So sánh trình tự gen GmDREB2 phân lập từ một số giống đậu tương trồng phổ biến ở miền bắc việt nam

m ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐINH THỊ HƯNG SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN GmDREB2 PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG TRỒNG PHỔ BIẾN Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên – 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐINH THỊ HƯNG SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN GmDREB2 PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG TRỒNG PHỔ BIẾN Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên – 2014 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nội dung trình bày luận văn tơi tìm hiểu hướng dẫn GS.TS Chu Hồng Mậu Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Tác giả Đinh Thị Hưng Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Chu Hồng Mậu tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm q báu để tơi hồn thành Bản luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học Tôi xin chân thành cảm ơn TS , ThS thầy cô Bộ môn Di truyền học & Sinh học đại, khoa Sinh – K , Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình thực Tôi xin cảm ơn PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Trưởng khoaKhoa Khoa học sống, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên TS nhiệt tình giúp đỡ tơi q trình thực đề tài - Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới tồn thể gia đình, cảm ơn bạn bè đồng nghiệp cổ vũ, động viên suốt thời gian qua Tác giả Đinh Thị Hưng Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn i Lời cam đoan ii Mục lục iii Danh viết tắt bảng mục ký hiệu, .vi chữ Danh mục vii Danh mục hình viii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY ĐẬU TƯƠNG VÀ TÁC ĐỘNG CỦA HẠN ĐẾN CÂY ĐẬU TƯƠNG 1.1.1 Cây đậu tương 1.1.2 Tác động hạn đến đậu tương 11 1.1.3 Đặc điểm sinh học đậu tương 1.1.4 Giá trị kinh tế đậu tương 1.1.5 Tình hình sản xuất đậu tương giới Việt Nam 1.2 GEN DREB VÀ DREB2 Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG 13 1.2.1 Gen DREB 13 1.2.2 DREB2 gen GmDREB2 16 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 21 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 21 2.1.2 Hoá chất thiết bị 22 2.1.3 Địa điểm cứuHọc 22 Số hóa nghiên Trung tâm http://www.lrc-tnu.edu.vn/ liệu 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.2.1 Các phương pháp sinh học phân tử 22 2.2.2 Phương pháp phân tích xử lý trình tự gen 30 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 KẾT QUẢ TỪ HAI GIỐNG ĐẬU TƯƠNG CBD DVN5 31 3.1.1 Kết nhân gen DREB2 31 ả GmDREB2 32 3.2 SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN DREB2 VÀ TRÌNH TỰ 36 GmDREB2 36 3.2.2 So sánh trình tự ống đậu tương CBD, DVN5 vớ ố AAY89658 40 3.2.3 Kết so sánh vùng AP2 protein DREB2 số giống đậu tương nghiên cứu 41 3.3 SO SÁNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ TRÌNH TỰ AMINO 42 3.3.1 Kết so sánh trình tự gen DREB2 số giống đậu tương Việ 054363 42 3.3.2 So sánh trình tự amino acid suy diễn số giống đậu tương Việ 89658 45 3.3.3 Kết so sánh vùng AP2 protein DREB2 tương CBD, DVN5, BG, ống đậu 89658 46 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48 KẾT LUẬN 48 ĐỀ NGHỊ 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABA Abscisis acid bp Cặp base Cs Cộng cDNA Complementary DNA( Sợi DNA bổ sung tổng hợp từ RNA thông tin nhờ enzym phiên mã ngược) DREB Dehydration- Responsive Element Binding EDTA Ethyen Diamin Tetraacetic Acid kb Kilo base PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) RNA Ribonucleic Acid TAE Tris acetat EDTA CBD Cao Bằng Đen DVN5 Giống ĐVN5 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bả , ản lượng đậ ệ .9 Bảng 2.1 Nguồn gốc giống đậu tương