THUỐC TRỪ sâu có NGUỒN gốc từ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TIỂU LUẬN HỌC PHẦN CÔNG NGHỆ VI SINH TÊN TIỂU LUẬN: THUỐC TRỪ SÂU CÓ NGUỒN GỐC TỪ VI NẤM Metarhizium anisopliae THÁI NGUYÊN 2014 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ 2 I. MỞ ĐẦU 3 1.1. Đặt vấn đề 3 1.2. Mục tiêu 4 II. NỘI DUNG 5 2.1. Giới thiệu về vi nấm Metarhizium anisopliae 5 2.1.1. Đặc điểm hình thái và phân loại vi nấm Metarhizium anisopliae 5 2.1.2. Cấu tạo và thành phần hóa học của tế bào vi nấm 7 2.1.3. Khả năng sinh độc tố và cơ chế tác động của nấm Metarhizium anisopliae 8 2.1.4. Phổ kí chủ của nấm Metarhizium anisopliae 10 2.2. Quy trình sản xuất thuốc trừ sâu từ vi nấm Metarhizium anisopliae 11 2.2.1. Lựa chọn chủng giống và môi trường để sản xuất 11 2.2.2. Phương pháp sản xuất 12 2.3. Các chế phẩm sinh học từ nấm Metarhizium anisopliae 15 2. 4. Tình hình nghiên cứu và sử dụng vi nấm Metarhizium anisopliae 16 2.4.1. Tình hình nghiên cứu sử dụng Metarhizium trên thế giới 16 2.4.2. Tình hình nghiên cứu sử dụng Metarhizium ở Việt Nam 17 III. KẾT LUẬN 19 TÀI LIỆU THAM KHẢO 20 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Số hiệu Tên hình Trang 2.1 Nấm Metarhizium anisopliae 6 2.2 Côn trùng nhiễm Metarhizium anisopliae 9 2.3 Một số chế phẩm từ Metarhizium được sử dụng ở Việt Nam 15 I. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Sâu bệnh hại cây trồng luôn là mối đe dọa cho nền sản xuất nông nghiệp đặc biệt là ở các nước mà nông nghiệp là nền kinh tế chủ lực thì vấn đề sâu bệnh lại càng trở nên nghiêm trọng và trở thành đối tượng quan tâm hàng đầu trong các nghiên cứu khoa học với mục đích làm sao tìm ra được phương pháp tốt nhất để tiêu diệt sâu hại. Trong nhiều thập kỷ qua, các loại thuốc hóa học diệt trừ sâu bệnh được sử dụng phổ biến và rộng rãi. Các hợp chất này có tác dụng tiêu diệt sâu bệnh nhanh chóng và hiệu quả. Tuy nhiên, cùng với thời gian thuốc trừ sâu hóa học đã lộ ra những nhược điểm không thể khắc phục được như làm cho sâu hại quen dần và trở nên “nhờn thuốc” khi sử dụng thuốc sâu hại không những không chết mà còn sinh sôi và phát tán mạnh hơn, dư lượng thuốc tồn dư nhiễm vào đất gây ô nhiễm môi trường, xáo trộn hệ sinh thái, ảnh hưởng đến sức khỏe con người… 4. Trước thực tế đó, con người buộc phải tìm kiếm một phương pháp khác vừa hiệu quả vừa an toàn cho con người và không ô nhiễm môi trường đồng thời không làm mất cân bằng sinh thái. Trên cơ sở đó, biện pháp phòng trừ bằng sinh học ra đời. Biện pháp này dựa trên khả năng kí sinh của các loài nấm, vi khuẩn, virus và khả năng ăn con mồi của các

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC - TIỂU LUẬN HỌC PHẦN CÔNG NGHỆ VI SINH TÊN TIỂU LUẬN: THUỐC TRỪ SÂU CÓ NGUỒN GỐC TỪ VI NẤM Metarhizium anisopliae THÁI NGUYÊN - 2014 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Số hiệu Tên hình Trang 2.1 Nấm Metarhizium anisopliae 2.2 Côn trùng nhiễm Metarhizium anisopliae 2.3 Một số chế phẩm từ Metarhizium sử dụng Việt Nam 15 I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Sâu bệnh hại trồng mối đe dọa cho sản xuất nông nghiệp đặc biệt nước mà nông nghiệp kinh tế chủ lực vấn đề sâu bệnh lại trở nên nghiêm trọng trở thành đối tượng quan tâm hàng đầu nghiên cứu khoa học với mục đích tìm