phân loại các chủng nấm candida spp gây bệnh niêm mạc lưỡi miệng và đường sinh dục bằng quy trình cải tiến

Nhưng sau 10 năm người ta thấy C.albicans chiếm 53,2% còn C.glabrata chiếm tới 27,1%, C.krusei chiếm 1,4% [51] Ngoài ra, Candida có thể xâm nhập vào thần kinh trung ương, mọi bộ phận của

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nhiễm nấm là một trong những bệnh khá phổ biến trên thế giới Nấmtồn tại ở khắp mọi nơi: môi trường đất, nước, không khí, ở thực vật, độngvật và trên cả cơ thể người Khi gặp điều kiện thuận lợi như nóng ẩm, sangchấn, sức đề kháng suy giảm…nấm sẽ phát triển và gây bệnh Bệnh do nấmgây ra gặp nhiều ở các nước nhiệt đới và ôn đới Bệnh có thể gặp ở ngườilớn và trẻ em [29]

Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa có nhiệt độ và độ ẩm cao

là điều kiện thuận lợi cho vi nấm phát triển và dễ dàng gây nhiễm nấm ởngười Những năm gần đây, tỷ lệ nhiễm nấm thông thường do ý thức kém vàđiều kiện vệ sinh thiếu thốn đã giảm nhiều Tuy nhiên, do sự xuất hiện đạidịch HIV/AIDS cùng với việc ứng dụng những thành tựu mới của y học hiệnđại như: Ghép tạng, dùng thuốc ức chế miễn dịch, hoá trị, xạ trị điều trị ungthư, sử dụng kháng sinh hoạt phổ rộng, corticoid kéo dài, các bệnh rối loạn

chuyển hoá Thực tế nghiên cứu cho thấy tỷ lệ nhiễm Candida sp ở các bệnh

nhân suy giảm miễn dịch chiếm tỷ lệ khá cao Bên cạnh đó, dần xuất hiện tìnhtrạng kháng thuốc kháng nấm ở các bệnh nhân này đang ngày một gia tăng[1], [2], [3]

Tại bệnh viện Da liễu TW số bệnh nhân đến khám và làm xét nghiệm

tìm nấm rất đông và đa dạng Trong đó, tỷ lệ Candida sp gây bệnh niêm mạc

sinh dục và lưỡi miệng chiếm tỷ lệ cao nhất Bệnh biểu hiện các triệu chứnglâm sàng ở vùng bị bệnh thường không đặc hiệu như: Ngứa, đau rát, viêm trợtniêm mạc, tiết dịch, chảy máu…Bệnh gây nhiều phiền toái ảnh hưởng đếnchất lượng cuộc sống của bệnh nhân, đặc biệt nếu không điều trị đúng và kịpthời sẽ diễn biến dai dẳng, tiến triển nặng nề Tuỳ thuộc vào bệnh cảnh lâm

sàng từng vị trí mà gây nhiều biến chứng ảnh hưởng đến các cơ quan phủ tạngthậm chí gây vô sinh hoặc tử vong.

Thất bại điều trị do nhiều nguyên nhân liên quan đến các yếu tố như: yếu

tố vật chủ, yếu tố thuốc và vi nấm gây bệnh Trong đó, yếu liên quan đến vật chủ thường là yếu tố quan trọng nhất đưa đến hiện tượng đề kháng [26]

Trước thực trạng người bệnh chưa có thói quen đến khám và tư vấn tại các cơ

sở y tế chuyên khoa có uy tín mà thông thường tự ý mua và sử dụng thuốctheo kiểu “đa năng”, phần nào tạo thuận lợi cho bệnh nhân trong điều trị Bêncạnh đó, với thói quen của chính cán bộ y tế không chuyên khoa thường điềutrị theo kiểu “bao vây” Mặt khác, cách thức điều trị ngắn hạn, liều duy nhấtgóp phần gia tăng tình trạng kháng thuốc nếu điều trị không đúng nguyênnhân hoặc không đủ liều Đặc biệt đối với những trường hợp nhiễm nấm

Candida sp có biến chứng hoặc tái phát, được khuyến cáo là không sử dụng.

Thực trạng trên cho thấy nếu thiếu điều kiện xét nghiệm có thể gặp khó khăntrong việc tìm nguyên nhân để chẩn đoán và điều trị bệnh một cách hiệu quả[27] Gần đây, tại phòng nấm bệnh viện Da liễu TW đã tự tìm tòi, nghiên cứu

và cập nhật kiến thức từ các chuyên gia hàng đầu nấm học đến từ CDC Đồngthời, dựa trên kinh nghiệm kế thừa từ lớp người đi trước Phòng xét nghiệm

nấm tiến hành cải tiến quy trình định loại nấm Candida sp Nhằm nâng cao

chất lượng xét nghiệm, rút ngắn thời gian, tiết kiệm kinh tế đồng thời đơngiản dễ thực hiện và có thể triển khai thực hiện kỹ thuật tại các tuyến y tế cơ

sở Bên cạnh đó, cập nhật một số kỹ thuật nhằm xác định độ nhạy cảm các

chủng Candida sp với một số kháng sinh hiện hành và kháng sinh kháng nấm

mới Từ đó, giúp các thầy thuốc lâm sàng lựa chọn kháng sinh kháng nấmthích hợp để điều trị cho người bệnh mang lại hiệu quả cao Đồng thời, qua đókhảo sát mức độ kháng thuốc nhằm giảm nguy cơ thất bại điều trị nấm

Candida sp

Đó là lý do khiến chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này với mục tiêu:

1 Xác định tỷ lệ nhiễm nấm Candida spp niêm mạc lưỡi, miệng và đường sinh dục Tìm hiểu một số yếu tố liên quan tạo cơ hội cho nấm gây bệnh.

