Vaccine thực phẩm

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn LỜI MỞ ĐẦU PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35 PHẦN KẾT LUẬN 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO .41 PHAN KIM NGỌC VÀ PHẠM VĂN PHÚC (2007),CNSH TRÊN NGƯỜI VÀ ĐỘNG VẬT, NXB GIÁO DỤC, TR 643 .41 12 YASMIN THANAVALA VÀ CS (2005), “IMMUNOGENICITY IN HUMANS OF AN EDIBLE VACCINE FOR HEPATITIS B”, PNAS VOL 102 _ NO 9, P3378-3382 .42 Lời mở đầu Vaccine thực phẩm (edible vaccine) sản phẩm công nghệ sinh học đại, xuất cách khoảng thập kỷ trở lại, kết hợp sinh học phân tử, nuôi cấy mô miễn dịch học Các loại vaccine tiêm có giá thành cao người tiêm yêu cầu phải có kỹ năng, việc dùng lại kim tiêm số nơi khó khăn lây truyền virut viêm gan B, C, HIV…Vaccine tiêm yêu cầu bảo quản lạnh, đặc biệt có nhiều nơi vùng sâu, vùng xa mạng điện lưới chưa đến vaccine không đến Cho đến thời gian gần người ta sử dụng vaccine sống nhược độc làm kháng nguyên kích thích tạo kháng thể cần thiết thể người vật nuôi Vaccine kiểu có số hạn chế như: có khả quay trở lại dạng độc hoạt lực giảm nhanh thể người vật nuôi Hiện nay, nhờ công nghệ DNA tái tổ hợp Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn người ta sản xuất protein vỏ số loại virus virus bệnh lỡ mồm long móng, bệnh dại viêm gan B Tuy nhiên, vaccine sản xuất theo phương pháp có giá thành cao, điều kiện bảo quản vận chuyển nghiêm ngặt, cần có kỹ thuật viên để tiến hành tiêm chủng [3] Vaccine thực phẩm mô hình lý tưởng giúp khắc phục khó khăn nói vaccine sản xuất theo phương pháp truyền thống vaccine DNA tái tổ hợp Nguyên lý trình chuyển loại gen đặc biệt vào tế bào thực vật Loại gen hoạt động thể thực vật, biến thành nơi sinh protein kháng nguyên Khi kháng nguyên vào thể người thông qua ăn uống (dưới dạng tươi sống không nấu chín, không làm hoạt tính kháng nguyên), hệ thống miễn dịch người tự động sinh kháng thể để chống lại kháng nguyên Như thay việc tiêm chủng vaccine việc ăn hoa rau xanh có kháng nguyên [3] Ở nước ta Vaccin thực phẩm có lẻ cụm từ mẻ nước phát triển giới xa lạ lắm, từ năm đầu thập niên 90 người ta tạo thành công “cây Vaccine ăn” đầu tiên, từ bùng lên chiến dịch nghiên cứu vaccine ăn thực vật giới khoa học khắp nơi giới, thu thành công đáng kể: - Sản xuất vaccine chống bệnh infectious bursan desease virus (IBDV) gà cỏ rabidopsis chuyển gen - Chuyển gen orf2 virus gây bệnh viêm gan E vào cà chua, Pichia pastoris - Sản xuất vaccine viêm gan B chuối chuyển gen, Physalis ixocarpa, đậu lupin vàng, rau diếp cà chua - Chuyển gen LTB E coli (B subunit of E coli heat-labile enterotoxin) gây bệnh đường ruột vào khoai tây - Chuyển gen CTB (cholera toxin B subunit) gây bệnh tả vi khuẩn Vibrio cholerae gen LTB vào thuốc lá… Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Tuy nhiên việc nghiên cứu phát triển vaccine ăn phương hướng nghiên cứu công nghệ sinh học, đặc biệt nước phát triển nước nghèo, nơi mà vấn đề miễn dịch thường mối quan tâm lớn Xuất phát từ lý nên chọn đề tài :” Vaccine thực phẩm” PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Định nghĩa Vaccine thực phẩm Vaccine thực phẩm: Là loại vaccine hệ tạo cách chuyển gen kháng nguyên vào thực vật Gen hoạt động thể thực vật sinh protein kháng nguyên tương ứng Khi kháng nguyên vào thể người thông qua ăn uống (dưới dạng tươi sống), hệ thống miễn dịch người tự động sinh kháng thể để chống lại kháng nguyên Như thay việc tiêm chủng vaccine việc ăn hoa rau xanh có kháng nguyên [3] Theo Mason cộng định nghĩa: Vaccine thực phẩm vaccine thoả mãn: Tế bào thực vật có khả tổng hợp xác tích luỹ protein gây miễn dịch; việc ăn thực vậtchuyển gen biểu kháng nguyên vaccine kích thích đáp ứng miễn dịch thể [10] 1.2 Cơ sở khoa học vaccine thực phẩm 1.2.1 Về sinh học phân tử Chuyển gen kỹ thuật sử dụng DNA tinh khiết để đưa vào thể hay tế bào khác nhằm tạo tính trạng di truyền DNA biểu đối tượng đích Từ đời đến nay, kỹ thuật chuyển gen mang lại cho nhân loại thành to lớn nhiều lĩnh vực, đặc biệt nông nghiệp y học Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Người ta thống kê 2/3 diện tích nông nghiệp giới sử dụng trồng chuyển gen với mục đích khác tăng suất, cải thiện giống, thu sản phẩm trội hay đặc tính chống chịu điều kiện đó, số tiêu biểu giống Bt biểu độc tố Bacillus thuringiensis (Bt) để tạo tính kháng côn trùng nhóm nhai- nghiền (chewing insects) giống trồng chống chịu chất diệt cỏ Y học mảnh đất màu mỡ cho dòng sản phẩm biến