa sinh, đặc điểm hình thái hạt của các giống lúa cạn địa phƣơng Nghiên cứu của Trần Văn Thủy (1999) về việc đánh giá nguồn gen cây lúa cạn ở Tây Nguyên [20]; Nguyễn Đức Thạnh và cs (1998) nghiên cứu đánh giá tập đoàn các giống lúa cạn địa phƣơng và nhập... nghiên cứu của Đỗ Thị Dƣơng (2001) [3], Phạm Thị Thu Nga (2006) [11], Chu Hoàng Mậu và cs (2007) [12]… Việc sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để đánh giá hệ gen của cây lúa cạn, xác định các chỉ thị phân tử và nghiên cứu bản chất DNA của tính chịu hạn, chất lƣợng hạt gạo của cây lúa cạn là vấn đề đang đƣợc quan tâm nghiên cứu 1.3 PROTEIN VẬN CHUYỂN LIPID (LTP) VÀ GEN LTP (LIPID TRANSFER PROTEIN) ... thấy sự thay đổi nào của ASTT ở bốn giống lúa cạn trong điều kiện thiếu nƣớc cực đoan Turner và Jones, 1980, thấy rằng các giống lúa cạn có tiềm năng nƣớc ở mô lá cao hơn các giống lúa nƣớc Tuy nhiên cho đến nay vẫn chƣa có đủ số liệu để kết luận sự khác nhau về kiểu gen liên quan đến điều chỉnh ASTT giữa các giống lúa cạn và lúa nƣớc Thành phần hóa sinh của hạt nhƣ: Hàm lƣợng protein, đƣờng tan, enzym,... chính của chúng là ngăn chạn sự co cụm của protein và tái hoạt hóa các protein biến tính LEA (Late embryogenesis abundant protein) : Tế bào bị mất nƣớc là hiện tƣợng phổ biến xảy ra khi cây trồng gặp các điều kiện ngoại cảnh bất lợi nhƣ: nóng, hạn, lạnh…Một trong những nhóm gen quan trọng liên quan đến các điều kiện mất nƣớc là các gen mã hóa nhóm protein có tên gọi LEA (Late embryogenesis abundant protein . ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN TRÀ MY SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN LIPID TRANSFER PROTEIN (LTP) CỦA GIỐNG LÚA CẠN THUỘC NHÓM CHỊU HẠN TỐT VỚI GIỐNG LÚA CẠN THUỘC NHÓM CHỊU HẠN KÉM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái. ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN TRÀ MY SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN LIPID TRANSFER PROTEIN (LTP) CỦA GIỐNG LÚA CẠN THUỘC NHÓM CHỊU HẠN TỐT VỚI GIỐNG LÚA CẠN THUỘC NHÓM CHỊU HẠN KÉM Chuyên ngành: Di truyền học Mã. hạn tốt với giống lúa cạn thuộc nhóm chịu hạn kém& quot; 2. Mục tiêu nghiên cứu Xác định đƣợc sự sai khác về trình tự gen LTP và trình tự amino acid của LTP của giống lúa thuộc nhóm chịu hạn tốt