xây dựng quy trình cải tiến kỹ thuật giải trình tự dna phù hợp việc tiến hành tự động và phân tích bằng phần mềm từ phương pháp sanger kinh điển

Nắm bắt được cơ chế lây nhiễm củaHIV và quá trình đáp ứng miễn dịch theo từng giai đoạn của cơ thể đối vớiviệc tấn công của HIV là điều rất quan trọng để ứng dụng trong nghiên cứuchẩn đo

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hơn hai thập kỷ qua, nhân loại phải đương đầu với đại dịch HIV/AIDSnguy hiểm, có tốc độ lây truyền cao, chưa có vắc xin phòng bệnh và chưa cóthuốc điều trị đặc hiệu HIV/AIDS không chỉ là nguyên nhân cướp đi hàngtriệu sinh mạng người trên thế giới mà còn là hiểm họa tác động nghiêm trọngđến mọi khía cạnh của đời sống xã hội, làm ảnh hưởng tới kinh tế, văn hóa, xãhội và nòi giống của mỗi quốc gia

Đại dịch HIV/AIDS đang tiếp tục lan rộng trên toàn cầu với tốc độ13.000 ca nhiễm mới mỗi ngày Theo báo cáo của Tổ chức phòng chốngAIDS của Liên Hợp Quốc (UNAIDS) và của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO),trên toàn thế giới có khoảng 40,3 (36,7- 45,3) triệu người đang sống với HIV/AIDS và khoảng 25 triệu bệnh nhân đã tử vong (UNAIDS/WHO, 2010) Nhưvậy, kể từ khi bắt đầu đại dịch đến nay, trên thế giới đã có tới gần 65 triệungười nhiễm HIV Trong năm 2008, đã có 2,7 (2,4- 3,0) triệu trường hợpnhiễm mới và 2,0 (1,7-2,4) triệu bệnh nhân AIDS đã chết (UNAIDS/WHO,2009), điều đó cũng có nghĩa là cứ mỗi phút có 5,1 trường hợp nhiễm mới và3,8 trường hợp chết vì AIDS hoặc cứ 6-7 giây có một trường hợp nhiễm mới

và cứ 14-16 giây có một người chết vì AIDS trên thế giới

Đông Nam Á và Đông Âu là những khu vực có tốc độ lây nhiễm HIVcao thông qua con đường tiêm chích ma túy Việt Nam hiện đang được xếp vàodanh sách các nước có tỷ lệ nhiễm HIV cao trên thế giới cũng như trong khuvực Theo Bộ Y tế, Việt Nam đang là nước có số lượng người nhiễm HIV caothứ 6 ở Châu Á Ở Việt Nam hiện nay cứ 15 phút lại có một người bị nhiễmHIV Số lượng người nhiễm HIV/AIDS gia tăng kéo theo nhu cầu chăm sóc và

hỗ trợ ngày càng tăng Theo đánh giá mới đây của Tổ chức Y tế thế giới, HIV/

AIDS đang được xếp hàng thứ 3 trong các nguyên nhân gây tử vong (chiếm7,5%) ở các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam (Bao, 2009).

Sự đa dạng của các chủng HIV là một con số khó thống kê vì HIV cókhả năng biến đổi rất lớn và tùy thuộc vào các vùng địa lý khác nhau Quátrình xâm nhiễm của HIV vào cơ thể vật chủ diễn ra khá phức tạp do HIV tấncông trực tiếp vào hệ thống miễn dịch của cơ thể Hiện nay, việc sử dụngvaccine phòng lây nhiễm HIV rất khó khăn vì các vaccine phòng chống HIVvẫn trong giai đoạn nghiên cứu hoặc ứng dụng thử nghiệm và giá thành rấtcao Vì vậy kiểm soát và ngăn chặn quá trình lây nhiễm HIV chủ yếu dựa vàoviệc phát hiện nguồn bệnh lây lan trong giai đoạn sớm Chẩn đoán sự lâynhiễm HIV là mối quan tâm toàn cầu Nắm bắt được cơ chế lây nhiễm củaHIV và quá trình đáp ứng miễn dịch theo từng giai đoạn của cơ thể đối vớiviệc tấn công của HIV là điều rất quan trọng để ứng dụng trong nghiên cứuchẩn đoán Các phương pháp chẩn đoán HIV ngày càng phát triển, đòi hỏi sựchuẩn xác và độ nhạy cao để có thể phát hiện sớm HIV ngay sau khi HIV

xâm nhiễm vào cơ thể người Vì vậy, chuyên đề này nhằm "Xây dựng quy trình cải tiến kỹ thuật giải trình tự DNA phù hợp việc tiến hành tự động và phân tích bằng phần mềm từ phương pháp Sanger kinh điển"

Nhiễm trùng khởi phát Chuyển đổi huyết thanh Nhiễm trùng tiềm tàng Nhiễm trùng cấp

1 HIV VÀ HỆ MIỄN DỊCH

1.1 Các loại tế bào bị nhiễm bởi HIV.

HIV có khả năng xâm nhập vào nhiều loại tế bào như tế bào máu, tếbào não, tế bào da nhưng chủ yếu tấn công vào tế bào TCD4 và đại thực bào(Alimonti JB, Ball TB, Fowke KR, 2003) Các loại tế bào chính bị nhiễmHIV được chỉ ra trong hình 1

Hình 1: Các tế bào bị nhiễm HIV

Những tế bào bị nhiễm HIV có thể chết thậm chí là sớm hơn những gì

mà người ta nghĩ cho đến nay Nếu các tế bào nhiễm có chu kỳ sống ngắn hơnthì điều này làm tăng các khả năng trốn thoát của virus khỏi sự kiểm soát của

hệ thống miễn dịch (Christian L Althaus et al 2009).

