2.3.2.1. Tách chiết DNA tổng số từ lá lúa
• Kỹ thuật thu và bảo quản lá:
Hạt lúa đƣợc rửa sạch rồi ngâm vào nƣớc ấm (nƣớc 3 sôi 2 lạnh) trong 24 giờ. Gieo các mầm lúa vào các bát, mỗi bát gieo khoảng 30 hạt. Hàng ngày tƣới nƣớc đủ ẩm. Sau 2 tuần, cắt thu lấy lá dùng ngay hoặc bảo quản ở tủ lạnh sâu - 800C.
Phƣơng pháp tách DNA tổng số theo Gawel và cs, 1991 có cải tiến nhƣ sau:
- Lấy 200mg lá non đã để lạnh ở - 800C nghiền nhanh trong cối chày xứ (cối chày xứ đã đƣợc vô trùng và để ở - 800C) thành bột mịn.
- Bổ sung 0,8 ml đệm rửa (Tris HCl 1M, EDTA 0,5M, pH=8, Sobitol 2M, NaH2PO4 0,4 %, H2O), li tâm 15 phút tốc độ 12000 vòng /phút, loại bỏ dịch nổi. Bƣớc này làm 2 lần.
- Thêm 700 μl đệm tách (Tris HCl 1M, pH=8, NaCl 5M, EDTA 0,5M, CTAB 4%, H2O), trộn nhẹ. Ủ 650C ít nhất 1 giờ, 5 phút lắc đều 1 lần, lấy ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút.
- Thêm 600 μl chloroform : isoamyl (24:1), trộn đều 20 phút. - Li tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
- Hút 500 μl dịch trong sang ống 1,5 ml, bỏ tủa.
- Thêm 500 μl isoprropanol, trộn nhẹ đặt lên đá chờ có tủa trắng.
- Li tâm 13000 vòng /phút trong 5 phút, bỏ dịch, úp xuống giấy cho khô. - Bổ sung 300 μl cồn 70% búng nhẹ.
- Li tâm 13000 vòng/phút, 5 phút, loại bỏ cồn (làm 2 lần). - Làm khô DNA.
- Hoà tan DNA trong 100 μl H2O khử ion.
• Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng và độ tinh sạch của DNA
Kiểm tra độ tinh sạch của DNA bằng 2 phƣơng pháp:
Điện di trên gel agarose
Chuẩn bị gel agarose 1%, dung dịch đệm dùng cho điện di là TAE 1X. Tra mẫu và chỉ thị phân tử (Marker). Chạy điện di ở 100V trong 30 phút. Nhuộm gel trong dung dịch Ethidium bromide (2µg/ml; 15 µl/bản gel) trong
10 phút. Rửa gel bằng nƣớc cất, sau đó soi qua tia cực tím và chụp ảnh bằng máy Gel Logic 1500 – Kodak –USA.
Phương pháp quang phổ hấp thụ
- Kiểm tra hàm lƣợng và độ tinh sạch của DNA trên máy quang phổ ở bƣớc sóng 260nm và 280nm.
- Cho 995µl nƣớc cất và 5µl DNA mẫu vào cuvet (hệ số pha loãng 200 lần), lắc đều đặt vào máy đo.
Hàm lƣợng và độ tinh sạch DNA đƣợc tính theo công thức: Hàm lƣợng DNA (ng/μl) = 50 x HSPL x OD260 Độ sạch của DNA = OD260 / OD280
Trong đó: HSPL: hệ số pha loãng
OD260: chỉ số đo đƣợc ở bƣớc sóng 260nm 50: hằng số
OD280: chỉ số đo đƣợc ở bƣớc sóng 280nm
Nếu tỷ lệ OD260/OD280 = 1,8 - 2,0 thì mẫu DNA đƣợc coi là đủ tiêu chuẩn về độ sạch.