phương pháp tốt để tiêu diệt sâu hại Trong nhiều thập kỷ qua, loại thuốc hóa học diệt trừ sâu bệnh sử dụng phổ biến rộng rãi Các hợp chất có tác dụng tiêu diệt sâu bệnh nhanh chóng hiệu Tuy nhiên, với thời gian thuốc trừ sâu hóa học lộ nhược điểm khắc phục làm cho sâu hại quen dần trở nên “nhờn thuốc” sử dụng thuốc sâu hại khơng khơng chết mà cịn sinh sôi phát tán mạnh hơn, dư lượng thuốc tồn dư nhiễm vào đất gây ô nhiễm môi trường, xáo trộn hệ sinh thái, ảnh hưởng đến sức khỏe người… [4] Trước thực tế đó, người buộc phải tìm kiếm phương pháp khác vừa hiệu vừa an tồn cho người khơng nhiễm môi trường đồng thời không làm cân sinh thái Trên sở đó, biện pháp phịng trừ sinh học đời Biện pháp dựa khả kí sinh lồi nấm, vi khuẩn, virus khả ăn mồi loài ăn thịt, có nghĩa sử dụng sinh vật sống để diệt trừ côn trùng gây hại Nhờ ưu điểm mình, biện pháp nhà khoa học khắp giới quan tâm hướng ưu tiên hàng đầu cơng tác phịng trừ sâu bệnh [2, 4] Trong số tác nhân phịng trừ sâu bệnh vi nấm thuộc lớp Hyphomycetes, ngành phụ nấm bất toàn Deteromycotina sử dụng rộng rãi có ưu điểm phân bố phổ kí sinh rộng Lồi nấm kí sinh trùng phổ biến lớp Hyphomycetes thường tìm thấy trùng hại trồng nông nghiệp là: Metarhizium, Beauveria, Hirsutella, Nomuraea Paecilomyces Mỗi loài nấm xác định đặc tính bào tử [9, 12, 16] Trong đó, nấm xanh Metarhizium anisopliae nghiên cứu ứng dụng rộng rãi giới Năm 1879, Metchnikoff phân lập loài nấm từ bọ cánh cứng Anisopliae austriaca đề nghị sử dụng loài nấm để phịng trừ loại trùng hại Hollingsworth, Meleisea Iosefa (1988) cho biết nông trường, Metarhizium anisopliae gây bệnh cho khoảng 65% ấu trùng 27% thành trùng Hiện nay, chế phẩm trừ sâu từ vi nấm Metarhizium anisopliae sử dụng rộng rãi để phịng trừ trùng hại nhiều loại trồng [6, 8] Để hiểu rõ vi nấm Metarhizium anisopliae chế kháng sâu bệnh chúng, quy trình sản xuất thuốc trừ sâu từ loại vi nấm này, tiến hành giới thiệu “thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ vi nấm Metarhizium anisopliae” 1.2 Mục tiêu - Giới thiệu vi nấm Metarhizium anisopliae - Giới thiệu quy trình sản xuất thuốc trừ sâu từ vi nấm Metarhizium anisopliae - Tình hình nghiên cứu sử dụng vi nấm Metarhizium anisopliae giới Việt Nam II NỘI DUNG 2.1 Giới thiệu vi nấm Metarhizium anisopliae 2.1.1 Đặc điểm hình thái phân loại vi nấm Metarhizium anisopliae Sợi nấm phát triển bề mặt sâu bệnh có màu từ màu trắng đến màu xanh, cuống sinh bào tử ngắn mọc tỏa tròn đám sợi nấm dày đặc Bào tử trần hình que có kích thước 3,5 x 6,4 x 7,2 µm, màu từ lục xám đến oliu – lục, bào tử xếp thành chuỗi chặt chẽ nhìn mắt thường người ta thấy bào tử tạo bề mặt thể côn trùng lớp phấn rõ màu xanh lục Sợi nấm phát triển bên trùng có chiều rộng khoảng - µm, dài khoảng 20 µm, chia thành nhiều tế bào ngắn, tế bào thấy rõ nhiều giọt mỡ [8] Nấm Metarhizium anisopliae có bào tử dạng hình trụ, hình hạt đậu, khuẩn lạc có màu xanh có màu tối màu hồng vỏ quế, chùng phát triển chậm mơi trường khơng có peptone, thích hợp mơi trường có peptone, cụ thể mơi trường Sabouraud nấm phát triển tốt điều kiện nhiệt độ 250C sau – 10 ngày ni cấy khuẩn lạc có đường kính dài - µm Lồi nấm Metarhizium anisopliae có hai lồi dạng bào tử nhỏ lớn, dạng bào tử nhỏ Metarhizium var anisophliae có kích thước