1.2 Các giai đoạn và dấu hiệu của người nhiễm HIV

1.2.1 Giai đoạn nhiễm trùng khởi phát (Primary infection)

Đây là giai đoạn đầu tiên, khi virus bắt đầu thâm nhập vào cơ thể

(http://www.sfaf.org/hiv-info/basics/) Sau đó từ hai đến bốn tuần trên 87%người nhiễm HIV trải qua những dấu hiệu giống cúm trong vài ngày, đó cũng

là biểu hiện của hệ miễn dịch cơ thể bắt đầu chiến đấu với sự lây nhiễm mớicủa HIV Những dấu hiệu bệnh bao gồm: sốt, ớn lạnh, đau đầu, đổ mồ hôi (Bradley Hare, 2004) Thông thường từ 6-12 tuần hệ miễn dịch bắt đầu sảnxuất kháng thể để chống lại virus Nghĩa là trong máu của một người mớinhiễm HIV sẽ không thể có kháng thể kháng HIV trong vài tuần đầu tiên.Người nhiễm mới thì khả năng lây nhiễm trong giai đoạn này rất cao bởi vì sốlượng lớn của HIV trong dịch của cơ quan sinh dục (NIAID, 2003) Ở giaiđoạn này kháng nguyên p24 xuất hiện

1.2.2 Giai đoạn chuyển đổi huyết thanh

Giai đoạn chuyển đổi huyết thanh được miêu tả là thời gian khi cơ thể

bắt đầu sản xuất kháng thể kháng lại virus Đây cũng là giai đoạn khó chẩnđoán nhất vì lượng kháng nguyên p24 giảm dần thay thế là sự xuất hiện củakháng thể kháng p24 nhưng còn quá ít Hầu hết mọi người phát triển khángthể trong vòng 3 tháng Một vài người có thể trên 6 tháng mới phát triểnkháng thể kháng HIV(http://www.sfaf.org/hiv-info/basics/)

1.2.3 Thời kỳ nhiễm trùng tiềm tàng (clinical latency)

Đây là thời kỳ không có dấu hiệu của bệnh hay còn gọi là không triệuchứng Phải mất bao lâu để một người bị nhiễm HIV mới phát triển nhữngdấu hiệu của bệnh? Đây là câu hỏi không có câu trả lời bởi vì nó có thể kéodài từ 3 tháng đến 10 năm thậm chí có thể kéo dài lâu hơn nữa tuỳ thuộc sứckhỏe và chức năng của hệ miễn dịch cơ thể Mặc dù không có dấu hiệu củabệnh nhưng virus vẫn tiếp tục nhân lên và tấn công những tế bào của hệ miễn

dịch (NIAID, 2003) Ở giai đoạn này nồng độ IgM anti-HIV giảm dần đểthay thế bằng sự hình thành IgG anti-HIV Ngoài ra, trong giai đoạn này ta cóthể tìm thấy kháng nguyên gp120 trong máu người bệnh

Mức độ HIV trong cơ thể ngưòi nhiễm HIV tương quan với sự suygiảm của tế bào CD4(sự suy giảm của hệ miễn dịch) Mức độ HIV càng tăng,

số lượng tế bào CD4 càng giảm thì càng nhanh tiến đến giai đoạn AISD vàchết (NIAID, 2003)

Khi hệ miễn dịch bị phá hủy một số người sẽ bắt đầu xuất hiện một sốnhững dấu hiệu nhẹ, không đặc hiệu đối với quá trình nhiễm HIV, bao gồm:

- Nổi hạch trong vòng hơn 3 tháng

- Mệt mỏi

- Giảm cân

- Thường xuyên sốt và đổ mồ hôi

- Liên tục nhiễm nấm (miệng và âm đạo)

- Liên tục phát ban và bong da

- Khung chậu dễ bị viêm và không đáp ứng với thuốc điều trị

- Mất trí nhớ trong thời gian ngắn

- Thường xuyên hoặc đôi khi nhiễm herpes ở miệng, bộ phận sinh dụchoặc đau hậu môn

- Bệnh zona

1.2.4 Giai đoạn nhiễm trùng cấp (Acute infection)

Giai đoạn này có sự xuất hiện của hội chứng AIDS Thời kỳ đầu cóbiểu hiện suy giảm miễn dịch do sự giảm sút tế bào TCD4 cũng như sự rốiloạn miễn dịch của tế bào lympho B và đại thực bào nên lâm sàng có hạch

sưng ở nhiều nơi kéo dài 2-4 tháng nhưng điều trị viêm không tác dụng Sau

đó, hệ miễn dịch suy giảm trầm trọng, hội chứng AIDS xuất hiện toàn diện,người bệnh suy mòn và dẫn đến tử vong Trong huyết thanh bệnh nhân thấy

sự xuất hiện trở lại của kháng nguyên p24 và có thể thấy sự xuất hiện củakháng nguyên gp41, kháng thể kháng gp41, kháng thể kháng gp120

Hình 2: Sự thay đổi số lượng TCD4+ và biểu hiện lâm sàng

trên bệnh nhân nhiễm HIV chưa điều trị

1.3 Suy giảm miễn dịch do HIV

Khi HIV xâm nhập vào cơ thể, nó không chỉ làm giảm về số lượng màcòn làm suy giảm chức năng của các tế bào miễn dịch đặc biệt là tế bàolympho T, lympho B và đại thực bào Tuy nhiên, do HIV có ái tính đặc biệtvới phân tử CD4 nằm trên bề mặt của tế bào lympho T (tế bào đóng vai trònhạc trưởng quan trọng chỉ huy và điều hòa quá trình đáp ứng miễn dịch) làm

ly giải hoặc bất hoạt chức năng của tế bào này dẫn đến suy giảm tất cả cácloại đáp ứng miễn dịch.