2.3.2.1. Tách dòng và xác định trình tự gen LTP
• Nhân gen LTP bằng PCR từ DNA hệ gen cây lúa
Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với cặp mồi LTPrF/ LTPrR đƣợc thiết kế dựa trên trình tự cDNA phân lập từ giống lúa Yukihikari (Nhật Bản) đƣợc công bố bởi Masuta và cs (2003) ở GenBank với mã số AY466108 [35], cặp mồi đƣợc tổng hợp tại hãng Invitrogen, trình tự cặp mồi là:
Bảng 2.3. Mồ i nhân gen LTP ở lúa
Mồi Trình tự gắn mồi Nhiệt độ gắn mồi
LTPrF 5' - ATGGCCGGCAAGAAGGTGC - 3' 560C LTPrR 5' - TTAGAGAGGGCAGGTGAAGTC - 3' 560C
Thành phần phản ứng củ a phản ứng PCR nhân đoạn gen LTP ở lúa đƣợ c trì nh bà y ở bả ng 2.4.
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng nhân gen LTP Thành phần Thể tích (µl) PCR master mix 25 DNA Khuôn (~10 - 50 ng) 2 LTP 1R (10 pmol/µl) 1 LTP1F (10 pmol/µl) 1 DMSO 2,5 Nƣớc khử ion 18,5 Tổng 50
Chu kỳ nhiệt: 940C: 3 phút; lặp lại 30 chu kỳ (940C- 1 phút, 560C- 1 phút, 720C- 1 phút 30 giây); 720C- 10 phút; 40C - ∞. Sau chu kỳ cuối cùng, chuyển về nhiệt độ 4oC bảo quản trƣớc khi tinh sạch, bảo quản ở -20oC.
Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng bộ kít của Hãng Bioneer (AccuPrep PCR Purification Kít) theo qui trì nh nhƣ sau:
- Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm - Bổ sung đệm hòa tan (GB - Gel binding buffer) theo tỉ lệ: Vmẫu : VGB: VIzopropanol = 1 : 3 : 1 (1µl tƣơng ứng với 1mg mẫu). Ủ ở 600 trong 10 phút, sau khi gel tan hết ủ thêm 5 phút cho gel tan hoàn toàn.
- Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột Qiaquick spin colum, ly tâm 13000v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.
- Bổ sung 500 µl dung dịch GB, để 2 phút ở nhiệt độ phòng cho dung dịch GB tiếp xúc hoàn toàn với sản phẩm PCR sau đó ly tâm 13000v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.
- Rửa màng lọc chứa DNA của PCR bằng cách cho 500 µl dung dịch WB (Washing buffer) lên trên màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1
phút, rồi bỏ dịch dƣới. Ly tâm lại lần hai đảm bảo cho màng chứa DNA của PCR thật khô.
- Chuyển cột lọc sang ống Eppendorf mới, bổ sung 30 µl dung dịch EB (Elution buffer) lên trên màng lọc, để nhiệt độ phòng 2 phút, đem ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút, sau đó bỏ cột. Thu mẫu DNA đã đƣợc tinh sạch. Bảo quản ở -200C.
• Tạo vectơ tái tổ hợp
Sản phẩm phản ứng PCR sẽ đ ƣợc gắn vào vector pTZ57R/T (Hình 2.3) theo phƣơng phá p dò ng hó a TA (TA - cloning) của hãng Invitrogen , có enzym topoisomerase là m enzym nố i .
Hình 2.3. Cấu trúc của vector pTZ57R/T
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng
Tên hóa chất Thể tích (µl) Nƣớc tinh khiết 12,2 DNA khuôn 4 Vector pTZ57R/T 1 Ligation buffer 10X 2 Enzyme T4 ligase 0,8 Tổng thể tích 20
Hỗn hợp đƣợc ủ ở 220C trong 1h, sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α.
• Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E. coli
Vector tái tổ hợp đƣợc đƣa vào tế bào E. coli chủng DH 5α bằng một quá trình gọi là chuyển nạp (transformation). Đó là quá trình tạo cho plasmid đã đƣợc gắn nối, tiếp xúc với tế bào thích ứng nhằm tạo điều kiện cho chúng xuyên qua màng vào trong nguyên sinh chất. Khi đã đƣợc chuyển nạp, plasmid (có thể tái tổ hợp hoặc không) sẽ cùng nhân lên cùng với tế bào chủ khi nuôi trong môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp.