2 Phân loại các chủng nấm Candida spp gây bệnh niêm mạc lưỡi miệng

và đường sinh dục bằng quy trình cải tiến Và xác định độ nhaỵ cảm chủng nấm Candida spp với một số kháng sinh kháng nấm bằng phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuyếch tán trên thạch.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vài nét lịch sử

Bệnh được viết trong y văn từ thời Hypocrate và Galen dưới những têngọi khác nhau như: Monilia, Candida…Năm 1792, Frank mô tả lâm sàng cănbệnh này Năm 1894, Wilkinson xác định các triệu chứng lâm sàng của bệnhliên quan với căn nguyên do nấm Đến 1923 Berkhout mô tả rất chi tiết nấmnày dưới tên thống nhất Candida [27]

1.2 Đặc điểm nấm Candida (Yeast - Levure) [49, 25, 26]

- Candida thuộc chi nấm men, họ Cryptococcaceae

- Tồn tại trạng thái đơn bào, có nhân chuẩn

- Hình dạng: hình tròn hoặc hình bầu dục, đôi khi gặp dạng sợi hoặc vôđịnh hình

- Kích thước dao động từ 3 – 10 mm, thông thường lớn hơn gấp 10 lần sovới vi khuẩn

- Sinh sản vô tính theo phương thức nảy chồi Khi bào tử chồi được sinh

ra theo dạng tuyến tính không phân cắt thì hình thành nên cấu trúc gọi là giảsợi nấm

- Khả năng thích nghi môi trường đường cao

- Tồn tại trong thiên nhiên, trong các môi trường chứa đường như hoaquả, rau dưa, mật mía…

1.3 Tính chất gây bệnh

- Candida thuộc vi hệ tuy nhiên có thể bền vững hoặc thoáng qua Bìnhthường có thể tìm thấy Candida ký sinh ở trên da, trong họng miệng, đườngtiêu hoá, âm đạo… mà không gây bệnh, chúng sống cộng sinh và cân bằngtrong vi hệ bình thường [39]

- Candida thực sự gây bệnh cho người khi cơ thể suy giảm miễn dịch và

có yếu tố thuận lợi Có hơn 300 loài Candida sp gây bệnh, trong đó loài C.albicans hay gặp nhất [25] Ngoài ra, có thể gặp C.glabrata, C.tropicalis, C.krusei, C.parasillosis , mỗi loài Candida khác nhau có độc tính khác nhau

nên khả năng gây bệnh và độ nhạy cảm kháng sinh chống nấm cũng khácnhau [5]

- Candida có thể gây bệnh ở nhiều cơ quan, tổ chức: Ở nông trên da,

niêm mạc miệng lưỡi, niêm mạc sinh dục nam nữ và cũng có thể xâm nhậpsâu gây bệnh ở: Phổi, tim, máu, não… có thể gây tử vong Sự phát triển củachúng chịu sự kiềm chế của các vi khuẩn sống trong vi hệ Chúng trở nên gâybệnh khi có điều kiện thuận lợi; sức đề kháng suy giảm và mất cân bằng trong

vi hệ [9], [38], [80]

- Điều kiện thuận lợi:[7], [25]

+ Yếu tố bên trong:

Yếu tố sinh lý: Tình trạng tăng cân, thừa cân, béo phì, đang có thai, chu

kỳ kinh nguyệt, pH âm đạo thay đổi

Bệnh lý: đái tháo đường, bệnh lý gây suy giảm miễn dịch như: ung thư,

bệnh tự miễn, đặc biệt HIV/AIDS

Do dùng thuốc: kháng sinh, corticoid kéo dài, thuốc tránh thai, xạ trị,

hoá trị liệu trong ung thư…

+ Yếu tố bên ngoài:

Loét do bỏng

Người già răng rụng hết

Răng giả, khớp thái dương hàm không khớp, hai mép xệ, nước bọt tụ lại

nhiều làm môi trường luôn ẩm ướt tạo điều kiện cho nấm phát triển

Người thường xuyên ngâm tay trong nước như nội trợ, thợ giặt là, công

nhân chế biến hoa quả, bánh kẹo, sản xuất bia…

* Cơ chế gây bệnh

Các loài Candida tồn tại được trong môi trường niêm mạc, đầu tiên

chúng phải bám dính được vào tế bào biểu mô niêm mạc Sau đó, xâm nhập

vào tế bào biểu mô nhờ men phân huỷ protein đặc hiệu do Candida tiết ra Đối với C.albicans có khả năng bám dính và xâm nhập vào tế bào biểu niêm mạc cao hơn các loài Candida khác Điều này đã lý giải vì sao nhiễm Candida niêm mạc chủ yếu do loài C.albicans gây ra.(8)(28)

1.4 Các bệnh gây ra do Candida

1.4.1 Nhiễm Candida ở da, móng

Bệnh thường gặp ở các nếp kẽ, vùng da ẩm ướt: Kẽ bẹn, kẽ cổ, nách,nếp lằn mông thường gặp ở những người béo phì, bệnh nhân đái tháo đường.Thương tổn đỏ tươi, bề mặt có nhiều vẩy nhỏ, mụn nước rìa thương tổn vàxuất hiện những thương tổn vệ tinh

Viêm quanh móng do Candida, theo Lâm Văn Cấp (2001) chiếm tỷ lệ3,7% tổng số bệnh nhân xét nghiệm nấm Trong đó, có 70,1% do nhiễm nấm

C albicans Bệnh biểu hiện viêm móng và quanh móng: Sưng, đau mưng mủ

rãnh móng hoặc móng dày sừng đôi khi teo nhỏ Bệnh gặp nhiều vào mùa hè

và thường ở người phải tiếp xúc với nước, chế biến hoa quả, làm đậu, làmbún, nội trợ…[8]

1.4.2 Nhiễm Candida ở da đầu

Thường ít gặp, trên da đầu có những đám chân tóc bị viêm hoá mủ,

trong đó tìm thấy nấm Candida và tụ cầu Tóc rụng không mọc lại, không tìm

thấy sợi và bào tử nấm trong sợi tóc [10]

1.4.3 Nhiễm Candida niêm mạc miệng

Người ta thấy có khoảng 30-50% người khoẻ mạnh bị nhiễm nấm

Candida niêm mạc miệng, lưỡi Hay gặp hơn ở trẻ sơ sinh do bị lây nhiễm

trong quá trình chuyển dạ bởi người mẹ nhiễm nấm âm đạo không điều trị kịp

thời Hoặc trẻ bú mẹ cũng hay bị nhiễm nấm Candida miệng (Tưa lưỡi) Bệnh

hay gặp ở người già, thường liên quan đến hệ miễn dịch bi suy giảm nặng domột số bệnh lý: tiểu đường, ung thư, bệnh bạch cầu cấp…

