Nghiên cứu khả năng đối kháng của một số chủng vi sinh vật phân lập từ đất trồng rừng đối với một số loại nấm vật gây bệnh thực vật phổ biến ở miền bắc Việt Nam

Hội nghị tư vấn khu vực châu Á Thái Bình Dương của FAO năm 1992 đã khẳng định đấu tranh sinh học là nền tảng của chương trình IPM (Quản lý dịch hại tổng hợp) với chiến lược là sử dụng tác nhân sinh học để hạn chế các quần thể VSV gây bệnh. Trong số các tác nhân sinh học thường được sử dụng để ức chế VSV gây bệnh, xạ khuẩn là nhóm có nhiều tiềm năng nhất vì tỷ lệ loài có khả năng sinh chất kháng sinh cao, trong đó có nhiều chất kháng sinh có khả năng chống nấm mạnh. Cho tới nay , trong khoảng hơn 8.000 chất kháng sinh được biết đến trên thế giới thì 80% là do xạ khuẩn sinh ra . Vì vậy, việc tìm kiếm các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh kháng nấm bệnh cây có thể góp phần vào công tác bảo vệ cây trồng và xây dựng nền nông nghiệp an toàn và bền vững.

LỜI CẢM ƠN

Hiện nay, trong quá trình học tập tại các trường Đại học chủ yếu chútrọng đào tạo cho Sinh viên nắm vững kĩ thuật lý thuyết, và kiến thức tổng quanngành nghề, và những hiểu biết về khoa học nói chung Nên chưa thể đi sâu vàothực tế Việc tham gia nghiên cứu khoa học là 1 cơ hội cho sinh viên tiếp cận,ứng dụng những kiến thức đã được học trên ghế nhà trường vào cuộc sống cụthể, đem lại cho sinh viên những kinh nghiệm bổ ích, và tinh thần hăng say laođộng, thêm yêu ngành nghề mình đã chọn Bên cạnh đó còn rèn luyện kĩ năngthực hành, rèn cho sinh viên sự nhạy bén, sáng tạo điều rất cần thiết cho Sinhviên sau này khi ra trường

Báo cáo nghiên cứu khoa học đã được hoàn thành tại Viện Công nghệSinh học, trường Đại học Lâm Nghiệp - thị trấn Xuân Mai - huyện Chương Mỹ -Thành phố Hà Nội Để hoàn thành báo cáo này, chúng em luôn được sự quantâm của nhà trường, sự động viên của bạn bè và sự giúp đỡ, hướng dẫn nhiệttình của các thầy cô

Nhân dịp này, cho phép chúng em được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đếnThS Nguyễn Thị Minh Hằng đã tận tình chỉ dẫn, giúp đỡ chúng em trong suốtquá trình nghiên cứu Xin được cảm ơn Viện Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp,trường Đại học Lâm Nghiệp đã tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quátrình nghiên cứu để hoàn thành bản báo cáo này

Do trong quá trình nghiên cứu khoa học còn có nhiều hạn chế về mặt thờigian và kinh nghiệm, báo cáo không tránh khỏi những thiếu sót Em rất mongnhận được những ý kiến đóng góp của thầy cô giáo để báo cáo nghiên cứu khoahọc được hoàn thiện hơn

Chúng em xin trân thành cảm ơn!

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1 1 Một số bệnh do nấm gây ra và chất kháng sinh trong phòng chống nấm bệnh 3

1.1.1 Thực trạng về bệnh hại cây trồng 3

1.2 Giới thiệu về xạ khuẩn 8

1.2.1 Vị trí phân loại và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên 8

1.2.2 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 8

1.2.3 Cấu tạo của xạ khuẩn 10

1.2.4 Đặc điểm sinh lý hóa của xạ khuẩn 12

1.3 Giới thiệu về Bacillus 14

1.3.1 Vị trí phân loại và sự phân bố của Bacillus subtilis trong tự nhiên 15

1.3.2 Đặc điểm hình thái 16

1.3.3 Đặc điểm nuôi cấy 16

1.3.4 Bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis 16

1.3.5 Sự hình thành bào tử 17

1.3.6 Tính chất đối kháng của Bacillus subtilis với một số vi sinh vật gây bệnh 17

1.4 Tình hình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật đối kháng trong bảo vệ thực vật ở trong nước và trên thế giới 18

CHƯƠNG II MỤC TIÊU – NỘI DUNG – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Mục tiêu nghiên cứu 20

2.2 Nội dung nghiên cứu 20

2.3 Đối tượng nghiên cứu 20

2.4 Vật tư và hóa chất sử dụng cho nghiên cứu 21

2.4.1 Dụng cụ và thiết bị 21

2.4.2 Hóa chất 21

2.4.3 Môi trường nghiên cứu 21

2.5 Phương pháp nghiên cứu 23

2.5.1 Phương pháp phân lập nấm gây bệnh từ các mẫu bệnh 23

2.5.2 Phương pháp phân lập xạ khuẩn 23

2.5.3 Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Bacillus từ đất 25

2.5.4 Phương pháp xác định hoạt tính đối kháng 25

2.5.5 Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh 26

2.5.6 Phương pháp thuần khiết và bảo quản giống 26

2.5.7 Phương pháp nhuộm Gram và quan sát đặc điểm hình thái của tế bào vi sinh vật 27

2.5.8 Phương pháp xác định đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi sinh vật 28

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Kết quả phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm bệnh 30

3.1.1 Kết quả thu thập mẫu bệnh 30

3.1.2 Kết quả phân lập nấm bệnh và đặc điểm sinh học của các chủng nấm bệnh 31

3.1.3 Kết quả quan sát hình dạng tế bào nấm (hình 3.2) 33

3.2 Kết quả phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn từ đất có khả năng đối kháng với nấm bệnh thực vật 35

3.2.1 Kết quả phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn từ đất và các đặc điểm sinh học của xạ khuẩn 35

3.2.2 Xác định hoạt tính đối kháng của xạ khuẩn với nấm bệnh 39

3.2.3 Kết quả quan sát hình dạng tế bào xạ khuẩn 41

3.3 Kết quả phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus từ đất có khả năng đối kháng với nấm bệnh 43

3.3.1 Kết quả phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus từ đất 43

3.3.2 Xác định hoạt tính đối kháng của các chủng vi khuẩn Bacillus với nấm bệnh .44

3.3.3 Kết quả quan sát hình dạng tế bào xạ khuẩn 45

3.4 Đặc tính sinh lý hóa của các chủng vi sinh vật 47

3.4.1 Khả năng đồng hóa nguồn Cacbon 47

3.4.2 Ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ 47

3.4.3 Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật 48

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Bảng thu thập mẫu bệnh 30

Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc các chủng nấm bệnh đã được phân lập 32