Cơ chế giảm tế bào TCD4 do tác động trực tiếp của HIV (Bộ Y tế, 2004):

- Tế bào TCD4 bị phá hủy do HIV xâm nhập và nhân lên làm tăng tínhthấm màng tế bào, gây ứ đọng calci và nước

- Khi virus nhân lên sẽ giải phóng một lượng lớn cDNA, RNA tự dotrong bào tương tế bào, gây độc cho tế bào

- Dưới tác động của HIV làm tế bào TCD4 chết theo chương trìnhnhanh hơn bình thường

- Các phân tử CD4 mới hình thành trong bào tương chưa hiện diện trên

bề mặt tế bào đã bị liên kết với gp120 và sản phẩm gp120-CD4 trong bàotương sẽ làm chết tế bào

Cơ chế suy yếu của tế bào TCD4 dưới tác động gián tiếp bởi HIV

- HIV phong bế quá trình chín của TCD4 chưa bị nhiễm thông qua cytokine của tế bào bị nhiễm

- Do KN gp120 trên bề mặt tế bào TCD4 đã bị nhiễm lại tiếp tục gắnvới CD4 của TCD4 chưa bị nhiễm tạo thành hợp bào là tế bào khổng lồ nhiềunhân có đời sống ngắn không quá 48 giờ

- Do cơ chế tự miễn, gp120 của virus bong ra từ tế bào TCD4 đã bịnhiễm HIV lại gắn với phân tử CD4 của tế bào chưa bị nhiễm nên trong máuxuất hiện KT kháng gp120 của virus làm huỷ hoại tế bào T có cấu trúc bề mặttương tự gp120 theo cơ chế gây độc tế bào (ADCC) hoặc theo cơ chế kết hợp

bổ thể

- Do HIV phá hủy cả tế bào nguồn, tế bào non để biệt hoá thành tế bàolympho

Do TCD4 giảm cả về số lượng và chất lượng, các cytokine của TCD4

bị thiếu hụt làm giảm khả năng hỗ trợ hoạt hoá với các tế bào lympho B, đại

thực bào và tế bào lympho T khác dẫn dến hệ thống miễn dịch của cơ thể suygiảm về cả miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào.

1.4 Chẩn đoán sinh học có suy giảm miễn dịch và có rối loạn miễn dịch

- Dấu hiệu tin cậy và trực tiếp nhất là giảm TCD4+ (bình thường 1280/ mm3) và giảm số lượng TCD8+ (bình thường 258- 800/mm3)

450 Dấu hiệu tin cậy gián tiếp là tỷ lệ TCD4+/ T CD8+ giảm (bìnhthường: 1,4- 2,2)

- Qui định : Nếu T CD4+ < 400/mm3 là tiên lượng xấu, chứng tỏ đã suygiảm miễn dịch đáng kể Nếu T CD4+ < 200 /mm3 là suy giảm miễn dịchnghiêm trọng, giảm lympho B, bình thường 25- 280/mm3

- Theo dõi kháng nguyên p24:

+ Vừa có giá trị phát hiện sớm bệnh 50-70% (+) ở giai đoạn sơ nhiễm.+ Khi có hội chứng AIDS đầy đủ 50-70% (+) trở lại

+ Bệnh tiến triển trầm lặng thì kháng nguyên p24 giảm dần theo thời gian

- Dấu hiệu gián tiếp suy giảm miễn dịch (Bùi Đại et al, 2000, NguyễnTriệu Vân et al, 1999)

2 Chẩn đoán phát hiện HIV

Chẩn đoán sự nhiễm HIV thông thường phát hiện một cách gián tiếpthông qua kháng thể đặc hiệu kháng virus (Gurtler 1996) Đây là dấu hiệu củađáp ứng miễn dịch dịch thể, chống lại những tác nhân được tìm thấy gần như100% những người nhiễm HIV

Chẩn đoán trực tiếp sự lây nhiễm HIV cũng có thể tiến hành nhờ việcxác định virus truyền nhiễm (sử dụng nuôi cấy tế bào chỉ có thể thực hiệntrong phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp 3), kháng nguyên virus (ELISAphát hiên kháng nguyên p24) hoặc axit nucleic của virus (tức là bộ gen củavirus; NAT = phát hiện axit nucleic) Để xác định tình trạng nhiễm trùng của

PA N+

NA N-

bệnh nhân, phát hiện virus trực tiếp chỉ cần thiết trong những trường hợp nhấtđịnh, chẳng hạn như nhiễm trùng nguyên phát hoặc nhiễm trùng theo đường

từ mẹ sang con (mô tả chi tiết ở dưới) Bên cạnh xét nghiệm định tính ( trả lờicâu hỏi "có hoặc không có"), xét nghiệm đính lượng để phát hiện số lượngvirus đã trở nên rất quan trọng: Nồng độ của virus trong huyết thanh, được gọi

là "lượng virus", đã trở thành một công cụ không thể thiếu cho việc địnhhướng liệu pháp kháng retrovirus (Berger 2001) Thuật ngữ "xét nghiệmHIV" (vẫn thường được hiểu không chính xác là "xét nghiệm AIDS”), tuynhiên hầu như thuật ngữ này luôn luôn đề cập đến việc phát hiện kháng thểđặc hiệu kháng HIV, dấu ấn của nhiễm trùng HIV

* Tiêu chuẩn đánh giá

Để đánh giá chất lượng của bộ kit, người ta căn cứ vào hai tiêu chuẩnquan trọng nhất là độ nhạy và độ đặc hiệu của chúng

