Bài thuyết trình Các phương pháp sắc kí cột ppt

TS: Ngô Đại Nghiệp Lớp: SHO7B1 Nhóm 4 MSSV  Nguyễn Đinh Diễm Thụy 30700514  Huỳnh Thị Lệ Phương 30760857  Nguyễn Anh Tôn 30700536  Trần Quốc Nhẫn 30700342  Đỗ Minh Trí 30760942  Sự tinh sạch của protein rất quan trọng vì từ protein tinh sạch chúng ta có thể xác định được trình tự acid amin, mối liên hệ về tiến hóa giữa các protein trong những cá thể khác nhau và khảo sát các chức năng sinh hóa của các protein đó.  Để tinh sạch protein, người ta thường dựa vào các đặc điểm tương đồng và các tính chất khác nhau vốn có của nó.  Trong một số trường hợp, để dễ dàng hơn cho việc tinh sạch, người ta gắn vào protein một đuôi acid amin (tag) - tạo ra dạng protein dung hợp (fusion protein).  Tủa protein  Thẩm tích  Siêu lọc  Sắc ký (Sắc ký giấy, sắc ký cột, Sắc ký lỏng – khí, Sắc lý ái lực miễn dịch, Sắc ký ái lực, Sắc ký trao đổi ion, Sắc ký cao áp lỏng…)  Điện di protein (điện đi trên gel Agarose, điện di trên gel Polyacrylamide, điện di protein theo điểm đẳng điện… ) Phương pháp tốt nhất để phân đoạn protein là sắc ký cột (column chromatography). Sắc ký (Chromatography) là một phương pháp phân tách quan trọng nhất trong sinh học phân tử vì nó thích hợp với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch có thể được sử dụng ngay cho việc định lượng và định danh. Sắc ký cột là phương pháp mà chất nhồi (là pha tĩnh: hấp phụ, trao đổi ion, phân bố gen) được nhồi vào cột, dùng để phân chia các chất trong hỗn hợp và tinh chế các chất. Thông thường, người ta hoà tan hỗn hợp chất nghiên cứu vào một dung môi (pha động) với lượng vừa đủ, rồi nạp lên cột theo cách phù hợp sao cho chất nghiên cứu lan thành một lớp phẳng lên cột; sau đó, tiến hành sắc ký. Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha động và tĩnh. Có nhiều nguyên nhân đưa đến sự phân bố khác nhau của các chất, nhưng chính sự lặp đi lặp lại hiện tượng hấp phụ - phản hấp phụ của các chất khi dòng pha động chuyển động qua pha tĩnh là nguyên nhân chủ yếu của việc tách sắc ký. K=Cs/Cm=Nồng độ của hợp chất trong pha tĩnh/Nồng độ của hợp chất trong pha động. Dụng cụ:  Cột sắc kí ( giống như cái buret), gồm 1 ống thủy tinh và 1 cái khóa, nhưng không cần vạch chia độ, kích thước lớn hoặc nhỏ tùy yêu cầu sử dụng  Chất nhồi cột (pha tĩnh, stationary phase, thường dùng silicagel,) Chất nhồi cột quyết định quá trình sắc kí.  Dung môi: thông thường chọn dung môi phụ thuộc vào chất nhồi cột. Thực hiện: Bước 1 là nhồi cột: Sau khi đã chọn cột, làm khô và cân silicagel cần dùng, pha dung môi chạy hệ rồi thì hòa tan silicagel vào dung môi đó. Bước 2 nạp mẫu chất vào: Có 2 loại nạp mẫu là nạp mẫu khô và nạp mẫu ướt. Bước 3: sau khi hoàn tất việc nạp mẫu rồi thì lót 1 miếng bông gòn ở bên trên mẫu chất để ổn định hệ rồi tiếp tục châm dung môi vào, từ từ thay đổi độ phân cực của hệ, Bước 4 mở khóa: lúc này cột bắt đầu tách chất, hứng lượng dung môi chảy ra, mỗi lần hứng khoảng 1/5 hũ .Sau đó đem chấm bản các hủ bi, những hủ có vệt tương tự nhau sẽ được gom lại, đó là 1 chất. Tiếp tục như vậy thì cuối cùng ta sẽ tách được các chất mong muốn. [...]...Đây là phương pháp sắc ký đơn giản nhất ví dụ, hai chất A và B liên tục chảy qua cột có nạp sẵn các các chất hấp phụ Người ta xác định nồng độ các cấu tử trong dung dịch chảy ra khỏi cột và xây dựng đồ thị theo hệ toạ độ: nồng độ cấu tử- thể tích dung dịch chảy qua cột đồ thị này thường gọi là sắc ký đồ hay đường cong thoát (có tác giả gọi là đường cong xuất) Trong phương pháp rửa giải, đầu... B Trong phương pháp rửa đẩy, sau khi đưa mẫu vào cột, ta cho chảy qua cột một dung dịch rửa chứa chất có ái lực với pha tĩnh lớn hơn các cấu tử cần tách Các cấu tử cần tách sẽ bị chuyển dần xuống phía dưới khi ta tiến hành quá trình rửa cột và tuần tự thoát ra khỏi cột Cấu tử thoát ra khỏi cột đầu tiên là cấu tử tương tác với pha tĩnh yếu nhất, sau đó dần dần đến các cấu tử có