Các phương pháp sắc kí

C C ÁC PH NG PHÁP S C KÍ ƯƠ Ắ ÁC PH NG PHÁP S C KÍ ƯƠ Ắ THU NH N VÀ TINH S CH Ậ Ạ THU NH N VÀ TINH S CH Ậ Ạ PROTEIN PROTEIN L L ê Th H ng Chuyênị ồ ê Th H ng Chuyênị ồ D D ng Minh Th nhươ ạ ng Minh Th nhươ ạ Nguy Nguy n Th Đan Thuỳễ ị n Th Đan Thuỳễ ị Nguy Nguy n Th Thu Trangễ ị n Th Thu Trangễ ị Nh Nh óm thực hiện: óm thực hiện: Khi đã có nguồn cung cấp protein, việc tiếp theo là tinh sạch và xác định tính chất của nó. Quá trình trên được thực hiện theo sơ đồ: Kĩ thuật sắc kí (Chromatography) • Bản chất: tách và thu nhận riêng biệt các phân tử protein có tính hấp phụ khác nhau (trừ phương pháp lọc gel) trên chất mang thích hợp nhồi trong cột sắc kí • Ra đời: Tswett, nhà thực vật học Nga, phân tách các hạt sắc tố (pigments) thực vật với 2 pha lỏng-rắn Chromatography SEC-Size exclusion Chro. (Gel permeation Chro.) (Gel filtration Chro.) • IEC-Ion exchange Chro. • Affinity Chro. – IAC • Hydrophobic Chro. • IE - HPLC • HPAC – HPIAC • RP – HPLC • EBC - Expanded bed Chro. • Membrane Chromatography HP HP Nguy Nguy ên t cắ ên t cắ • Pha Pha động động (Mobile phase) • Pha t Pha t ĩnh ĩnh (Stationary phase) 1. Sắc kí lọc gel (Gel Permeation Chromatography Size Exclusion Chromatography) • Bản chất: Sự tách riêng biệt các phân tử protein dựa trên sự khác biệt về hình dạng và MW, khi hỗn hợp protein di chuyển dọc theo nền chất mang có kích thước lỗ qui định theo cơ chế thẩm thấu.  sự khuyếch tán chọn lọc Column • Φ= 10mm. L= 500-1000mm • Các hạt polymer có kích thước xác định – Dextran: Sephadex G & Sephacryl S (Pharmacia) – Polyacrylamide: Bio-Gel P (Bio-Rad) – Agarose: Sepharose CL & Superose (Pharmacia) hay Biogel A (Bio-Rad). – Polyacrylamide-agarose: Ultrogel AcA (LKB Instruments) – Ethylene glycol-methacrylate: Fractogel HW (Toyo Soda Company-TSK …………… • Dung môi được đưa vào cột với tốc độ 1 ml/phút, áp suất 50 - 200 bar . thuật sắc kí (Chromatography) • Bản chất: tách và thu nhận riêng biệt các phân tử protein có tính hấp phụ khác nhau (trừ phương pháp lọc gel) trên chất mang thích hợp nhồi trong cột sắc kí • Ra. C C ÁC PH NG PHÁP S C KÍ ƯƠ Ắ ÁC PH NG PHÁP S C KÍ ƯƠ Ắ THU NH N VÀ TINH S CH Ậ Ạ THU NH N VÀ TINH S CH Ậ Ạ PROTEIN PROTEIN L L ê. cao hơn nhiều 3. Sắc kí kị nước (Hydrophobic Chromatography) • Bản chất: dựa trên tương tác giữa các nhóm chức có tính kị nước nằm trên bề mặt phân tử protein (thường là các a.a có tính kị