Quy trình biến nạp nhƣ sau:
Bổ sung 7µl vector đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến Ecoli DH
5α và trộn nhẹ, rồi ủ trong đá lạnh (0 - 4°C) trong 30 phút, cho plasmid xuyên qua màng chuyển nạp vào tế bào. Sau đó hỗn hợp đƣợc xử lý sốc nhiệt ở 42°C trong 1 phút và ngay lập tức chuyển vào ủ trên đá lạnh trong 5 phút. Bổ sung 400µl môi trƣờng LB lỏng (pepton, cao nấm men, NaCl) vào hỗn hợp rồi đem hỗn hợp nuôi lắc 200 vòng/phút trong 1 giờ ở 370C để vi khuẩn tái tổ hợp nhân lên trong vài chu kỳ sinh trƣởng và phát triển. Sử dụng que cấy trải, trải 100 - 150µl dịch khuẩn lên đĩa môi trƣờng LB đặc (pepton, cao nấm men, NaCl, agarose) có chứa kháng sinh ampicillin (100mg/l), X-gal (40mg/l) và IPTG (100µM). Ủ đĩa ở 370C trong 16 - 20 giờ.
• Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp
Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp thực hiện bằng hai phƣơng pháp: chọn lọc theo phản ứng cơ chất (với X -gal) nhằm loại trừ những vi khuẩn không chuyển nạp thành công vectơ tái tổ hợp, và chọn lọc theo phƣơng pháp kháng sinh ampicillin nhằm loại trừ những vi khuẩn không chuyển nạp đƣợc bất kỳ vector nào và các loại vi khuẩn nhiễm tạp khác.
Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp đƣợc thực hiện trong buồng cấy vô trùng theo các bƣớc sau:
- Khuẩn lạc màu trắng trên môi trƣờ ng LB agar đƣợc lựa chọn nuôi cấy trong các ống chứa 5 ml môi trƣờng LB Bactotryptone hoặc casein hydrolysate (10g/l), dịch chiết nấm men (5 g/l) và NaCl (10g/l)], khoảng 10ml nƣớc thịt /ống.
- Bổ sung 5 µl Ampicillin nồng độ là khoảng 50 µg/ml để chọn lọc dòng có mang gen kháng kháng sinh.
- Có thể bổ sung thêm X-gal vào môi trƣờng để loại bỏ những ống môi trƣờng có màu xanh (do đoạn gen chƣa gài vào vector) mà khi chọn lọc khuẩn lạc bị lẫn tạp hoặc khi chọn lọc khuẩn lạc có nhân hơi xanh.
- Sau khi cấy khuẩn lạc, ống môi trƣờng đƣợc lắc 200 vòng/phút trong 16 – 20 giờ ở 370C cho vi khuẩn nhân lên.
• Tách DNA plasmid tái tổ hợp
Sƣ̉ dụ ng bộ hó a chấ t tá ch chiế t plasmid tá i tổ hợ p củ a hã ng Bioneer (AccuPrep™ Plasmid Mini Extraction Kit) để tách chiết plasmid. Tách DNA plasmid tái tổ hợp đƣợc thực hiện theo các bƣớc sau:
(1) Chuyển dịch nuôi cấy ở trên sang ống Eppendorf 1,5 ml, ly tâm 8000 vòng/phút trong 2 phút để thu tế bào. Sau ly tâm bỏ dịch bên trên, giữ cặn tế bào bên dƣới (dùng pipet hút hết dịch trong giữ lại cặn tế bào).
(2)Thêm 250 µl dung dịch Rasuspension buffer vào để hòa tan cặn, dùng pipet hút nhẹ lên xuống vài lần cho đều.
(3) Thêm 250 µl dung dịch Lysis buffer vào hỗn dịch trên để phá màng tế bào, đậy nắp, nhẹ nhàng trộn bằng cách lắc xuôi ngƣợc toàn bộ vài lần.
(4) Thêm 350 µl dung dịch Neutralization buffer, trộn nhẹ nhàng, sau đó đem ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 10 phút, nhiệt độ 40C. (5) Chuyển toàn bộ phần dịch trong bên trên lên trên màng của cột
lọc. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch dƣới.
(6) Thêm 500 µl dung dịch Washing A buffer lên trên màng lọc, để ở nhiệt độ phòng 5 phút, sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch bên dƣới.
(7) Thêm 700 µl dung dịch Washing B buffer lên màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch dƣới. Ly tâm lại để làm khô cột.
(8) Chuyển cột lọc sang ống Eppendorf mới, thêm 20 µl dung dịch Utution buffer lên trên màng lọc, để nhiệt độ phòng 2 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ cột lọc và thu đƣợc dịch chứa DNA plasmid ở dƣới.
Ký hiệu mẫu và bảo quản ở - 200C. • Kiểm tra vector tái tổ hợp
DNA ngoại lai là sản phẩm của PCR đƣợc tạo dòng vào plasmid pTZ57R/T sẽ đƣợc plasmid nhân lên trong tế bào E. coli và đƣợc tách chiết nhƣ đã trình bày ở trên. Vấn đề là cần thiết kiểm tra, liệu đoạn DNA ngoại lai có phải là từ sản phẩm PCR chúng ta mong muốn hay không? Một trong những phƣơng pháp nhanh nhất là kiểm tra độ dài của đoạn DNA ngoại lai xem có đúng nhƣ độ dài của sản phẩm trƣớc khi tạo dòng hay không.
Plasmid pTZ57R/T có độ dài khoảng 2886bp. Tại hai đầu của vùng tiếp nhận DNA ngoại lai, ngƣời ta đã bố trí hai điểm cắt của enzym giới hạn EcoRI
Vị trí cắt của enzym EcoRI: 5'... G|AAT T C...3'
băng có độ dài khoảng 2886bp của chính DNA plasmid, băng kia sẽ cho độ dài tƣơng ứng với sản phẩm PCR (với điều kiện trong chuỗi DNA của PCR không có điểm cắt khác của EcoRI). Nếu trong đó có một hay vài điểm cắt EcoRI, thì độ dài của PCR khi kiểm tra sẽ bằng tổng số băng cộng lại. Từ đó
biết đƣợc: 1) PCR có đƣợc tạo dòng hay không; 2) Độ dài của sản phẩm đƣợc tạo dòng là bao nhiêu và ƣớc định có phải của PCR mong muốn hay không; 3) Từ đó, có nên tiến hành giải trình tự để biết chính xác chuỗi nucleotid hay không.
Tiế n hà nh cắt kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp
Bảng 2.6. Thành phần của phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp
bằ ng enzym EcoRI
Tên hóa chất Thể tích (µl)
Nƣớc tinh khiết 16
Dung dịch đệm của enzym Tago chemthem BamHI 2
Enzym EcoRI 1
DNA plasmid tái tổ hợp 1
Tổng thể tí ch 20
Hỗn hợp phản ứng trên đƣợ c trộn đều trong một ống e ppendorf và ủ ở 370C trong 2 giờ cho phản ứng xảy ra . Điện di kiểm tra trên thạch agarose 1%, nếu có đoạn DNA cần thiết chèn vào vector , chúng ta sẽ tiến hành giải trình tự gen cần xác định.