Đặc biệt nhiễm nấm miệng lưỡi ở người trẻ tuổi có thể là dấu hiệu chỉđiểm quan trọng và phổ biến nhất của bệnh nhân HIV/AIDS, chiếm 50% ởbệnh nhân nhiễm HIV và 80-90% ở bệnh nhân AIDS Trong đó, có 60% táiphát sau 3 tháng điều trị [30], [31]

1.4.4 Nhiễm nấm Candida niêm mạc đường sinh dục:

- Đường lây:

+ Qua đường tình dục

+ Do vô trùng không tốt: làm thủ thuật sản khoa,…

+ Từ môi trường sống: nước ao hồ, mặc chung đồ lót, kém vệ sinh, môitrường âm đạo ẩm ướt Bệnh rất thường găp ở phụ nữ và theo Scrip (1997)nhận thấy hầu hết phụ nữ đều có ít nhất một lần trong đời biểu hiện lâm sàng

viêm âm đạo (VÂĐ) do nấm Candida và khoảng một nửa trong số họ tái phát hàng năm Ngoài ra, khoảng 1/3 trường hợp viêm âm đạo hoàn toàn không có

triệu chứng, thường được phát hiện qua việc khám kiểm tra định kỳ và xétnghiệm cận lâm sàng [36]

- Đối với những trường hợp viêm quy đầu, viêm niệu đạo do nấm ở namgiới gặp chủ yếu ở bệnh nhân bị tiểu đường hoặc vợ (bạn tình) bị viêm âmhộ(AH), âm đạo (AĐ) do nấm Tuy nhiên, đây không phải bệnh lây truyềnqua đường tình dục nên không cần phải điều trị bạn tình, nhưng cần xem xétlại trong trường hợp bệnh tái phát

Bình thường trong cơ thể người, nấm sống cộng sinh trong âm đạo màkhông có biểu hiện lâm sàng Chúng chịu sự kiểm soát các vi sinh vật sốngtrong vi hệ và hệ thống miễn dịch cơ thể, nhằm cân băng môi trường âm đạo.Khi yếu tố nào đó bị phá vỡ dẫn đến mất cân bằng vi hệ nấm có cơ hội phát

triển mạnh và trở thành tác nhân gây bệnh Cũng có giả thiết khác cho rằng sựthiếu hụt kháng thể IgG kéo dài gây nhiễm nấm trầm trọng [34], [33]

Năm 2000 Lisiak M nghiên và cộng sự nghiên cứu 416 chủng nấm trênbệnh nhân biểu hiện viêm âm hộ âm đạo do nấm:

C.albicans chiếm đa số 81,97%, tiếp theo C.glabrata 11,06%, C.kruseichiếm 2,16%, C.tropicalis 1,2%, C.guillermondii chiểm 1,3% Còn không xácđịnh loài là 2,4% [33]

1.4.5 Nhiễm nấm Candida phủ tạng

+ Nhiễm nấm Candida ở ống tiêu hoá

Nấm gây bệnh ở thực quản là một trong những biểu hiện ban đầu bệnhnhân HIV/AIDS Khoảng 10% bệnh nhân AIDS bị các suy giảm miễn dịch

khác có nhiễm kèm Candida thực quản Biểu hiện triệu chứng thường là khó nuốt, sút cân, hội chứng suy mòn có thể tử vong Nhiễm nấm Candida đường

ruột gây tiêu chảy kéo dài

+ Nhiễm nấm Candida hô hấp.

Nấm Candida có thể gây viêm thanh quản, tắc nghẽn khí quản, viêm

phổi hoặc phế quản phổi Chẩn đoán xác định căn cứ sinh thiết nhu mô phổi.Tuy nhiên, cần phải nuôi cấy để phân biệt với Paracoccidiomycose

+ Nhiễm nấm Candida tim.

Có thể viêm màng ngoài tim sau mổ Viêm nội tâm mạc do Candida.

Ngoài ra, những nguời đặt van tim nhân tạo hoặc nghiện heroin là yếu tố

thuận lợi viêm nội tâm mạc do Candida.

+ Nhiễm nấm Candida huyết

Chủ yếu gặp bệnh nhân có bệnh lý ác tính như lympho Hogdkin hoặckhông Hogdkin Người nghiện ma tuý, bị bỏng rộng là yếu tố thuận lợi cho

nhiễm Candida huyết Bệnh cảnh lâm sàng diễn biến nặng nề, nguy kịch.

Bệnh nhân có thể tử vong rất nhanh (52)

Vào những năm 1988-1990, một bệnh viện Pháp cho biết tỷ lệ nhiễm

Candida spp huyết trong bệnh cảnh lâm sàng chủ yếu do C.albicans chiếm 80,3%, C.glabrata 0,1%, C.krusei chiếm 0% Nhưng sau 10 năm người ta thấy C.albicans chiếm 53,2% còn C.glabrata chiếm tới 27,1%, C.krusei

chiếm 1,4% [51]

Ngoài ra, Candida có thể xâm nhập vào thần kinh trung ương, mọi bộ

phận của mắt như nhãn cầu, kết mạc, gây mù loài vĩnh viễn (5)

Thông thường các bệnh nhiễm vi nấm nhiều khi tiến triển âm thầm hoặc

có thể chẩn đoán nhầm bệnh lý khác bởi các triệu chứng lâm sàng không điểnhình nên nếu thiếu điều kiện xét nghiệm việc định nguyên nhân có thể gặp

khó khăn Ngoài ra, có khoảng 1/3 các trường hợp nhiễm Candida sp niêm

mạc không có triệu chứng, thường phát hiện qua thăm khám sức khoẻ định kỳ

và làm xét nghiệm cận lâm sàng [14]