+ Độ nhạy

- Độ nhạy = số trường hợp dương tính thật/ số trường hợp dương tính

thật + số trường hợp âm tính giả

- Độ nhạy (SE %) = X 100

PA: Tổng số mẫu cho kết quả dương tính thật

ND: Số mẫu cho kết quả âm tính giả

N+: ND + PA

+ Độ đặc hiệu

- Độ đặc hiệu = số trường hợp âm tính thật/ số trường hợp âm tính thật +

số trường hợp dương tính giả

Độ đặc hiệu (SP %): SP = X 100%

NA: Tổng số mẫu cho kết quả âm thật

PD: Số mẫu cho kết quả dương tính giả

N-: NA + PD

2.1 Những vấn đề về chẩn đoán trong giai đoạn cửa sổ

Sau khi nhiễm HIV phải mất vài tuần trước khi kháng thể được pháthiện Hiện tượng này gọi là chẩn đoán cửa sổ và được xác định bởi giai đoạn

cơ thể đòi hỏi sản phẩm phát hiện mức độ của kháng thể (Busch 1997) Sựchuyển đổi kháng thể từ âm tính sang dương tính gọi là quá trình chuyển đổihuyết thanh Những xét nghiệm sàng lọc gần đây được sử dụng trong chẩnđoán đã được ghi nhận có thể phát hiện được HIV sau sáu tuần của giai đoạntiền lây nhiễm vào khoảng 80% và sau tuần thứ 12 là 100%; duy nhất vàitrường hợp chỉ phát hiện được sau 6 tháng

Kỹ thuật sàng lọc thế hệ thứ 4 đã cố gắng để rút ngắn thời gian của quátrình chẩn đoán giai đoạn cửa sổ bằng cách phát hiện đồng thời kháng thể HIV

và kháng nguyên p24 (Gurtler 1998, Ly 2001) Mặc dù các kỹ thuật phát hiệnthế hệ thứ 4 này có thể phát hiện sớm hơn ở giai đoạn tiền nhiễm, nhưng ở giaiđoạn cửa sổ lại phát hiện muộn hơn do nhiều lý do về mặt kỹ thuật Thậm chítrong giai đoạn này có thể lại không thể phát hiện được (Meier 2001)

Trong giai đoạn sớm của quá trình chuyển đổi huyết thanh, những kỹthuật kiểm tra sàng lọc bằng kháng thể sẽ cho phản ứng rất yếu Sử dụng kỹthuật Western blot để khẳng định trong giai đoạn này sẽ không xuất hiện mộtbăng nào hoặc xuất hiện không đầy đủ, thường thì băng p24 xuất hiện đầutiên và có thể nhìn thấy Trong những trường hợp như vậy thường rất khóphân biệt với những nguời không bị lây nhiễm nhưng vẫn xảy ra phản ứngkhông đặc hiệu Đây cũng là một thông tin hết sức quan trọng cho các phòngxét nghiệm thấy hết tầm quan trọng thế nào trong quá trình tiến hành kiểm tra

Trong những trường hợp như vậy sẽ kiểm tra lại trong vòng một thờigian ngắn Nếu thực sự lây nhiễm HIV và đang ở trong giai đoạn chuyển đổi

huyết thanh thì lượng kháng thể sẽ được tăng đáng kể trong vài ngày sau, vàtrong vòng vài tuần thì sẽ thấy sự xuất hiện đầy đủ của các băng thông quaphản ứng western-blot Nó phụ thuộc It depends on the individualcircumstances whether direct virus detection e.g by means of PCR isadvisable at the outset Note: antiretroviral post-exposure prophylaxis maymake direct virus detection more difficult and potentially delayseroconversion.

2.2 Các kỹ thuật phát hiện HIV trong cơ thể

2.2.1 Phát hiện trực tiếp sự có mặt của HIV

Các phương pháp phát hiện trực tiếp sự có mặt của HIV có thể là pháthiện bản thân virus ở dạng hoàn chỉnh, RNA/cDNA virus hoặc phát hiệnnhững KN đặc trưng của virus (Bộ Y tế, 2005c)

2.2.1.1 Phân lập virus hoàn chỉnh

Bệnh phẩm có thể là: máu, dịch não tuỷ, dịch sinh dục, sữa mẹ, mảnhcắt tổ chức nhưng phổ biến nhất là sử dụng bạch cầu đơn nhân trong máungoại vi

Sau khi phân lập, bạch cầu đơn nhân của người bệnh được nuôi cấytrong môi trường nhân tạo có thêm những bạch cầu của người lành (có CD4)

để virus thâm nhiễm, nhân lên đạt đủ mật độ để phát hiện ra bằng các kỹ thuậtriêng như tìm KN hay enzyme đặc trưng của virus

Đây là một kỹ thuật có giá trị nhưng cho kết quả chậm sau khoảng 15ngày nuôi cấy, trang bị hiện đại tốn kém nên chỉ sử dụng trong nghiên cứu,xác định chủng virus được phân lập, đánh giá tính kháng lại thuốc chốngRetrovirus của HIV, chẩn đoán HIV ở trẻ sơ sinh và ở những bệnh nhân cóbiểu hiện lâm sàng bất thường Độ nhạy của xét nghiệm chẩn đoán HIV ở trẻ

sơ sinh khi mới sinh khoảng 43% và khi trẻ trên 3 tháng có thể đạt 90-95%(Đỗ Trung Phấn, 1999)

2.2.1.2 Phát hiện virus bằng kính hiển vi điện tử kết hợp với phương pháp miễn dịch

Kết quả: Nếu phản ứng dương tính, ta có phức hợp KN-IgG-α-IgG-Au

và khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử sẽ nhìn rõ các hạt vàng và nơi HIVkhư trú

Giá trị: Phát hiện được vị trí khư trú của HIV nhưng đòi hỏi trang thiết

bị hiện đại đắt tiền

2.2.2 Phát hiện KN của HIV

Kháng nguyên HIV, đặc biệt kháng nguyên vỏ nhân p24 có trong huyếtthanh, huyết tương, dịch não tuỷ có thể được phát hiện bằng phương phápELISA tóm bắt kháng nguyên (Capture ELISA) hoặc bằng kỹ thuật RIA