Bảng 3.3 Một số đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn 37

Bảng 3.4 Hoạt tính kháng nấm của các chủng xạ khuẩn 39

Bảng 3.5 Đặc điểm hình thái các chủng vi khuẩn Bacillus phân lập từ đất 43

Bảng 3.6 Hoạt tính kháng nấm của các chủng vi khuẩn Bacillus 44

Bảng 3.7 Khả năng đồng hóa nguồn Cacbon của các chủng vi sinh vật 47

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ 48

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của pH 49

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Triệu chứng đốm thân cây đu đủ do nấm P.aphanidermatum gây ra 4

Hình 1.2 Triệu chứng phồng lá chè do nấm exsobasidium vexans gây ra 5

Hình 1.3 Triệu chứng bệnh thán thư hại xoài do nấm Colletotrichum gloeosporioides gây ra 6

Hình 1.4 Triệu chứng bệnh thối than và tướp lá ngô 6

Hình 1.5 Triệu chứng bệnh phấn đen ở bắp ngô do nấm Ustilago zeae Shwein Unger gây ra 7

Hình 1.6 Triệu chứng bệnh khô cành lá cây cà phê do nấm Colletotrichum cofeanum gây ra 7

Hình 1.7 Các dạng khuẩn lạc của xạ khuẩn 9

Hình 1.8 Các dạng cuống sinh bào tử xạ khuẩn 10

Hình 3.1 Mẫu bệnh sau khi nuôi cấy 32

Hình 3.2 Bào tử của một số chủng nấm 34

Hình 3.3 Vi sinh vật phân lập được từ đất 35

Hình 3.4 Tinh sạch các chủng xạ khuẩn 36

Hình 3.5 Hình thái khuẩn lạc của các chủng xạ khuẩn 38

Hình 3.6 Xạ khuẩn giữ giống trong ống nghiệm 39

Hình 3.7 Hoạt tính kháng nấm của các chủng xạ khuẩn 40

Hình 3.8 Hình thái khuẩn lạc của chủng BT1 41

Hình 3.9 Hình dạng hệ sợi và bào tử của chủng BT1 42

Hình 3.10 Hình dạng tế bào và bào tử của chủng BT4 42

Hình 3.11 Hoạt tính kháng nấm của các chủng vi khuẩn Bacillus 44

Hình 3.12 Hình dạng tế bào và bào tử của chủng RC1 46

Hình 3.13 Hình dạng tế bào của chủng RC2 46

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DDT: Dichloro diphenyl trichloroethane

FAO: Food and Agriculture Organization of the United Nations.IPM: Integrated Pest Management

CFU: Colony Forming Unit

CZ: Czapek Dox Agar

PDA: Potato Dextrose Agar

ISP : International Streptomyces Project

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nước ta là một nước nhiệt đới gió mùa nóng ẩm nên điều kiện thích hợp

để cho dịch bệnh nấm tồn tại và phát triển Hàng năm phải chịu thiệt hại hàngtrăm tỉ đồng vì hoa màu bị nhiễm nấm bệnh Hàng ngàn hecta cây ăn quả, câycông nghiệp bị giảm năng suất sau thu hoạch hoặc chặt bỏ vì nhiễm nấm bệnh.Bệnh hại do nấm là một vấn đề mà người nông dân còn gặp nhiều khó khăntrong việc quản lý và phòng trừ Thiệt hại kinh tế của bệnh cây là điều thấy rấtrõ: làm giảm năng suất cây trồng, giảm phẩm chất nông sản khi thu hoạch vàbảo quản, ảnh hưởng xấu đến đất trồng và cơ cấu cây trồng Từ thế kỷ 18 Anton

De Bary đã đặt nền móng môn khoa học bệnh cây (1853) Để khắc phục nhữngthiệt hại do bệnh cây gây ra, người ta đã sử dụng nhiều biện pháp như: kỹ thuậtcanh tác, thuốc hóa học, … trong đó sử dụng thuốc hóa học để phòng ngừa vàngăn chặn bệnh hại cây trồng là được nhiều người ưa chuộng do tính dễ sửdụng, hiệu quả cao nếu kết hợp với biện pháp canh tác thì việc phòng bệnh chocây đạt hiệu quả lớn Tuy nhiên, sau thời gian dài sử dụng thuốc hóa học cũngnhư phân hóa học người ta đã nhận thấy chúng ảnh hưởng đến môi trường sốngrất lớn Chúng tác động xấu đến cân bằng sinh thái, gây ô nhiễm môi trường đất,nước làm cho người và gia súc bị ngộ độc Đáng ngại hơn, một số thuốc trừ sâuchậm phân hủy đã lưu tồn lâu trong đất (DDT lưu tồn được 25 năm) sự lưu tồnlâu trong đất của các chất hoá học này làm nồng độ của chúng tăng dần theo thờigian Đồng thời việc sử dụng tuỳ tiện liều lượng, thời gian phun thuốc hóa học

đã tạo nên dư lượng lớn không cho phép trong rau màu và lương thực, gây nênnhững vụ ngộ độc thực phẩm lớn mà con người mà chúng ta từng biết trong thờigian qua

Chính vì vậy, Hội nghị tư vấn khu vực châu Á Thái Bình Dương của FAOnăm 1992 đã khẳng định đấu tranh sinh học là nền tảng của chương trình IPM(Quản lý dịch hại tổng hợp) với chiến lược là sử dụng tác nhân sinh học để hạnchế các quần thể VSV gây bệnh Trong số các tác nhân sinh học thường được sử

dụng để ức chế VSV gây bệnh, xạ khuẩn là nhóm có nhiều tiềm năng nhất vì tỷ

lệ loài có khả năng sinh chất kháng sinh cao, trong đó có nhiều chất kháng sinh

có khả năng chống nấm mạnh Cho tới nay , trong khoảng hơn 8.000 chất khángsinh được biết đến trên thế giới thì 80% là do xạ khuẩn sinh ra(Dhanasekaranetal., 2012) Vì vậy, việc tìm kiếm các chủng xạ khuẩn có khảnăng sinh chất kháng sinh kháng nấm bệnh cây có thể góp phần vào công tác bảo

vệ cây trồng và xây dựng nền nông nghiệp an toàn và bền vững

Xuất phát từ những lý do trên, chúng em thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng đối kháng của một số chủng vi sinh vật phân lập từ đất trồng rừng đối với một số loại nấm vật gây bệnh thực vật phổ biến ở miền bắc Việt Nam”