Tại phòng xét nghiệm vi nấm Bệnh viện Da liễu TW năm 2010 số lượtbệnh nhân đến xét nghiệm nấm khoảng 25.000.000 lượt, trong đó số ca xét

nghiệm dương tính là 11.900.000 Tỷ lệ nhiễm nấm do chủng Candida gây ra

chiếm gần 1/3 Đến năm 2011 số lượng bệnh nhân đã tăng lên gấp đôi

Điều đó cho thấy xét nghiệm tìm nấm có vai trò quan trọng trong việc phục

vụ bệnh nhân cũng như giúp các bác sỹ lâm sàng chẩn đoán và điều trị hiệu quả.Ngày nay mỗi bệnh viện đều xây dựng quy trình định loại nấm riêng phùhợp từng lĩnh vực chuyên ngành Tuy nhiên, các kỹ thuật cũ còn tồn tại một

số hạn chế như: người làm kỹ thuật thụ động, không tích lũy kinh nghiệm.Giá thành kỹ thuật còn cao và đôi khi phức tạp mất thời gian Điều đặc biệt ởđây là quy trình cũ chỉ định loại một hoặc vài loài nấm, trong khi có nhiềuloài nấm và số lượng loài nấm ngày càng tăng cũng như tỷ lệ nhiễm nấm ngày

càng cao Qua từng giai đoạn phát triển kinh tế - xã hội và khoa học kỹ thuật,

những người làm công tác xét nghiệm luôn khắc phục hạn chế bằng cách cải

tiến kỹ thuật xét nghiệm sao cho phù hợp với từng thời kỳ và đặc thù chuyênnghành Da liễu Tại phòng xét nghiệm nấm cùng tập thể khoa xét nghiệm nóiriêng và Ban lãnh đạo bệnh viện nói chung đang từng bước xây dựng một hệthống quản lý chất lượng chung trong phòng thí nghiệm Hệ thống này cầnnhững thành phần thiết yếu như: quản lý thiết bị, quản lý nhân sự và kiểmsoát quá trình thực hiện Mỗi yếu tố trên bao gồm rất nhiều khâu đặc biệt làkhâu kiểm soát chất lượng xét nghiệm thông qua xây dựng quy trình thườngquy chuẩn (SOPS) Nó được coi như là tài liệu hướng dẫn chi tiết giúp ta từngbước thực hiện các thao tác xét nghiệm Đồng thời, đòi hỏi ngắn gọn rõ ràng,

dễ hiểu và cập nhật thường xuyên ít nhất mỗi năm 1 lần Nhằm đảm bảo rằngcác xét nghiệm do phòng thí nghiệm thực hiện đúng và đáng tin cậy

Mục đích kỹ thuật:

- Xây dựng quy trình phân loại nấm men nhằm rút ngắn thời gian, tiếtkiệm kinh tế, ngắn gọn, dễ hiểu, thao tác kỹ thuật dễ thực hiện và chính xác

Từ đó, giúp cho chẩn đoán và điều trị các bệnh lý do nấm Candida gây ra

nhanh và hiệu quả

- Đánh giá hiệu quả quy trình mới bằng cách định danh các chủng chuẩnATCC và có so sánh với một số quy trình khác

- Có thể áp dụng đào tạo và chuyển giao kỹ thuật cho các tuyến y tế cơ sởTrên thực tế đa số các phòng xét nghiệm chỉ làm xét nghiệm trực tiếptìm nấm, trong đó có một số ít tiến hành nuôi cấy nhưng không định loại nấm

Candida sp Trong khi đó có rất nhiều loài nấm Candida; Lodder và

Kreger-van-Rij (1952) phân loại 164 loài nấm men Năm 1984 Kreger-Kreger-van-Rij 196loài Thế giới đã sử dụng nhiều kỹ thuật trong định loại nấm men, tính đếnnay phân lập hơn 300 loài nấm Candida. [25] Nhiều tác giả đã chứng minh

rằng mỗi loài nấm Candida có độc lực khác nhau nên khả năng gây bệnh và

độ nhạy cảm với kháng sinh chống nấm rất khác nhau [28]

Sobel JD (2002) chỉ ra rằng: Có khoảng 80-90% các chủng phân lập

được trong âm đạo là C.albicans Còn C.glabrata chiếm tỷ lệ ít hơn nhiều

(Torulopsis glabrata) nhưng về mặt lâm sàng gây bệnh gần giống như

C.albicans nhưng C.glabrata thường đề kháng với điều trị [32]

Trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu nhằm đánh giá sự nhạy cảm

các chủng nấm Candida sp với kháng sinh chống nấm như:

- Kỹ thuật E – Test (AB Biodisk), CLSI/ M 38-A2 Các kỹ thuật đó cógiá thành cao và phức tạp, không áp dụng trên phạm vi rộng

- Kỹ thuật so màu (Colorimetrix Panel): Fungifast, ATB FungusFungitest (Bio-rad) Nhược điểm: Có ít loại thuốc chống nấm và chỉ có hainồng độ Rất hạn chế trong việc phát hiện kháng thuốc (R: Resitants) [26]

- Tại bệnh viện Da liễu TW có đề tài nghiên cứu Đỗ Thị Hằng (2003)nhưng chỉ là bước đầu đánh giá độ nhạy cảm của chủng nấm với các khángsinh hiện hành bằng kỹ thuật Fungitest Tuy nhiên, theo nhiều nghiên cứukhác trên thế giới cho thấy kỹ thuật này nhiều hạn chế

Xây dựng quy trình chuẩn nhằm xác định loài nấm Candida gây bệnh là

bước đầu tiên quan trọng trong việc xác định độ nhạy cảm chủng nấm với cáckháng sinh chống nấm Từ đó, giúp các thầy thuốc lâm sàng chẩn đoán chínhxác căn nguyên gây bệnh và tìm được kháng sinh phù hợp để điều trị hiệuquả Đồng thời, giúp người bệnh tiết kiện chi phí và dùng thuốc an toàn

Vì vậy, chúng tôi tiến hành phân loại nấm Candida sp bằng kỹ thuật cải tiến và đánh giá độ nhạy cảm các chủng Candida sp bằng cách áp dụng kỹ

thuật khuyếch tán trên thạch thông qua các khoanh giấy kháng sinh chốngnấm Trong đó có sử dụng một số kháng sịnh chống nấm hiện hành và khángsịnh chống nấm mới đang được các nhà y học trên thế giới ưa dùng

Lịch sử các thuốc kháng nấm

Khoảng 40 năm về trước người ta thây có 5 thuốc chống nấm ra đời.Nhưng khoảng 10 năm trở lại đây( từ năm 2000 đến nay) đã có hơn 8 thuốcmới ra đời Điều đó chứng tỏ vi nấm gây bệnh đang là được chú ý bởi ngàynay nó là một trong những căn nguyên gây bệnh quan trọng và ngày càng giatăng, đặc biệt là có thể gây tử vong [26]