• Giải trình tự và xử lý số liệu
Giải trình đƣợc thực hiện trên máy giải trình t ự động . Trình tự chuỗi nucleotide đƣợc xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng trên máy tính. So sánh đối chiếu và xử lý số liệu của các trình tự thu nhận đƣợc với các trình tự
có trong Ngân hàng gen quốc tế (GenBank) bằng chƣơng trình Bioedit. Thành phần amino acid đƣợc thu nhận bằng cách sử dụng bộ mã di truyền.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC GIỐNG LÚA CẠN NGHIÊN CỨU
3.1.1. Tác động của hạn đến cây lúa cạn ở giai đoạn mạ
Đặc tính chịu hạn của cây trồng nói chung và cây lúa nói riêng là tính trạng đa gen. Những giống lúa có khả năng chịu hạn thƣờng có bộ rễ khỏe, dài, mập. Đây là đặc điểm giúp cây lúa dễ dàng thu nhận đƣợc những phân tử nƣớc ít ỏi trong đất để duy trì sự sống. Do đó, đặc điểm của bộ rễ là một trong những chỉ tiêu quan trọng trong việc tuyển chọn giống lúa chịu hạn [6]. Đặc biệt, đối với những giống lúa cạn thì bộ rễ dài, khỏe, mập là những chỉ tiêu quan trọng nhất giúp cho cây có khả năng chịu hạn tốt. Để tồn tại đƣợc trong những điều kiện bất lợi bắt buộc cây trồng phải có những cơ chế thích nghi đó là sự biến đổi mạnh một số chất liên quan đến sự gia tăng áp suất thẩm thấu nhƣ giảm cố định CO2, giảm tổng hợp protein và axit nucleic, tăng hoạt tính ribonuclease (RNase) và tăng hàm lƣợng prolin, tăng nồng độ các chất hòa tan nhƣ betain... Điều này liên quan trực tiếp đến quá trình điều chỉnh ASTT và tăng tính đàn hồi của màng tế bào giúp cho cây duy trì sự sống khi lâm vào tình trạng thiếu nƣớc. Với mục tiêu so sánh khả năng chịu hạn của các giống lúa cạn địa phƣơng, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu một số chỉ tiêu nhƣ: xác định tỷ lệ thiệt hại, khả năng giữ nƣớc, chỉ số chịu hạn tƣơng đối và hàm lƣợng prolin của cây mạ.
Tỷ lệ thiệt hại của các giống lúa dưới tác động của hạn nhân tạo
Phân tích ảnh hƣởng của hạn đến sự sinh trƣởng và phát triển của các giống lúa cạn đƣợc tiến hành thông qua tỷ lệ cây héo, tỷ lệ cây chết sau 3, 5, 7 ngày hạn. Chúng tôi đã xác định đƣợc tỷ lệ thiệt hại do hạn gây ra ở 9 giống lúa cạn nghiên cứu, kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.1.
CB1 NA4 CB2 NA5 NA1 NA6 NA3 NA2
NA1 CB2 NA5 NA3
LC NA4 CB1 NA6 NA1 LC
A B
Hình 3.1. Ảnh các giống lúa ở giai đoạn mạ ở thời điểm trƣớc và sau khi xử lý bởi hạn (A: Trước hạn; B: Sau 5 ngày hạn)
Bảng 3.1. Tỷ lệ thiệt hại ở giai đoạn cây mạ trong điều kiện gây hạn nhân tạo (%)
Tên giống Hạn 3 ngày Hạn 5 ngày Hạn 7 ngày
NA1 2,56 17,44 47,69 NA2 3,59 17,95 51,28 NA3 2,05 13,85 45,13 NA4 7,18 23,59 66,67 NA5 5,64 22,05 56,41 NA6 9,74 26,67 78,97 LC 7,69 25,13 71,28 CB1 4,62 21,54 55,90 CB2 6,15 22,56 58,97 NA5 NA3
Bảng 3.1 cho thấy sau 3, 5, 7 ngày gây hạn tất cả các giống lúa nghiên cứu đều chịu tác động của hạn, tỷ lệ thiệt hại do hạn gây ra tăng theo thời gian gây hạn. Qua theo dõi thí nghiệm cho thấy, sau 3 ngày gây hạn lá non ở một số cây có hiện tƣợng quăn lại, còn thân và rễ không có hiện tƣợng gì. Sau 5 ngày hạn, mức độ ảnh hƣởng đó tăng lên rõ rệt. Đặc biệt, sau 7 ngày hạn tỷ lệ héo và chết của các giống đều tăng lên cao.
Giống lúa NA1 tăng từ 2,56% đến 47,69%, CB1 tăng từ 4,62% - 55,90%, NA4 tăng từ 7,18% - 66,67%, LC tăng từ 7,69% - 71,28%, giống có