Bài giảng thực hành sinh hoá

- Khi làm việc với acid hay base mạnh: Bao giờ cũng đổ acid hay base vào nước khi pha loãng không được đổ nướcvào acid hay base; Không hút acid hay base bằng miệng mà phải dùng các dụng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-BÀI GIẢNG

THỰC HÀNH HÓA SINH

TS Nguyễn Hoài Hương

CN Bùi Văn Thế Vinh

Dùng cho sinh viên ngành Môi trường và Công nghệ Sinh học

Năm xuất bản: 2009

MỤC LỤC Trang

Quy tắc làm việc trong phòng thí nghiệm Hóasinh

5

Bài 1 Cách pha chế các dung dịch dùng trong thí

nghiệm Hóa sinh

3 Enzyme amylase và phương pháp xác định hoạt

GIỚI THIỆU MÔN HỌC

Bài giảng “Thực hành sinh hoá” dành cho sinh viên năm thứ hai khoa Môi

trường & Công nghệ Sinh học, trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM

Với thời lượng 30 tiết và tuỳ thuộc điều kiện, cơ sở vật chất của phòng thínghiệm cho phép, sinh viên tiến hành làm 5 bài thực hành gồm các nội dung chính củahọc phần lý thuyết hóa sinh cơ sở

1 Giới thiệu phòng thí nghiệm hóa sinh, cách pha chế các dung dịch dungtrong thí nghiệm hóa sinh ;

2 Định lượng đường khử bằng phương pháp acid dinitro-salicylic (DNS);

3 Định lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl;

4 Định lượng protein bằng phương pháp Bradford;

5 Xác định hoạt tính enzyme amylase

QUY TẮC LÀM VIỆC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM HÓA

SINH

I An toàn khi làm việc với axit và kiềm

1 An toàn khi làm việc với axit:

Phải làm việc trong tủ hút bất cứ khi nào đun nóng axit hoặc thực hiện phản

ứng với các hơi axit tự do

Khi pha loãng, luôn phải cho axit vào nước trừ phi được dùng trực tiếp

Giữ để axit không bắn vào da hoặc mắt bằng cách đeo khẩu trang, găng tay vàkính bảo vệ mắt Nếu làm văng lên da, lập tức rửa ngay bằng một lượng nước lớn

Luôn phải đọc kỹ nhãn của chai đựng và tính chất của chúng

H2SO4: Luôn cho acid vào nước khi pha loãng, sử dụng khẩu trang và găng tay

để tránh phòng khi văng acid

Các acid dạng hơi (HCl) thao tác trong tủ hút và mang găng tay, kính bảo hộ

2 An toàn khi làm việc với kiềm

Kiềm có thể làm cháy da, mắt gây hại nghiêm trọng cho hệ hô hấp

Mang găng tay cao su, khẩu trang khi làm việc với dung dịch kiềm đậm đặc

Thao tác trong tủ hút, mang mặt nạ chống độc để phòng ngừa bụi và hơi kiềm.Amoniac: là một chất lỏng và khí rất ăn da, mang găng tay cao su, khẩu trang,thiết bị bảo vệ hệ thống hô hấp Hơi amoniac dễ cháy, phản ứng mạnh với chất oxyhoá, halogen, axit mạnh

Amoni hydroxyt: chất lỏng ăn da, tạo hỗn hợp nỏ với nhiều kim loại nặng: Ag,

Pb, Zn và muối của chúng

Kim loại Na, K, Li, Ca: phản ứng cực mạnh với nước, ẩm, CO2, halogen, axitmạnh, dẫn xuất clo của hydrocacbon Tạo hơi ăn mòn khi cháy Cần mang dụng cụbảo vệ da mắt Chỉ sử dụng cồn khô khi tạo dung dịch natri alcoholate, cho vào từ từ.Tránh tạo tinh thể cứng khi hoà tan Tương tự khi hoà tan với nước, đồng thời phảilàm lạnh nhanh

Oxit canxi rất ăn da, phản ứng cực mạnh với nước, cần bảo vệ da mắt, đường

hô hấp do dễ nhiểm bụi oxit

Natri và kali hydroxyt: rất ăn da, phản ứng cực mạnh với nước Các biện pháp

an toàn như trên, cho từng viên hoặc ít bột vào nước chứ không được làm ngược lại