đổi di truyền đối tượng vi sinh vật, thực vật động vật Phổ biến dược liệu tự nhiên sản xuất nhờ tế bào thực vật Thực vật nguồn cung cấp hợp chất hóa học dùng làm dược liệu có giá trị Những sản phẩm này, biết chất trao đổi thứ cấp (secondary metabolites), thường sản xuất với lượng nhỏ (dạng vết) thực vật chức trao đổi chất rõ ràng Chúng dường sản phẩm phản ứng hóa học thực vật với môi trường chung quanh, thích nghi với stress môi trường bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật động vật Để sản xuất sản phẩm thứ cấp từ thực vật, mô thực vật ngoại sinh từ hoàn chỉnh nuôi cấy dịch huyền phù (suspension culture) điều kiện vô trùng (Hình 1.1) Cơ sở kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật dựa tính toàn thể hóa sinh (biochemical totipotency) tế bào thực vật Nhiều sản phẩm trao đổi chất sản xuất từ nuôi cấy dịch huyền phù có chất lượng cao hoàn chỉnh [3] Dòng sản phẩm y dược biến đổi di truyền quan tâm vaccine thực phẩm Trong kỹ thuật này, người ta sản xuất vaccine cách chuyển gen sản xuất protein kháng nguyên tác nhân gây bệnh vào thể thực vật Sản phẩm thu lá, củ, hay chuyển gen sản phẩm vaccine cần thiết, ăn phận Hình 1.1 Nuôi cấy tế bào dịch huyền phù thực vật hệ lên men 100 L Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn kích thích thể đáp ứng miễn dịch với tác nhân gây bệnh chúng xâm nhập thể Với tiến công nghệ sinh học đại, đặc biệt kỹ thuật di truyền phân tử cho phép tạo sản xuất lượng lớn protein thấy bề mặt tác nhân gây bệnh, protein nói sử dụng vaccine tiểu phần(subunit vaccine) hay làm kháng nguyên đưa vào thể cần kích thích miễn dịch tạo kháng thể chống lại tác nhân gây bệnh Điều hạ giá thành sản phẩm vaccine mà loại bỏ nguy lây lan bệnh gây truyền nhiễm qua đường tiêm hay qua huyết Trước nhà khoa học thường sản xuất loại protein tiểu phần nhờ “nhà máy vi sinh vật”, vi sinh vật lựa chọn phù hợp chuyển gen sản xuất protein kháng nguyên tác nhân gây bệnh với hiệu suất cao nhờ vector thiết kế đặc biệt, vi sinh vật biến đổi gen nhân lên với số lượng lớn để thu sản phẩm cần thiết qua nhiều bước tinh chế, tinh trung gian Đối với vaccine thực phẩm với sở lý thuyết tương tự người ta sử dụng đối tượng chuyển gen thực vật Muốn đưa gen vào tế bào thực vật trước tiên phải gắn vào vector nhân tố giúp mang gen, nhân biểu trình tự DNA tế bào đích  Một số đặc tính mà vector cần có − Kích thước vector nhỏ tốt, dễ xâm nhập vào tế bào, đồng thời thuận lợi trình chép − Vector phải có khả tái bản, nhờ DNA vector chép trì quần thể tế bào − Mang đặc tính cho phép phát dễ dàng, mã hoá gen thị chọn lọc, chứa gen thị để thao tác E.coli gen thị khác để tiến hành Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn chọn lọc thực vật Thông thường gen kháng với kháng sinh, nhờ lựa chọn tế bào mang gen chuyển (vector) từ quần thể lớn tế bào − Chứa vị trí nhận biết enzyme giới hạn để sử dụng làm vị trí ghép DNA tạo thể tái tổ hợp Vi khuẩn số vi sinh vật khác có chứa phân từ DNA dạng vòng, tương đối nhỏ, tách biệt với nhiễm sắc thể vi khuẩn chép độc lập Những phân tử gọi Plasmid nói chung không thiết yếu sinh trưởng vi sinh vật, chúng thường cung cấp lợi chọn lọc sinh vật chủ tính kháng kháng sinh Vì đặc tính Plasmid sử dụng rộng rãi làm vector đặc bịêt xây dựng phân tử tái tổ hợp phức tạp Ngoài vi khuẩn vi rút sử dụng làm vector chúng hoạt động phân tử vận chuyển đoạn DNA tương đối lớn [7] 1.2.2 Về miễn dịch học Hầu hết vi sinh vật gây bệnh xâm nhập vào thể qua bề mặt nhầy đường tiêu hoá, hô hấp đường tiết niệu Khi vaccine ăn vào thể theo đường miệng cảm ứng hệ thống miển dịch thể dịch sản xuất kháng thể chống lại vi sinh vật gây bệnh, tiếp hệ thống thể dịch lại tác động vào hệ thống miển dịch tế bào, tạo globulin miển dịch tăng cường khả bảo vệ sớm hiệu cho thể Khi tiêu hoá vaccine ăn được, kháng nguyên giải phong ruột non [5] 1.2.2.2 Kháng nguyên Định nghĩa: Những chất vào thể kích thích thể để gây tượng miễn dịch gọi kháng nguyên Điều kiện để chất xác định kháng nguyên:  Tính lạ: Cơ thể không đáp ứng bảo vệ chất có sẵn chất giống chất có sẵn thể Cơ thể đáp ứng bảo vệ chất đưa vào phải khác hoàn toàn với chất có sẵn thể, chất vào Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn thể có chất khác với thể tăng nhanh tăng mạnh khả miễn dịch thể nhiêu  Trọng lượng phân tử lớn: Kháng nguyên phải có trọng lượng phân tử lớn 10.000 dalton (đơn vị đo trọng lượng, tương đương trọng lượng nguyên tử hiđrô)  Cấu trúc phân tử