bào tử 3,5 x 5,0 - 2,5 x 4,5 µm, dạng bào tử lớn Metarhizium anisophliae var.major có kích thước bào tử 10,0 – 14,0 µm Để phân biệt loài trên, số nhà khoa học nghiên cứu đặc tính huyết khác loài xác định loài Metarhizium anisopliae chủng gây bệnh mạnh côn trùng thuộc cánh cứng Coleoptera Nhiều nhà khoa học nghiên cứu tìm thấy có khoảng 204 lồi côn trùng thuộc họ Elaridae Curculionidae dễ bị nhiễm bệnh nấm Metarhizium anisopliae [6] Nấm Metarhizium anisopliae loài nấm ký sinh rộng đối tượng gây hại nông lâm nghiệp khắp giới cánh cứng, cánh đều, cánh nửa cứng, cánh vẩy,… Cho đến nhà khoa học giới chưa xác định loại vi nấm có hiệu lực cao phổ tác dụng rộng rãi chủng Metarhizium anisopliae Tại Úc năm 1995, Richard Miller tách vài trăm dòng nấm Metarhizium anisopliae từ nhóm trùng sống đất gốc mía Trong số 95 chủng thử nghiệm trực tiếp, tác giả chọn hai chủng có khả diệt sâu Lepidota frenchi Lepidota consobrina hại rễ mía chủng diệt sâu Antitrogus parvulus với LD50 - x 104 bào tử [18] Henel chọn từ 22 chủng vi nấm, có chủng Metarhizium anisopliae phù hợp cho phương pháp phòng trừ sinh học loài mối Masutiesrmes exitiosus (Hill K L, 1999, trích dẫn Phạm Thị Thùy, 2004) [6] Nhiều lồi nấm chi Metarhizium có khả diệt côn trùng thuộc họ Elalerdae Curculionidae thuộc cánh cứng Coleoptera, ấu trùng muỗi Aedes aegypti, Anopheles setphensi, Clexpipiens thuộc hai cánh Diptera, bọ xít đen hại lúa mì Scotiphora coarctata thuộc cánh nửa cứng Hemiptera, châu chấu sống lưng vàng Patanga sucincta, châu chấu mía Heiroglyphus tonkinensis thuộc cánh thẳng Orthopterra, mối hại đất Masutitermes extiosus thuộc cánh Isoptera… ngồi ra, cịn nhiều loại chế phẩm khác Hình 2.1 Nấm Metarhizium anisopliae 2.1.2 Cấu tạo thành phần hóa học tế bào vi nấm Thành phần cấu tạo tế bào vi nấm gồm có: thành tế bào, chất nguyên sinh, không bào, nhân tế bào thể ẩn nhập Thành phần hóa học tế bào vi nấm thay đổi tùy theo lồi, theo vị trí tế bào sợi nấm so với nấm Các thành phần nguyên tố hóa học tế bào vi nấm quan trọng cacbon (40%), oxy (40%), nito (7 - 8%) hydro (2 - 3%) Hydratcacbon quan trọng tế bào nấm Glycogen Trehalogen Glycogen hydratcacbon dự trữ nấm tương đương với tinh bột thực vật Tỷ lệ hydratcacbon thành phần khác tế bào, thay đổi theo loài vi nấm [1] Sợi nấm, hệ sợi khuẩn lạc: sợi nấm có vách ngăn, tồn sợi nấm nhánh phát triển từ bào tử nấm gọi hệ sợi nấm Sợi nấm phát triển từ ống nảy mầm bào tử mọc ra, sợi nấm tăng trưởng đo theo chu kỳ thời gian Trên môi trường nuôi cấy nhân tạo số chất tự nhiên, hệ sợi vi nấm phát triển thành khối có hình dạng định, thường có tiết diện hình trịn, gần hình cầu gọi khuẩn lạc Một khuẩn lạc phát sinh từ đoạn sợi nấm thông thường từ bào tử Tốc độ tăng trưởng loại vi nấm thường tính đường kính khuẩn lạc Khuẩn lạc vài lồi vi nấm cịn đặc trưng màu sắc sợi nấm Bề mặt khuẩn lạc vi nấm mượt, nhẵn bóng, dạng bột, dạng hạt, dạng sợi dạng xốp Chưa có nhiều dẫn chứng biến đổi sinh lý, sinh hóa bào tử nấm thuộc nhóm phân loại khác nhau, nhiên có cơng trình nghiên cứu tới biến đổi Trong trình nảy mầm, sợi nấm cần glucoza đường đơn khác từ mơi trường bên ngồi Glucoza xem nguồn cacbon cần nảy sợi nhiều loại vi nấm, chúng giúp cho vi nấm thu nhận lượng, tạo liên kết trình tổng hợp, chẳng hạn nảy