2.1.1. Vật liệu
Hạt của 9 giống lúa cạn có nguồn gốc từ các tỉnh: Nghệ An, Cao Bằng, Lào Cai đƣợc sử dụng làm vật liệu nghiên cứu. Tên địa phƣơng và nguồn gốc đƣợc trình bày ở bảng 2.1.
Bả ng 2.1. Các giống lúa cạn sử dụng làm vật liệu nghiên cứu
TT Kí hiệu Tên giống Địa điểm thu mẫu
1 NA1 Bụt Kềnh Khỉn - Yên Hòa - Tƣơng Dƣơng - Nghệ An 2 NA2 Cục Kềnh Khỉn - Yên Hòa - Tƣơng Dƣơng - Nghệ An 3 NA3 Giáng Kềnh Khỉn - Yên Hòa - Tƣơng Dƣơng - Nghệ An 4 NA4 Giòi Kềnh Khỉn - Yên Hòa - Tƣơng Dƣơng - Nghệ An 5 NA5 Màn Kềnh Khỉn - Yên Hòa - Tƣơng Dƣơng - Nghệ An 6 NA6 Nhan Kềnh Khỉn - Yên Hòa - Tƣơng Dƣơng - Nghệ An 7 LC Tả Pa Khâu Tả Pa Khâu - Mƣờng Khƣơng - Lào Cai
8 CB1 Cốc Pàng Phan Thanh - Bảo Lạc - Cao Bằng 9 CB2 Phan Thanh Phan Thanh - Bảo Lạc - Cao Bằng
NA1 NA6 NA2 CB1 NA3 CB2 NA4 LC NA5
2.1.2. Hóa chất và thiết bịHóa chất Hóa chất
Các hóa chất dùng trong nghiên cứu gồm: Yeast Extract và trypton (DIFCO-Mỹ), EDTA, SDS, Tris-HCl (Sigma-Mỹ), Acid acetic (Merk-Đức), X-gal (Sigma-Mỹ), Kanamycin, Ampicilin (Merk-Đức), Agar (Sigma, Mỹ); Agarose (Sigma, Mỹ), cồn tuyệt đối.
Bộ kit tách chiết DNA tổng số “QIAamp DNA Mini kit (QIAGEN Inc, USA)”, bộ kit dùng cho phản ứng PCR do hãng Promega cung cấp, kit tách dòng “TA cloning Kit” (Invitrogen), bộ kit Plasmid Extraction Kit (BIONEER) sử dụng tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp. Bộ kit giải trình trình tự nucleotide do hãng QIAGEN cung cấp. các loại enzym giới hạn:
EcoRI, BamHI, NotI (BioLabs - Mỹ). Tế bào E. coli thuần chủng DH5α.
Thiết bị
Bảng 2.2. Danh mụ c cá c thiế t bị sử dụng
STT Tên thiết bị Nguồn gốc xuất sứ
1 Máy PCR Amplied Biosystems USA/Singapore 2 Bộ điện di Scie – plas Ltd – UK
3 Máy chụp ảnh gel Gel Logic 1500 – Kodak –USA 4 Máy đo quang phổ Biomaet3 – Thermo Scientific USA 5 Máy đo pH F – 51BW – Horiba - Japan
6 Tủ lạnh -200C; -800C Super freezer Eco130 – Ficchetti – Italy 7 Máy DNA sequencing ABI Prism 3130 – USA/Japan
8 Máy li tâm Eppendorf – CHLB Đƣ́ c
2.2. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Các thí nghiệm phân tích hóa sinh đƣợc tiến hành tại phòng thí nghiệm Di truyền, khoa Sinh - KTNN, trƣờng Đại học Sƣ phạm Thái Nguyên.
Phân tích Sinh học phân tử tại Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gen, Viện khoa học sự sống, Đại học Thái Nguyên.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Quy trình nghiên cứu đƣợc thể hiện ở hình 2.3.
Hạt của các giống lúa cạn nghiên cứu
Trồng vào các chậu thí nghiệm
Đánh giá khả năng chịu hạn của lúa ở
giai đoạn mạ
Xác định hàm lƣợng prolin
Giống lúa chịu hạn tốt và chịu hạn kém
Phân lập gen liên quan đến tính chịu hạn (LTP)
Hình 2.2. Mô hình khái quát quá trình nghiên cứu đề tài 2.3.1. Phƣơng pháp sinh lí, hóa sinh
2.3.1.1. Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn
Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn theo phƣơng pháp của Lê Trần Bình và đtg (1998) [1].