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Nấm được xếp vào nhóm sinh vật, nhưng không giống như Rong Tảo,nấm không chứa diệp lục tố Cấu tạo thường là đơn bào hoặc đa bào, có thể quansát dưới kính hiển vi hoặc nhìn bằng mắt thường, chúng có thể đo được từ vàimicrons cho tới vài centimeters có khi tới vài metters, trường hợp nấm có quảthể ở Lớp Đảm khuẩn (Basidiomycetes) Nấm có cơ quan sinh trưởng dạng sợi,phân nhánh Một tập hợp nhiều sợi nấm sinh trưởng tạo thành tản nấm là thểdinh dưỡng của nấm Sợi nấm không có màng ngăn gọi là sợi đơn bào và sợinấm có nhiều màng ngăn gọi là sợi đa bào Chiều rộng của sợi nấm biến độngtrong khoảng 0,5-100 µm, phần lớn từ 5-20 µm, chiều dài thay đổi tùy theo cácloại nấm và điều kiện dinh dưỡng Nấm có thể sợi không màu hoặc các màukhác nhau Nấm đất gây bệnh có thể tồn tại trong đất trong thời gian rất dài kể

cả trong điều kiện không có cây ký chủ Chúng bảo tồn bằng các sợi nấm, hạchnấm, hậu bào tử, bào tử trứng và những bào tử có vách dày ở trong đất và trêntàn dư cây trồng Nấm xâm nhiễm, gây hại cây trồng làm cho rễ và các tế bàomạch dẫn của cây không còn khả năng hút nước và chất dinh dưỡng từ giá thể

Vì vậy mà các triệu chứng của bệnh nấm gây ra thường rất giống nhau, đều gâyhéo vàng, còi cọc và chết cây Nhiệt độ thích hợp nhất của nấm là 25 – 28oC,nhiệt độ thấp nhất là 5 – 10oC, cao nhất là 35oC

1 1 Một số bệnh do nấm gây ra và chất kháng sinh trong phòng chống nấm bệnh

1.1.1 Thực trạng về bệnh hại cây trồng

Ở các nước sản xuất nông nghiệp, bệnh cây đã gây ra những thiệt hại kinh

tế nghiêm trọng Các dịch bệnh đạo ôn hại lúa, bệnh bạc lá (do vi khuẩn gây ra),bệnh vàng lụi (do virus gây ra), bệnh khô vằn (do nấm gây ra), …đã gây tổn thấtlớn không những về năng suất mà còn làm mất tính ổn định của giống cây trồng.Theo thống kê của tổ chức lương nông thế giới cho thấy: các loại cây trồng trênđồng ruộng hiện nay phải chống đở với 100.000 loài sâu hại khác nhau, 10.000

loài nấm, 200 loài vi khuẩn, 600 loài tuyến trùng và 600 loài virus gây bệnh;thiệt hại hàng năm khoảng 20% (tức 1/5) sản lượng lương thực thực phẩm trênthề giới bị mấttrắng.

Sau đây là một số bệnh gây thiệt hại lớn phổ biến ở miền Bắc Việt Nam:

* Bệnh thối gốc cây đu đủ:

- Bệnh phát sinh trên thân cây,vết bệnh lúc đầu bằng đầu kim, sau đó lanrộng ra khắp thân cây đổi sang màu nâu hay đen Lá bị vàng, rũ và rụng đi,dogốc bị thối cây sẽ bị đổ và chết Thường cây được 2-3 năm tuổi dễ bị nhiễmbệnh, tuy nhiên cây non vẫn bị bệnh Cây con gieo từ đất có mầm bệnh có thểmang mầm bệnh và sau khi trồng nếu điều kiện thích hợp bệnh sẽ phát

triển.Bệnh thường phát triển nặng vào đầu mùa mưa, do nấm pythium

aphanidermatum thuộc lớp Phycomycetes gây ra Có nhiều loài Pythium gây

bệnh này nhưng chủ yếu là P.aphanidermatum Nấm có đặc điểm như: túi bào

- Bệnh do nấm exsobasidium vexans gây ra Dưới điều kiện độ ẩm cao,

nhiệt độ thấp bệnh phát sinh mạnh Các thời điểm bệnh thường phát sinh mạnhthường từ tháng 3 đến tháng 5 và tháng 9- 10 Nhiệt độ thích hợp là 15–200C.Nhiệt độ 11-120C không có lợi ích cho sự phát triển của bệnh và trên 260C bệnhkhông phát triển

Hình 1.2 Triệu chứng phồng lá chè do nấm exsobasidium vexans gây ra

* Bệnh thán thư trên cây xoài:

- Là loại bệnh nguy hiểm nhất, thường gây hại trong mùa mưa hoặcnhững lúc đêm có sương Nấm bệnh tấn công trên cành non, lá non, hoa và quả.Trên hoa bệnh là rụng hoa, ở lá đốm bệnh màu xám nâu, tròn hay góc cạnh, tạođốm cháy lá và rách lá, cuối cùng lá bị rụng Trên quả, bệnh ban đầu chỉ là cácđốm nâu nhỏ, sau đó phát triển thành các đốm thối đen lõm xuống vỏ quả Bệnh

do nấm Colletotrichum gloeosporioides gây ra.

Hình 1.3 Triệu chứng bệnh thán thư hại xoài do nấm Colletotrichum

gloeosporioides gây ra

* Bệnh thối than và tướp lá ngô:

- Bệnh làm thối phần trên của thân và gây ra các vết bệnh trên lá Trên lá,ban đầu vết bệnh ươn ướt như giọt dầu, về sau phần giữa vết bệnh khô, nhưngchung quanh vẫn còn một viền màu nhạt, sau tạo thành vết bệnh trên lá dài, kíchthước rất khác nhau, cuối cùng lá bị bệnh rách theo chiều dọc và tướp ra

Thân cây ngô thường bị thối bắt đầu ở phần trên ngang gần mắt đóng bắp.Trên bề mặt dóng thân xuất hiện các sọc màu nâu đỏ, còn phần bên trong thânthì bị thối nâu hoặc thối đen Hiện tượng thối thân càng phát triển, ngọn cây ngô

bị héo và chết, hoa cờ không phát triển được

Hình 1.4 Triệu chứng bệnh thối than và tướp lá ngô.

