vaccine thực phẩm (edible vaccine)

Các loại vaccine tiêm hiện nay có giá thành rất cao và người tiêm yêu cầu phải có kỹ năng, hơn nữa việc dùng lại kim tiêm ở một số nơi khó khăn có thể lây truyền virut như viêm gan B, C,

LỜI MỞ ĐẦU 2

PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

PHẦN 2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34

PHẦN 3 KẾT LUẬN 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

6 PHAN KIM NGỌC VÀ PHẠM VĂN PHÚC (2007),CNSH TRÊN NGƯỜI VÀ ĐỘNG VẬT, NXB GIÁO DỤC, TR 643 40

12 YASMIN THANAVALA VÀ CS (2005), “IMMUNOGENICITY IN HUMANS OF AN EDIBLE VACCINE FOR HEPATITIS B”, PNAS VOL 102 _ NO 9, P3378-3382 40

Lời mở đầu

Vaccine thực phẩm (edible vaccine) là một trong những sản phẩm công nghệ sinh học hiện đại, chỉ mới xuất hiện cách đây khoảng 2 thập kỷ trở lại, là sự kết hợp giữa sinh học phân tử, nuôi cấy mô và miễn dịch học

Các loại vaccine tiêm hiện nay có giá thành rất cao và người tiêm yêu cầu phải có

kỹ năng, hơn nữa việc dùng lại kim tiêm ở một số nơi khó khăn có thể lây truyền virut như viêm gan B, C, HIV…Vaccine tiêm cũng yêu cầu bảo quản lạnh, đặc biệt có nhiều nơi vùng sâu, vùng xa mạng điện lưới chưa đến thì vaccine cũng không đến được

Cho đến thời gian gần đây người ta vẫn sử dụng vaccine sống nhược độc làm kháng nguyên kích thích tạo kháng thể cần thiết trong cơ thể người và vật nuôi Vaccine kiểu này có một số hạn chế như: có khả năng quay trở lại dạng độc hoặc hoạt lực của nó giảm khá nhanh trong cơ thể người và vật nuôi Hiện nay, nhờ công nghệ DNA tái tổ hợp người ta đã sản xuất được protein vỏ của một số loại virus như virus bệnh lỡ mồm long

móng, bệnh dại và viêm gan B Tuy nhiên, vaccine được sản xuất theo các phương pháp trên có giá thành cao, điều kiện bảo quản và vận chuyển nghiêm ngặt, cần có kỹ thuật viên để tiến hành tiêm chủng [3].

Vaccine thực phẩm là một mô hình lý tưởng vì nó giúp khắc phục được các khó khăn nói trên của vaccine được sản xuất theo phương pháp truyền thống hoặc vaccine DNA tái tổ hợp Nguyên lý cơ bản của quá trình này là chuyển một loại gen đặc biệt vào tế bào thực vật Loại gen này hoạt động trong cơ thể thực vật, sẽ biến thành nơi sinh ra protein kháng nguyên Khi những kháng nguyên này đi vào cơ thể người thông qua ăn uống (dưới dạng tươi sống không nấu chín, nếu không sẽ làm mất hoạt tính kháng nguyên), hệ thống miễn dịch của người sẽ tự động sinh ra kháng thể để chống lại kháng nguyên Như vậy là đã thay việc tiêm chủng vaccine bằng việc ăn những hoa quả hoặc rau xanh có kháng nguyên [3]

Ở nước ta Vaccin thực phẩm có lẻ là một cụm từ khá mới mẻ nhưng đối với các nước phát triển trên thế giới thì nó không có gì xa lạ lắm, bởi từ những năm đầu thập niên

90 người ta đã tạo thành công những “cây Vaccine ăn” đầu tiên, từ đó bùng lên một chiến dịch nghiên cứu vaccine ăn được trong thực vật của giới khoa học khắp nơi trên thế giới,

và đã thu được những thành công đáng kể:

- Sản xuất vaccine chống bệnh infectious bursan desease virus (IBDV) ở gà trong

cỏ rabidopsis chuyển gen

- Chuyển gen orf2 của virus gây bệnh viêm gan E vào cây cà chua, và cây Pichia pastoris

- Sản xuất vaccine viêm gan B trong cây chuối chuyển gen, cây Physalis ixocarpa, đậu lupin vàng, rau diếp và cà chua

- Chuyển gen LTB của E coli (B subunit of E coli heat-labile enterotoxin) gây bệnh đường ruột vào khoai tây

- Chuyển gen CTB (cholera toxin B subunit) gây bệnh tả của vi khuẩn Vibrio

đang phát triển và những nước nghèo, nơi mà vấn đề miễn dịch thường là mối quan tâm lớn.