phức tạp: Cấu trúc phân tử phức tạp khả gây miễn dịch cao Có kháng nguyên đồng loại (alloantigen hay isoantigen) kháng nguyên đa loài Kháng nguyên ta quan tâm kháng nguyên đa loài: tồn bề mặt tế bào mô động vật, vi sinh vật (virut vi khuẩn) Người ta chia kháng nguyên vi sinh vật loại sau: -Kháng nguyên vi khuẩn gồm: Kháng nguyên vi khuẩn hoà tan enzyme ngoại bào Kháng nguyên vi khuẩn không hoà tan thành phần tế bào chủ yếu nằm bề mặt tế bào, loại quan tâm kháng nguyên lông (ký hiệu H), kháng nguyên thân (ký hiệu O) Các chất độc (toxin) bị độc tính trở thành giải độc tố (toxoid) có tính kháng nguyên không gây độc kháng nguyên cần quan tâm -Kháng nguyên virut gồm: Kháng nguyên V: bao gồm phần virut virut Kháng nguyên S: kháng nguyên hoà tan vỏ glycoprotein hay nucleic acid virut [5] 1.2.2.2 Kháng thể (antibody) Kháng thể globulin có huyết động vật tạo trình kích thích kháng nguyên có khả liên kết đặc hiệu với kháng nguyên Kháng thể tạo theo chế gọi kháng thể đặc hiệu hay kháng thể miễn dịch, ký hiệu Ig Người ta thường tìm thấy kháng thể huyết động vật nên huyết chứa kháng thể gọi kháng huyết Có loại kháng thể: IgG, IgM, IgD, IgA Lá lách quan tạo kháng thể [5] Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 1.3 Phương Pháp chuyển gen Chuyển gen hay biến nạp thông tin di truyền kỹ thuật sử dụng DNA tinh khiết để đưa vào thể hay tế bào khác theo dõi biểu thông tin di truyền Để biến nạp hiệu nguyên liệu di truyền vào tế bào vật chủ, cấu trúc di truyền cần thiết kế thích hợp cho hợp biểu gen ngoại lai Cấu trúc di truyền phải mang gen thị chọn lọc (selectable marker gen: gen mã hoá protein khử độc hoá chất bổ sung môi trường nuôi cấy, cho phép sinh trưởng ưu tiên tế bào có DNA hợp nhất) sàng lọc (screenable marker gen: gen mã hoá protein cho kết sản phẩm sống sót nhờ xác định tế bào biến nạp thể gen) để nhận biết hiệu biến nạp gen Một cấu trúc di truyền đặc trưng bao gồm: gen khởi đầu (promoter), gen mã hoá (coding gen), gen kết thúc (terminator) [2] Các phương pháp chuyển gen bị không bị giới hạn genotype khác thực vật Tuỳ thuộc vào mục đích ứng dụng, đối tượng, thiết kế phương thức biến nạp thích hợp cho genotype khác Trong nghiên cứu bản, người ta thường tập trung nghiên cứu cấu trúc chức gen biến nạp, khảo sát promoter chế phân tử thực vật để chuyển gen thành công vào loài khác [2] Các chuyển gen thương mại hóa hệ trồng chuyển gen, ba hệ trồng chuyển gen dự đoán trước [3] - Thế hệ thứ Các tính trạng sản xuất (ví dụ chống chịu chất diệt cỏ, kháng bệnh/côn trùng) - Thế hệ thứ hai Các gen xếp thành chồng cho nhiều tính trạng (ví dụ tổ hợp gen kháng bệnh cộng với tính trạng chất lượng) - Thế hệ thứ ba Các tính trạng khác đáp ứng cho việc sử dụng đặc biệt cuối (ví dụ thực phẩm, sợi, nhiên liệu, dầu nhờn, nhựa, dược phẩm nguyên Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn liệu thô cho trình công nghiệp) Công nghệ chuyển gen (biến nạp gen) thực việc chuyển gen ngoại lai vào tế bào mô thực vật dùng phương pháp sau 1.3.1 Chuyển gen gián tiếp vi khuẩn Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium rhizogenes hai loài vi khuẩn gây bệnh cho thực vật, sử dụng vector tự nhiên để mang gen ngoại lai vào mô tế bào thực vật A tumefaciens có chứa plasmid lớn kích thước khoảng 200 kb gọi Tiplasmid (tumor inducing plasmid) tác nhân gây bệnh cho Khi bị nhiễm A.tumefaciens qua vết thương, biểu bệnh rõ khối u hình thành chỗ lây nhiễm, hình thành khối u sau tiếp tục mà không cần thiết phải có diện vi khuẩn Khả có A tumefacien chuyển đoạn DNA Ti-plasmid (T-DNA) xâm nhập vào hệ gen bị bệnh [2] Cơ chế lây nhiễm Agrobacterium rhizogenes mầm tương tự, vùng T-DNA A.rhizogenes có gen sản sinh auxin, thay đổi hình thái thực vật tạo nhiều rễ tơ (hairy roots) bị nhiễm bệnh [2] T-DNA đoạn DNA có kích thước 25 Kb có chứa gen mã hoá cho sinh tổng hợp auxin, xytokinin, opin gen gây khối u Trong Ti- plasmid, vị trí TDNA giới hạn RB LB Ngoài T-DNA, Ti- plasmid có vùng DNA mã hoá cho việc tái sinh plasmid, cho khả lây nhiễm tiếp hợp (vùng vir), cho việc tiêu hoá opine [2] Vùng vir phụ trách khả lây nhiễm, sản phẩm gen nằm vùng vir tác động hợp chất phenol tiết từ vết thương loạt protein đặc hiệu virE2, virB, virD, protein nhận biết vết thương chủ thích hợp, kích thích sản sinh đoạn T-DNA, bao bọc che chở đoạn DNA giúp chúng tiếp cận với hệ gen chủ cách an toàn [2] Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Hình 1.2 Cơ chế cảm ứng tổn thương rễ Agrobacterium Hình 1.3 Ti- plasmid 1.3.2 Chuyển gen trực tiếp Trong phương pháp chuyển gen trực tiếp thành tế bào cellulose vững rào cản ngăn chặn hấp thụ DNA vào tế bào thực vật, tất phương pháp 10 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Hình 1.21 Chọn giống lúa Kitaake và Hosetsu để biểu hiện gene CTB Chuyển gen Gen CTB chèn vào vector pGPTV-35S-HPT, sử dụng promoter biểu gen tối ưu nội nhũ glutelin GluB-1 (hình 1.22) Vector chuyển vào lúa nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Hình 1.22 Gene CTB được biến đổi cho phù hợp chèn vào binary vector (pGPTV-35S-HPT) Phân tích kết chuyển gen Dùng kỹ thuật PCR chứng minh gen CTB chuyển thành công vào hai loại lúa Kitaake và Hosetsu (hình 1.23 ) - WT: Wild-type lúa không chuyển gene - Tg: lúa chuyển gene CTB Hình 1.23 Dùng kĩ thuật PCR để xác nhận sự sát nhập gene CTB vào DNA 28 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Dùng phương pháp Northern blot để xác nhận sự biểu hiện của mRNA đoạn mã CTB loại lúa chuyển gen (tg) so sánh với loại lúa không chuyển gen( wt) (hình 1.24) Dùng phương pháp Western blot với gel Hình 1.24 Dùng phương pháp Northern blot để xác nhận sự biểu hiện của mRNA đoạn mã CTB SDS/PAGE cho thấy nồng độ cao protein CTB được biểu hiện (12 – 15 kDa) (hình 1.25) ( Hình đầu mũi tên đỏ) Hình 1.25 Dùng phương pháp Western blot với gel SDS/PAGE cho thấy nồng độ cao protein CTB được biểu hiện (12 – 15 kDa) 29 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Kiểm tra bền vững kháng nguyên hạt lúa Nội hạt lúa chứa loại protein đặc trưng PB-I PB-II Phân tích kính hiển vi điện tử cho thấy CTB kết hợp với hai loại protein (hình 1.26) Hình 1.26 CTB được lưu trữ bề mặt PB-I (đầu mũi tên) PB-II (mũi tên) *Xử lý với pepsin: Hạt gạo dược mang xử lýa với pepsin, Dùng kỹ thuật Western blot cho thấy 90% glutelins (1 loại protein khác thành phần chủ yếu gạo) bị tiêu hoá bởi pepsin 75% CTB gạo không bị ảnh hưởng bởi pepsin Điều chúng tỏ CTB biểu hạt gạo bền vững với điều kiện môi trường dày- ruột 1.5 Thành tựu giới nước 1.5.1 Thế giới 1.5.1 Cây lúa biến đổi gen tạo vaccine chống lại giun sán Các nhà khoa học thuộc ĐH Tokyo, ĐH Gifu NIAS (Japanese National Institute of Agrobiological Sciences) phát triển thành công giống lúa biến đổi gen tích tụ vaccine chống lại giun sán mức độ có ý nghĩa Cây lúa chuyển gen biểu As16 –một antigen bảo vệ chống lại ký sinh giun Ascaris suum- phối hợp với độc tố dịch tả thuộc “toxin B subunit” (CTB) Con giun Ascaris tuyến trùng ký sinh ruột, dày người động vật, bệnh ký sinh lan rộng toàn giới Độc tố dịch tả sử dụng chất phụ trợ có tính nhớt để kích hoạt phản ứng miễn dịch xảy 30 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Các nhà khoa học ghi nhận mức độ thể protein dung hợp dạng khảm nội nhũ hạt thóc, với giá trị trung bình 50 μg/g hạt Cây lúa GM thử chuột với trứng tuyến trùng; chuột ăn thóc GM có trứng tuyến trùng xuất phổi thấp chuột đối chứng Họ ghi nhận nghiên cứu chứng minh vaccine ăn thể lúa giúp loài người chống lại dạng ký sinh loài động vật dùng làm mô hình chuột [15] 1.5.1.2 Sản xuất kháng nguyên HIV từ chuyển gen Việc phát triển sản xuất loại vắc xin phù hợp mục tiêu hướng tới việc ngăn chặn lây lan bệnh AIDS Mặc dù có 20 năm nghiên cứu người ta chưa phát vắc xin có hiệu việc chống lại bệnh Các nhà khoa học cho vắc xin lý tưởng chống lại virut gây triệu chứng suy giảm miễn dịch người (HIV) có hiệu việc ngăn chặn việc lan truyền vi rút với việc chi phí sản xuất rẻ phép sử dụng rộng rãi nước phát triển Các nhà nghiên cứu từ Viện Max Planck sinh học phân tử thực vật Đức Đại học Cambridge Anh quốc đã khai thác khả “transplastomic” để sản xuất kháng nguyên HIV hợp phần AIDS vaccine Họ cho thể thành công HIV antigens p24, mục tiêu T-cellphản ứng miễn dịch với cá thể dương tính HIV, Nef plastids thuốc khoai tây Gene cassettes dung hợp cách tối hảo p24-Nef kích hoạt tích tụ protein kháng nguyên khoảng 40% protein Đó kết gấp 100 lần cao kết trước sản xuất p24 chuyển nạp gen vào nhân truyền thống chứng minh tiềm to lớn chuyển gen vào plastid để sản xuất protein làm dược phẩm thực vật Các nhà khoa học giả định kiểu hình chuyển nạp gen thể chloroplast nhờ tận dụng thể ribô để sản xuất protein tái tổ hợp [17] 31 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 1.5.1.3 Chuyển gien sản xuất vắc xin chống bệnh đậu mùa Một nhóm nhà khoa học thuộc Các phòng thí nghiệm CNSH, Đại học Thomas jefferson, Philadelphia, Mỹ, sản