Tại Mỹ, năm 1980 tỷ lệ tử vong gây ra bởi các bệnh do vi nấm đứnghàng thứ 10 trong các nguyên nhân của nhóm bệnh nhiễm trùng nói chung.Đến năm 1997, tỷ lệ này tăng gấp 3-4 lần và đã vượt lên đứng hàng thứ 7 [37]Thất bại điều trị do nhiều nguyên nhân liên quan đến các yếu tố như: yếu

tố vật chủ, yếu tố thuốc và vi nấm gây bệnh Vậy khi nào chúng ta cần pháthiện hiện tượng đề kháng hay làm thử nghiệm xác định độ nhạy cảm vớithuốc kháng nấm Có một số khuyến cáo sau đây:

- Nhiễm Candida bề mặt

+ Chỉ những trường hợp thất bại về lâm sàng, không nên sử dụng cho bắtđầu điều trị

- Nhiễm Candida spp và Trichosporon spp xâm nhập

+ Nên làm kháng sinh đồ khi bắt đầu điều trị và khi xuất hiện dấu hiệu của thất bại điều trị

- Nhiễm Cryptococcus

+ Chỉ khi thấy thất bại điều trị

- Với Amphotericin-B chỉ nên làm khi có vấn đề về điều trị

+ Các trường hợp khác nên thảo luận với các bác sỹ phòng xét nghiệm [26]

Sơ đồ 1: Sự ra đời thuốc kháng nấm

Sơ đồ 2: Cơ chế thuốc kháng nấm dùng trong thử nghiệm

Tình hình nhiễm Candida đường sinh dục

Thế giới

- Ở Mỹ, dữ liệu từ năm 1979-1981 cho thấy; nấm sinh dục là cănnguyên thứ hai gây nhiễm trùng âm đạo theo sau bệnh viêm âm đạo do vikhuẩn (BV) Năm 1990 có khoảng 1,3 triệu phụ nữ Mỹ bị nhiễm nấm sinhdục được công bố trong y văn, nhiễm trùng âm đạo do nấm Candida không

được coi là một bệnh lây truyền qua đường tình dục, nhưng có 12-15% namgiới bị lây nhiễm sau khi quan hệ với những người phụ nữ đó.(http…

- Iavazzo C., Vogiatzi C., Falagas M.E(2008): Nghiên cứu cho thấy tỷ lệ

nhiễm nấm âm đạo Candida sp khoảng 42,5%

- Victo Silva(2011): Tỷ lệ nhiễm Candida sp sinh dục là 5-30%

- Theo Klein Catherine (2002) thì có khoảng 70-75% phụ nữ nhiễmnấm sinh dục ít nhất 1 lần trong đời Trong số đó có 40-50% trường hợp táiphát [50]

- Klein Cathesine cho rằng vấn đề không chỉ chẩn đoán và điều trị viêm

âm đạo do nấm Candida sp mà càn thiết phải xem xét tình trạng tái phát [50]

- Sobel J.D(2002) trường đại học y khoa Mỹ: Viêm âm đạo do

C.albicans đáp ứng tốt với các thuốc kháng nấm thông thường Còn C.glabrata tỷ lệ thất bại tương đối cao [32]

- Magaldi S và cộng sự; phân lập 137 chủng Candida thấy: 45%

C.albicans kháng chéo với Intraconazole và 10% kháng Fluconazol Còn 30% C.tropicalis kháng với Intraconazole hoặc Fluconazol [57]

- Các nhà khoa học thuộc trường ĐH Leeds nghiên cứu rằng: Khi BNnhiễm nấm âm đạo đã điều trị đúng và đủ liều bằng thuốc kháng nấm nhưng

do vẫn còn một số độc tố nấm và những bào tử nấm chưa bị tiêu diệt hết.Chúng vẫn có khả năng kích thích âm đạo đồng thời kết hợp với một trongcác yếu tố thuận lợi làm bệnh lại tái diễn [12]

- Đàm Thị Hoà tại Viện Da liễu ( 1996-1998): Tỷ lệ Candida ânm đạo

- Một nghiên cứu khác ở 80 phụ nữ đến khám thai, phát hiện 14 người

có triệu chứng nhiễm nấm Candida âm đạo tái phát Sau khi khảo sát tác giảthấy: Đã tồn tại dai dẳng một kiểu gen của nấm Candida Kiểu gen này đã thayđổi về hình thái và tính chất ngay trong môi trường có thuốc chống nấm [35]

- Trần Thị Lợi (2008): Nghiên cứu ở phụ nữ đến khám phụ khoa TPCần Thơ: Tỷ lệ viêm âm đạo do 3 tác nhân là 34%, trong đó căn nguyên donấm Candida sp chiếm 10% [16]

- Một số nghiên cứu cho thấy khoảng 20-55% phụ nữ khoẻ mạnhnhiễm nấm sinh dục không có triệu chứng Trong số những người có triệuchứng tiết dịch âm đạo được phân lập chẩn đoán xác định nấm chiếm 29,8%

- Theo Nguyễn Bích Ngọc: Trong các bệnh viêm nhiễm đường sinh dục

Candida sp có tỷ lệ tái phát cao nhất [28] Hàng

- Đỗ Thị Hằng (2003): Chủng C.albicans hay gặp nhất(61,8%) và tỷ lệ nhạy cảm ITR và KET là 76,8% Còn C.glabrata (23,6%) nhạy cảm KET

53,8% và ITR chỉ là 23,6% (4)

- Nguyễn Thị Xiêm và Cộng sự ( 1975-1978) tình hình nhiễm nấm ở

VN trong những thập niên 70, 80 không thay đổi đáng kể, mặc dù có một sốthuốc điều trị mới [22]

- Nhiều nghiên cứu dich tễ học: Candida là nguyên nhân chính HCTDĐSD

và ngày càng gia tăng, nhiều bệnh nhân tái nhiễm (4-5 đợt/ năm) [33]

- Một nghiên cứu về mối liên quan giữa yếu tố tâm lý và những phụ nữhay bị nấm Candida sinh dục tái phát mạn tính, tác giả nhận thấy: Nhữngngười này thường xuyên trong trạng thái dễ bị trầm cảm, lo âu [51] H