Xuất phát từ những lý do trên nên tôi chọn đề tài :” Vaccine thực phẩm”

PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Định nghĩa Vaccine thực phẩm

Vaccine thực phẩm: Là loại vaccine thế hệ mới được tạo ra bằng cách chuyển một gen kháng nguyên vào thực vật Gen này khi hoạt động trong cơ thể thực vật sẽ sinh ra protein kháng nguyên tương ứng Khi những kháng nguyên này đi vào cơ thể người thông qua ăn uống (dưới dạng tươi sống), hệ thống miễn dịch của người sẽ tự động sinh ra kháng thể để chống lại kháng nguyên đó Như vậy là đã thay việc tiêm chủng vaccine bằng việc

ăn những hoa quả hoặc rau xanh có kháng nguyên [3]

Theo Mason và cộng sự định nghĩa: Vaccine thực phẩm là vaccine thoả mãn: Tế bào thực vật có khả năng tổng hợp chính xác và tích luỹ protein gây miễn dịch; việc ăn thực vậtchuyển gen biểu hiện kháng nguyên vaccine có thể kích thích đáp ứng miễn dịch

hiện độc tố của Bacillus thuringiensis (Bt) để tạo ra tính kháng đối với các côn

trùng nhóm nhai- nghiền (chewing insects) và giống cây trồng chống chịu chất diệt cỏ

Y học cũng là mảnh đất màu mỡ cho dòng các sản phẩm biến đổi di truyền trên cả

3 đối tượng vi sinh vật, thực vật và động vật Phổ biến hiện nay là các dược liệu tự nhiên được sản xuất nhờ các tế bào thực vật

Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất hóa học dùng làm dược liệu rất có giá trị Những sản phẩm này, được biết như là các chất trao đổi thứ cấp (secondary metabolites), thường được sản xuất với một lượng rất nhỏ (dạng vết) trong thực vật và không có chức năng trao đổi chất rõ ràng Chúng dường như là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường chung quanh, là sự thích nghi với stress của môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật Để sản xuất các sản phẩm thứ cấp từ thực vật, các mô thực vật ngoại sinh từ cây hoàn chỉnh được nuôi cấy dịch huyền phù (suspension culture) trong điều kiện vô trùng (Hình 1.1) Cơ sở của kỹ thuật nuôi cấy

mô thực vật dựa trên tính toàn thể hóa sinh (biochemical totipotency) duy nhất của tế bào thực vật Nhiều sản phẩm trao đổi chất có thể được sản xuất từ nuôi cấy dịch huyền phù

có chất lượng cao hơn trong cây hoàn chỉnh [3]

Dòng sản phẩm y dược biến đổi di

truyền được quan tâm nữa là vaccine thực

phẩm

Trong kỹ thuật này, người ta sản xuất

vaccine bằng cách chuyển các gen sản xuất

protein kháng nguyên của tác nhân gây bệnh

vào cơ thể thực vật Sản phẩm thu được là lá,

củ, hay quả của cây chuyển gen chính là sản

phẩm vaccine cần thiết, khi ăn các bộ phận

này của cây sẽ kích thích cơ thể đáp ứng miễn Hình 1.1 Nuôi cấy tế bào dịch huyền

Với sự tiến bộ của công nghệ sinh học hiện đại, đặc biệt là các kỹ thuật di truyền phân tử cho phép chúng ta tạo ra và sản xuất lượng lớn bất kỳ protein nào được thấy trên

bề mặt của tác nhân gây bệnh, những protein nói trên có thể được sử dụng như là vaccine tiểu phần(subunit vaccine) hay làm kháng nguyên đưa vào cơ thể cần kích thích miễn dịch tạo ra kháng thể chống lại tác nhân gây bệnh đó Điều này không những hạ giá thành sản phẩm vaccine mà còn loại bỏ được nguy cơ lây lan các bệnh có thể gây truyền nhiễm qua đường tiêm hay qua huyết thanh

Trước kia các nhà khoa học thường sản xuất các loại protein tiểu phần này nhờ các