Nguyên lý chung của các kỹ thuật này là dùng kháng thể đa dòng(polyclonal antibody) kháng HIV cố định trong các giếng nhựa hoặc trên cácviên bi polystyrene tiếp xúc với bệnh phẩm cần thử, sau đó, ủ tiếp phức hợpnày với kháng thể kháng HIV có gắn enzym hoặc chất phóng xạ Enzym sẽlàm biến đổi màu cơ chất Khi đo màu cơ chất hoặc đo hoạt tính phóng xạ cóthể định tính và định lượng kháng nguyên

Về lý thuyết người ta có thể phát hiện tất cả các kháng nguyên củavirus nhưng trên thực tế, do tính đặc hiệu và ái lực của các kháng thể chủ yếuhướng tới các protein chính trong vỏ nhân (nucleocapsid) như p24 Vì vậy,

kỹ thuật này thường sử dụng để phát hiện kháng nguyên p24 Dấu hiệu mấtkháng nguyên p24 ở những người đã có phản ứng huyết thanh học HIVdương tính là dấu hiệu nói lên sự khởi đầu của AIDS lâm sàng (NXB Y học,1995) Đây là xét nghiệm có độ đặc hiệu cao (98-99%) nhưng độ nhạy chỉ đạt10-25% ở trẻ sơ sinh và 50% ở trẻ lớn hơn (http://www.Dostquangtri.gov.vn).

2.2.3 Các kỹ thuật sinh học phân tử trong xét nghiệm HIV

Các kỹ thuật sinh học phân tử ngày càng được áp dụng rộng rãi trongcông tác xét nghiệm, theo dõi điều trị và nghiên cứu sinh học di truyền củavirus và là công cụ hữu hiệu trong chẩn đoán sớm nhiễm HIV, theo dõi tiếntriển bệnh, chỉ định và theo dõi hiệu quả điều trị thuốc, nghiên cứu tính khángthuốc

2.2.3.1 Các kỹ thuật định tính

* Kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật tổng hợp DNAnhờ enzym Polymerase do nhà bác học người Mỹ có tên là Kary Mulis phátminh năm 1983 Kỹ thuật PCR đã đem lại một cuộc cách mạng trong ditruyền học phân tử Nhờ kỹ thuật PCR mà một đoạn DNA ở một vùng bất kỳtrong bộ gen được khuếch đại lên rất nhiều bản sao khi trình tự nucleotid ởhai đầu đoạn đó đã biết Khi phân lập được từng gen riêng biệt chúng ta cóthể tạo dòng gen hay gây các đột biến và làm thay đổi các gen này; đồng thờichúng ta có thể ứng dụng các kỹ thuật để chẩn đoán các dạng đột biến genhay để xác định các dạng đột biến

Dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi tính và nguyên lý tổng hợp DNAnhờ hoạt tính của các DNA polymerase Với nguyên liệu là bốn loạinucleotid, enzym DNA polymerase xúc tác sự tổng hợp một mạch DNA mới

từ DNA khuôn Phản ứng này đòi hỏi sự có mặt của những mồi xuôi và mồingược có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự DNA khuôn Phản ứngPCR là một chuỗi phản ứng gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm

ba giai đoạn:

- Giai đoạn 1: là giai đoạn biến tính (denaturation) Chuỗi xoắn képDNA khuôn bị biến tính, tách dời nhau thành 2 chuỗi đơn, phân tử DNA đượcbiến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử, nhiệt độnày thường là khoảng 940C – 950 C trong vòng 30 giây

- Giai đoạn 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing) nhiệt độ được hạ xuống vềnhiệt độ gắn mồi cho phép các đoạn oligonucleotid gắn với sợi DNA khuôn.Trong quá trình này, enzym DNA polymerase bền với nhiệt sẽ được hoạt hóa

và bắt đầu giai đoạn kéo dài mồi

- Giai đoạn 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extention ) Nhiệt độđược nâng lên đến nhiệt độ tối ưu của enzym xúc tác cho quá trình kéo dàimồi Ở chu kỳ đầu, mỗi sợi DNA khuôn đơn sẽ tạo ra một chuỗi đôi mới(hình 1) Số lượng vùng gen đích được sao chép tăng lên gấp đôi Như vậy,theo tính toán nếu hiệu suất của phản ứng là 100% thì chỉ cần sau 20 chu kỳ

có thể thu được một triệu bản sao chép vùng gen đích Tuy nhiên, thườngphản ứng PCR không thể đạt hiệu suất lý thuyết (100%) do nhiều yếu tố tácđộng Do vậy, số lượng bản sao chép thu được thường vào khoảng trên 105.Phản ứng PCR liên quan đến quá trình tổng hợp DNA trong đó 2 đoạnolygonucleotid mồi quyết định vị trí khởi đầu cho quá trình sao chép củaenzym polymerase và do đó nó quyết định vùng gen nào của DNA khuôn sẽđược sao chép Các mồi này liên kết bổ sung với vùng gen đích của DNAkhuôn và đầu 3, (OH) hướng về phía đoạn mồi khác DNA polymerase cần cócác đoạn mồi olygonucleotid cho hoạt động xúc tác Quá trình kéo dài mồi

với sự có mặt của 4 loại deoxynucleotid đã được hoạt hóa (dATP,dGTP,dCTP

và dTTP) và dung dịch đệm đặc hiệu cho phép vùng DNA nằm giữa hai vị tríbám của mồi được nhân lên trong mỗi chu kỳ phản ứng

Sau mỗi chu kỳ như vậy, các chuỗi đôi DNA mới tạo thành sẽ tiếp tụcđược dùng làm DNA khuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếptheo Sản phầm cuối cùng của phản ứng PCR là đoạn DNA chuỗi có chiều dàibằng khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩmđược xác định bởi đầu tận cùng 5’của hai đoạn gen mồi