Tình hình nhiễm Candida sp lưỡi miệng

- Shadzi S and Chadeganipour M (1996): Candida albicans là vi nấm

chủ yếu gây bệnh tại vùng lưỡi miệng bệnh nhân HIV/AIDS, chiếm tỷ lệ75% [46]

- Victo Silva(2011): Tỷ lệ nhiễm Candida sp lưỡi miệng trong cộngđồng khoảng 30-50% Trong đó, đáng lưu ý là hiện tượng đề kháng vớiFluconazol của C abicans 4-6%, còn C.krusei chiếm tỷ lệ rất cao 90% [26]

- Espinel (2000) và Sobel J.D(2001): Biểu hiện đa đề kháng vớiFluconazol + Clotrimazol + Ketoconazol, hiện tượng này chủ yếu gặp 2chủng nấm là C.glabrata và C.krusei [47],[15], [32]

- Cartledge J D., Midgley J and Gazzard B G (1996): Riêng chủng

Candida sp ở miệng thường được điều trị bằng nystatin (amphotericine B

dạng uống), có độ nhạy cảm 100% với loại thuốc này [17]

- Theo tác giả Trần Phú Mạnh Siêu (2005), tác nhân gây bệnh nấm

miệng họng chủ yếu là Candida albicans: năm 2004 là 57/73 ca (78,2%), năm

albicans và Candida sp khác gây bệnh vùng miệng lưỡi nhạy cảm gần như

100% với các thuốc kháng nấm thông thường như Ketoconazole,Clotrimazole, Amphotericine B [3]

1.5 Biểu hiện lâm sàng nhiễm nấm Candida niêm mạc [1, 42]

1.5.1 Triệu chứng cơ năng: thường không điển hình

- Ngứa

- Đau rát

- Đỏ da, phù nề niêm mạc

- Riêng đối với nhiễm nấm đường sinh dục (ĐSD)

+ Khí hư màu trắng váng sữa, mùi hôi, bột dính

+ Tiểu tiện buốt

+ Đau khi giao hợp

+ pH âm đạo thay đổi

1.5.2 Triệu chứng thực thể

* Viêm niêm mạc miệng:

- Trẻ em: Thường gặp ở những trẻ sơ sinh đẻ non, suy dinh dưỡng, cóthể trẻ bị lây từ sản phụ bị nhiễm nấm đường sinh dục truyền sang con trongquá trình chuyển dạ đẻ Biểu hiện lâm sàng vùng niêm mạc má, lưỡi, lợi, hầu

họng xuất hiện mảng tưa màu trắng trông giống váng sữa chua, dễ bong để lạinền trầy xước, rướm dịch hoặc máu

- Người lớn: Bệnh ít gặp người khoẻ mạnh, hay gặp người già, liênquan đến suy giảm miễn dịch do tiểu đường, bạch cầu cấp, ung thư…, đặcbiệt ở người nhiễm HIV là dấu hiệu chỉ điểm phổ biến nhất của AIDS

Biểu hiện lâm sàng: Lưỡi đỏ, nứt lưỡi, đau rát, lưỡi dày cảm giácngậm bông trong miệng, nhiều rêu lưỡi Ăn mất ngon thậm chí sợ ăn Lưỡi cóthể dày bệu in vết hằn răng, nhưng nhiều khi viêm teo nhỏ và mất gai lưỡi.Rất ít khi thấy giả mạc trắng bám lưỡi Có thể lưỡi trợt đỏ, chảy máu kèmtheo nứt mép, môi trợt, viêm môi bong vẩy…thường liên quan đến bệnh lýtrong miệng hay tật liếm môi

Biến chứng

- Lưỡi tê bì mất vị giác, ngoài ra Candida sp thâm nhiễm họng, thựcquản, dạ dày ruột, gan đôi khi xuất hiện hoại tử chảy máu…thậm chí xâmnhập não, máu biểu hiện bệnh cảnh lâm sàng rất nặng nề trên bệnh nhân suygiảm miễn dịch

- Đặc biệt ở bệnh nhân HIV/AIDS có thể chưa tử vong ngay do “cănbệnh thế kỷ” Nhưng nếu nhiễm nấm cơ hội bệnh nhân sẽ suy kiệt và tử vongrất nhanh nếu không phát hiện và điều trị kịp thời

* Niêm mạc đường sinh dục:

Ở nữ giới:

Viêm âm hộ, âm đạo do Candida

Thực thể: Khám từ ngoài vào trong thấy có những triệu chứng như:

Âm hộ :

Đỏ phù toàn bộ hoặc từng đám, bờ giới hạn rõ,

Môi lớn đỏ, rãnh giữa môi lớn, môi bé phủ dịch tiết trắng đục Làm kỹthuật lau sạch dịch tiết thấy niêm mạc màu đỏ sẫm, bóng, bờ không đều nhamnhở, bên ngoài có một viền vảy đỏ

Âm đạo:Thành – niêm mạc âm đạo: phù nề và có màu đỏ tươi

Có dịch màu kem dính vào thành âm đạo,có khi không thấy rõ do xuấttiết nhiều dịch, có khi lẫn mủ, nhưng triệu chứng thường gặp hơn là dịch âmđạo trắng đục và lổn nhổn như váng sữa Cùng đồ sau dịch thường đọng lạigiống như cặn sữa

Đo pH dịch âm đạo thường dưới 4,5

Mùi dịch bình thường, nghiệm pháp Sniff không có mùi cá ươn

Cổ tử cung

Phù nề, có thể trợt loét, có khi lộ tuyến

Thường thì cổ tử cungphủ một lớp màng trắng như màng giả lấy ra dễ dàng

- Nữ giới: Viêm tử cung, vòi trứng, thậm chí dẫn tới vô sinh thứ phát

- Nam giới: Viêm tuyến tiền liệt, túi tinh, mào tinh hoàn v.v…

- Ảnh hưởng tới chất lượng cuộc sống, đặc biệt trong trường hợp viêmnhiễm do chủng nấm kháng thuốc, bệnh dai dẳng hay tái phát

1.6 Chẩn đoán xác định

1.6.1 Dựa vào dấu hiệu lâm sàng

- Triệu chứng cơ năng

- Triệu chứng thực thể

1.6.2 Cận lâm sàng

- Xét nghiệm soi tươi và nhuộm Gram tìm nấm (Quy trình chuẩn)

- Nuôi cấy và định loại nấm ( Quy trình chuẩn)

- Kháng sinh đồ nấm: Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuyếch tán trên thạch

1.7 Điều trị

- Tại chỗ: Thuốc bôi, thuốc đặt ( Nystatin, Clotrimazol, AB…)

- Toàn thân: thuốc uống (5FC, AB, MZC, KET, ITR, FLU, Voriconazol,Capofungin…

Các thuốc chống nấm:

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNGVÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng

- Bệnh nhân có biểu hiện viêm miệng luỡi, viêm đường sinh dục do

nấm Candida đến khám và điều trị tại phòng khám Bệnh viện Da liễu TW.