“nhà máy vi sinh vật”, vi sinh vật được lựa chọn phù hợp sẽ được chuyển gen sản xuất ra protein kháng nguyên của tác nhân gây bệnh với hiệu suất cao nhất nhờ 1 vector được thiết kế đặc biệt, vi sinh vật được biến đổi gen này sẽ được nhân lên với số lượng lớn để thu được sản phẩm cần thiết qua nhiều bước tinh chế, tinh sạch trung gian Đối với vaccine thực phẩm cũng với cơ sở lý thuyết tương tự nhưng người ta sử dụng đối tượng chuyển gen là thực vật

Muốn đưa một gen vào tế bào thực vật trước tiên nó phải được gắn vào 1 vector đây là nhân tố giúp mang gen, nhân bản và đôi khi biểu hiện một trình tự DNA trong tế bào đích

− Chứa ít nhất 1 vị trí nhận biết của enzyme giới hạn để sử dụng làm vị trí ghép DNA trong tạo thể tái tổ hợp

Vi khuẩn và một số vi sinh vật khác có chứa các phân từ DNA dạng vòng, tương đối nhỏ, tách biệt với nhiễm sắc thể vi khuẩn và sao chép độc lập Những phân tử này được gọi là Plasmid và nói chung không thiết yếu đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật, chúng thường cung cấp lợi thế chọn lọc đối với sinh vật chủ như tính kháng kháng sinh

Vì những đặc tính này các Plasmid được sử dụng rộng rãi làm vector đặc bịêt trong xây dựng các phân tử tái tổ hợp phức tạp

Ngoài các vi khuẩn các vi rút cũng được sử dụng làm vector và chúng có thể hoạt động như những phân tử vận chuyển đối với các đoạn DNA tương đối lớn [7]

1.2.2.2 Kháng nguyên

Định nghĩa: Những chất khi vào cơ thể sẽ kích thích cơ thể để gây ra hiện tượng miễn dịch được gọi là kháng nguyên

Điều kiện để 1 chất được xác định là kháng nguyên:

 Tính lạ: Cơ thể sẽ không bao giờ đáp ứng bảo vệ đối với những chất có sẵn hoặc những chất giống như các chất có sẵn trong cơ thể Cơ thể chỉ đáp ứng bảo vệ khi chất đưa vào phải khác hoàn toàn với các chất có sẵn trong cơ thể, những chất khi vào cơ thể có bản chất càng khác với cơ thể bao nhiêu thì càng tăng nhanh và tăng mạnh khả năng miễn dịch của cơ thể bấy nhiêu

 Trọng lượng phân tử lớn: Kháng nguyên phải có trọng lượng phân tử lớn hơn 10.000 dalton (đơn vị đo trọng lượng, tương đương trọng lượng nguyên tử hiđrô)

Có kháng nguyên đồng loại (alloantigen hay isoantigen) và kháng nguyên đa loài Kháng nguyên ta quan tâm là kháng nguyên đa loài: tồn tại trên bề mặt tế bào mô động vật, vi sinh vật (virut và vi khuẩn)

Người ta chia kháng nguyên vi sinh vật ra các loại sau:

-Kháng nguyên vi khuẩn gồm:

Kháng nguyên vi khuẩn hoà tan là các enzyme ngoại bào

Kháng nguyên vi khuẩn không hoà tan là thành phần tế bào chủ yếu nằm trên bề mặt tế bào, 2 loại được quan tâm nhất là kháng nguyên lông (ký hiệu H), và kháng nguyên thân (ký hiệu O)

Các chất độc (toxin) khi bị mất độc tính trở thành giải độc tố (toxoid) có tính kháng nguyên nhưng không gây độc cũng là một kháng nguyên cần quan tâm

-Kháng nguyên virut gồm:

Kháng nguyên V: bao gồm 1 phần của virut hoặc cả virut

Kháng nguyên S: là kháng nguyên hoà tan có thể là vỏ glycoprotein hay nucleic acid của virut [5]

1.2.2.2 Kháng thể (antibody)

Kháng thể là các globulin có trong huyết thanh của động vật được tạo ra do quá trình kích thích của kháng nguyên và có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng nguyên Kháng thể được tạo ra theo cơ chế này được gọi là kháng thể đặc hiệu hay kháng thể miễn dịch, được ký hiệu là Ig Người ta thường tìm thấy kháng thể này trong huyết thanh của động vật nên huyết thanh chứa kháng thể được gọi là kháng huyết thanh Có 4 loại kháng thể: IgG, IgM, IgD, IgA Lá lách là cơ quan chính tạo ra kháng thể [5]

