Bài thuyết trình Các phương pháp sắc kí cột ppt

Sắc ký Chromatography là một phương pháp phân tách quan trọng nhất trong sinh học phân tử vì nó thích hợp với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch có thể được sử dụng ngay cho việc

TS: Ngô Đại

Nghiệp

 Lớp: SHO7B1

Nhóm 4

MSSV

 Nguyễn Đinh Diễm Thụy

30700514  Huỳnh Thị Lệ Phương

30760857  Nguyễn Anh Tôn

30700536  Trần Quốc Nhẫn

30700342  Đỗ Minh Trí

30760942

 Sự tinh sạch của protein rất quan trọng vì từ protein tinh sạch chúng ta có thể xác định

được trình tự acid amin, mối liên hệ về tiến

hóa giữa các protein trong những cá thể khác nhau và khảo sát các chức năng sinh hóa của các protein đó

 Để tinh sạch protein, người ta thường dựa vào các đặc điểm tương đồng và các tính chất khác nhau vốn có của nó

 Trong một số trường hợp, để dễ dàng hơn cho việc tinh sạch, người ta gắn vào protein một

đuôi acid amin (tag) - tạo ra dạng protein dung hợp (fusion protein)

 Tủa protein

 Thẩm tích

 Siêu lọc

 Sắc ký (Sắc ký giấy, sắc ký cột, Sắc ký lỏng – khí, Sắc lý ái lực miễn dịch, Sắc ký ái lực, Sắc

ký trao đổi ion, Sắc ký cao áp lỏng…)

 Điện di protein (điện đi trên gel Agarose,

điện di trên gel Polyacrylamide, điện di

protein theo điểm đẳng điện… )

Phương pháp tốt nhất để phân đoạn protein

là sắc ký cột (column chromatography).

Sắc ký (Chromatography) là một phương pháp phân tách quan trọng nhất trong sinh học phân

tử vì nó thích hợp với nhiều loại hợp chất và

sản phẩm tinh sạch có thể được sử dụng ngay cho việc định lượng và định danh

Sắc ký cột là phương pháp mà chất nhồi (là pha tĩnh: hấp phụ, trao đổi ion, phân

bố gen) được nhồi vào cột, dùng để phân chia các chất trong hỗn hợp và tinh chế các chất Thông thường, người ta hoà tan hỗn hợp chất nghiên cứu vào một dung

môi (pha động) với lượng vừa đủ, rồi nạp lên cột   theo cách phù hợp sao cho chất nghiên cứu lan thành một lớp phẳng lên cột; sau đó, tiến hành sắc ký.

Phương pháp sắc ký dựa vào sự

phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha động và tĩnh Có nhiều

nguyên nhân đưa đến sự phân bố

khác nhau của các chất, nhưng chính

sự lặp đi lặp lại hiện tượng hấp phụ - phản hấp phụ của các chất khi dòng pha động chuyển động qua pha tĩnh

là nguyên nhân chủ yếu của việc tách sắc ký

K=Cs/Cm=Nồng độ của hợp chất trong pha tĩnh/Nồng độ của hợp chất trong pha động.

 

 Chất nhồi cột (pha tĩnh, stationary phase,

thường dùng silicagel,) Chất nhồi cột quyết định quá trình sắc kí

 Dung môi: thông thường chọn dung môi

phụ thuộc vào chất nhồi cột

 Thực hiện:

Bước 1 là nhồi cột : Sau khi đã chọn cột, làm khô và cân silicagel cần dùng, pha dung môi chạy hệ rồi thì hòa tan silicagel vào dung môi

đó

Bước 2 nạp mẫu chất vào: Có 2 loại nạp mẫu

là nạp mẫu khô và nạp mẫu ướt

Bước 3: sau khi hoàn tất việc nạp mẫu rồi thì lót 1 miếng bông gòn ở bên trên mẫu chất để

ổn định hệ rồi tiếp tục châm dung môi vào,

từ từ thay đổi độ phân cực của hệ, Bước 4 mở khóa : lúc này cột bắt đầu tách chất, hứng

lượng dung môi chảy ra , mỗi lần hứng khoảng 1/5 hũ Sau đó đem chấm bản các hủ bi, những

hủ có vệt tương tự nhau sẽ được gom lại, đó là 1 chất Tiếp tục như vậy thì cuối cùng ta sẽ tách

được các chất mong muốn.