Đồng thời, có chỉ định xét nghiệm trực tiếp tìm nấm dương tính, chỉ định nuôicấy phân loại nấm và làm kháng sinh đồ nấm bằng phương pháp khoanh giấykháng sinh khuyếch tán trên thạch

- Bệnh nhân biểu hiện viêm niêm mạc nhưng xét nghiệm nấm âm tính

- Bệnh nhân đang trong thời kỳ kinh nguyệt hoặc ra máu

- Bệnh nhân không hợp tác

Nghiên cứu không vi phạm y đức vì tất cả người bệnh đều được hỏi ýkiến và đồng ý tham gia nghiên cứu, các thủ thuật khám, lấy bệnh phẩm đềukhông xâm hại đến người bệnh Đồng thời, đây cũng là các xét nghiệm thườngquy áp dụng khi khám phụ khoa, các thông tin thu nhận được từ người bệnh đềuđược giữ bí mật, người bệnh khi tham gia nghiên cứu và đến khám trong thời giannghiên cứu (nếu có nhu cầu) sẽ được hướng dẫn các kiến thức đúng về phòng tránhviêm nhiễm do nấm cũng như được thăm khám đầy đủ đúng quy trình

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứư: Nghiên cứu mô tả, tiến cứu

2.2.2 Kỹ thuật thu thập số liệu

Thu thập số liệu theo mẫu bệnh án thống nhất (phụ lục kèm theo)

2.2.3 Mẫu nghiên cứu

Cỡ mẫu cho nghiên cứu tỷ lệ phân bố nấm Candida sp ở niêm mạc

p: tỷ lệ bệnh nhân nhiễm nấm Candida sp niêm mạc xét nghiệm dương tính.

ε: giá trị tương đối (=0,1)

Kết quả tính cỡ mẫu là n=385 bệnh nhân

Cỡ mẫu nghiên cứu đặc điểm chủng nấm Candida sp niêm mạc và xác

định độ nhạy cảm chủng nấm với kháng sinh chống nấm.

n: cỡ mẫu cho nghiên cứu đặc điểm chủng nấm Candida sp niêm mạc

và xác định độ nhạy cảm chủng nấm với kháng sinh chống nấm.

Z1-α/2α/2 : Hệ số tin cậy 95% (=1,96)

p: tỷ lệ độ nhạy cảm của chủng nấm với kháng sinh chống nấm

ε: giá trị tương đối (=0,2)

Kết quả tính cỡ mẫu là n= 97 bệnh nhân

2.2.4 Biến số nghiên cứu

Tuổi, giới, nghề nghiệp của BN nhiễm nấm Candida sp, tỷ lệ các chủng Candida sp phân bố niêm mạc lưỡi miệng và sinh dục, xác định các chủng Candida thường gặp và tình trạng kháng thuốc của các chủng nấm đó.

2.2.5 Quy trình thu thập số liệu

- Đặc điểm đặc phân bố nấm Candida sp ở niêm mạc: Khám theo mẫubệnh án nghiên cứu (Phụ lục)

- Tỷ lệ nhạy cảm: Xét nghiệm trực tiếp, nuôi cấy, phân loại và làm KSĐ

Sơ đồ 3: Quy trình thu thập số liệu

Bệnh nhân viêm da, niêm mạc

2.6 Quy trình phân loại nấm Candida spp có cải tiến

Bệnh phẩm

Xét nghiệm trực tiếp(+)

Sabouraud+Chloramphenicol

24-48h, tº=25-30ºC Khuẩn lạc thuần

Test mầm giá (3h, tº=37ºC)

(1)

Dương tính Âm tính

95% C albicans Non albicans

Bột ngô+Tween 80 (48h, tº=25-30ºC)

(2) Bào tử màng dày+Giả sợi Các hình thái khác (3)

(97%)

CHROM agar Candida

Sơ đồ 4: Cải tiến quy trình phân loại nấm Candida spp

Auxacolor

• Test ống mầm giá đậu

• Thử nghiệm tạo bào tử màng dầy ( môi trường Bột ngô),

• CHROMO agar Candida

- Ống tube thuỷ tinh vô khuẩn

- Que cấy, tăm bông vô khuẩn

- Bàn phụ khoa

- Mỏ vịt (các kích cỡ)

- Pank, bông thấm nước,

- Găng tay, khẩu trang

- Thuốc nhuộm Gram, Nacl 9‰, KOH 20%

- Môi trường Sabouraud +Chloramphenicol+ Actidion

- Huyết thanh thỏ( hoặc người)

- Môi truờng lên men và hấp thu đường

- Môi trường PCB, KIT Auxacolor hãng Bio-rat

2.6.4 Nội dung xét nghiệm

2.6.4.1 Xét nghiệm trực tiếp

* Lấy bệnh phẩm

Mẫu bệnh phẩm tuỳ thuộc vào vị trí thương tổn Thông thường bệnhphẩm xét nghiệm tìm nấm Candida là:

- Lưỡi miệng: Dùng dao cùn lấy giả mạc trắng, và dùng tăm bông ngoáy họng

- Da, móng và rãnh quanh móng: Dùng dao cùn cạo thương tổn da nhẵn,cắt khối sừng mủn dưới móng và cạo rãnh quanh móng