1.3 Phương Pháp chuyển gen

Chuyển gen hay biến nạp thông tin di truyền là kỹ thuật sử dụng DNA tinh khiết

để đưa vào cơ thể hay tế bào khác và theo dõi biểu hiện của thông tin di truyền mới này

Để biến nạp hiệu quả nguyên liệu di truyền vào tế bào vật chủ, các cấu trúc di truyền cần được thiết kế thích hợp cho sự hợp nhất và biểu hiện của các gen ngoại lai Cấu trúc di truyền phải mang 1 gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker gen: gen mã

hoá 1 protein khử độc của hoá chất bổ sung trong môi trường nuôi cấy, cho phép sinh trưởng ưu tiên của các tế bào có DNA được hợp nhất) hoặc sàng lọc (screenable marker gen: gen mã hoá 1 protein cho kết quả trong sản phẩm sống sót nhờ đó có thể xác định tế bào biến nạp thể hiện gen) để nhận biết hiệu quả biến nạp gen Một cấu trúc di truyền đặc trưng bao gồm: gen khởi đầu (promoter), gen mã hoá (coding gen),

và gen kết thúc (terminator) [2]

Các phương pháp chuyển gen có thể bị hoặc không bị giới hạn bởi các genotype khác nhau của thực vật Tuỳ thuộc vào mục đích ứng dụng, đối tượng, có thể thiết kế một phương thức biến nạp thích hợp cho từng genotype khác nhau Trong các nghiên cứu cơ bản, người ta thường tập trung nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của các gen biến nạp, khảo sát các promoter và các cơ chế phân tử ở thực vật để có thể chuyển gen thành công vào các loài khác nhau [2]

Các cây chuyển gen đang được thương mại hóa hiện nay là thế hệ đầu tiên của các cây trồng chuyển gen, và ba thế hệ cây trồng chuyển gen có thể được dự đoán trước là [3]

- Thế hệ thứ nhất Các tính trạng sản xuất (ví dụ chống chịu chất diệt cỏ, kháng bệnh/côn trùng)

- Thế hệ thứ hai Các gen xếp thành chồng cho nhiều tính trạng (ví dụ tổ hợp của các gen kháng bệnh cộng với các tính trạng chất lượng)

- Thế hệ thứ ba Các tính trạng khác nhau được đáp ứng cho việc sử dụng đặc biệt cuối cùng (ví dụ thực phẩm, sợi, nhiên liệu, dầu nhờn, nhựa, dược phẩm và các nguyên liệu thô cho các quá trình công nghiệp)

Công nghệ chuyển gen (biến nạp gen) thực hiện việc chuyển các gen ngoại lai vào

tế bào và mô thực vật có thể dùng các phương pháp sau

1.3.1 Chuyển gen gián tiếp bằng vi khuẩn Agrobacterium

Agrobacterium tumefaciens và Agrobacterium rhizogenes là hai loài vi khuẩn gây

A tumefaciens có chứa một plasmid lớn kích thước khoảng 200 kb gọi là

Ti-plasmid (tumor inducing Ti-plasmid) chính là tác nhân gây bệnh cho cây Khi cây bị nhiễm

A.tumefaciens qua các vết thương, biểu hiện bệnh rõ nhất là các khối u được hình thành ở

ngay chỗ lây nhiễm, sự hình thành khối u sau đó có thể tiếp tục mà không cần thiết phải

có sự hiện diện của vi khuẩn Khả năng này có được do A tumefacien đã chuyển 1 đoạn

DNA của Ti-plasmid (T-DNA) xâm nhập vào hệ gen của cây bị bệnh [2]

Cơ chế lây nhiễm của Agrobacterium rhizogenes đối với cây 2 lá mầm cũng tương

tự, nhưng trong vùng T-DNA của A.rhizogenes chỉ có gen sản sinh ra auxin, vì thế sự

thay đổi hình thái chính của thực vật là tạo ra nhiều rễ tơ (hairy roots) khi bị nhiễm bệnh [2]