Số lượng chu kỳ mỗi phản ứng PCR phụ thuộc vào số lượng khuônDNA ban đầu, thường không vượt quá 40 chu kỳ tùy theo mục đích sử dụng Cuối cùng, sản phẩm của phản ứng được làm lạnh về nhiệt độ phònghoặc 40C

PCR thường ít được sử dụng hơn so với chẩn đoán huyết thanh học vàchỉ được sử dụng trong một số trường hợp nghi là mới nhiễm HIV còn đangtrong giai đoạn cửa sổ và chưa thể phát hiện được kháng thể bằng phươngpháp huyết thanh học (CDC, 2001)

* Các kỹ thuật định lượng

Định lượng virus, RNA huyết tương hoặc DNA provirus là thông sốquan trọng để theo dõi mức độ xâm nhập và nhân lên của HIV, chỉ định điềutrị và theo dõi, đánh giá kết quả điều trị

+ Kỹ thuật AMPLICOR

Kỹ thuật dùng để định lượng RNA HIV trong huyết tương Nhờenzyme RT (Revese Transcriptase), sao chép ngược RNA thành cDNA Sảnphẩm PCR sẽ được lai ghép với các mẫu dò đặc hiệu với DNA đích đã được

cố định trên giá đỡ và được phát hiện với mẫu có gắn các tín hiệu cho phépđọc được bằng phương pháp so màu

+ Kỹ thuật Real time PCR

Đây là phương pháp cho phép khuếch đại và xác định số lượng cácchuỗi DNA được tạo ra trong từng chu kỳ nhiệt Sau mỗi chu kỳ nhiệt, sốlượng các bản sao DNA được tổng hợp tăng lên sẽ cho các tín hiệu phátquang tăng tỷ lệ thuận Dựa vào một gam mẫu chuẩn có số lượng DNA đíchxác định tiến hành đồng thời cùng mẫu thử để xây dựng một đường chuẩn dựatrên số liệu bản sao DNA đích và giá trị Ct của từng mẫu tương ứng (Ct làthời điểm ở chu kỳ n của PCR cho tín hiệu huỳnh quang tăng vọt so với tínhiệu nền) Nếu số lượng DNA bản đích càng lớn thì Ct càng nhỏ Có nhiềuphương pháp sử dụng phép phát quang để xác định số lượng bản sao DNAđược nhân lên

Các phương pháp PCR thông thường chỉ đánh giá định tính mà khôngđánh giá định lượng virus Phương pháp real-time PCR thực hiện nhanh, phùhợp, không đắt, và định lượng được sản phẩm DNA và RNA Real-time PCRhoặc PCR sao chép ngược (reverse transcriptase-PCR, RT-PCR) có thể pháthiện mức độ nhân lên của DNA dựa trên mức độ chất chỉ thị mầu được giảiphóng sau khi sản phẩm DNA được khuếch đại Phương pháp này có thể pháthiện được 10.000 chuỗi gen sao chép/phản ứng (khoảng 100 tế bào bị nhiễm)

Real time PCR là kỹ thuật PCR mà sản phẩm khuếch đại được hiển thịngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng Chìa khóa chính của kỹ thuật là hóa

chất, thuốc thử có trong type phản ứng có gắn chất huỳnh quang Ngày nay,

kỹ thuật này ngày càng được ứng dụng rộng rãi và hiệu quả Có thể nói đây là

kỹ thuật phát hiện " không đồng nhất", vì trong kỹ thuật này, một hỗn hợp củasản phẩm PCR được phát hiện, chứ không phải từng thành phần của sản phẩmđược phát hiện như trong kỹ thuật điện di Quá trình phản ứng đơn giản nhất

là bổ sung ethidium bromid vào hỗn hợp phản ứng Khi ethidium bromid xen

vào cấu trúc chuỗi đôi DNA, tín hiệu huỳnh quang sẽ được tạo ra, mức độ tínhiệu phụ thuộc vào lượng DNA chuỗi đôi được tạo ra trong quá trình phản ứng.

Với hướng tiếp cận như vậy, cho đến nay đã có nhiều cải tiến trong các

kỹ thuật phát hiện DNA chuỗi đôi Các kỹ thuật đó là:

- Real time PCR sử dụng SYBR Green I

- Real time PCR sử dụng đầu dò đặc hiệu (probe)

Với phản ứng real time PCR, kết quả khuyếch đại DNA đích sẽ đượchiển thị ngay sau sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng thông qua biểu đồkhuyếch đại của phản ứng Quan sát biểu đồ này ta thấy trục tung (Y) biểu thịcường độ huỳnh quang phát ra từ các ống phản ứng khi nhận ánh sáng kíchthích Trục hoành (X) là các chu kỳ nhiệt

Hình 3 Biểu đồ real time PCR định lượng HIV trong huyết thanh

Khi đánh giá hai phương pháp PCR cổ điển và real-time PCR người tanhận thấy Real time PCR có nhiều ưu điểm hơn so với PCR cổ điển:

- Real-time PCR kiểm soát lượng huỳnh quang giải phóng ra trong phảnứng, do vậy ta có thể biết được lượng sản phẩm PCR tại từng thời điểm (chukỳ) của phản ứng của quá trình khuếch đại Trái ngược với PCR cổ điển, chỉcho ta biết được lượng sản phẩm khuếch đại tại thời điểm cuối cùng của phản

Cycle20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 4018

16 14 12 10 9 7 5 3 1

Threshold: 73 (Adjusted manually)

Baseline settings:automatic, Drift correction OFF

Cycle20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 4018

16 14 12 10 9 7 5 3 1

Cycle20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 4018

16 14 12 10 9 7 5 3 1

Threshold: 73 (Adjusted manually)

Baseline settings:automatic, Drift correction OFF

ứng bằng cách điện di trên gel sau khi phản ứng kết thúc Mặt khác, gelagarose có hạn chế là độ phân giải thấp, kỹ thuật điện di của người làm thínghiệm do vậy kết quả thường không chính xác.