* Bệnh phấn đen ở cây ngô:

- Bệnh thường xuất hiện ở bắp ngô là chính Mới đầu chỗ bị bệnh chỉ nổilên như một bọc nhỏ, mầu trắng nhẵn, sau đó cứ lớn dần và tạo thành dạng vô

định hình, phình to ra, nhiều khía cạnh, mầu trắng, bên trong là một khối rắnmầu vàng nhạt, sau biến dần thành bột mầu đen, bóp dễ vỡ.

- Bệnh do nấm Ustilago zeae Shwein Unger (DC.) Corda thuộc bộ

Ustilaginales, lớp Nấm Đảm gây ra.

Hình 1.5 Triệu chứng bệnh phấn đen ở bắp ngô do nấm Ustilago zeae

Shwein Unger gây ra.

* Bệnh khô cành lá cây cà phê:

Bệnh do nấm Colletotrichum cofeanum gây ra trên cây cà phê, bệnh phát triển

đặc biệt vào mùa mưa Khi bị bệnh trên cành, lá ban đầu chỉ xuất hiện nhữngđốm tròn màu nâu đen, sau đó lan rộng dần, trên đó có các vòng tròn đồng tâm.Nếu bị nặng các vết bệnh liên kết với nhau thành từng mảng khô, màu nâu hayđen sẫm

cây cà phê do nấm Colletotrichum cofeanum gây ra

1.2 Giới thiệu về xạ khuẩn

1.2.1 Vị trí phân loại và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên

Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bốrất rộng rãi trong tự nhiên Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn,thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được Sựphân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác

và thảm thực vật Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 2.400.000 mầm xạ khuẩn, chiếm 9 - 45% tổng số VSV Sự phân bố của xạkhuẩn còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường,chúng có nhiều trong các lớpđất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu 6,8 - 7,5 Xạ khuẩn có rất ít trong lớpđất kiềm hoặc axit và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm, số lượng xạ khuẩntrong đất cũng thay đổi theo thời gian tro ng năm Một trong những đặc tínhquan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh, 60 - 70%

-xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh chất kháng sinh

Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì cótới 80% là do xạ khuẩn sinh ra Trong số đó có trên 15% có nguồn gốc từ các

loại xạ khuẩn hiếm như Micromonospora Actinomadura, Actinoplanes,

Streptoverticillium, Streptosporangium Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn hiếm

đã cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị đang dùng trong y học nhưgentamixin, tobramixin, vancomixin, rosamixi Ngoài ra, xạ khuẩn tham gia tíchcực vào các quá trình chuyển hoá nhiều hợp chất trong đất, nước Dùng để sảnxuất nhiều enzym như proteaza,amylaza, xenluloza…một số axit amin và axithữu cơ Một số xạ khuẩn có thể gây bệnh cho người, động vật

1.2.2 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn

Xạ khuẩn sống rất phổ biến trong tự nhiên cũng như trong đất, chúng cónhiều đặc điểm giống vi khuẩn và khác với nấm mốc như kích thước tế bào nhỏ,thành tế bào không chứa cenllulose hay kitin, phân chia tế bào theo kiểu vô ti(Amytoz), không phân biệt giới tính; tuy nhiên, xạ khuẩn cũng có những đặcđiểm giống nấm mốc hơn như có hệ sợi khuẩn ty phân nhánh, nhưng ở xạ khuẩn

hệ sợi không có vách ngăn Sự phân hoá của khuẩn ty khí sinh bắt đầu từ nhữngmấu lồi xuất hiện trên bề mặt của sợi khuẩn ty sau đó mấu lồi lớn lên thành chồi,chồi phát triển dài ra thành sợi, cuối cùng tạo thành hệ sợi dầy đặc Đường kínhmỗi sợi khuẩn ty là 0,5µm – 1,5µm (R.E Buchanan,1998).

Khuẩn ty khí sinh của xạ khuẩn phát triển ra bên ngoài không khí trên bềmặt môi trường rắn tạo thành khuẩn lạc xạ khuẩn; khuẩn lạc xạ khuẩn dạng hìnhtròn do khuẩn ty phát triển theo hình phóng xạ tạo thành nhiều vòng tròn đồngtâm (xem hình 1.7), khác với khuẩn lạc của nấm men, nấm mốc và vi khuẩn,khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì, bề mặt có mấu lồi, có nếp nhăn hoặcsần sùi Theo Procofieva Bengopxkaia (1936), cho rằng khuẩn lạc của xạ khuẩn

có 3 lớp: lớp ngoài gồm các sợi bện chặt lại với nhau, lớp trong tương đối xốphơn, và lớp giữa thì có cấu trúc tổ ong Khuẩn lạc của xạ khuẩn có thể mang cácmàu sắc khác nhau như: màu đỏ, màu lam, màu xám, màu tím

Hình 1.7 Các dạng khuẩn lạc của xạ khuẩn

Các khuẩn ty mọc phía dưới khuẩn lạc và cắm sâu vào trong môi trường

là khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty cơ chất có nhiệm vụ hút chất dinh dưỡng để cungcấp dinh dưỡng cho toàn bộ cơ thể nên còn gọi là khuẩn ty dinh dưỡng Đườngkính khuẩn ty cơ chất thay đổi từ 0,2μm – 0,3μm, khuẩn ty không có vách ngănm – 0,3μm – 0,3μm, khuẩn ty không có vách ngănm, khuẩn ty không có vách ngăn

và không bị đứt đoạn Tuỳ loại môi trường mà khuẩn ty cơ chất có thể tiết ramôi trường một số loại sắc tố trong đó có sắc tố hòa tan được trong nước có sắc

tố hòa tan được trong dung môi hữu cơ

Sau thời gian phát triển, trên đầu sợi khuẩn ty khí sinh hình thành nênnhững sợi phân hóa gọi là cuống sinh bào tử; tuỳ theo từng loài mà cuống sinhbào tử có thể thẳng hay uốn cong, xoắn lò so hay xoắn ốc; chúng có thể mọcđơn, mọc đối, mọc vòng, mọc thành chùm, số vòng xoắn của cuống sinh bào tử

có thể từ 5 – 10 vòng, đường kính vòng xoắn có thể thay đổi từ 5 – 7nm(hình1.8)