Chuẩn bị: Cát vàng đãi sạch, phơi khô sàng và loại bỏ những hạt to,
nhỏ quá, cho vào chậu nhựa. Hạt thóc ngâm trong nƣớc 3 sôi 2 lạnh trong 24 giờ. Gieo các mầm lúa vào các chậu, mỗi chậu gieo 30 hạt. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần trong điều kiện và chế độ chăm sóc nhƣ nhau. Tƣới cho đủ độ ẩm, tới khi mạ đƣợc 3 lá tiến hành gây hạn nhân tạo bằng cách không tƣới
nƣớc, trong quá trình gây hạn che không cho nƣớc mƣa vào chậu thí nghiệm. Thời điểm tiến hành thí nghiệm đƣợc thực hiện vào mùa khô. Khi cát trong các chậu thí nghiệm khô thì đánh giá khả năng chịu hạn của các giống với nhau bằng cách theo dõi số cây héo trong vòng 3, 5, 7 ngày, tỉ lệ cây phục hồi sau 3, 5, 7 ngày.
• Xác định tỉ lệ cây sống sót (%)
Số cây sống
Tỉ lệ sống sót = Tổng số cây nghiên cứu x100%
• Xác định khả năng giữ nước qua các giai đoạn xử lí bởi hạn theo công thức
W = Wft
Wfc
x 100%
Trong đó: W(%): Khả năng giữ nƣớc của cây sau khi xử lý bởi hạn Wft(g): Khối lƣợng tƣơi của cây sau khi xử lý bởi hạn (g) Wfc(g): Khối lƣợng tƣơi của cây không khi xử lý (g) • Tỷ lệ thiệt hại do hạn gây ra được tính theo công thức:
∑ o ( N b)
Trong đó:
A= x 100%
NC
A: Tỷ lệ thiệt hại do hạn gây ra (%); b: Trị số thiệt hại của mỗi cấp
C: Trị số thiệt hại của cấp cao nhất No: Số cây của mỗi cấp thiệt hại N: Tổng số cây xử lý
Các trị số :
Số cây chết : Trị số 3
• Tỷ số khối lượng khô của rễ so với thân lá được tính theo công thức:
T = Wr
Wt
x 100%
Trong đó : T: Tỷ số khối lƣợng khô của rễ với thân lá (%) Wr: Khối lƣợng khô của rễ
Wt: Khối lƣợng khô của thân, lá
• Chỉ số chịu hạn tương đối được tính theo công thức:
1
Sn=
2
sinα (a.b+b.c+c.d+d.e+e.f +f. T1+T1.T2+T2.T3+T3.T4+T4.g+g.h+h.i+i.a)
Trong đó:
a: % cây không héo sau 3 ngày hạn b: % cây hồi phục sau 3 ngày hạn c: % cây không héo sau 5 ngày hạn d: % cây hồi phục sau 5 ngày hạn e: % cây không héo sau 7 ngày hạn f: % cây hồi phục sau 7 ngày hạn
T1: Tỷ số khối lƣợng khô của rễ với thân, lá trƣớc khi gây hạn T2: Tỷ số khối lƣợng khô của rễ với thân, lá sau 3 ngày hạn T3: Tỷ số khối lƣợng khô của rễ với thân, lá sau 5 ngày hạn T4: Tỷ số khối lƣợng khô của rễ với thân, lá sau 7 ngày hạn g: Khả năng giữ nƣớc sau 3 ngày hạn
h: Khả năng giữ nƣớc sau 5 ngày hạn i : Khả năng giữ nƣớc sau 7 ngày hạn
α: Góc tạo bởi hai trục mang trị số gần nhau và đƣợc tính bằng 360/x Sn : Chỉ số chịu hạn tƣơng đối của các giống lúa
2.3.1.2. Xác định hàm lượng prolin
• Chuẩn bị cây mạ: Hạt lúa khi đã nảy mầm, đƣợc gieo trong các chậu nhựa có đƣờng kính 10cm, cao 6 cm có lót giấy lọc. Mỗi giống đƣợc trồng vào bốn chậu, 30 cây/chậu. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần trong điều kiện chăm sóc nhƣ nhau.