II Quy tắc làm việc với hóa chất thí nghiệm

3 Cách sử dụng và bảo quản hoá chất:

Khi làm việc với hóa chất, nhân viên phòng thí nghiệm cũng như sinh viên cần hết sứccẩn thận, tránh gây những tai nạn đáng tiếc cho mình và cho mọi người Những điềucần nhớ khi sử dụng và bảo quản hóa chất được tóm tắt như sau:

- Hóa chất phải được sắp xếp trong kho hay tủ theo từng loại (hữu ơ, vô cơ,muối, acid, bazơ, kim loại, ) hay theo một thứ tự a, b, c để khi cần dễ tìm

- Tất cả các chai lọ đều phải có nhãn ghi, phải đọc kỹ nhãn hiệu hóa chất trướckhi dùng, dùng xong phải trả đúng vị trí ban đầu

- Chai lọ hóa chất phải có nắp Trước khi mở chai hóa chất phải lau sạch nắp,

cổ chai, tránh bụi bẩn lọt vào làm hỏng hóa chất đựng trong chai

- Các loại hóa chất dễ bị thay đổi ngoài ánh sáng cần phải được giữ trong chai

lọ màu vàng hoặc nâu và bảo quản vào chổ tối

- Dụng cụ dùng để lấy hóa chất phải thật sạch và dùng xong phải rửa ngay,không dùng lẫn nắp đậy và dụng cụ lấy hóa chất.

- Khi làm việc với chất dễ nổ, dễ cháy không được để gần nơi dễ bắt lửa Khicần sử dụng các hóa chất dễ bốc hơi, có mùi, phải đưa vào tủ hút, chú ý đậy kín nắpsau khi lấy hóa chất xong

- Không hút bằng pipette khi chỉ còn ít hóa chất trong lọ, không ngửi hay nếmthử hóa chất

- Khi làm việc với acid hay base mạnh:

Bao giờ cũng đổ acid hay base vào nước khi pha loãng (không được đổ nướcvào acid hay base);

Không hút acid hay base bằng miệng mà phải dùng các dụng cụ riêng như ốngbóp cao su

Trường hợp bị bỏng với acid hay base rửa ngay với nước lạnh rồi bôi lên vết

bỏng NaHCO3 1% (trường hợp bỏng acid) hoặc CH3COOH 1% (nếu bỏng base) Nếu

bị bắn vào mắt, dội mạnh với nước lạnh hoặc NaCl 1%

Trường hợp bị hóa chất vào miệng hay dạ dày, nếu là acid phải súc miệng và

uống nước lạnh có MgO, nếu là base phải súc miệng và uống nước lạnh có CH3COOH1%

Lưu ý các kí hiệu cảnh báo nguy hiểm:

BÀI 1: CÁCH PHA CHẾ CÁC DUNG DỊCH DÙNG TRONG THÍ NGHIỆM HÓA SINH

I Lý thuyết

1.1 Dung dịch

Dung dịch là hỗn hợp của hai hay nhiều chất tác động tương hỗ với nhau vềmặt vật lý và hóa học Trong dung dịch gồm có chất hòa tan và dung môi Nếu chấthòa tan ở dạng rắn thì gọi là chất tan, nếu là chất lỏng thì gọi là dung chất

Tùy theo tính chất của dung môi mà phân thành dung dịch nước và dung dịchkhan Phần lớn các dung dịch acid, base, muối trong phòng thí nghiệm là dung dịch

nước, dùng dung môi là nước Một số chất khác tan trong dung môi hữu cơ

Hàm lượng chất hòa tan trong dung dịch thể hiện ở nồng độ dung dịch Có

nhiều cách biểu thị nồng độ khác nhau Mỗi cách sẽ tiện dụng trong chuẩn bị, phântích và tính toán khác nhau