Hình 1.8 Các dạng cuống sinh bào tử xạ khuẩn

1.2.3 Cấu tạo của xạ khuẩn

Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram dương, toàn bộ

cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinhchất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập

Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 - 20 nm có tácdụng duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào Thành tế bào gồm 3 lớp:

Lớp ngoài cùng dày khoảng 60 - 120A°, khi già có thể đạt tới 150 - 200A°, lớpgiữa rắn chắc, dày khoảng 50A°, lớp trong dày khoảng 50A° Các lớp này chủyếu cấu tạo từ các lớp glucopeptide bao gồm các gốc N – axetyl glucozamin liênkết với N - axetyl muramic bởi các liên kết 1,4 - glucozit Khi xử lý bằnglyzozym, các liên kết 1,4 - glucozit bị cắt đứt, thành tế bào bị phá huỷ tạo thànhthể sinh chất (protoplast), cấu trúc sợi cũng bị phá huỷ khi xử lý tế bào với hỗnhợp este chlorofom và các dung môi hoà tan lipit khác Nguyên nhân là do lớpngoài cùng có cấu tạo chủ yếu bằng lipit khác với nấm Thành tế bào xạ khuẩnkhông chứa xenllulose và kitin nhưng chứa nhiều enzym tham gia vào quátrìnhtrao đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào.

Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm được cấu tạochủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipit và protein Chúng có vai trò đặc biệtquan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của xạkhuẩn Nguyên sinh chất và nhân tế bào xạ khuẩn không có khác biệt lớn so với

tế bào vi khuẩn Trong nguyên sinh chất của xạ khuẩn cũng chứa mezoxom vàcác thể ẩn nhập (các hạt polyphosphate: hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộmsudan III và các hạt polysaccharide bắt màu với dung dịch lugol)

Tuy nhiên, điểm khác biệt của xạ khuẩn so với các sinh vật prokaryote ởchỗ chúng có tỷ lệ G + C rất cao trong DNA, thường lớn hơn 55%, trong khi đó

ở vi khuẩn tỷ lệ này chỉ là 25 45% [8]

Xạ khuẩn thuộc loại vi khuẩn Gram dương nên ngoài yếu tố di truyềntrong nhiễm sắc thể còn có các yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể, chúng cóthể tự nhân lên mà được Lederberg gọi là plasmid Các plasmid đem lại cho tếbào nhiều đặc tính chọn lọc quý giá như có thêm khả năng phân giải một sốhợpchất, chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với các kháng sinh, chuyểngene, sản xuất các chất kháng sinh trong đất và môi trường tuyển chọn [9]

Xạ khuẩn thuộc loại cơ thể dị dưỡng, nguồn cacbon chúng thường dùng làđường, tinh bột, rượu và nhiều chất hữu cơ khác Nguồn nitơ hữu cơ là protein,

pepton, cao ngô, cao nấm men Nguồn nitơ vô cơ là nitrat, muối amôni…Khảnăng đồng hoá các chất ở các loài hay chủng xạ khuẩn khác nhau là khác nhau.

1.2.4 Đặc điểm sinh lý hóa của xạ khuẩn

1.2.4.1 Đặc điểm sinh lý nuôi cấy

Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong môi trường đất - xạkhuẩn chiếm 20 – 40% tổng số vi sinh vật trong đất, tập trung ở nhiều lớp đấttrên bề mặt (sâu xuống khoảng 40cm) Hầu như trong các loại đất đều có mặtcủa xạ khuẩn, đa số xạ khuẩn là vi sinh vật hiếu khí, ưa ẩm, một số xạ khuẩn ưanhiệt Xạ khuẩn thường sống tốt trong môi trường có pH trung tính

Xạ khuẩn thuộc cơ thể dị dưỡng nên nguồn hydratcacbon mà chúng sửdụng có thể là tinh bột, đường, polysaccaric… nguồn nitơ mà xạ khuẩn sử dụngbao gồm: muối amon, muối nitrat (nguồn nitơ vô cơ); protein, pepton, cao ngô,

…(nguồn nitơ hữucơ)

1.2.4.2 Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn

Có nhiều lập luận khác nhau hoặc theo nguồn gốc hoặc theo hướng điềutrị bệnh nhưng nhìn chung có thể hiểu chất kháng sinh (Antibiotic) là các chất

có nguồn gốc vi sinh vật và thực vật có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêudiệt một số vi sinh vật khác một cách có chọn lọc ngay khi ở nồng độ thấp Chấtkháng sinh là một chất hóa học có hoạt tính kháng lại các vi sinh vật như: vikhuẩn gây bệnh cho người và động vật; nấm gây bệnh ở động vật và thực vật Các

vi sinh vật mẫn cảm với chất kháng sinh ở những mức độ khác nhau, đa số các vikhuẩn gram dương mẫn cảm với chất kháng sinh hơn các vi khuẩn gram âm

1.2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh

* Điều kiện nuôi cấy:

- Độ thông khí: yếu tố thông khí ảnh hưởng quyết định đến sinh tổng hợpchất kháng sinh Các xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí nên độ thông khí

để đạt hiệu suất cực đại đóng vai trò quan trọng ảnh hưởng khả năng sinh khángsinh; lượng không khí cung cấp vào môi trường nuôi cấy là lưu lượng thổi khí 1thể tích môi trường /1phút

- Nhiệt độ: có những loài xạ khuẩn ưa nhiệt hay sống tốt khi nhiệt độ củamôi trường cao nhưng đa số các xạ khuẩn sinh kháng sinh mà chúng ta khảo sátthường phát triển tốt ở nhiệt độ 28oC – 30oC (nhiệt độ phòng thí nghiệm) Nhiệt