xuất thành công loại vắc xin chống bệnh đậu mùa từ thuốc chuyển gien, vắc xin chứng minh chuột lợn Bệnh đậu mùa virut Variola gây ra, bệnh dễ lây nhiễm mà gây tử vong cho người Những kết cho thấy tính khả thi việc sản xuất văcxin siêu phân tử an toàn tiết kiệm nhờ sử dụng hệ thống sản xuất thực vật Lợi sản xuất vắc xin từ thực vật bao gồm chi phí sản xuất giảm; quy mô sản xuất lớn; sản phẩm an toàn; khả quản lý qua đường miệng [16] 1.5.1.4 Thuốc chuyển gen có chứa vắc-xin chống dịch hạch Nguyên nhân gây bệnh dịch hạch loại vi khuẩn có tên Yersinia pestis, bệnh dịch có nguy xảy số vùng châu Phi, châu Á, châu Mỹ Liên Xô cũ, đặc biệt nơi người sống gần với loài gặm nhấm Y pestis nguy hiểm bị hít vào phổi, phá hủy phổi người bệnh, dẫn đế n chết Kháng sinh sử dụng để chữa bệnh dịch hạch, biện pháp chữa trị có hiệu bệnh phát sớm Một vài chủng Y pestis kháng thuốc kháng sinh, nên nhà khoa học phải tìm kiếm biện pháp sản xuất hàng loạt loại vắc-xin Luca Santi Hugh S Mason khám phá loại vắc-xin phòng bệnh dịch hạch thuốc Trong nghiên cứu gần đây, nhà khoa học phân tích biểu thị prôtêin Y.pestis trồng: kháng nguyên F1, tạo thành phần vỏ bao tế bào Y.pestis, kháng nguyên V, có tham gia vào trình gây bệnh, hỗn hợp F1 V Các gen kháng nguyên đưa vào tế bào thuốc khuẩn Agrobacterium tumefaciens Sau prôtêin tạo thành phân tích tính kháng nguyên thử nghiệm chuột bạch Các nhà nghiên cứu thấy rằng: 1) loại kháng nguyên biểu lộ mức độ cao thuốc lá; 2) loại prôtêin tạo phản ứng miễn dịch chuột thí nghiệm; 3) sau xịt liều Y pestsis có chứa 100% độc tố vào chuột, chuột 32 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn sử dụng vắc-xin có tỉ lệ sống cao sau 21 ngày, chuột giả miễn dịch (sham-immunized) chết sau ngày [18] 1.5.1.5 Vacxin giúp ngăn ngừa ung thư Các nhà khoa học phát triển loại chuối khoai tây chứa văcxin chống virut papilloma (HPV) gây bệnh lây nhiễm qua tình dục đồng thời nguyên nhân chủ yếu ca ung thư cổ tử cung phụ nữ Các nhà nghiên cứu Đại học Rochester tiến hành thử nghiệm giống có chứa văcxin giai đoạn thử nghiệm lâm sàng Bệnh HPV nguyên nhân phổ biến gây ung thư phụ nữ nước phát triển, chiếm tới 80% Phát triển loại văcxin để phòng ngừa bệnh có giá trị to lớn Các nhà khoa học tiến hành cho chuột ăn khoai tây từ công nghệ sinh học hy vọng chúng có phản ứng miễn dịch tự bảo vệ 1.5.2 Tình hình nước Hiện nay, Việt Nam sản xuất 9/10 vaccine phục vụ chương trình tiêm chủng mở rộng UNICEF công nhận quốc gia thứ hai toán xong bệnh bại liệt Nhưng nước ta, vaccine ăn vấn đề mẻ chưa có tài liệu đề cập sâu loại vaccine Các nghiên cứu vaccine thực phẩm nước ta chử yếu viện CNSH thực hiện, dần có kết khả thi Viện công nghệ sinh học chủ trì thực đề tài trọng điểm chương trình nghiên cứu khoa học với nội dung chuyển gen gây bệnh virus dại vào đối tượng lạc Viện Di Truyền Nông Nghiệp đề xuất triển khai thực đề tài sản xuất vaccine ăn có nguồn gốc thực vật Wolffia (bèo tấm) thông qua Agrobacterium Nhiều nghiên cứu đặc tính sinh học bèo cho thấy thực vật có tốc độ sinh trưởng nhanh theo kiểu nảy chồi, đặc biệt có hàm lượng dinh dưỡng cao, loại thức ăn tốt cho gia súc làm thức ăn tươi cho người số nước giới bèo mang đầy đủ đặc điểm cần thiết hệ thống sản xuất protein hiệu cao đối tượng lí tưởng cho nghiên cứu vaccine ăn 33 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn  Tạo vaccine viêm gan B ‘ăn được’ từ trái cà chua Các nhà khoa học thuộc Phòng Công nghệ Gen - Viện Sinh học Nhiệt đới TP.HCM tiến hành nghiên cứu vaccine ngừa viêm gan B ăn từ phận ăn tươi quả, lá, thân, củ Trong có cà chua Nước ta vùng lưu hành cao bệnh viêm gan siêu vi B (HBV) Tỷ lệ người mang mầm bệnh vào khoảng 10 - 15% dân số (trên 10 triệu người) Ngoài giới nhiều công bố khoa học dùng công nghệ chuyển gien mã hóa protein HBsAg vào nhân lục lạp tế bào, vào số trồng, Qua kết trên, nhóm nghiên cứu Phòng Công nghệ Gen - Viện Sinh học Nhiệt đới nhận thấy, protein kháng nguyên HBsAg sử dụng qua đường tiêu hóa có khả tạo miễn dịch tốt Điều mở triển vọng nghiên cứu chuyển nạp gien vào trồng có phận ăn tươi quả, lá, thân, củ Bằng phương pháp chuyển gien vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, kết nghiên cứu Viện Sinh học Nhiệt đới nhận số loại có cà chua mang gien mã hoá kháng nguyên bề (http://sokhoahoccn.angiang.gov.vn/xemnoidung.asp?) 34 mặt virus viêm gan B Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Phần KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 