nghiên cứu 21 2.2 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA .24 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR nhân gen DREB2 25 Bảng 2.4 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen DREB2 25 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng colony – PCR 28 Bảng 2.7 Chu trình nhiệt phản ứng colony – PCR 29 Bảng 3.1 Các vị trí sai khác trình tự đoạn gen GmDREB2 hai giống đậu tương CBD DVN5 với gen GmDREB2 có mã số DQ054363 .39 Bả ữa trình tự 89658 41 Bả ữa trình tự 89658 42 Gm 42 Bả ữa trình tự đoạn genGmDREB2 giống đậu tương Việ Bảng 3.6 ự có mã số DQ054363 44 ữa trình tự amin 89658 46 Bảng 3.7 tự ữa trình tương Việ Số hóa Trung tâm Học liệu 89658 47 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 45 giống (CBD : 8, 10, 33, 41, 44, 69, 96, 159, 163, 165, 178, 202, 219, 261, 268, 284, 340, 458, 459, 465 3.5) Bảng 3.5 sai khác trình tự đoạn gen GmDREB2 giống đậu tương Việt Nam v trình tự có mã số DQ054363 TT Vị trí nucleotide DQ054363 CBD DVN5 BG BS A T A A A 10 G G G G T 33 C C T C C 41 C C G C C 44 C C C C A 69 A A G A A 96 G G C G G 159 T C C C C 163 C A A A A 10 165 T G G G G 11 178 C T T T T 12 202 A G G G G 13 219 T C C C C 14 261 C T T T T 15 268 C G C C C 16 284 A A A A G Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 17 340 A A C A A 18 458 A A G A A 19 459 G G A G G 20 465 C C C C G 3.3.2 So sánh trình tự amino acid suy diễn số giống 89658 so sánh g (CBD, DVN5, BG, BS) v 89658 3.10 Hình 3.10 T tương CBD, DVN5, BG, BS v 89658 3.10 acid: 3, 14, 32, 68, 90, 114, 153 3.6) Bảng 3.6 sai khác trình tự ami tương CBD, DVN5, BG, BS v 89658 TT Vị trí amino acid AAY89658 CBD DVN5 BG BS E V E E E 14 T T R T T 32 K K N K K 68 T A A A A 90 P A P P P 114 K K Q K K 153 E E G E E 3.3.3 Kết so sánh vùng AP2 protein DREB2 tương CBD, DVN5, BG, giống đậu 89658 Trên sở trình tự trình tự , DVN5, AAY89658 (Hình 3.10) Kết so sánh cho thấy vùng AP2 protein DREB2 gồm 59 amino acid, từ đồng cao (98,3%), 3.7) thứ 34 đến 92 độ tương hai vị trí amino acid (35, 57) (Bảng Hình 3.11 T (BD, DVN5, BG, BS) 89658 Trên hình 3.11 cho thấy vùng AP2 có độ tương đồng giống đậu tương Việt Nam 98,3% Các giống BG, BS, DVN5 khác vị trí số 35 giống CBD khác vị trí 35 57 (Bảng 3.7) Bảng 3.7 sai khác trình tự ệt Nam (BD, DVN5, BG, BS) 89658 Vị trí AAY89658 amino acid CBD DVN5 BG BS 35 T A A A A 57 P A P P P KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN 1.1 Đã nhân bản, tách dòng thành cơng xác định trình tự nucleotide gen GmDREB2 từ hai giống CBD DVN5 Gen GmDREB2 có 480 nucleotide, mã hóa 159 amino acid có 59 amino acid vùng AP2 1.2 gen GmDREB2 98% hai , DVN5 protein DREB2 acid (35, 57) gen GmDREB2 13 acid protein ĐỀ NGHỊ gen GmDREB2 để thiết kế vector phục vụ tạo chuyển gen nhằm cải thiện khả chịu hạn đậu tương Việt Nam Dao TX., Dinh HT,., Ho TM., Vu TTT., Nguyen TNT., Nguyen VTT,., Le VS and Chu HM (2014) Glycine max mRNA for transcription factor DREB2 protein (DREB2 gene), cultivar CaoBangDen (CBD) GenBank, HG965099.1 Dao TX., Dinh HT,., Ho TM., Vu TTT., Nguyen TNT., Nguyen VTT,., Le VS and Chu HM (2014) Glycine max mRNA for transcription factor DREB2 protein (DREB2 gene), cultivar VietNam5 (DVN5) GenBank, HG965098.1 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Ngô Thế Dân (1999), Cây Đậu Tương, Nxb Nông Nghiệp Đường Hồng Dật (2008 , Cây Đậu Tương - thâm canh tăng suất đẩy mạnh phát triển), Nxb Nơng Nghiệp Lê Dỗn Diên, Trương Văn Đến, Nguyễn Bá Trinh (1989), Nâng cao chất lượng nông sản, tập 2,(đậu tương), Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Trần Văn Điền (2007), Giáo Trình Cây Đậu Tương, Nxb Nông Nghiệp Trần Thị Phương Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hố sinh sinh học phân tử số giống đậu tương có khả chịu