độ tối ưu cho sinh tổng hợp chất kháng sinh thường nằm trong khoảng 18oC –

28oC

- pH: sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc đáng kể vào độ pH của môitrường Độ pH thích hợp để sinh tổng hợp chất kháng sinh là pH trung tính, ở

pH acid và kiềm sẽ ức chế quá trình sinh tổng hợp chất khángsinh

- Nhân giống: Qua thực nghiệm cho thấy sinh tổng hợp chất kháng sinhkhông chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men mà còn phụ thuộc vào chất lượngcủa bào tử và giống sinh dưỡng, nghĩa là tuổi và khả năng đồng đều về mặt ditruyền và hoạt tính trao đổi chất của giống phản ánh điều kiện nuôi cấy Điềukiện của môi trường nhân giống cũng như thời gian nhân giống cũng khác nhautùy vào từng chủng và tuổi của bào tửgiống

- Hình thức lên men: trong sinh tổng hợp chất kháng sinh phương phápnuôi cấy cũng là một trong những yếu tố quyết định; Qui trình sản xuất chấtkháng sinh thường được nuôi cấy theo phương pháp nuôi cấy chìm trong nồi lênmen có khuấy đảo và sụckhí

* Thành phần môi trường nuôi cấy:

- Sinh tổng hợp chất kháng sinh ở vi sinh vật phụ thuộc chặt chẽ vào môitrường lên men Trước hết là nguồn C, N và phosphat vô cơ Các vi sinh vật khi

đã phát triển trên môi trường nhân giống và cấy truyền lên môi trường lên men

có nguồn gốc C, N và các thành phần môi trường khác nhau sẽ dẫn đến khảnăng sinh các chất khác nhau

- Nguồn cacbon: quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp chất kháng sinhchịu ảnh hưởng sâu sắc thông qua các nguồn cacbon khác nhau Tuỳ thuộc vàotừng chủng mà cần chọn nguồn cacbon thích hợp; các loại đường đơn: Glucose,

Manitole, … hay các loại đường kép: Saccarose, Lactose, … cũng có thể là cácloại tinh bột hoặc các chất có thành phần không xác định như rỉ đường, đạimạch, …Đối với xạ khuẩn, nhiều chủng có hoạt tính amylaza cao nên nguồncacbon thích hợp đối với chúng là tinh bột.

- Nguồn nitơ: nguồn và nồng độ nitơ trong môi trường nuôi cấy cũng ảnhhưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh Sự dư thừa các ion amin hoặc các nitơchuyển hóa nhanh khác sẽ ức chế sinh tổng hợp chất kháng sinh nhưErytromoxin, Leucomicin, Novobioxin, … Quá trình sinh tổng hợp chất khángsinh từ xạ khuẩn thường đòi hỏi có cả 2 nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ trong môitrường Nguồn nitơ hữu cơ thích hợp là các hợp chất từ thực vật như: bột đậutương, bột đậu xanh, cao ngô… nguồn nitơ vô cơ là: muối amon hoặc nitrat

1.3 Giới thiệu về Bacillus

Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn Gram dương Thuộc chi

Bacilliaceae Có nội bào tử hình ovan có khuynh hướng phình ra ở một đầu.

Bacillus có hình dạng tế bào hình que (giúp phân biệt với các loài vi

khuẩn sinh nội bào tử khác) sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kị khí

không bắt buộc Tế bào Bacillus có thể đơn hoặc chuỗi, chúng chuyển động bằng tiêm mao Nhờ khả năng sinh bào tử nên các vi khuẩn Bacillus có thể tồn

tại trong thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau và rất phổ biến trong tựnhiên nên có thể phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau như đất, nước, thức ăn,trầm tích biển,… nhưng chủ yếu là phân lập từ đất nơi mà đóng vai trò cực kìquan trọng trong chu trình C, N

Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại sinh

nhờ sử dụng các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acid hữu cơ,…Một vài loài có thể lên men cacbohydrat tạo thành glycerol và butanediol, mộtvài loài khác thì cần acid amin, vitamin B1 để sinh trưởng Hầu hết chúng đều làloài ưu nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 300C - 450C, nhưng cũng có nhiềuloài ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 650C

Đa số Bacillus sinh trưởng ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 - 10

như B.alcalophillus, hay có loài phù hợp với pH = 2 - 6 như B.acidocaldrius.

Ngoài khả năng sản sinh enzyme ngoại bào như emylase, protease,cellulase … nó còn có khả năng tiết các chất kháng sinh, do đó chúng được ứngdụng rất nhiều trong công nghiệp, trong bảo vệ môi trường, trong sản xuất chếphẩm sinh học bảo vệ thực vật…

Bacillus thường gặp trong tự nhiên tồn tại nhiều trong đất là Bacillus subtilis.

1.3.1 Vị trí phân loại và sự phân bố của Bacillus subtilis trong tự nhiên

Bacillus subtilis được Ferdinand Cohn- một cộng sự của Robert Koch

mô tả và đặt tên năm 1872 Đó là 1 loại vi khuẩn Gram dương, có khả năng mọcđược khi có sự hiện diện của oxi và có thể tạo thành dạng đặc biệt khi tế bào ở

trạng thái nghỉ được gọi là nội bào tử (endospore) B.subtilis là vi khuẩn đại diện cho loài (genus) Bacillus của họ Bacillaceae (family) Năm 2004, dựa trên phương pháp phân tích 16S rRNA người ta phân chia loài Bacillus thành nhiều

họ và loài vi khuẩn tạo bào tử khác nhau Những thành viên của họ Bacillus

được đề cập ở đây là loại vi khuẩn “ gram dương, kỵ khí hay kỵ khí tùy tiện, tạonội bào tử”

Vi khuẩn Bacillus subtilus phân bố hầu hết ở trong tự nhiên Phần lớn

chúng cư trú trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 – 100 triệu

CFU/g Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc thì Bacillus subtilus rất hiếm.

Nước và bùn cửa sông cũng như ở biển cũng có mặt bào tử và tế bào Bacillus

subtilus (Vũ Thị Thứ, 1996).