• Xử lí hạn: Khi cây đƣợc 3 lá, ở các chậu đối chứng vẫn tƣới nƣớc, các chậu thí nghiệm sẽ dừng tƣới nƣớc. Sau 3, 5, 7 ngày gây hạn sẽ tiến hành thu lá và rễ để tách chiết prolin.
• Tách chiết prolin: Hàm lƣợng prolin của lá và rễ đƣợc tách chiết và xác định theo phƣơng pháp của Bates (1973) [22].
Tiến hành: Nghiền 0,3 gram mẫu (lá hoặc rễ) đã để lạnh ở - 800C trong 24h. Thêm 10ml dung dịch acid sulfosalicylic 3%, li tâm 7000 vòng/phút trong 20 phút và lọc qua giấy lọc Whatman. Lấy 2ml dịch chiết đã li tâm cho ống nghiệm, bổ sung 2ml acid acetic và 2ml dung dịch acid ninhydin, đun cách thủy hỗn hợp trên ở nhiệt độ 100oC trong 60 phút, sau đó ủ trong đá 5 phút. Bổ sung vào bình phản ứng 4ml toluen, lắc đều và lấy 2ml dịch màu hồng ở trên đem đo OD ở bƣớc sóng 520nm. Hàm lƣợng prolin đƣợc xác định trên máy theo đồ thị chuẩn.
2.3.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử
2.3.2.1. Tách chiết DNA tổng số từ lá lúa
• Kỹ thuật thu và bảo quản lá:
Hạt lúa đƣợc rửa sạch rồi ngâm vào nƣớc ấm (nƣớc 3 sôi 2 lạnh) trong 24 giờ. Gieo các mầm lúa vào các bát, mỗi bát gieo khoảng 30 hạt. Hàng ngày tƣới nƣớc đủ ẩm. Sau 2 tuần, cắt thu lấy lá dùng ngay hoặc bảo quản ở tủ lạnh sâu - 800C.
Phƣơng pháp tách DNA tổng số theo Gawel và cs, 1991 có cải tiến nhƣ sau:
- Lấy 200mg lá non đã để lạnh ở - 800C nghiền nhanh trong cối chày xứ (cối chày xứ đã đƣợc vô trùng và để ở - 800C) thành bột mịn.
- Bổ sung 0,8 ml đệm rửa (Tris HCl 1M, EDTA 0,5M, pH=8, Sobitol 2M, NaH2PO4 0,4 %, H2O), li tâm 15 phút tốc độ 12000 vòng /phút, loại bỏ dịch nổi. Bƣớc này làm 2 lần.
- Thêm 700 μl đệm tách (Tris HCl 1M, pH=8, NaCl 5M, EDTA 0,5M, CTAB 4%, H2O), trộn nhẹ. Ủ 650C ít nhất 1 giờ, 5 phút lắc đều 1 lần, lấy ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút.
- Thêm 600 μl chloroform : isoamyl (24:1), trộn đều 20 phút. - Li tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
- Hút 500 μl dịch trong sang ống 1,5 ml, bỏ tủa.
- Thêm 500 μl isoprropanol, trộn nhẹ đặt lên đá chờ có tủa trắng.
- Li tâm 13000 vòng /phút trong 5 phút, bỏ dịch, úp xuống giấy cho khô. - Bổ sung 300 μl cồn 70% búng nhẹ.
- Li tâm 13000 vòng/phút, 5 phút, loại bỏ cồn (làm 2 lần). - Làm khô DNA.
- Hoà tan DNA trong 100 μl H2O khử ion.
• Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng và độ tinh sạch của DNA
Kiểm tra độ tinh sạch của DNA bằng 2 phƣơng pháp:
Điện di trên gel agarose
Chuẩn bị gel agarose 1%, dung dịch đệm dùng cho điện di là TAE 1X. Tra mẫu và chỉ thị phân tử (Marker). Chạy điện di ở 100V trong 30 phút. Nhuộm gel trong dung dịch Ethidium bromide (2µg/ml; 15 µl/bản gel) trong
10 phút. Rửa gel bằng nƣớc cất, sau đó soi qua tia cực tím và chụp ảnh bằng máy Gel Logic 1500 – Kodak –USA.