nóng, chịu hạn Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội Trần Đình Long (2000), Cây đậu tương, Nxb Nơng nghiệp Hà Nội з Chu Hồng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền đại chọn giống trồng, Nxb Đại học Thái Ngun Chu Hồng Mậu, Nơng Thị Man, Lê Trần Bình (2001), Đánh giá số tính trạng kinh tế quan trọngvà khả chịu hạn dòng đậu tương (Glycine max (L.) Merril) Đột biến, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ,1(13), Đại Học Thái guyên,16-21 Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thúy Hường, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Hà (2011), Gen đặc tính chịu hạn đậu tương Nxb Đại học Quốc Gia, Hà Nội 10 Phạm Văn Thiều (2008), Cây đậu Tương - Kỹ thuật trồng chế biến sản phẩm, Nxb Nông nghiệp Tiếng Anh 11 Arumingtyas,E.L., Sugianto,A and Pahlevi,M.R.(2011),Glycine max cultivar Wilis dehydration-responsive element binding protein (DREB2) gene, partial cds,NCBI, JF946771 12 Chen F., Chen S.Y and Liu Q (2002), Isolation of a rice cDNA encoding a DREB-like protein induced by stresses NCBI, Gen Bank, Accession AY064403 13 Chen J, Xia X, Yin W (2009), Expression profiling and functionalcharacterization of a DREB2-type gene from Populus euphratica College of Forestry, Beijing Forestry University, No 35, Qinghua East Road, Beijing 100083,China 14 Chen M., Wang Q Y, Cheng X G, Xu Z S, Li L C, Ye X G, Xia L Q, Ma Y Z., (2007) GmDREB2, a soybean DRE-binding transcription factor, conferred drought and high-salt tolerance in transgenic plants Biochem Biophys Res Commun 353(2):299-305 15 Chen,M., Xu,Z., Xia,L., Li,L., Cheng,X., Dong,J., Wang,Q and Ma,Y, (2013),Glycine max dehydration responsive element-binding protein (DREB3), mRNA,NCBI, NM_001250024 16 Chen Y., Chen P and de los Reyes B.G (2004), Analysis of the expression of DREB1 gene orthologs in cultivated and wild species of soybean NCBI, Gen Bank, Accession AY802779 17 Fujita Y., Fujita M., Satoh R., Maruyama K., Parvez M M., Seki M., Hiratsu K., Ohme-Takagi M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K., (2005), AREB1 is a transcription activator of novel ABRE-dependent ABA signaling that enhances drought stress tolerance in Arabidopsis, Plant Cel, 17(12), pp 3470-88 18 Gaiyun Zhang, Ming Chen, Liancheng Li, Zhaoshi Xu, Xueping Chen, JiamingGuo and Youzhi Ma, (2009), Overexpression of the soybean GmERF3 gene, an AP2/ERF type transcription factor for increased tolerances to salt, drought, and diseases in transgenic tobacco , Journal of Experimental Botany, 60(13), pp 3781-3796 19 Huang B., Jin,L and Liu J.(2007), Molecular cloning and functional characterization of a DREB1/CBF-like gene (GhDREB1L) from cotton, Sci China, C, Life Sci 50 (1), 7-14 20 Hoang TX,(.T.N.U.)., Pham TT,(.A.D.T.)., Le DH,(.T.N.U.)., Nguyen VTT, (.T.N.U.)., Le VS,(.A.D.T.) and Chu ,(.T.N.U.),(2014),Glycine max mRNA for transcription factor DREB2 protein (DREB2 gene), cultivar BacSon - LangSon (BS),NCBI,HG965101 21 Hoang TX,(.T.N.U.)., Pham TT,(.A.D.T.)., Le DH,(.T.N.U.)., Nguyen VTT,(.T.N.U.)., Le VS,(.A.D.T.) and Chu HM,(.T.N.U.),(2014),Glycine max mRNA for transcription factor DREB2 protein (DREB2 gene), cultivar BacGiang (BG),HG965100 22 Kobayashi F, Ishibashi M, Takumi S (2008) Transcriptional activation of Cor/Lea genes and increase in abiotic stress tolerance through expression of a wheat DREB2 homolog in transgenic tobacco Laboratory of Plant Genetics, Graduate School of Agricultural Science, Kobe University, 1-1 Rokkodai-cho, Nada-ku, Kobe, 657-8501, Japan 23 Li X.P., Tian A.G., Luo G.Z., Gong Z.Z., Zhang J.S., Chen S.Y., (2005), Soybean DRE-binding transcription factors that are responsive to abiotic stresses, Theor Appl Genet, 110(8), pp 1355-62 24 Liu L, Zhu K, Yang Y, Wu J, Chen F, Yu D.