T-DNA là đoạn DNA có kích thước 25 Kb trong đó có chứa gen mã hoá cho sinh tổng hợp auxin, xytokinin, opin và các gen gây khối u Trong Ti- plasmid, vị trí của T-DNA được giới hạn bởi RB và LB Ngoài T-DNA, trên Ti- plasmid còn có các vùng DNA mã hoá cho việc tái sinh plasmid, cho khả năng lây nhiễm và tiếp hợp (vùng vir), cho việc tiêu hoá opine [2]

Vùng vir phụ trách khả năng lây nhiễm, sản phẩm của gen nằm trong vùng vir dưới tác động của các hợp chất phenol tiết ra từ vết thương là một loạt các protein đặc hiệu như virE2, virB, virD, các protein này nhận biết các vết thương ở các cây chủ thích hợp, kích thích sản sinh ra các đoạn T-DNA, bao bọc che chở các đoạn DNA này và giúp chúng tiếp cận với hệ gen của cây chủ một cách an toàn [2]

9

Hình 1.3 Ti- plasmid

1.3.2 Chuyển gen trực tiếp

Trong phương pháp chuyển gen trực tiếp thành tế bào cellulose khá vững chắc là rào cản ngăn chặn sự hấp thụ DNA vào tế bào thực vật, vì vậy tất cả các phương pháp chuyển gen trực tiếp đều phải giải quyyết vấn đề này đầu tiên Thông thường người ta có thể dùng phương pháp enzyme(xử lý mô thực vật bằng enzyme peclinase và cellulose, dưới tác dụng của 2 enzyme này thành tế bào thực vật bị phân huỷ tạo ra protoplast (tế bào trần), tế bào trần có thể hấp thụ DNA trực tiếp, sau đó sẽ tạo điều kiện để tế bào tổng hợp thành tế bào rồi tiến hành tái sinh cây hoàn chỉnh [2]

1.3.2.1 Chuyển gen bằng súng bắn gen

Súng bắn gen (Gene gun) là một thiết bị sử dụng để đưa thông tin di truyền vào tế bào, được thiết kế đầu tiên cho biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào thực vật và được phát triển vào đầu thập niên 1980 do các nhà thực vật học ở Ðại học Corrnell cùng với các nhà nghiên cứu ở Corrnell Nanofabrication Facility, Newyork, USA

Hình 1.4 Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium

Hình 1.6 Sơ đồ nguyên

lý hoạt động

Súng bắn gen được bán trên thị trường vào năm 1990 Ðạn sử dụng cho loại súng này là các hạt kim loại nặng cơ bản được bao bọc DNA Tên chính xác và đầy đủ của

súng bắn gen là hệ thống phân phối hạt biolistics (biolistic particle delivery system) và kỹ thuật này thường được gọi một cách đơn giản là biolistics (sự kết hợp giữa hai thuật ngữ biology (sinh học) và ballistics (sự bắn tung)) Mặc dù có nhiều thiết kế kỹ thuật khác

nhau nhưng nguyên lý chung của phương pháp này là sử dụng áp lực xung của khí helium

để gia tốc các hạt

Hình 1.5 Sơ đồ hoạt động của súng bắn gen

Súng bắn gen bao gồm hai buồng bằng thép không gỉ, kích thước 6x7x10 nối với hai bơm chân không DNA ngoại lai được gắn vào các hạt tungsten có đường kính rất nhỏ, khoảng 1μm (các kim loại nặng khác như vàng và bạc cũng được sử dụng nhưng không thường xuyên do giá cả đắt) Các hạt này được đặt trên một cái đĩa ở mặt bên trong của súng Sự bùng nổ khí helium ở 1000psi làm cho cái đĩa bắn về phía trước với tốc độ

1300 food/s, tương đương với tốc độ khi một viên đạn rời khỏi nòng súng Một tấm chắn

làm dừng đĩa lại và các hạt vàng hay tungsten được phóng

về phía các tế bào đích Chúng xuyên qua vách tế bào và phóng thích các phân tử DNA (Hình 1.6) Súng bắn gen sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp để hợp nhất sự biểu hiện các gen đã phân phối Các tế bào biến đổi di truyền có thể được sử dụng để tạo thực vật bao gồm cả sự sửa đổi di truyền mong muốn ở trong

tất cả các tế bào của chúng (Voiland, 1999)