1.3.2 Đặc điểm hình thái

Bacillus subtilus là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, là vi khuẩn Gram dương,

kích thước 0,5 - 0,8 μm – 0,3μm, khuẩn ty không có vách ngănm × 1,5 - 3μm – 0,3μm, khuẩn ty không có vách ngănm, đứng đơn lẽ hoặc thành chuỗi ngắn Vikhuẩn có khả năng di động, có 8 – 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tếbào vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước từ 0,8 – 1,8μm – 0,3μm, khuẩn ty không có vách ngănm Bào tử phát triểnbằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, không kháng acid, có khả năng chịunhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ (Tô Minh Châu, 2000)

1.3.3 Đặc điểm nuôi cấy

- Điều kiện phát triển: Hiếu khí, nhiệt độ tối ưu là 37°C

- Nhu cầu Oxi: Bacillus subtilus là vi khuẩn hiếu khi nhưng lại có khả

năng phát triển yếu trong môi trường thiếu oxi

- Độ pH: Bacillus subtilus thích hợp nhất với pH = 7,0 – 7,4.

- Môi trường nuôi cấy: Bacillus subtilus có thể sinh trưởng và phát triển

được trên nhiều môi trường khác nhau như môi trường TSA, môi trường gelatin,môi trường PDA, môi trường TSB,…

+ Môi trường thạch đĩa TSA: Khuẩn lạc có dạng hình tròn, rìa răng cưakhông đều, có tâm sẩm màu, phát triển chậm, màu vàng xám, đường kính 3 -5mm Sau 1- 4 ngày bề mặt nhăn nheo màu hơi sẩm

+ Môi trường thạch nghiêng TSA: Dễ mọc, tạo thành màu xám, rìa gợnsóng

+ Môi trường canh TSB: Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường,

tạo màng nhăn, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tan đều khi lắc lên

Dinh dưỡng cần các nguyên tố C, H, O, N và các nguyên tố khác

1.3.4 Bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis

Bào tử là một hình thức tiềm sinh của vi khuẩn, nó giúp cho vi khuẩnvượt qua những điều kiện bất lợi như: môi trường nghèo dinh dưỡng, nhiệt độ,

pH không thích hợp, môi trường tích luỹ nhiều sản phẩm trao đổi chất bất lợi….Mỗi vi khuẩn chỉ tạo được một bào tử Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽnảy mầm để trở về dạng tế bào sinh dưỡng

* Quá trình hình thành bào tử gồm các bước:

1.3.6 Tính chất đối kháng của Bacillus subtilis với một số vi sinh vật gây bệnh

Do Bacillus subtilis là vi khuẩn bắt buộc đường ruột nên ngoài khả

năng chịu đựng được acid dạ dày, các chất dịch tiêu hoá trong đường ruột.Chúng còn có khả năng đấu tranh lại với các vi sinh vật gây bệnh ở đường ruột.Với các vi sinh vật gây bệnh, khi môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện

của Bacillus subtilis với một số lượng lớn sẽ gây ra sự cạnh tranh dinh dưỡng,

cạnh trạnh không gian sống giữa vi khuẩn và nấm Do vi khuẩn phát triển nhanhhơn (trong 24h) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi trường,đồng thời tạo ra kháng sinh subtilin nên sự sinh trưởng của nấm bị ức chế

Các chuyên gia tại Đại Học Havard, Mỹ cho biết: khi chất dinh dưỡng bắtđầu cạn kiệt, các vi sinh vật đối phó bằng cách chuyển sang tình trạng “ngủ

đông”, hay nghỉ ngơi trong một thời gian dài Bacillus subtilis thực hiện điều đó

bằng cách tạo ra bào tử, có thể duy trì trạng thái sống tiềm tàng trong nhiều năm,thậm chí hàng thế kỉ

Tuy nhiên trong thí nghiệm của mình, nhóm nghiên cứu nhận thấy ở giai

đoạn rất sớm của sự hình thành bào tử, một vài tế bào Bacillus đã tạo ra kháng

sinh để giết chết những tế bào vi khuẩn ở bên cạnh chưa bắt đầu quá trình này.Chất kháng sinh sẽ phá vỡ màng tế bào vi khuẩn bị tấn công, giải phóng chấtdinh dưỡng và được tế bào đang hình thành bào tử tiêu thụ Theo các nhà nghiêncứu trên, quá trình tạo bào tử tiêu tốn một lượng lớn năng lượng, phải mất vàigiờ và khi đã bắt đầu thì không thể đảo ngược Do đó, vi khuẩn sẽ cố gắng tránhthời điểm đó càng lâu càng tốt Đặc biệt, khi dinh dưỡng trong môi trường đãcạn kiệt, vi khuẩn sẽ tiêu diệt những kẻ xung quanh để hút chất dinh dưỡng vàkéo dài thời kì chờ đợi này, cho đến khi phải chuyển sang sống tiềm sinh(Nguyễn Thị Công Dung, 2004)

1.4 Tình hình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật đối kháng trong bảo vệ thực vật ở trong nước và trên thế giới

- Năm 1992, Lê Gia Hy và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu “Tính đốikháng của xạ khuẩn được phân lập từ đất Việt Nam đối với bệnh đạo ôn”, (Tạpchí Công nghệ sinh học, tập 14, số a, tr 11 - 12)

- Năm 2012, Lê Thu Hiền và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu “Nghiên

cứu vi khuẩn, xạ khuẩn đối kháng với nấm Fusarium oxysporum gây bệnh héo

vàng cà chua, dưa chuột”, (Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứnhất năm 2012, tr 1009 -1017)

- Năm 2000, Biền Văn Minh (nay là PGS.TS Biền Văn Minh) đã nghiêncứu khả năng sinh chất kháng sinh của một số chủng xạ khuẩn phân lập từ đấtBình - Trị - Thiên

- Năm 2001, Đỗ Thu Hà đã tiến hành nghiên cứu “Sự phân bố của xạ

khuẩn sinh các chất kháng sinh nhóm Polyen chống nấm trong đất của khu vực

Quảng Nam - Đà Nẵng” (Tạp chí Sinh học, tập 23, số 4, tr 46 - 52)

- Năm 2012, Nguyễn Quang Huy và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu

“Phân lập các chủng Bacillus có hoạt tính tạo màng sinh vật (Biofilm) và tácdụng kháng khuẩn của chúng”, (Tạp chí sinh học, tập 34, số 1, tr.99 - 106)

- Năm 2013, Đỗ Thị Tuyến và cộng sự đã nghiên cứu đề tài “Đặc điểmphân loại chủng xạ khuẩn HT17.8 có khả năng kháng nấm gây bệnh trên chè tạiThái Nguyên”, (Tạp chí Khoa học & Công nghệ, tập 107, số 07, tr.97 - 102)

- Năm 2014, Vũ Thúy Nga đã nghiên cứu “Phân lập, tuyển chọn chủng vi

khuẩn Bacillus đối kháng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh héo rũ trên một số

cây trồng cạn

- Năm 2014, Trần Thị Hồng và cộng sự đã nghiên cứu đề tài “Phân lập visinh vật đối kháng một số nguồn bệnh nấm thực vật và đánh giá hoạt tính của

chúng in vitro và in vivo”, (Tạp chí Khoa học và Công nghệ, tập 52, số 4) Kết

quả nhận được cho thấy có 31 chủng vi khuẩn và 5 chủng xạ khuẩn phân lập đối

kháng nấm F.oxysporum, tất cả 37 chủng vi khuẩn và 2 chủng xạ khuẩn ức chế sinh trưởng của F.sonali, 10 chủng vi khuẩn và 6 chủng xạ khuẩn đối kháng với

Phytophthora sp.