Phương pháp quang phổ hấp thụ
- Kiểm tra hàm lƣợng và độ tinh sạch của DNA trên máy quang phổ ở bƣớc sóng 260nm và 280nm.
- Cho 995µl nƣớc cất và 5µl DNA mẫu vào cuvet (hệ số pha loãng 200 lần), lắc đều đặt vào máy đo.
Hàm lƣợng và độ tinh sạch DNA đƣợc tính theo công thức: Hàm lƣợng DNA (ng/μl) = 50 x HSPL x OD260 Độ sạch của DNA = OD260 / OD280
Trong đó: HSPL: hệ số pha loãng
OD260: chỉ số đo đƣợc ở bƣớc sóng 260nm 50: hằng số
OD280: chỉ số đo đƣợc ở bƣớc sóng 280nm
Nếu tỷ lệ OD260/OD280 = 1,8 - 2,0 thì mẫu DNA đƣợc coi là đủ tiêu chuẩn về độ sạch.
2.3.2.1. Tách dòng và xác định trình tự gen LTP
• Nhân gen LTP bằng PCR từ DNA hệ gen cây lúa
Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với cặp mồi LTPrF/ LTPrR đƣợc thiết kế dựa trên trình tự cDNA phân lập từ giống lúa Yukihikari (Nhật Bản) đƣợc công bố bởi Masuta và cs (2003) ở GenBank với mã số AY466108 [35], cặp mồi đƣợc tổng hợp tại hãng Invitrogen, trình tự cặp mồi là:
Bảng 2.3. Mồ i nhân gen LTP ở lúa
Mồi Trình tự gắn mồi Nhiệt độ gắn mồi
LTPrF 5' - ATGGCCGGCAAGAAGGTGC - 3' 560C LTPrR 5' - TTAGAGAGGGCAGGTGAAGTC - 3' 560C
Thành phần phản ứng củ a phản ứng PCR nhân đoạn gen LTP ở lúa đƣợ c trì nh bà y ở bả ng 2.4.
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng nhân gen LTP Thành phần Thể tích (µl) PCR master mix 25 DNA Khuôn (~10 - 50 ng) 2 LTP 1R (10 pmol/µl) 1 LTP1F (10 pmol/µl) 1 DMSO 2,5 Nƣớc khử ion 18,5 Tổng 50
Chu kỳ nhiệt: 940C: 3 phút; lặp lại 30 chu kỳ (940C- 1 phút, 560C- 1 phút, 720C- 1 phút 30 giây); 720C- 10 phút; 40C - ∞. Sau chu kỳ cuối cùng, chuyển về nhiệt độ 4oC bảo quản trƣớc khi tinh sạch, bảo quản ở -20oC.
Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng bộ kít của Hãng Bioneer (AccuPrep PCR Purification Kít) theo qui trì nh nhƣ sau:
- Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm - Bổ sung đệm hòa tan (GB - Gel binding buffer) theo tỉ lệ: Vmẫu : VGB: VIzopropanol = 1 : 3 : 1 (1µl tƣơng ứng với 1mg mẫu). Ủ ở 600 trong 10 phút, sau khi gel tan hết ủ thêm 5 phút cho gel tan hoàn toàn.
- Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột Qiaquick spin colum, ly tâm 13000v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.
- Bổ sung 500 µl dung dịch GB, để 2 phút ở nhiệt độ phòng cho dung dịch GB tiếp xúc hoàn toàn với sản phẩm PCR sau đó ly tâm 13000v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.
- Rửa màng lọc chứa DNA của PCR bằng cách cho 500 µl dung dịch WB (Washing buffer) lên trên màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1
phút, rồi bỏ dịch dƣới. Ly tâm lại lần hai đảm bảo cho màng chứa DNA của PCR thật khô.
- Chuyển cột lọc sang ống Eppendorf mới, bổ sung 30 µl dung dịch EB (Elution buffer) lên trên màng lọc, để nhiệt độ phòng 2 phút, đem ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút, sau đó bỏ cột. Thu mẫu DNA đã đƣợc tinh sạch. Bảo quản ở -200C.