(2008), Molecular cloning, expression profiling and trans-activation property studies of a DREB2-like gene from chrysanthemum (Dendranthema vestitum) National Center for Soybean Improvement, National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing, 210095, People's Republic of China 25 Li,L.B., Bai,R., He,C.F., Ren,Q., Wang,Y.M., Zhang,J.X and Liu,(2007) Cymbidium insigne DRE-binding protein DREB1 (DREB1) mRNA, complete cds,NCBI, EF654657 26 Liu,M., Wang,N., Ma,Y.Z and Cheng,X.G(2005),Glycine max dehydration responsive element-binding protein 3, (DREB3) mRNA, complete cds,NCBI, DQ055133 27 Liao Y., Zou H.F., Wang H.W., Zhang W.K., Ma B., Zhang J.S., Chen S.Y., (2008), Soybean GmMYB76, GmMYB92, and GmMYB177 genes confer stress tolerance in transgenic Arabidopsis plants, Cell Res, 18(10), pp 1047–1060 28 Liu W and Feng F (2008), Nicotiana tabacum DREB4 mRNA, complete cds, College of Life Science, Henan Agricultural University, Wenhua Road, Zhengzhou, Henan 450002, P.R China 29 Lucas S., Hammon N., Glavina del Rio T., Detter J., Dalin E., Tice H., Pitluck S., Tuskan G., Chapman J., Putnam N.H., (2005), Populus trichocarpa AP2/ERF domain-containing transcription factor (DREB11), mRNA, US DOE Joint Genome Institute, 2800, Mitchell Drive B100, Walnut Creek, CA 94598-1698, USA 30 Nakashima K, Shinwari ZK, Skuma Y, Seki M, Miura S, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K (2000), Organization and expression of two Arabidopsis DREB2 genes encoding DRE-binding proteins involved in dehydration- and high-salinity-responsive gene expression Biological Resources Division, Japan International Research Center for Agricultural Sciences, Tsukuba, Ibaraki 31 Nguyen,V.T.T., Chu,H.M., Hoang,V.M.and Le,D.H(2011),Glycine max dreb5 gene for drought responsive element binding protein, cultivar VangNganSon (DREB5)gene,NCBI, HE647690 32.Nguyen,V.T.T., Chu,M.H., Hoang,M.V and Le,H.D(2012),Glycine max dreb5 gene for drought responsive element binding protein 5, cultivar XanhBaBe (DREB5)gene,NCBI, HE648567 33 Qin F., Li J., Zhao J., Chen S.-Y and Liu Q (2002) Isolation of a maize cDNA encoding an DREB-like protein induced by stress, NCBI, Gen Bank, Accession AF448789 34 Li X.P., Tian A.G., Luo G.Z., Gong Z.Z., Zhang J.S., Chen S.Y., (2005), Soybean DRE-binding transcription factors that are responsive to abiotic stresses, Theor Appl Genet, 110(8), pp 1355-62 35 Wang P.R., Deng X.J., Gao X.L., Chen J., Wan J., Jiang H., Xu Z.J., (2006), “Progress in the study on DREB transcription factor”, Yi Chuan, 28(3), pp 369-74 36 Yang K., Moon J.K., Jeong N., Back K., Kim H.M., Jeong S.C., (2008), Genome structure in soybean revealed by a genomewide genetic map constructed from a single population NCBI, Accession EU036414, Http://www.ncbi.nlm.nih.gov 37 Zhen Y and Ungerer M C (2008), “Relaxed selection on the CBF/DREB1 regulatory genes and reduced freezing tolerance in the southern range of Arabidopsis thaliana”Mol Biol E, 25 (12), 2547-2555 38 http://www.gos.gov.vn 39 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleccore} 40 http://faostat.fao.org ... diễn phân lập từ số giống đậu tương trồng miền Bắc Việt Nam Nội dung nghiên cứu (i) Nhân gen, tách dòng xác định trình tự gen GmDREB2 từ hai mẫu đậu tương nghiên cứu; (ii) So sánh trình tự gen GmDREB2. .. đậu tương Việt Nam Ở Việt Nam, đậu tương trồng từ lâu, trước đậu xanh họ đậu khác Các giống đậu tương nước ta bao gồm giống đậu tương nhập nội, giống lai tạo, giống đậu tương đột biến giống đậu. .. nghiên cứu Từ lý tiến hành nghiên cứu đề tài: So sánh trình tự gen GmDREB2 phân lập từ số giống đậu tương trồng phổ biến miền Bắc Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu Xác định sai khác trình tự gen DREB2