1.1.1 Các đơn vị nồng độ dung dịch

a) Nồng độ phần trăm, (%)

i) Nồng độ phần trăm khối lượng - khối lượng, % (w/w): là số gam chất tan có

trong 100g dung dịch

Ví dụ: dung dịch NH4Cl 5% (w/w) là trong 100g dung dịch có chứa 5g NH4Cl

ii) Nồng độ % khối lượng thể tích (w/v): là số g chất tan có trong 100ml dung

dịch

Ví dụ: dung dịch CuSO4 10% (w/v) là trong 100ml dung dịch chứa 10g CuSO4

iii) Nồng độ phần trăm thể tích - thể tích, % (v/v): là số ml dung chất có trong

100ml dung dịch

Ví dụ: dung dịch glycerine 10% (v/v) là trong 100ml dung dịch chứa 10ml glycerine

b) Nồng độ gam-lit, (g/L): là số gam chất tan có trong 1 lít dung dịch.

c) Nồng độ phân tử gam hay nồng độ mol, (Mol/L) hay M: là số phân tử gam

(hay số mol) chất tan trong 1 lít dung dịch

Ví dụ: Dung dịch KH2PO4 M/15 là trong 1000ml dung dịch chứa M/15 phân tử gam

KH2PO4.

d) Nồng độ đương lượng (N): là số đương lượng gam (đlg) chất tan có trong 1

lit dung dịch

Số đương lượng chất tan = số mol (n) x hệ số đương lượng (z)

Hệ số đương lượng (z): phụ thuộc vào bản chất của chất đó và phản ứng màchất đó tham gia

i) Nếu phản ứng là phản ứng acid, base: z là số ion H+ hay OH- mà 1 phân tử,ion của chất đó tác dụng vừa đủ

Ví dụ: Phản ứng giữa HCl và NaOH

H2SO4+ 2 NaOH → Na2SO4 + 2 H2O

H2SO4→ 2 H+ z = 2

NaOH → 1 OH- z = 1

ii) Nếu phản ứng là phản ứng ôxy – hóa khử: z là số electron mà 1 phân tử, ion

của chất đó cho hay nhận

f) Đơn vị nồng độ dùng trong các phép phân tích vi lượng :

- Nồng độ mg/mL: số mg chất tan trong 1mL dung dịch

- Miligam phần trăm, mg%: mg chất hòa tan trong 100g dung dịch

- Microgam phần trăm, µg%: là số µg chất hòa tan trong 100g dung dịch

- Phần nghìn,0/00: số g chất hòa tan trong 1000g dung dịch

- Phần triệu, ppm: số mg chất hòa tan trong 1kg hay 1 lít dung dịch

- Phần tỷ, ppb: số µg chất hòa tan có trong 1kg hay 1 lít dung dịch

Lượng NaOH cần để pha dung dịch : X= (40*500)/100= 200g

Lượng nước cần thiết: 500-200=300g (hay 300ml)

Vậy, cân 200g NaOH và đong 300 ml nước cất, hòa tan ta được 500g dungdịch NaOH 40%

ii) Chất tan là chất rắn ngậm nước (CuSO4.5H2O; Na2HPO4 12H2O; )

Khi pha dung dịch cần phải tính thêm lượng nước kết tinh có sẵn

Ví dụ: Pha 320g dung dịch CuSO4 10% (w/w) từ CuSO4.5H2O

M(CuSO4) = 160 và M(CuSO4.5H2O) = 250

Lượng CuSO4khan để pha dung dịch là: X = (10*320)/100 = 32g

Lượng CuSO4.5H2O cần dùng: Y = (250*32)/160 = 50g

Lượng nước cất thêm vào: 320 -50 = 270g (hay ml)

Vậy, cân 50g CuSO4.5H2O, đong 270ml nước cất, hòa tan ta được 320g dung

dịch CuSO4 10%

b) Pha dung dịch loãng từ một dung dịch đậm đặc hơn:

Ví dụ: Pha 500g dung dịch NaOH 5% từ dung dịch NaOH 10%

Lượng NaOH cần để pha dung dịch 5% là: X = (5*500)/100 = 25g

Lượng dung dịch NaOH 10% cần dùng là: Y = (100*25)/10 = 250g

Lượng nước cất thêm vào: 500-250 = 250g

Vậy, đong 250ml nước cất và 250g dd NaOH 10%, hòa tan ta được 500gNaOH 5%

c) Pha dung dịch bão hoà:

Lấy chất tan cần pha vào becher, thêm một ít nước cất và khuấy cho tan Nếusau khi khuấy, chất tan không tan hết lắng xuống thì phần dung dịch phía trên là dungdịch bão hòa Nếu chất tan tan hết, thêm chất tan và tiếp tục khuấy, cứ như thế cho

đến khi chất tan không còn tan được nữa

d) Pha dung dịch có nồng độ % theo thể tích

i) Chất tan là chất rắn khan

Cân lượng chất tan cần thiết, chuyển sang bình định mức, dùng nước cất hòatan và định mức đến thể tích đúng

Ví dụ: Pha 1 lít dung dịch NaCL 5% (w/v)

Lượng NaCl cần để pha dung dịch: X = (5*1000)/100 = 50g

Vậy, cân 50g NaCl, hòa tan và định mức thành 1 lít bằng nước cất, ta được 1 lítdung dịch NaCl 5%.

ii) Chất tan là chất rắn ngậm nước (CuSO4.5H2O; Na2HPO4 12H2O; )

Khi pha dung dịch ta cần phải tính đến lượng nước kết tinh có sẵn giống như ởphần a

iii) Chất tan dạng lỏng: Một số chất tan ở dạng lỏng như HCl, H2SO4

Việc cân không thuận lợi, có thể đưa về đơn vị thể tích theo công thức

V = M/dV: Thể tích chất lỏng; M: khối lượng chất lỏng cần cân; d: tỷ trọng chất lòng

Chú ý: Các hóa chất lỏng bán trên thị trường thường không ở dạng nguyên chất

mà là các dung dịch đậm đặc Giới hạn hòa tan tối đa được tính bằng % thể tích và

thay đổi tùy theo loại hóa chất Ví dụ như H2SO4: 95-98%; HCl: 37%; H3PO4: 85%; NH4OH: 25% Do đó khi pha các dung dịch từ các loại hóa chất này ta phải chú

65-ý đến nồng độ của dung dịch đậm đặc

Ví dụ: Pha 440ml dung dịch HCl 1% từ dung dịch HCl 37% (d=1,19g/ml)

Lượng HCl cần để pha dung dịch 1% là: X= (1*440)/100 = 4,4g

Lượng dung dịch HCl 37% cần dùng là : Y = (100*4,4)/37 = 11,9g

= 11,9/1,19 = 10 mlLượng nước cất thêm vào:440-10 = 430ml

Vậy, dùng ống đong lấy 10ml dung dịch HCl37%, và 430ml nước cất ta được

440 ml HCl 1%

Do việc sử dụng các loại bình định mức làm cho việc pha chế dung dịch thínghiệm trở nên đơn giản và chính xác vì vậy ngày nay đa số các dung dịch thí nghiệm

được pha chế theo nồng độ khối lượng - thể tích (w/v)

e) Pha dung dịch nồng độ phân tử gam

i) Chất tan là chất rắn khan

Muốn pha dung dịch nồng độ 1M của một chất nào đó, ta tính khối lượng phân

tử chất đó (hoặc tra bảng) theo đơn vị gam Cân chính xác lượng chất tan, qua phễucho vào bình định mức có dung tích 1 lít Cho vào từng lượng nước cất nhỏ, lắc đểhòa tan hoàn toàn và đưa nước cất tới mức Chuyển dung dịch sang bình chứa, lắc đểtrộn đều đồng nhất

Khi phải đun nóng dung dịch để hòa tan, hoặc quá trình hòa tan có toả nhiệt thìphải chờ nhiệt độ trở lại bình thường (nhiệt độ không khí) rồi mới thêm nước tới vạch

định mức

Ví dụ: Pha 1 lít dung dịch KOH 1M

Phân tử lượng của KOH: MKOH = 39 +16 +1 =56

Lượng KOH để pha 1 lít dung dịch 1M là: 56g

Vậy, cân 56g KOH, hòa tan trong 1 ít nước, cho vào bình định mức 1000 Đây

là phản ứng tỏa nhiệt, cần làm nguội dung dịch trước khi định mức thành 1 lít.Nếu muốn pha dung dịch 2M; 3M hay 0,1M; 0,05M ta cũng tiến hành tương tựvới lượng cân tương ứng

Ví dụ: Pha 500ml dung dịch KCl 3M

Phân tử lượng của KCl: MKCl = 39 +35,5 = 74,5

Lượng KCl để pha 500ml dung dịch 3M là: X= (74,5 *3*500)/1000 =

111,75g

Vậy, cân 111,75g KCl, hòa tan trong 1 ít nước, cho vào bình định mức 500,

định mức đến vạch

ii) Chất tan là chất rắn ngậm nước: khi tính lượng chất tan cần cân phải tính

luôn cả khối lượng các phân tử nước

iii) Chất tan dạng lỏng: nếu chất tan là dung dịch, ta phải tính toán dựa vào

Định mứ c thành 1 lít Tiến hành pha trong tủ Hotte vì hơi acid bay lên rất độc

hại

f) Pha nồng độ đương lượng (N)

Việc pha dung dịch nồng độ đương lượng gam (N) cũng tương tự với cách phadung dịch nồng độ phân tử gam (M)

1.1.3 Hiệu chỉnh nồng độ dung dịch

Khi pha hóa chất, có nhiều nguyên nhân làm cho nồng độ dung dịch không

chính xác như việc cân đong không chính xác, các hóa chất không tinh khiết hay bị

hút ẩm Thời gian tàng trữ lâu nên chất tan bị thăng hoa, bị oxy hóa, dung môi bay

hơi, vì vậy phải kiểm tra nồng độ thực của các dung dịch pha sẵn dựa vào các dung

dịch có nồng độ chính xác được gọi là dung dịch chuẩn (fixanal)

a) Dung dịch chuẩn

Dung dịch chuẩn là các dung dịch được chuẩn bị sẵn, đảm bảo chính xác và

được dùng để định chuẩn các dung dịch tự pha chế khi làm thí nghiệm Các chất dùng

trong dung dịch chuẩn phải khá bền vững sao cho nồng độ của chúng không thay đổinhanh chóng theo thời gian

Pha dung dịch chuẩn, ta phải dùng ống chuẩn Ống chuẩn là một ống ampunthủy tinh hay nhựa đóng kín Bên trong chứa một lượng cân chính xác chất tan hoặcdung dịch chất tan Khi chuyển hết lượng chất tan trong ống vào bình định mức và pha

thành 1 lít ta được dung dịch chuẩn có nồng độ đã ghi trên nhãn ngoài ống

Cách pha dung dịch chuẩn từ ống chuẩn :

- Dùng đinh thủy tinh chọc thủng ampun, hứng lên phểu vào bình định mức,dùng bình tia rửa sạch chất tan có trong ampun vào bình định mức 1 lit, vừa thêm

nước cất vừa lắc và đưa nước cất tới vạch mức

- Đối với các hợp chất bền vững, có thành phần không thay đổi như NaCl,AgNO3, acid oxalic, có thể pha dung dịch chuẩn trực tiếp bằng cách cân chính xácchất cần pha, pha loãng và định mức tới thể tích đúng

- Đối với các chất như NaOH, HCl, Na2S2O3, không thể pha ngay được dungdịch chuẩn, do các chất này thường không bền vững và dễ thay đổi thành phần, vì vậysau khi pha phải hiệu chỉnh lại nồng độ

Ví dụ: NaOH thường nhiễm một lượng Na2CO3 rất dễ chảy nước, HCl dễ bay

hơi, Na2S2O3 dễ bị mất nước tinh thể khi để ngoài không khí

b) Phương pháp hiệu chỉnh nồng độ dung dịch

Đối với các chất dễ thay đổi thành phần khi ở dạng rắn, nếu muốn pha dung

dịch có nồng độ chính xác, ta pha dung dịch có nồng độ gần đúng, sau đó hiệu chỉnhnồng độ của dung dịch dựa vào phản ứng với một dung dịch chuẩn thích hợp