Mục tiêu của súng bắn gen thường là callus của các

tế bào thực vật giống nhau sinh trưởng trong môi trường gel trên đĩa petri Sau khi các

hạt tungsten đã va chạm vào đĩa, gel và callus bị phá vỡ

nhiều Tuy nhiên một số tế bào không bị phá vỡ khi va

chạm mạnh và đã tiếp nhận các hạt tungsten được bao bọc

DNA và cuối cùng các phân tử DNA ngoại lai đã xâm

nhập và hợp nhất vào nhiễm sắc thể thực vật Các tế bào từ đĩa petri được tập hợp lại và chọn lọc các tế bào đã hợp nhất thành công và biểu hiện DNA ngoại lai bằng các kỹ thuật hóa sinh hiện đại như sử dụng gen chọn lọc nối tiếp và Northern blots

Hình 1.7 Súng bắn gen có

buồng chân không

Hình 1.8 Súng bắn gen cầm

tay

Các tế bào đơn đã chọn lọc từ callus có thể được xử lý với một số hormone thực vật như auxin, gibberelin và mỗi một tế bào có thể phân chia, biệt hóa thành các tế bào

mô, cơ quan, tế bào chuyên hóa của toàn bộ cây Cây mới có nguồn gốc từ một tế bào nảy mầm thành công có thể mang các đặc tính di truyền mới

Chuyển gen bằng phương thức dội bom cũng là một kỹ thuật phát triển từ súng bắn gen chỉ khác về thiết bị còn nguyên lý thì vẫn tương tự như mô tả trên

Phương pháp này có ưu điểm là thao tác dễ dàng, có thể chuyển gen vào nhiều loại

tế bào và mô, các tế bào được biến nạp có tỉ lệ sống sót cao, cho phép đưa các gen vào tế bào ở vị trí mong muốn Do vậy nó được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực [1]

1.3.2.2 Dùng hoá chất- Hấp thụ DNA trực tiếp vào tế bào trần

Ở phương pháp này, thành tế bào được loại bỏ bằng phương pháp enzyme, tạo ra protoplast (tế bào trần) Tế bào trần có thể hấp thụ DNA, tổng hợp thành tế bào sau đó tái sinh cây hoàn chỉnh

 Kỹ thuật calcium phosphate

Hình 1.9 Thao tác chuyển gen bằng phương thức dội bom

Kỹ thuật calcium phosphate (calcium phosphate technique) đã được phát triển đầu tiên là để xác định sự lây nhiễm của DNA virus (Graham,1973) và hiện nay được sử dụng rông rãi để thử nghiệm hoạt động biến nạp của

DNA virus cũng như DNA tách chiết từ các tế

bào eukaryote (Wigler, 1978; Graham, 1979;

Pellicer, 1980)

Kỹ thuật này yêu cầu ủ các tế bào nhận

với các chất đồng kết tủa DNA và calcium

phosphat (Hình 1.10) Kết tủa này bám vào tế

bào và sau đó sẽ hấp thụ vào tế bào qua quá

trình ẩm bào (Loyter, 1982) Trong tế bào, các

phân tử DNA ngoại lai nằm trong không bào được tạo thành do ẩm bào và lysosome thứ hai nhưng rất ít DNA đi đến nhân và hợp nhất vào genome chủ

Cho đến nay, đây là kỹ thuật vô cùng có giá trị đối với các nghiên cứu chuyển gen vào các tế bào soma nuôi cấy và đang được sử dụng nhiều để chuyển các dòng genome vào tế bào đích Tỉ lệ các tế bào được biến nạp ổn định của kỹ thuật này là tương đương với phương pháp vi tiêm nhưng khác với vi tiêm là nhiều tế bào được biến nạp cùng một lần Phương pháp này được sử dụng phổ biến bởi vì đơn giản protocol dễ thực hiện, ít tốn kém, số tế bào chết sau biến nạp không đáng kể, sự biểu hiện gen có thể là nhất thời hoặc

ổn định và quan trọng trong việc thiết kế vector virus tái tổ hợp Tuy nhiên hiệu quả biến nạp và mức độ biểu hiện của gen chuyển thấp [3]