- Real-time PCR có độ đặc hiệu cao hơn rất nhiều so với PCR cổ điển dodụng các mẫu dò đặc hiệu để phát hiện sản phẩm khuếch đại Trong khi đóPCR cổ điển chỉ phân biệt sản phẩm khuếch đại dựa vào kích thước của cácbăng sản phẩm trên gel Trong khi đó khi tiến hành phản ứng PCR, có nhiềutrường hợp sản phẩm PCR không đặc hiệu cũng có kích thước của sản phẩmbằng kích thước sản phẩm PCR mong muốn nên dễ nhầm lẫn

- Ở phản ứng Real-time PCR sau khi kết thúc phản ứng chúng ta khôngcần phải làm các thao tác như điện di giúp tiết kiệm thời gian và hóa chất

- Với phản ứng real-time PCR chỉ mất 1-2 giờ trong khi PCR cổ điểnmất 3-5 giờ

- Đặc biệt, phản ứng real -time PCR là một hệ thống kín nên ít có nguy cơ tạpnhiễm

2.2.4 Phát hiện gián tiếp sự có mặt của HIV (Chẩn đoán kháng thể kháng HIV)

Kiểm tra kháng thể đối với HIV cần ít nhất hai kỹ thuật:

1 Kỹ thuật sàng lọc

2 Ít nhất một kỹ thuật để khẳng định

Để loại trừ việc vô ý làm lẫn mẫu xét nghiệm, người ta thường xétnghiệm thêm một mẫu máu thứ hai của cùng một bệnh nhân Chỉ khi đó, kếtquả chẩn đoán HIV mới có thể cho thông báo cho bệnh nhân Hầu hết các kỹtrhuật kiểm tra sàng lọc đều dựa trên nguyên lý của phản ứng ELISA(enzyme linked immune sorbent assay) hoặc các xét nghiệm tương tự(UNAIDS, 1997b) Xét nghiệm sàng lọc phải có độ nhạy rất cao để giảm

thiểu nguy cơ cho kết quả âm tính giả Điều này có nghĩa rằng các xétnghiệm này phải có thể phát hiện sự sự có mặt của kháng thể kháng HIV ởnồng độ rất thấp, ví dụ trong giai đoạn đầu của quá trình nhiễm trùng nguyênphát Nếu kết quả của một xét nghiệm sàng lọc là dương tính, kết quả nàyphải được khẳng định bởi (ít nhất) một xét nghiệm khẳng định khác Khôngbao giờ được chẩn đoán sự nhiễm HIV dựa trên kết quả dương tính của duynhất một kỹ thuật sàng lọc.

Các kỹ thuật phát hiện gián tiếp sự có mặt của HIV thông qua các thànhphần đặc hiệu kháng lại các thành phần cấu trúc của virus (Phạm Nhật An và

Cs, 1995)

* Kỹ thuật ngưng kết (agglutination)

Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý ngưng kết thụ động, những hạt nhưgelatin (SERODIA test), latex hoặc hồng cầu người làm giá đỡ cho cácprotein virus Khi cho tiếp xúc với KT kháng HIV, các hạt này tạo thành mộtmạng lưới ngưng kết có thể nhận định bằng mắt thường

Đây là kỹ thuật đơn giản, nhanh, không đòi hỏi trang bị cao có thể tiếnhành hàng loạt nên có ý nghĩa điều tra dịch tễ, sàng lọc máu tuy nhiên cóphản ứng dương tính giả

* Kỹ thuật miễn dịch enzyme pha rắn ELISA

ELISA là phương pháp cho phép phát hiện hầu hết các mẫu xét nghiệm

có KT kháng HIV Tuy nhiên, đây là phương pháp có độ nhạy cao, do đó cóthể cho những kết quả dương tính giả Để hạn chế nguy cơ này, cần phải cóphương pháp kết hợp để khẳng định chẩn đoán của ELISA Western Blot(WB) là phương pháp hỗ trợ phổ biến nhất để khẳng định kết quả dương tínhcủa ELISA, IFA cũng được dùng như một phương pháp thay thế cho WB

ELISA được ứng dụng để phát hiện các KT IgG HIV, IgA HIV hoặc IgM anti-HIV bằng 3 kỹ thuật sau:

anti-+ Kỹ thuật ELISA gián tiếp

KT kháng HIV trong máu bệnh nhân kết hợp đặc hiệu với KN HIV đãđược cố định sẵn trên giá đỡ (ở các giếng phản ứng trên hạt nhựa) Phức hợpKN-KT được nhận biết bởi một cộng hợp là KT kháng Ig người có gắnenzyme và sẽ cho phản ứng hiện màu với một cơ chất thích hợp Giá trị mật

độ quang của phản ứng màu tỷ lệ thuận với lượng KT kháng HIV hiện diệntrong mẫu thử

Đây là xét nghiệm có độ nhạy cao nhưng độ đặc hiệu không cao dothường bị dương tính giả

+ Kỹ thuật ELISA Sandwich

KT kháng HIV được cố định trong giếng để tóm bắt các KN virus trongmẫu thử và được phát hiện bởi kháng thể 2 gắn enzyme Giá trị mật độ quangcủa phản ứng màu tỷ lệ thuận với lượng KN hiện diện trong mẫu thử ELISAsandwich thường được sử dụng để phát hiện KN p24 của HIV trong chẩnđoán sớm HIV

+Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (IFA)

Nguyên lý của IFA cũng tương tự ELISA nhưng chất gắn đánh dấu là

chất màu huỳnh quang và kết quả được đọc dưới kính hiển vi huỳnh quang.Phản ứng dương tính được thể hiện bằng những tế bào bị nhiễm HIV phátquang ở ngoại vi