Ví dụ: Pha dung dịch NaOH 0,1 N từ NaOH rắn và dùng dung dịch chuẩn

H2SO4 0,1N để chuẩn độ lại

Đối với các dung dịch dễ thay đổi trong quá trình bảo quản, mỗi lần sử dụng lại

phải xác định lại hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch

Xét một phản ứng trung hòa acid - base, 1 ion gam H+ sẽ phản ứng với 1 iongam OH- Do đó:

C1V1 = C2V2Nếu gọi Cp là nồng độ dung dịch định pha và Ct là nồng độ thực của dung dịch

ta có hệ số hiệu chỉnh K:

K= Cp/Ct= Vp/Vt

Ví dụ: Dung dịch chuẩn là H2SO4 0,1N, dung dịch định pha là NaOH 0,1N.Lấy 10ml H2SO4 0,1N cho vào erlen, thêm ba giọt chỉ thị màu phenolphtalien,dùng burette chuẩn độ bằng NaOH được 11 ml NaOH

Vậy nồng độ thực tế NaOH đã pha là : Ct = (10*0,1)/11 = 0,091 N

Hệ số điều chỉnh K: K= 0,091/0,1 = 10/11 = 0,91

1.2 Dung dịch đệm:

1.2.1 Định nghĩa dung dịch đệm

pH môi trường làm thay đổi cấu trúc không gian protein vì một số amino acid

có mạch nhánh phân ly (COO- và NH4+ tạo liên kết ion) Họat động tối ưu của proteinphụ thuộc vào cấu trúc không gian nhất định trong môi trường, nghĩa là phụ thuộc vào

tỉ lệ phân ly của mạch nhánh thành ion, hay nói tóm lại là phụ thuộc vào pH môi

Trong cơ thể sống, dung dịch đệm đóng vai trò quan trọng, ví dụ như ổn định

pH của máu bằng các hệ đệm carbonate và phosphate

Về nguyên tắc thì phối hợp các loại đệm có các khoảng đệm khác nhau thành 1dung dịch là không có vấn đề gì Tuy nhiên sử dụng các đệm nào còn tùy thuộc vào

ứng dụng sao cho thành phần của đệm không phản ứng với các cấu tử trong hệ phảnứng khảo sát theo chiều hướng có hại Các phản ứng thường thấy là phản ứng tạo kết

tủa hay tạo phức hoặc oxy hóa khử

Có dung dịch chứa hỗn hợp 1 acid yếu (Ví dụ: acid acetic) với muối của nó (Vídụ: muối natri acetate), dung dịch sẽ cân bằng dạng như sau:

Trái lại, khi thêm một lượng base mạnh (OH-), acid điện li cho H3O+ (cân bằngchuyển dịch theo chiều thuận), ion hidroni H3O+ trung hòa OH- cho base yếu H2O Kếtquả pH của dung dịch tăng không đáng kể

Khả năng đệm của hỗn hợp đệm phụ thuộc vào hàm lượng acid và base liênhợp có trong hỗn hợp

1.2.2 Cách pha một số dung dịch đệm thường dùng

a) Dung dịch đệm borat:

- Dung dịch acid boric (a): 12,404 g H3BO3 hòa tan và định mức đến 1000 ml

- Dung dịch borat (b): 19,108 g Na2B4O7.10H2O hòa tan và định mức đến 1000ml

Dung dịch đệm borat có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) vàdung dịch (b) theo bảng dưới đây:

f) Dung dịch đệm Glycine – NaOH (pH = 8,6 – 10,6)

- Dung dịch glycine 0,2 M (a): 15,01g glycine hòa tan và định mức đến 1000ml

- Dung dịch NaOH 0,2 M (b): 8 g NaOH hòa tan và định mức đến 1000 ml.Dung dịch đệm Glycine có pH khác nhau khi lấy 50 ml dung dịch (a) và X mldung dịch (b) rồi định mức đến 200 ml

- Dung dịch natri acetate 0,2M (b): 16,4 g CH3COONa hoặc 27,2 g

CH3COONa.3H2O được hòa tan và định mức đến 1000 ml

Dung dịch đệm có pH khác nhau phụ thuộc vào X ml dung dịch (a) và Y mldung dịch (b) và định mức đến 100 ml