• Tạo vectơ tái tổ hợp
Sản phẩm phản ứng PCR sẽ đ ƣợc gắn vào vector pTZ57R/T (Hình 2.3) theo phƣơng phá p dò ng hó a TA (TA - cloning) của hãng Invitrogen , có enzym topoisomerase là m enzym nố i .
Hình 2.3. Cấu trúc của vector pTZ57R/T
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng
Tên hóa chất Thể tích (µl) Nƣớc tinh khiết 12,2 DNA khuôn 4 Vector pTZ57R/T 1 Ligation buffer 10X 2 Enzyme T4 ligase 0,8 Tổng thể tích 20
Hỗn hợp đƣợc ủ ở 220C trong 1h, sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α.
• Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E. coli
Vector tái tổ hợp đƣợc đƣa vào tế bào E. coli chủng DH 5α bằng một quá trình gọi là chuyển nạp (transformation). Đó là quá trình tạo cho plasmid đã đƣợc gắn nối, tiếp xúc với tế bào thích ứng nhằm tạo điều kiện cho chúng xuyên qua màng vào trong nguyên sinh chất. Khi đã đƣợc chuyển nạp, plasmid (có thể tái tổ hợp hoặc không) sẽ cùng nhân lên cùng với tế bào chủ khi nuôi trong môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp.
Quy trình biến nạp nhƣ sau:
Bổ sung 7µl vector đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến Ecoli DH
5α và trộn nhẹ, rồi ủ trong đá lạnh (0 - 4°C) trong 30 phút, cho plasmid xuyên qua màng chuyển nạp vào tế bào. Sau đó hỗn hợp đƣợc xử lý sốc nhiệt ở 42°C trong 1 phút và ngay lập tức chuyển vào ủ trên đá lạnh trong 5 phút. Bổ sung 400µl môi trƣờng LB lỏng (pepton, cao nấm men, NaCl) vào hỗn hợp rồi đem hỗn hợp nuôi lắc 200 vòng/phút trong 1 giờ ở 370C để vi khuẩn tái tổ hợp nhân lên trong vài chu kỳ sinh trƣởng và phát triển. Sử dụng que cấy trải, trải 100 - 150µl dịch khuẩn lên đĩa môi trƣờng LB đặc (pepton, cao nấm men, NaCl, agarose) có chứa kháng sinh ampicillin (100mg/l), X-gal (40mg/l) và IPTG (100µM). Ủ đĩa ở 370C trong 16 - 20 giờ.
• Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp
Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp thực hiện bằng hai phƣơng pháp: chọn lọc theo phản ứng cơ chất (với X -gal) nhằm loại trừ những vi khuẩn không chuyển nạp thành công vectơ tái tổ hợp, và chọn lọc theo phƣơng pháp kháng sinh ampicillin nhằm loại trừ những vi khuẩn không chuyển nạp đƣợc bất kỳ vector nào và các loại vi khuẩn nhiễm tạp khác.
Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp đƣợc thực hiện trong buồng cấy vô trùng theo các bƣớc sau:
- Khuẩn lạc màu trắng trên môi trƣờ ng LB agar đƣợc lựa chọn nuôi cấy trong các ống chứa 5 ml môi trƣờng LB Bactotryptone hoặc casein hydrolysate (10g/l), dịch chiết nấm men (5 g/l) và NaCl (10g/l)], khoảng 10ml nƣớc thịt /ống.
- Bổ sung 5 µl Ampicillin nồng độ là khoảng 50 µg/ml để chọn lọc dòng có mang gen kháng kháng sinh.
- Có thể bổ sung thêm X-gal vào môi trƣờng để loại bỏ những ống môi trƣờng có màu xanh (do đoạn gen chƣa gài vào vector) mà khi chọn lọc khuẩn lạc bị lẫn tạp hoặc khi chọn lọc khuẩn lạc có nhân hơi xanh.
- Sau khi cấy khuẩn lạc, ống môi trƣờng đƣợc lắc 200 vòng/phút trong 16 – 20 giờ ở 370C cho vi khuẩn nhân lên.
• Tách DNA plasmid tái tổ hợp
Sƣ̉ dụ ng bộ hó a chấ t tá ch chiế t plasmid tá i tổ hợ p củ a hã ng Bioneer (AccuPrep™ Plasmid Mini Extraction Kit) để tách chiết plasmid.