* Kỹ thuật Western Blot (WB)

Nguyên tắc: là một kỹ thuật theo nguyên lý ELISA gián tiếp thực hiệntrên băng giấy, cho phép xác định KT kháng các thành phần khác nhau củaprotein virus Có WB riêng cho HIV-1 và HIV-2

HIV được ly giải và điện di trên gel polyacrilamide để phân tách cácthành phần KN virus theo trọng lượng phân tử, sau đó được chuyển lên màngnitrocellulose hoặc PVDF (Polyvinylidene Difluoride) và được cắt thành từng

dải băng để sử dụng Mỗi dải băng dùng cho một mẫu thử nghiệm Ủ huyếtthanh của mẫu thử với băng giấy Nếu trong mẫu thử có KT kháng HIV thìchúng sẽ gắn đặc hiệu lên các protein là KN tương ứng và được phát hiệnbằng cộng hợp là KT kháng Ig người đã được đánh dấu bằng enzyme chomàu phản ứng với cơ chất Vị trí các băng màu tương ứng với thành phầnprotein virus gắn với KN đặc hiệu.

Giá trị: Xét nghiệm khẳng định WB có độ nhạy và độ đặc hiệu cao,được thực hiện trong trường hợp các kết quả xét nghiệm phát hiện sàng lọckhông phù hợp và khó biện luận

3 Các phương pháp giải trình tự DNA

Giải trình tự gen là quá trình xác định trật tự của các nucleotid(adenine, guanine, cytosine, thymine) trên phân tử DNA

Hiện nay, trong lĩnh vực sinh học nói chung và sinh học phân tử nóiriêng thì việc giải trình tự nucleotide của một đoạn gen hay của cả bộ gen củamột loài sinh vật là một kỹ thuật hết sức quan trọng Sự xuất hiện của cácphương pháp giải trình tự gen đã đã đánh dấu bước ngoặt lớn, mang lại mộtcuộc cách mạng trong nghiên cứu y sinh học cơ bản và trong nhiều lĩnh vựcứng dụng như công nghệ sinh học, chẩn đoán, sinh học pháp y

3.1 Giải trình tự DNA bằng phương pháp hóa học

Năm 1977, Maxam và Gilbert đã phát minh ra phương phương pháphóa học giải trình tự DNA Phương pháp này gồm các bước như sau [MaxamA., Gilbert W., 1997]:

(1): Đánh dấu một đầu của đoạn DNA cần phải giải trình tự bằng mộtgốc phospho đồng vị phóng xạ, thường đánh dấu tại đầu 5' bằng 32P

(2): Xử lý các đoạn DNA đã đánh dấu bằng chất hóa học có thể gâybiến đổi đặc hiệu một hoặc hai loại base của nucleotid trên đoạn DNA để Ví

dụ, dimethylsulphate để biến đổi Guanine bằng cách thêm một gốc methyl ở

vị trí nitrogen thứ 7, hydrazine làm biến đổi Thyamine và Cytosine, hydrazine

và NaCl gây biến đổi Adenine và Cytosine, acid làm biến đổi Guanine vàAdenine, NaOH làm biến đổi Adenine và Cytosine nhưng ưu tiên biến đổiAdenine hơn Cytosine Như vậy, trong giai đoạn này phải cần ít nhất 4 ốngnghiệm và mỗi ống nghiệm có một lượng DNA nhất định được xử lý bằngmột trong các chất hóa học nêu trên do đó mỗi ống nghiệm chỉ chứa các đoạnDNA có một vị trí nucleotid đặc hiệu đã bị biến đổi với chất hóa học

Hình 4: Đánh dấu phóng xạ và biến đổi các nucleotid bằng hóa chất.

(3): Các nucleotide bị biến đổi sẽ được lấy ra khỏi khung mạch Phosphate của đoạn DNA và do đó, đoạn DNA ban đầu sẽ được tách ra thànhcác đoạn mạch đơn đã được đánh dấu 32P và một đầu base nitơ bị lấy ra khỏimạch khung Các mạch đơn này có độ dài khác nhau tùy thuộc vào vị trí basenitơ bị lấy ra khỏi mạch khung

Hình 6: Xác định trình tự DNA từ các vạch trên xạ ký tự

Phương pháp hóa học xác định trình tự DNA của Maxam và Gilbert rấtkhó thực hiện vì cần phải xác định nhiều thông số tối ưu cho thí nghiệm,trong đó khó nhất là việc xác định nồng độ giới hạn các chất hóa học sao chokhi xử lý mẫu DNA trên mỗi đoạn DNA chỉ có một base bị biến đổi để ứngvới mỗi vị trí của base biến đổi sẽ có một mạch đơn đã được đánh dấu mộtđầu 32P được tách ra Chính vì sự phức tạp này nên phương pháp Maxam-Gilbert hiện nay ít được sử dụng mà thay vào đó là những phương phápenzyme xác định trình tự DNA với nhiều ưu điểm vượt trội hơn

3.2 Phương pháp enzyme giải trình tự DNA: Phương pháp Sanger (Dideoxynucleotid chain termination)

Phương pháp Dideoxynucleotid chain termination hay còn gọi là

phương pháp gián đoạn chuỗi (chain-determination method) là một phương

phápxác định trình tự DNA được Frederick Sanger phát triển vào năm 1977

Kĩ thuật này dùng phân tách trình tự cụ thể (sequence-specific termination) của một phản ứng tổng hợp DNA trong ống nghiệm (in vitro) dùng chất nền

nucleotide đã được chỉnh sửa

Nguyên tắc cơ bản của phương pháp Dideoxy dựa vào hoạt động củaenzymeDNA polymerasetrong quá trình tổng hợp DNA Enzyme DNA