- Năm 2015, Nguyễn Thị Thu Thủy và cộng sự đã nghiên cứu đề tài

“Đánh giá tính đa dạng và hoạt tính sinh học của xạ khuẩn ở rừng ngập mặnXuân Thủy - Nam Định”, (Hội nghị Khoa học toàn quốc về sinh thái và tàinguyên sinh vật lần thứ 6, 2015)

- Năm 2015, Nguyễn Thị Thúy Nga đã thực hiện nghiên cứu “Phân lập,tuyển chọn một số chủng vi khuẩn nội sinh tạo chất kích thích sinh trưởngIndole - 3 - acetic acid (IAA) và đối kháng nấm gây bệnh thối cổ rễ cây thông”,(Tạp chí Khoa học Lâm Nghiệp, tr 3948 - 3959) Kết quả đã xác định được loài

Bacillus subtilis đối kháng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh thối cổ rễ thông.

CHƯƠNG II MỤC TIÊU – NỘI DUNG – ĐỐI TƯỢNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu

- Phân lập được một số chủng nấm gây bệnh thực vật ở miền Bắc

- Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn, vi khuẩn có hoạt tính khángnấm gây bệnh trên cây nông- lâm nghiệp

- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của một sốchủng xạ khuẩn, vi khuẩn Bacillus có hoạt tính chống nấm mạnh, có nhiều triểnvọng ứng dụng

- Tối ưu 1 số điều kiện nuôi cấy xạ khuẩn, vi khuẩn Bacillus cho hoạt tínhđối kháng cao

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập được một số chủng nấm gây bệnh thực vật phổ biến ở miền Bắc

- Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn, vi khuẩn Bacillus có hoạttính kháng nấm gây bệnh

- Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn, vi khuẩn Bacillus đối kháng với một sốchủng nấm gây bệnh thực vật

- Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinhtrưởng của một số chủng vi sinh vật đối kháng đã phân lập được

2.3 Đối tượng nghiên cứu

- Cây đu đủ bị bệnh thối gốc, cây chè bị bệnh phồng lá, cây xoài bị bệnhthán thư, cây ngô bị bệnh thối than và tướp lá, cây ngô bị bệnh phấn đen, cây

cà phê bị bệnh khô cành lá

- Nấm gây hại phân lập được từ các mẫu cây trên được nghi ngờ lànhiễm bệnh

- Các chủng xạ khuẩn, vi khuẩn Bacillus phân lập được từ đất tại núi

Luốt ở trường Đại học Lâm nghiệp cùng với các mẫu đất trồng của cây bịbệnh

2.4 Vật tư và hóa chất sử dụng cho nghiên cứu

Chú ý: Tất cả các dụng cụ thủy tinh dùng để nuôi cấy vi sinh vật đều được

xử lý sạch, bao gói và hấp tiệt trùng ở 121°C trong 21 phút

2.4.2 Hóa chất

- Các loại đường: glucose, saccarose…

- Các loại muối: K2HPO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O, KNO3, NaCl,FeSO4.7H2O…

- Các loại cao: cao thịt, cao nấm men…

- Các loại khác: Thạch agar, khoai tây, tinh bột tan, casein, pepton,…

2.4.3 Môi trường nghiên cứu

Môi trường phân lập và giữ giống nấm

* Môi trường CZ (Czapek - Dox - Agar) (g/l)

Môi trường phân lập, giữ giống và nghiên cứu xạ khuẩn

* Môi trường Gause 1 (g/l)

- Tinh bột tan - 20g - FeSO4 - 0.01g

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Phương pháp phân lập nấm gây bệnh từ các mẫu bệnh

Chọn các mẫu lấy nấm bệnh có triệu chứng điển hình Rửa mẫu bệnhsạch đất cát dưới vòi nước, cắt chọn mảnh mô bệnh thích hợp Khử trùng bề mặtcác mảnh mô trên bằng cồn (etanol 70%) trong vòng 3 phút Rửa lại bằng nướccất vô trùng, thấm khô mảnh mô bằng giấy thấm vô trùng Dùng dao mổ vôtrùng cắt các mảnh mô trên thành các mảnh nhỏ 1 - 3mm (chứa cả phần mô bệnh

và mô khỏe) Dùng panh vô trùng đặt các mảnh mô nhỏ trên vào môi trườngCzapek trên đĩa petri Ghi chú cẩn thận bằng bút viết kính: ngày, cây, bệnh… Đểđĩa môi trường đã đặt mẫu trong tủ ấm 300C Theo dõi sự phát triển của sợi nấmmọc ra từ mô bệnh Khi nấm đã phát triển từ mô bệnh ra môi trường, lấy phầnđỉnh sợi nấm chuyển sang môi trường PDA Thu nhận giống thuần khiết trongống thạch nghiêng và bảo quản trong tủ lạnh ở 40C Dùng nấm bệnh đã phân lập

và thuần khiết làm VSVKĐ xạ khuẩn

2.5.2 Phương pháp phân lập xạ khuẩn

2.5.2.1 Phương pháp lấy mẫu đất

Dùng dao lấy khoảng 10 - 15 g đất ở bề mặt từ 5 - 10 cm ở các vị trí khácnhau (4 - 5 vị trí) Trộn đều các mẫu đất và đựng vào túi nilông đã khử trùng(ghi rõ loại đất, ngày và nơi lấy mẫu…) Đất lấy về được phân lập ngay hoặc cóthể bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 40C trong thời gian 24 giờ

2.5.2.2 Phương pháp phân lập