2.1 Ưu điểm Vaccine thực phẩm Vaccine thực phẩm có số ưu điểm sau: giá thành rẻ, ổn định, dễ sản xuất quy mô lớn, dễ quản lý, không cần tinh sạch, bảo quản lâu, dễ vận chuyển…  Cây chuyển gen mang gen sản xuất kháng nguyên giống trồng khác nên dễ dàng tăng qui mô sản xuất dể thu sinh khối, giá thành loại vaccine chắn se thấp hon nhiều lần so với loại vaccine khác  Ổn định, dễ bảo quản sử dụng: Thực vật từ trước đến dùng nhiều y dược, dễ chấp nhận người tiêu dùng Vaccine thực phẩm tạo thể thực phẩm(ngũ cốc) thông thường nên trồng tiêu thụ địa phương mà không cần vận chuyển xa, không cần có thiết bị bảo quản lạnh, không cần kim tiêm… nên dễ sử dụng phân phát Các kháng nguyên biểu thực vật ổn định nhiệt độ phòng chúng sản xuất bao bọc mô thực vật mà cụ thể chúng định vị lưới nội chất, thể Golgi bề mặt tế bào Nhờ tính ổn định mà chúng trở nên dể dàng bảo quản sử dụng (ngay thực vật) mà không cần giữ lạnh vaccine tiêm Trong trình sản xuất vaccine ăn người ta cần vận chuyển sử dụng phận thực vật chứa vaccine chế phẩm thực phẩm chứa vaccine  Được phân phối qua đường miệng (delivered orally) Nhiều nghiên cứu thử nghiệm gần cho thấy vaccine thực vật ăn phát huy tác dụng thể người Do chúng đuợc bọc mô thực vật, có mùi vị tính chất giống hoàn toàn với mô thực vật chứa (ngoại trừ khoai tây biến đổi gen có mùi vị khó chịu ăn sống không gọt vỏ), điều hạn chế phân huỷ dịch tiêu hoá kháng nguyên gặp thụ thể hệ miễn dịch thể nhận diện chúng 35 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn  An toàn: Vì vaccine sản xuất thực vật vaccine đơn vị sử dụng gen mã hoá cho phần protein vỏ virus mà không cần đến virus sống vaccine giảm độc lực hay virus chết vaccine bất hoạt Do vaccine không trở lại thành virus gây bệnh cho người động vật, đồng thời tránh nguy nhiễm mầm bệnh tiềm tàng từ vaccine Do đó, không cần tách chiết tinh kháng nguyên vaccine Vaccine ăn kích thích sản xuất kháng thể hệ thống thể dịch hiệu vaccine tiêm Ta biết hầu hết vi sinh vật gây bệnh xâm nhập vào thể qua bề mặt nhầy đường tiêu hoá, hô hấp đường tiết niệu Khi vaccine ăn vào thể theo đường miệng cảm ứng hệ thống miển dịch thể dịch sản xuất kháng thể chống lại vi sinh vật gây bệnh, tiếp hệ thống thể dịch lại tác động vào hệ thống miển dịch tế bào, tạo globulin miển dịch tăng cường khả bảo vệ sớm hiệu cho thể Khi tiêu hoá vaccine ăn được, kháng nguyên giải phóng ruột non thụ thể miễn dịch niêm mạc ruột nhận chúng kết hợp dễ dàng, triệt để tạo phản ứng miễn dịch Những nghiên cứu bảo vệ kháng nguyên làm vaccine ăn trước tác động dịch tiêu hoá, đặc biệt thể người khẳng định giá trị thực tiễn vaccine ăn sản xuất nhờ thực vật chuyển gen 2.2 Nhược điểm vaccine thực phẩm − Thực vật sinh vật tồn hàng ngàn năm qua nhiều biến đổi chọn lọc tự nhiên, hệ gen hoàn thiện dần sinh vật qua chọn lọc tự nhiên, bị biến đổi gen không chắn điều − Vaccine thực phẩm không khác loại trái thông thường, việc sử dụng liều cho phép sơ suất dễ xảy − Liều dùng vaccine thay đổi Ví dụ, chuối kích cỡ khác chứa lượng vaccine khác 36 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Điều đáng lo ngại trồng chứa vaccine lẩn, nhiễm với thực phẩm,.đó vấn đề quan tâm lớn, phải cẩn thận việc sử dụng thực vật chuyển gen làm vaccine hạn chế ngăn chặn khả lẫn tạp chúng vào vụ mùa thực phẩm bình thường Khi biết lượng vaccine thay đổi thực vật ăn bừa được, hay dùng vaccine khoai tây lượng protein kháng nguyên tích luỹ đó, vấn đề nan giải Tuy nhiên số loại định nhà nghiên cứu nghĩ cách thiết kế chúng thành viên thuốc hay miếng bánh với lượng xác protein kháng nguyên 37 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Phần KẾT LUẬN Việc sản xuất trồng chuyển gen nói chung vaccine thực phẩm nói riêng tiến triển Tuy nhiên, để hướng tới lợi ích tiềm tàng công nghệ sinh học thực vật chuyển gen sản phẩm dược phẩm từ trồng chuyển gen có nhiều nhân tố bổ sung cần xem xét bao gồm: kiểm soát công nghệ sinh học, sở hữu trí tuệ, an toàn thực phẩm, chấp nhận cộng đồng, tính chất gây dị ứng, nhãn hiệu, chọn lựa, môi trường, phân biệt sản phẩm chuyển gen mậu dịch quốc tế Tầm quan trọng việc ứng dụng lợi ích tiềm tàng kỹ thuật chuyển gen Trong kỹ thuật phát triển, mục đích cần đạt tối đa lợi ích giảm thiểu rủi ro Đây phần rào cản mà phần lớn loại vaccine thực phẩm khó để mang sử dụng phổ biến vaccine thực phẩm lựa chọn tối ưu so với loại vaccine cổ điển Một ngày nhắc đến từ tiêm chủng trẻ em không cần phải sợ hãi mũi tiêm vaccine tiêm hay nhăn mặt liều vaccine uống nồng mùi khó chịu nữa, ngược lại hoan hỉ phát cho loại trái ngon lành lại có tác dụng chủng ngừa bệnh truyền nhiễm Viễn cảnh tươi đẹp không xa nghiên cứu vaccine thực phẩm( hay gọi vaccine ăn) ngày nhiều, mang lại thành tựu to lớn Công trình nghiên cứu biểu thành công vaccine thực phẩm (protein bề mặt vi khuẩn Streptococcus thuốc với 0.02 % protein tổng số vào năm 1990 Sau hàng loạt báo cáo kháng nguyên thực vật công bố khẳng định hấp dẫn chủ đề này:(bảng 3.1) Ở Việt Nam cụm từ Vaccine thực phẩm mẻ, chưa kể đến việc ứng dụng cách đại trà thực tiễn, nhiên nước ta nhiều nước nghèo khác lại thị trường tiềm cho dòng sản phẩm Là nước nghèo Việt nam quốc gia phát triển khác, đứng trước dịch bệnh phổ biến, có chương trình tiêm chủng lớn cho trẻ em 38 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn để chống bệnh dịch thông thường, số lượng người chết chưa tiêm chủng ngừa bệnh thông thường không nhỏ, phần dân trí chưa cao, nhiều người chưa hiểu lợi ích việc tiêm chủng nên chủ quan, mặt khác việc bảo quản, vận chuyển loại vaccine thông thường cần điều kiện nghiêm ngặt mà trang thiết bị ta thiếu thốn nên lượng vaccine đến với nơi vùng sâu vùng xa giảm hoạt lực nhiều, chí hư hỏng, tác dụng Do số lượng trẻ em tử vong bệnh dịch thông thường tránh Việt Nam nói riêng giới nói chung lớn Bảng 3.1 : Các kháng nguyên vaccine biểu hệ thống thực vật (tregoining et al., 2004)[5] Dưới số số thống kê đau xót không đáng có: 39 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn  Hàng năm giới có khoảng 10 triệu trẻ em chết dịch bệnh  triệu trẻ em tử vong dịch tả(tiêu chảy) năm( theo tổ chức y tế giới WHO)  200-400 triệu người nhiễm viêm gan B, 1-2 triệu người chết hàng năm HBV  800000 người chết năm bệnh sởi  … Những số tiếp tục tăng việc sử dụng vaccine không cải tiến việc bảo quản phân phối, điều có quan hệ mật thiết với việc chủng ngừa nước phát triển Vấn đề giải dễ dàng với vaccine thực phẩm, vaccine sản xuất tiêu thụ vùng có dịch bệnh Theo Humphreys cs với mẫu ruộng nhỏ trồng ngũ cốc sản xuất 1kg kháng nguyên bảo quản nhiệt độ thường năm Do vậy, Vaccine thực phẩm giải pháp tối ưu, hướng phát triển đầy triển vọng tương lai, mang lại lợi ích thiết thực 40 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Trần Bình, Cao huyền Trang (2005),”Nghiên cứu phát triển vaccine ăn thực vật”, Tạp chí công nghệ sinh học 3(2):133-142 Lê Văn Hoàng, Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thưc vật (2007), NXB Khoa học kỹ thuật Nguyễn Hoàng Lộc(2007), Nhập môn công nghệ sinh học, Đại học Huế, tr 136137 tr 353 Lê Đình Lương, Quyền đình Thi (2003), Kỹ thuật di truyền ứng dụng, NXB ĐHQG Hà Nội Nguyễn Đức Lượng(2006), Sinh học đại cương, tập , NXB ĐHQG Hồ Chí Minh Phan Kim Ngọc Phạm Văn Phúc (2007),CNSH người động vật, NXB Giáo Dục, tr 643 Vũ văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp,(2005), Công nghệ sinh học, tập2, NXB Giáo Dục Tài liệu tiếng Anh Diane E Webster cs (2002), “Appetising solutions: an edible vaccine for measles”, MJA vol 176, p 434-437 KAPUSTA cs (1999), “A plant- derived edible vaccine against hepatitis B virut”, The FASEB Journal, Vol 13 October 1999, p 1796-1799 10 Neeraj Mishra cs (2008), ”Edible vaccines: A new approach to oral immunization”, Indian Journal of Biotechnology, Vol 7, July 2008, pp 283-294 11 Tomonori Nochi cs (2007),” Rice-based mucosal vaccine as a global strategy for cold-chain- and needle-free vaccination”, PNAS vol 104(26), p10986–10991 41 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 12 Yasmin Thanavala cs (2005), “Immunogenicity in humans of an edible vaccine for hepatitis B”, PNAS vol 102 _ no 9, p3378-3382 TÀI LIỆU INTERNET 13 http://dhgpharma.com.vn/dhgpharma/index.php?view=news&ID=306 14 http://elearning.hueuni.edu.vn/file.php/27/downgtcnchuyengen/c2.pdf 15.http://tinkhoahoc.blogspot.com/2008/11/cy-la-bin-i-gen-to-vaccine-chng-li-giun.html 16 http://www.agbiotech.vn/vn/?mnu=preview&key=1554 17 http://www.agbiotech.vn/vn/?mnu=preview&key=2682 18 http://www.isb.vt.edu/news/2006/news06.apr.htm 19 http://www.pasteur-hcm.org.vn/index.jsp 42 [...]