- Bệnh phẩm là máu: phải tiến hành nuôi cấy

- Bệnh phẩm dịch não tuỷ: ly tâm lấy cặn để soi tươi, nhuộm soi, nuôi cấy

- Nếu là dịch âm đạo trong viêm âm hộ - âm đạo nghi do Candida: Mở

+ Lấy cặn để nhuộm Gram hoặc soi tươi trong Nacl 9‰

+ Dầm trong mực tàu, để yên tĩnh 2-3 phút

- Đờm: phết tiêu bản nhuộm Gram

* Nhận định kết quả

- Trên tiêu bản soi tươi: Sử dụng kính hiển vi quang học vật kính 10, 40:+ Bào tử nấm men hình tròn hoặc bầu dục, kích thước 3-6- 10mm Có rấtnhiều tế bào men nẩy chồi, đôi khi thấy hiện tượng giả sợi nấm

- Trên tiêu bản nhuộm Gram: Sử dụng kính hiển vi quang học vật kính dầu 100

Tế bào nấm men có chồi hoặc không, hình tròn hoặc bầu dục, đôi khithấy sợi nấm hoặc giả sợi Bắt màu Gram dương

- Trên tiêu bản mực tầu thấy tế bào men nảy chồi hoặc không có vỏ dày,chiết quang Hình ảnh đó sơ bộ định hướng tới Cryptococcus

2.6.4.2 Nuôi cấy, định loại

- Môi trường: Sabouraud, Chloramphenicol (gentamycine), Actidion

- Bệnh phẩm sau khi lấy vô khuẩn, tiến hành cấy vào môi trường trên theophương pháp ria cấy hoặc cấy điểm Bệnh phẩm sau khi lấy phải cấy ngay

- Ria cấy từ 2-3 ống, t°=25- 30°C hoặc 37°C, thời gian sau 24- 48h

Thử nghiệm tạo ống mầm.( Germ tube test)

Đây là thử nghiệm nhằm chẩn đoán nhanh C.albicans Tuy nhiên, chỉ

mang tính giả định

• Dùng ăng chữ L lấy một lượng khuẩn lạc nhỏ bằng đầu ăng

• Hoà tan hoàn toàn vào ống tube đã nhỏ sẵn huyết thanh

• Đem ủ ở 37°C, thời gian khoảng 3h

• Lấy một giọt dung dịch đó nhỏ lên lam kính sạch, đậy lá kính đem soidưới kính hiển vi quang học

- Nhận định kết quả: Vật kính 10 nhận định sơ bộ, vật kính 40 khẳng định.+ Xuất hiện các bào tử nấm men và sợi nấm ngắn nối với nhau, mọc vềmột phía của bào tử, trông giống như hiện tượng giá đậu lên mầm và thườngxuất hiện với số lượng nhiều

Thử nghiệm này dương tính gặp trong 97% các trừơng hợp làC.albicans

Chú ý:

- Tốt nhất nên dùng huyết thanh ngựa Không nên dùng huyết thanhngười, còn nếu dùng huyết thanh người cần chắc chắn không có kháng thểkháng nấm

- Đọc kết quả trong vòng 3h, không nên để quá lâu hoặc đọc quá sớm.Bởi có thể gây nhầm lẫn khi nhận định kết quả

- Thử nghiệm còn cho kết quả âm tính nếu như chỉ thấy toàn tế bào nấm men

- Bên cạnh đó, thử nghiệm còn cho kết quả dương tính giả khi thấy có sựgiới hạn giữa bào tử nấm men gắn với sợi nấm

- Bảo quản huyết thanh ở 2- 8°C, nếu cất trữ lâu để dùng dần bảo quản

ở -20°C

Kỹ thuật cấy trên lam

Mục đích: Quan sát bào tử màng dày và giả sợi

- Môi trường: Tự chuẩn bị môi trường thạch Bột ngô + Tween 80

- Phương pháp cấy trên lam:

+ Đun cách thuỷ ống môi trường đến khi tan chảy hoàn toàn thành dịch lỏng.+ Đổ thạch lên lam kính d= 2cm, dùng que cấy “L” lấy một lượng khuẩnlạc bằng đầu ăng

+ Cấy thành 1 đường ziczac (6-8 điểm) cách đều nhau giữa miếng thạch + Đậy lá kính vô khuẩn

+ Đặt lam kính vào hộp lồng có sẵn giá đỡ là que thuỷ tinh hình chữ U+ Đặt miếng bông tẩm nước cất vào hộp lồng để tạo độ ẩm

+ Ủ trong tủ ấm t°= 25 - 30°C, đọc kết quả sau thời gian 24h-48h

xơ gấp 4-6 lần gạo, mì

- Nếu nấm men không sinh bào tử màng dày và sợi nấm giả có thể cầnphải làm thêm các thử nghiệm khác.

- Không được tiến hành nuôi cấy trên lam nếu nghi ngờ là chủng nấmlưỡng hình nguy hiểm

Môi trường CHROM agar Candida

- Môi trường đổi màu: Tự chuẩn bị

- Cách tiến hành: Ria cấy phân vùng khuẩn lạc nấm men lên đĩa thạch

- Đọc kết quả sau 2 ngày: Nhận định được ngay các loài Candida bởimỗi loài cho một màu sắc đặc trưng Độ nhạy và độ đặc hiệu cao 95%

Rất hữu ích trong việc phát hiện các chủng nấm đồng nhiễm trên mộtmẫu bệnh phẩm

Lên men đường

+ Auxacolor( Kit Bio-rad): Nhằm đánh giá khả năng sử dụng 13 loạiđường của các chủng nấm men, biểu hiện bằng sự thay đổi màu sắc của chấtchỉ thị pH có trong môi trường thử nghiệm Thử nghiệm dương tính khi màuchuyển từ tím sang vàng, còn âm tính cho màu tím

Ngoài ra, còn phát hiện sự kháng Actidion của nấm men và phát hiện Enzym

phenoloxydase của C.neoformans Thử nghiệm cho phép phát hiện 25

chủng nấm men gây bệnh thường gặp

Một số lưu ý

 Bệnh phẩm sau khi lấy phải cấy ngay

 Test ống mầm mang tính giả định nên có thể dương tính giả

 Bệnh nhân không dùng thuốc kháng nấm trước đó 3 ngày.

* Xác định độ nhạy cảm của chủng nấm với các kháng sinh chống nấm bằng kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuyếch tán trên thạch.

Nguyên lý: Kháng sinh ở trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch

Meuler-hinton có chứa các chủng vi nấm thử nghiệm và mức độ nhạy cảm