 Chuyển gen qua liposome

Hình 1.10 Phức hợp DNA-calcium

phosphat

Vào thập niên 1980, liposome nhân tạo đã được sử dụng để đưa DNA vào tế bào Lipid với toàn bộ lưới tích điện

dương ở pH sinh lý là thành phần

lipid tổng hợp phổ biến nhất của

liposome được phát triển cho chuyển

gen Thường thì lipid cation được

trộn với một lipid trung tính như

L-dioleoyl phosphatidy l-ethanolamine

(DOPE) Phần cation của phân tử

lipid kết hợp với DNA tích điện âm và kết quả là chứa đầy DNA trong phức hợp liposome-DNA (Hình 1.11) Ðối với các tế bào nuôi cấy, toàn bộ lưới tích điện dương của phức hợp liposome-DNA nói chung là gây ra hiệu quả chuyển gen cao hơn bởi vì nó cho phép phức hợp này kết hợp với màng tế bào tích điện âm bền hơn Nhờ cơ chế nhập bào, các phức hợp xuất hiện trong endosome và sau đó đi vào nhân Chưa rõ DNA được phóng thích từ endosome và đi qua màng nhân như thế nào DOPE được xem là một lipid kích thích sự dung hợp và vai trò của nó là phóng thích các phức hợp này từ endosome cũng như làm cho sự dung hợp của màng tế bào phía ngoài với phức hợp liposome-DNA xảy ra

dễ dàng Trong phương pháp này, các đại phân tử trước hết được đưa vào trong các túi phospholipid Các loại túi khác nhau đã được mô tả, nhưng túi một lớp mỏng là thích hợp nhất cho chuyển gen vì chúng có tỉ lệ khoảng trống chứa nước ở bên trong tương đối cao đối với mỗi đơn vị lipid và bởi vì chúng có tỉ lệ phân phối cao hơn Sự dung hợp của liposome với màng plasma là một sự kiện hiếm Hiệu quả biến nạp của phương pháp này thấp hơn so với phương pháp vi tiêm vào tiền nhân Các nổ lực nghiên cứu đang được tiến hành để tìm ra các điều kiện thí nghiệm mà có thể làm tăng sự phóng thích các phân tử đã kết nang từ con đường ẩm bào

Liposome đã được sử dụng để đưa protein, lipid và các phân tử nhỏ vào nhiều loại

tế bào nuôi cấy, tuy nhiên hiệu quả thấp hơn vi tiêm đối với RNA hoặc protein Cũng như thế, chuyển gen qua liposome và sự biểu hiện của gen chuyển là không vượt qua được các phương pháp chuyển gen thông thường (như hệ thống virus), sự biểu hiện gen chuyển

Hình 1.11 Phức hợp liposome-DNA

thường nhất thời, sự ức chế bởi các thành phần của huyết thanh có thể xảy ra Bên cạnh

đó, kỹ thuật này có nhiều ưu điểm là gen chuyển sẽ không hợp nhất vào genome chủ, có

hiệu quả tốt đối với cả tế bào in vitro và in vivo, có thể mang được các DNA có kích

thước rất lớn, độ tinh khiết cao, không gây miễn dịch, có thể sử dụng với các tế bào mà biến nạp bằng kỹ thuật calcium phosphat không có hiệu quả [3]

1.3.2.3 Chuyển DNA trực tiếp bằng xung điện

Kỹ thuật xung điện (electroporation) là một phương pháp cơ học được sử dụng để đưa các phân tử phân cực vào trong tế bào chủ qua màng tế bào Trong phương pháp này, một xung điện cao thế trong khoảnh khắc (vài phần nghìn giây) có khả năng làm rối loạn cấu trúc màng kép phospholipid (hình 1.12), tạo ra các lỗ thủng tạm thời cho phép các phân tử DNA ngoại lai từ môi trường xâm nhập vào bên trong tế bào

Nhiều kỹ thuật nghiên cứu trong sinh học phân tử yêu cầu đưa gen hoặc protein ngoại lai vào trong tế bào chủ Vì lớp

phospholipid kép của màng sinh chất có

một đầu ưa nước phía ngoài và một đầu ưa

nước phía trong , nên bất kỳ phân tử phân

cực nào, bao gồm cả DNA và protein, đều

không có khả năng đi qua màng một cách

tự do

Sơ đồ bên cho thấy các thành phần

hóa học của màng sinh chất Các đầu ưa nước phân cực hướng về phía ngoài trong khi các đuôi kỵ nước hướng về phía trong và tương tác với đuôi kỵ nước khác để cùng bám giữ màng Các phân tử phân cực không thể đi qua màng này nếu như không có sự hỗ trợ bên ngoài