... vận chuyển và sử dụng ngay bộ phận thực vật chứa vaccine đó hoặc chế phẩm thực phẩm chứa vaccine đó  Được phân phối qua đường miệng (delivered orally) Nhiều nghiên cứu thử nghiệm gần đây đã cho thấy vaccine trong thực vật có thể ăn được và phát huy tác dụng trong cơ thể người Do chúng đuợc bọc trong mô thực vật, sẽ có mùi vị và tính chất hầu như giống hoàn toàn với mô thực vật chứa nó (ngoại trừ khoai... được 9/10 vaccine phục vụ chương trình tiêm chủng mở rộng và được UNICEF công nhận là quốc gia thứ hai thanh toán xong bệnh bại liệt Nhưng ở nước ta, vaccine ăn được vẫn là vấn đề khá mới mẻ và chưa có tài liệu nào đề cập sâu về loại vaccine này Các nghiên cứu vaccine thực phẩm ở nước ta chử yếu do viện CNSH thực hiện, cũng đang dần có những kết quả khả thi Viện công nghệ sinh học đang chủ trì thực hiện... Nhược điểm của vaccine thực phẩm − Thực vật là sinh vật đã tồn tại hàng ngàn năm qua nhiều biến đổi chọn lọc tự nhiên, hệ gen của cây là sự hoàn thiện dần của sinh vật qua chọn lọc tự nhiên, vậy thì khi bị biến đổi gen sẽ không chắc chắn được điều gì − Vaccine thực phẩm không khác gì những loại trái cây thông thường, vì vậy việc sử dụng quá liều cho phép do sơ suất rất dễ xảy ra − Liều dùng vaccine có... QUẢ NGHIÊN CỨU 2.1 Ưu điểm của Vaccine thực phẩm Vaccine thực phẩm có một số ưu điểm sau: giá thành rẻ, ổn định, dễ sản xuất trên quy mô lớn, dễ quản lý, không cần tinh sạch, bảo quản lâu, dễ vận chuyển…  Cây chuyển gen mang gen sản xuất kháng nguyên cũng giống như những cây trồng khác nên dễ dàng tăng qui mô sản xuất và dể thu sinh khối, do vậy giá thành của loại vaccine này chắc chắn se thấp hon... wWw.SinhHoc.edu.vn  An toàn: Vì vaccine được sản xuất trong thực vật là vaccine dưới đơn vị sử dụng gen mã hoá cho một phần protein vỏ virus mà không cần đến virus sống như vaccine giảm độc lực hay virus chết như vaccine bất hoạt Do đó vaccine này không trở lại thành virus gây bệnh cho người và động vật, đồng thời nó cũng tránh được nguy cơ nhiễm mầm bệnh tiềm tàng từ vaccine Do đó, không cần tách chiết... khối, do vậy giá thành của loại vaccine này chắc chắn se thấp hon rất nhiều lần so với các loại vaccine khác  Ổn định, dễ bảo quản và sử dụng: Thực vật từ trước đến nay đã được dùng nhiều trong y dược, vì vậy nó dễ chấp nhận đối với người tiêu dùng Vaccine thực phẩm được tạo ra trong cơ thể những cây thực phẩm( ngũ cốc) thông thường nên có thể trồng và tiêu thụ tại địa phương mà không cần vận chuyển... dòng [6]  Vaccine viêm gan B trong khoai tây Tháng 7 năm 2005, Yasmin Thanavala và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm vaccine viêm gan B sản xuất trong cây khoai tây biến đổi gen, bà đã khẳng định khả năng miễn dịch của vaccine thực phẩm- vaccine viêm gan B trong khoai tây là có ý nghĩa thực tiễn và có thể bổ sung vào chiến dịch phòng chống viêm gan B toàn cầu Trong nghiên cứu này gen sản xuất kháng nguyên... không may thụ phấn chéo với các cây cối xung quanh, có thể lẩn vào các cây thực phẩm Arntzen nói: Đây là một sách lược mới để sản xuất và phân phối vaccin đến những nơi xa xôi, hẻo lánh [13]  Vacccine viêm gan B ở rau diếp và cây đậu lupin Nghiên cứu của J KAPUSTA và cộng sự thuộc học viện sinh hóa tự nhiên Balan về vaccine thực phẩm trong cây rau diếp và cây đậu lupin đựơc đăng trên tạp chí FASAB vol... phát triển thích hợp nhất, tạo ra sản phẩm năng suất và chất lượng cao nhất Tuy nhiên, để đưa gen mã hoá protein kháng nguyên vào thực vật hiện nay ta thường dùng phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium, và các báo cáo khoa học thành công trong đề tài này hầu hết là sử dụng vi khuẩn Agrobacterium, dưới đây là một số công trình nghiên cứu vaccine thực phẩm của một số nhà khoa học từ các quốc... tiêu hoá vaccine ăn được, kháng nguyên được giải phóng trong ruột non như vậy các thụ thể miễn dịch ở niêm mạc ruột sẽ nhận ra chúng và kết hợp dễ dàng, triệt để nhất và như vậy là đã tạo ra phản ứng miễn dịch Những nghiên cứu bảo vệ kháng nguyên làm vaccine ăn được trước tác động của dịch tiêu hoá, đặc biệt của cơ thể con người khẳng định giá trị thực tiễn của vaccine ăn được sản xuất nhờ thực vật ... An toàn: Vì vaccine sản xuất thực vật vaccine đơn vị sử dụng gen mã hoá cho phần protein vỏ virus mà không cần đến virus sống vaccine giảm độc lực hay virus chết vaccine bất hoạt Do vaccine không... thực vật) mà không cần giữ lạnh vaccine tiêm Trong trình sản xuất vaccine ăn người ta cần vận chuyển sử dụng phận thực vật chứa vaccine chế phẩm thực phẩm chứa vaccine  Được phân phối qua đường...  Vaccine viêm gan B khoai tây Tháng năm 2005, Yasmin Thanavala cộng tiến hành thử nghiệm vaccine viêm gan B sản xuất khoai tây biến đổi gen, bà khẳng định khả miễn dịch vaccine thực phẩm- vaccine