Đây là phương pháp sắc ký đơn giản

nhất ví dụ, hai chất A và B liên tục chảy qua cột có nạp sẵn các các chất hấp phụ Người ta xác định nồng độ các cấu tử

trong dung dịch chảy ra khỏi cột và xây dựng đồ thị theo hệ toạ độ: nồng độ cấu tử- thể tích dung dịch chảy qua cột đồ

thị này thường gọi là sắc ký đồ hay

đường cong thoát (có tác giả gọi là

đường cong xuất)

Trong phương pháp rửa giải, đầu tiên người

ta cho V ml dung dịch chứa hỗn hợp các cấu tử (ví dụ, hỗn hợp hai cấu tử A và B, trong đó A

có ái lực với cột nhỏ hơn B) chạy qua cột Các cấu tử A, B chứa trong V ml trước hết sẽ bị giữ lại ở phần trên của cột Sau đó cho dung dịch rửa (thường là dung môi hoà tan các cấu tử) chảy qua cột Lúc đó các cấu tử bị giữ ở phần trên của cột sẽ bị dung môi “rửa” và đưa dẫn xuống phía dưới Cấu tử A có ái lực với cột

nhỏ hơn B nên chuyển động xuống phía dưới nhanh hơn B

Trong phương pháp rửa đẩy, sau khi đưa mẫu vào cột, ta cho chảy qua cột một

dung dịch rửa chứa chất có ái lực với pha tĩnh lớn hơn các cấu tử cần tách Các cấu

tử cần tách sẽ bị chuyển dần xuống phía dưới khi ta tiến hành quá trình rửa cột và tuần tự thoát ra khỏi cột Cấu tử thoát ra khỏi cột đầu tiên là cấu tử tương tác với pha tĩnh yếu nhất, sau đó dần dần đến

các cấu tử có ái lực với cột mạnh dần

V PHÂN LOẠI CÁC

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ:

Pha tĩnh: có thể là chất rắn hoặc chất lỏng

mang rắn

Pha động : có thể là chất lỏng

hoặc chất khí.

Pha động là chất khí: thí dụ trong

kỹ thật sắc ký khí Trong trường

hợp này chất khí được gọi là khí

mang hay khí vecto

Pha động là chất lỏng: thí dụ trong

kỹ thuật sắc ký giấy, sắc ký lớp

mỏng, sắc ký cột Trong trường hợp này chất lỏng được gọi là dung môi giải ly (eluant).

Sắc ký phân chia (Partition

chromatography)

 Pha động là chất lỏng hoặc chất khí (trong sắc

ký khí).

 Pha tĩnh là chất lỏng, lớp chất lỏng với chiều

dày rất mỏng, chất lòng này được nối hóa học

lên bề mặt của những hạt rắn, nhuyễn mịn và có tính trơ.

silica gel hoặc alumin.

Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange

chromatography)

 Pha động chỉ có thể là chất lỏng.

 Pha tĩnh là chất rắn, là những hạt hình cầu rất nhỏ, có cấu tạo hóa học là

polymer nên gọi là hạt nhựa Bề mặt của hạt mang các nhóm chức hóa học ở dạng ion Có hai loại nhựa: nhựa trao đổi

anion và nhựa trao đổi cation

Sắc ký lọc gel ( Size exclusion

chromatography; gel filtration

Sắc ký ái lực dựa vào tính bám dính của một protein, các hạt trong cột có nhóm hóa học kết dính bằng liên kế cộng hóa trị Một protein có ái lực với nhóm hóa học này sẽ gắn vào các hạt

và di chuyển sẽ bị cản trở

ứng dụng rộng rãi trong việc tinh sạch protein

ký ái lực miễn dịch

Sắc ký ái lực (affinity

chromatography):

Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng

mở rộng của kỹ thuật sắc ký cột có khả năng phân tách protein được cải thiện

đáng kể Bản thân vật liệu tạo cột vốn

đã có sự phân chia rõ ràng và như thế

sẽ có nhiều vị trí tương tác dẫn đến khả năng phân tách được tăng lên đáng kể Bởi vì cột được làm từ vật liệu mịn hơn nên phải có một áp lực tác động lên cột

để có được một tốc độ chảy thích hợp

Kết quả thực có sự phân giải cao và

phân tách nhanh.

Sắc ký lỏng cao áp:

Chất hấp thu thông dụng torng sắc ký lớp mỏng là

silica gel, là loại pha tĩnh với tính chất rất phân cực

Pha động: luôn luôn là chất lỏng

 Trong sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng, kiểu triển

khai sắc ký thông dụng nhất là pha động di chuyển

từ dưới thấp lên trên cao.

Sắc ký cột hở cổ điển là tên gọi để chỉ loại sắc ký sử dụng một ống hình trụ,

được đặt dựng đứng, với đầu trên hở và đầu dưới có gắn một khóa

Pha tĩnh rắn được nhồi vào ống trụ

Mẫu cần tách được đặt lên trên bề mặt của pha tĩnh

Pha động là dung môi được liên tục

rót vào đầu cột

Thời gian lưu (retention time): (tR )

Với máy sắc ký khí và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), pha tĩnh là bột rắn, nhuyễn cực mịn, được nén trong một ống hình trụ nên

cần phải có một thiết bị tạo lực đẩy để giúp

pha động di chuyển ngang qua pha tĩnh

Thiết bị cảm biến thường được gọi là đầu dò (detector) tạo ra các tín hiệu điện tử để ghi

Hình học Cấu hình

sắc ký

Chiều di chuyển của pha động

Loại sắc ký

Phẳng Giấy Đi lên, đi

xuống, từ tâm lan tỏa tròn

Phân chia

Phẳng Lớp mỏng Đi lên, đi

xuống, từ tâm lan tỏa tròn

Hấp thu, phân chia, trao đổi ion, lọc gel Cột Cột hở Đi xuống Hấp thu, phân

chia, trao đổi ion, lọc gel Cột Sắc ký khí

(GC) Nhờ vào ngoại lực Hấp thu, phân chia Cột HPLC Nhờ vào ngoại

lực Hấp thu, phân chia, trao đổi

ion, lọc gel

VI CÁC LOẠI PHA

TĨNH SỬ DỤNG TRONG SẮC KÝ:

 Silica gel làm pha tĩnh trong sắc ký được

chế tạo bằng cách thủy giải silica natri (cho tác dụng với acid sulfiric) để thành acid

polysilisic, tiếp theo là sự ngưng tụ và

polymer hóa để đạt các chỉ tiêu vật lý cần thiết như có các hạt với kích cỡ hạt, thể tích

lỗ rỗng trên bề mặt, diện tích bề mặt… như yêu cầu.

 Có thể hiệu chỉnh tính hấp thu của silica

gel bằng các cho silica gel kết hợp với

những hợp chất khác như các bazo, các

dung dịch đệm ở mức pH xác định Cũng có thể thêm nitrat bạc để làm gia tăng khả

năng tách các hợp chất, nhất là các alcen.

a Silica gel pha thường:

Silica gel- tạo nối dùng cho pha đảo

Loại silica gel pha đảo có tính kém phân cực nên có ái lực mạnh với các hợp chất kém phân cực, giữ chặt các hợp chất này lại trong cột Pha động thường là nước

Silica gel- tạo nối dùng cho pha thường

Thực hiện các phản ứng điều chế tương tự như trên nhưng nhóm chất cuối dãy thường là phenyl, cyano, amino, diol,…