ái lực với cột mạnh... bị cột giữ lại Độ phân giải(Resolution ,R)  Từ sắc ký đồ, người ta biết được độ phân giải, ký hiệu R  Độ phân giải của cột sắc ký cho biết cột có khả năng tách các chất riêng ra hay không, được định nghĩa là sự khác nhau về thời gian lưu của hai pic kề sát nhau chia cho giá trị trung bình bề rộng đáy của 2 pic đó Hình học Cấu hình sắc ký Phẳng Giấy Phẳng Lớp mỏng Cột Cột hở Cột Sắc ký khí (GC) Cột. .. trong cột có nhóm hóa học kết dính bằng liên kế cộng hóa trị Một protein có ái lực với nhóm hóa học này sẽ gắn vào các hạt và di chuyển sẽ bị cản trở  Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi trong việc tinh sạch protein  Một dạng rất phổ biến của sắc ký ái lực là sắc ký ái lực miễn dịch Sắc ký lỏng cao áp: Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc ký cột. .. dịch chứa hỗn hợp các cấu tử (ví dụ, hỗn hợp hai cấu tử A và B, trong đó A có ái lực với cột nhỏ hơn B) chạy qua cột Các cấu tử A, B chứa trong Vml trước hết sẽ bị giữ lại ở phần trên của cột Sau đó cho dung dịch rửa (thường là dung môi hoà tan các cấu tử) chảy qua cột Lúc đó các cấu tử bị giữ ở phần trên của cột sẽ bị dung môi “rửa” và đưa dẫn xuống phía dưới Cấu tử A có ái lực với cột nhỏ hơn B nên... cellulose Pha động : là chất lỏng  Trong sắc ký lớp mỏng: Chất hấp thu thông dụng torng sắc ký lớp mỏng là silica gel, là loại pha tĩnh với tính chất rất phân cực Pha động: luôn luôn là chất lỏng  Trong sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng, kiểu triển khai sắc ký thông dụng nhất là pha động di chuyển từ dưới thấp lên trên cao Sắc ký cột hở cổ điển là tên gọi để chỉ loại sắc ký sử dụng một ống hình trụ, được... và polymer hóa để đạt các chỉ tiêu vật lý cần thiết như có các hạt với kích cỡ hạt, thể tích lỗ rỗng trên bề mặt, diện tích bề mặt… như yêu cầu  Có thể hiệu chỉnh tính hấp thu của silica gel bằng các cho silica gel kết hợp với những hợp chất khác như các bazo, các dung dịch đệm ở mức pH xác định Cũng có thể thêm nitrat bạc để làm gia tăng khả năng tách các hợp chất, nhất là các alcen ... động là chất khí: thí dụ trong kỹ thật sắc ký khí Trong trường hợp này chất khí được gọi là khí mang hay khí vecto  Pha động là chất lỏng: thí dụ trong kỹ thuật sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột Trong trường hợp này chất lỏng được gọi là dung môi giải ly (eluant) Sắc ký phân chia (Partition chromatography)  Pha động là chất lỏng hoặc chất khí (trong sắc ký khí)  Pha tĩnh là chất lỏng, lớp... thân vật liệu tạo cột vốn đã có sự phân chia rõ ràng và như thế sẽ có nhiều vị trí tương tác dẫn đến khả năng phân tách được tăng lên đáng kể Bởi vì cột được làm từ vật liệu mịn hơn nên phải có một áp lực tác động lên cột để có được một tốc độ chảy thích hợp Kết quả thực có sự phân giải cao và phân tách nhanh Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng (paper and thin- layer chromatography):  Trong sắc ký giấy: Pha... được liên tục rót vào đầu cột Thời gian lưu (retention time): (tR) Với máy sắc ký khí và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), pha tĩnh là bột rắn, nhuyễn cực mịn, được nén trong một ống hình trụ nên cần phải có một thiết bị tạo lực đẩy để giúp pha động di chuyển ngang qua pha tĩnh Thiết bị cảm biến thường được gọi là đầu dò (detector) tạo ra các tín hiệu điện tử để ghi thành sắc ký đồ (chromatography) .  Tủa protein  Thẩm tích  Siêu lọc  Sắc ký (Sắc ký giấy, sắc ký cột, Sắc ký lỏng – khí, Sắc lý ái lực miễn dịch, Sắc ký ái lực, Sắc ký trao đổi ion, Sắc ký cao áp lỏng…)  Điện di protein. đủ, rồi nạp lên cột theo cách phù hợp sao cho chất nghiên cứu lan thành một lớp phẳng lên cột; sau đó, tiến hành sắc ký. Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai. tách được các chất mong muốn. Đây là phương pháp sắc ký đơn giản nhất. ví dụ, hai chất A và B liên tục chảy qua cột có nạp sẵn các các chất hấp phụ. Người ta xác định nồng độ các cấu tử