Hình 1.12 Sơ đồ màng phospholipid kép

Kỹ thuật xung điện dựa trên trạng thái tương đối yếu của các tương tác kỵ nước của phospholipid kép và khả năng tập hợp lại một cách tự động của nó sau khi bị rối loạn (Purves, 2001) Vì vậy, một xung điện chớp nhoáng có thể gây ra rối loạn ở các vị trí của màng một cách nhất thời, làm cho các phân tử

phân cực có thể đi qua, nhưng sau đó màng có thế

đóng kín lại nhanh chóng và tế bào không bị ảnh

hưởng gì cả

Các tế bào chủ và DNA ngoại lai được tạo thành

dịch huyền phù và cho vào trong một cuvette

nhựa có điện cực (hình 1.15)

Ðể tạo ra xung điện cao thế trong một thời gian ngắn người ta sử dụng một thiết bị gọi là máy xung gen (gene pulser) (hình 1.14)

Quá trình cơ bản diễn ra bên trong máy

này có thể được trình bày bằng sơ đồ (hình

1.13)

Sơ đồ này cho thấy mạch điện cơ bản

cung cấp điện cho kỹ thuật xung điện Khi

công tắc thứ nhất đóng, tụ điện nạp điện vào

19

Hình 1.15 Cuvette nhựa có điện cực

Hình 1.16 Sơ đồ plasmid chứa DNA ngoại lai đi

qua các lỗ tạm thời

Hình 1.14 :Máy xung gen (Gene pulser)

(Hãng Biorad) Hình 1.13 Sơ đồ bố trí mạch cơ bản của máy

xung điện

và tích một điện áp cao Khi công tắc thứ hai đóng, điện áp này phóng qua dịch huyền phù tế bào Một xung điện cần thiết cho kỹ thuật này thường là khoảng 10.000-100.000 v/cm (thay đổi tùy theo kích thước của tế bào) trong vài phần triệu giây đến một phần ngàn giây Xung điện này làm rối loạn phospholipid kép của màng tế bào và tạo ra các

lỗ tạm thời Khả năng điện qua màng tế bào cùng lúc tăng lên 0,5-1,0 v vì vậy các phân

tử đã được nạp điện này đi qua màng tế bào thông qua các lỗ bằng cách thức tương tự như điện di (Hình 1.16)

Lối DNA đi vào tế bào không thể quan sát thấy dưới kính hiển vi, nhưng hình vẽ này cho thấy khái niệm cơ bản của sự tạo thành các lỗ trên màng mà DNA có thể đi qua.Khi các ion đã nạp điện và các phân tử đi qua các lỗ, màng tế bào phóng điện và các lỗ này đóng lại một cách nhanh chóng và phospolipid kép phục hồi lại cấu trúc cũ (Weaver, 1995) Lúc này các phân tử mong muốn đã ở trong tế bào và chúng được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo

Phương pháp này có thể sử dụng đối với gần như tất cả các loại tế bào của các loài Lúc đầu phương pháp này được sử dụng để chuyển gen vào các tế bào động vật có vú,

về sau cho cả tế bào thực vật ở dạng protoplast Với một số cây một lá mầm quan trọng (loài lúa phụ Japonica, ngô, lúa mì) mà không thể thực hiện được bằng phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium thì người ta đã thành công với phương pháp này Hiệu quả biến nạp cao Trong một nghiên cứu ở E.coli, 80% số tế bào nhận được DNA ngoại lai (Miller và Nickoloff, 1995) Lượng DNA ngoại lai cần thiết là ít hơn so với các phương pháp khác (Withers, 1995) Phương pháp này có thể thực hiện với các

mô in vivo còn nguyên vẹn (Weaver, 1995) Ðoạn DNA ngoại lai được biến nạp có kích thước lớn Tuy nhiên nếu các xung điện có cường độ và chiều dài không đúng thì một số

lỗ của tế bào sẽ trở nên quá lớn hoặc bị hỏng không thể đóng lại sau khi tế bào phóng điện, làm cho tế bào bị tổn thương hoặc bị thủng (Weaver, 1995) Một hạn chế nữa là sự vận chuyển DNA ngoại lai vào và ra khỏi tế bào trong suốt thời gian điện biến nạp là

Hình 1.16 Sơ đồ plasmid chứa DNA ngoại lai đi

qua các lỗ tạm thời

trên màng bào chất