Silica gel – tạo nối dùng cho sắc ký thủ tính

Hoạt tính sinh học của những hợp chất thủ tính đặc trưng tùy theo hóa lập thể của chúng Có đối phân có hoạt tính chữa bệnh trong khí đối phân còn lại không có dược tính đó, mà còn gây độc, vì thế nhất thiết phải tách riêng chúng

b Silica gel chế hóa:

Loại pha tĩnh thủ tính Cơ chế bắt giữ chất

vòng (crown ether) khách (tương tác giữa Tương tác giữa chủ-

chất tan đối với lỗ rỗng

có tính thủ tính của chủ

là cyclodextrin) Enzyme bị giữ cố định

Phức amino acid kim loại Phức xuyên lập thể phân

Alumina là oxid aluminium Al2O3

được điều chế với là hydroxid

aluminium, có thể điều chỉnh độ pH

của dung dịch phản ứng để sản xuất

ra hạt alumina với bề mặt có tính

acid, tính kiềm hay trung tính

Nhiệt độ lúc hoạt hóa trong quá trình điều chế là đặc điểm khác nhau giữa alumina và silica gel Muốn có

alumina hoạt tính mạnh, cần phải đun

Muốn làm giảm hoạt tính, thêm nước vào

Với sắc ký giấy, rất thuận tiện khi sử dụng tờ giấy lọc làm pha tĩnh, nhưng việc sử dụng trực tiếp có nhiều

Gel là tên gọi chung cho các loại pha tĩnh được điều chế từ tinh bôt, agar (polysaccarid) hoặc polyacrylamid,

trong đó các chuỗi dây dài được nối mạng ngang để tạo thành mạng

không gian ba chiều Gel thường

được sử dụng trong sắc ký cột hoặc điện di

Tên thương

mại của Gel hợp để tách Gel thích

các hợp chất

có trọng lượng phân

tử (đơn vị C)

Thể tích gel trương nở trong nước (ml /g gel

khô)

P-2 100 – 2.000 3 P-4 800 – 4.000 4 P-6 1.000 – 6.000 6,5 P-10 1.500 - 20.000 7,5

Loại gel

Sephadex hợp để tách Gel thích

các hợp chất

có trọng lượng phân

tử ( đơn vị

C)

Thể gel trương nở trong nước (ml/g gel

 Sắc ký cột khô (Dry – column

chromatography)

chớp nhoáng) (Flash

chromatography)

column flash chromatography; Vacuum liquid chromatography)

Sắc ký nhanh cột khô là một biến đổi

của sắc ký chớp nhoáng , với một vài khác biệt sau:

Để gia tăng vận tốc giải ly của pha động, sắc ký

chớp nhoáng sử dụng một lực đẩy từ trên đầu cột xuống, còn sắc ký nhanh – cột khô dùng

một lực hút tạo chân không ở đầu ra của cột

nhờ một máy bơm hút loại nhẹ.

Sắc ký chớp nhoáng sử dụng pha tĩnh là silica

gel loại dùng cho sắc ký cột, còn sắc ký nhanh-

cột khô sử dụng silica gel dùng cho loại sắc ký

lớp mỏng, cỡ hạt 15- 40 micromet.

 Trong quá trình giải ly, sắc ký chớp nhoáng vẫn

giữ một lớp dung môi ở trên đầu cột (cột không

được khô), còn với sắc lý nhanh- cột khô cột sắc

ký được rút khô san mỗi phân đoạn thu được.

 [1] Nguyễn Kim Phi Phụng; Phương pháp cô lập

các hợp chất hữu cơ; nhà xuất bản ĐHQG Tp.HCM – 2007

 [2] A Braithwaite, F.J.Smith Chromatographic

methods Kluwer Academic Publishrs Boston-

london, 45-501,1999.

 [3] W.Clark Still, Michael Kahn Abhijit Mitra

Rapid chromatographic technique for preparative separations with moderate resolution J Org

chem, 1978

 http://academics.vmi.edu/chem_aa/CH402/experim ents/ion_exchange.htm

 http://courses.cm.utexas.edu/jrobertus/ch339k/over heads-1/ch5_ion-exchange.jpg