sợi bào tử trần nấm Penicillin griseofulvum [1, 2] 2.1.3 Khả sinh độc tố chế tác động nấm Metarhizium anisopliae * Khả sinh độc tố diệt côn trùng Độc tố nấm Metarhizium anisopliae gồm số ngoại độc tố có tên Destruxin A, B, C hay D Các ngoại độc tố sản phẩm thứ cấp vòng peptit, L-prolyu, L-leucine, anhydride Desmethyl Destruxin B Cấu trúc chúng gồm aminoacid α-hytroxy acid Destruxin gây chán ăn gây độc cho côn trùng chúng hấp thu vào da, số Destruxin gây tê liệt côn trùng (Amiri, B L ctv., 1999; Dumas, C K ctv., 1996) [10] Một số Destruxin khác ức chế miễn dịch mạnh mẽ Các sản phẩm thứ cấp thường tích lũy vào cuối giai đoạn sinh trưởng nấm, nguồn thức ăn lượng cạn kiệt [8] Theo Suziki, K Kawakami ctv., (1998): Destruxin A có cơng thức ngun là: C 29H47N5O7, có điểm sơi 1880C; Destruxin B có cơng thức ngun là: C30H51O7N5, có điểm sơi 2340C [17] Gần đây, Alexandr Jegorov, Petr Sedmera, Vladimr Havlek and Vladimr Mat'ha (1998) ly trích thành cơng độc tố có tên Destruxin Ed1, Cyclopeptide từ vi nấm Metarhizium anisopliae [8, 17, 18] Năm 1969, Hamill, R L xác định độc tố diệt côn trùng nấm bạch cương Beauveria bassiana đặt tên cho độc tố Beauvericin [13] Ngoài ra, Dombrink Kurtzman M.A (2003) xác định chất độc tố sinh q trình trao đổi chất vịng peptit có sắc tố màu vàng tenelin basianin, sắc tố hydroxylat progesteron phần nhỏ tách từ testosteron (C 19H28O2) sinh ra… * Cơ chế tác động nấm Metarhizium anisopliae Hầu hết loài nấm gây bệnh cho sâu bệnh xâm nhập vào thể vật chủ qua lớp da (vỏ) thể Bào tử nấm bám vào bề mặt thể vật chủ Trong điều kiện đủ độ ẩm bào tử mọc mầm xâm nhiễm vào sâu bên thể côn trùng qua lớp vỏ chitin nhờ áp lực giới hoạt động enzyme nấm Nấm tiết loại enzyme làm mềm lớp vỏ chitin, qua lỗ thủng bào tử xâm nhập vào bên thể sâu tạo thành lỗ thủng nơi bào tử mọc Do khả xâm nhập vào bên thể côn trùng qua lớp vỏ thể nên nấm ký sinh sâu, loại trùng chích hút pha phát triển côn trùng trứng, nhộng mà vi sinh vật khác không ký sinh [ 1, 3] Nguyên nhân gây bệnh chủ yếu lây lan từ cá thể ốm sang cá thể khỏe thông qua tiếp xúc trực tiếp với nhau, hay qua nguồn thức ăn có chứa mầm bệnh Việc lây truyền theo đường đẻ trứng ký sinh không đáng kể Bệnh vi nấm dễ lan truyền va chạm đơn giản mà số bệnh vi sinh vật khác không xảy Khi lây bệnh chúng thường lây lan nhờ gió, mưa, chim, thú,… bệnh nấm tạo thành ổ bệnh kéo dài theo chiều gió thổi, đường truyền bệnh thông qua loại độc tố nấm [1] Cho đến nay, người ta xác định loại nấm có khả kí sinh gây chết nhiều lồi sâu bệnh trùng Trong số có tới 34 lồi trùng cánh cứng có loại trùng cánh vẩy Hình 2.2 Cơn trùng nhiễm Metarhizium anisopliae 10 2.1.4 Phổ kí chủ nấm Metarhizium anisopliae Cho đến người ta biết 70 lồi trùng bị vi nấm Metarhizium anisopliae tiêu diệt, số có tới 34 lồi trùng cánh cứng có lồi trùng cánh vảy [2, 3, 5] Một số lồi trùng điển hình mẫn cảm với nấm là: - Châu chấu sống lưng vàng : Patanga sucincta - Châu chấu mía : Hieroglyphus banian, Hieroglyphus tonkinensis - Châu chấu lúa : Oxya chinensis, Oxya dominuta - Châu chấu: Locusta sp - Bọ hại dừa : Brontispa sp, Brontispa longissima - Mối đất : Coptotermes sp, Coptotermes squamosus - Sâu kèn hại keo tai tượng : Amasstisasp - Sâu đo hại quế: Culculla paterianria - Sâu xanh thuốc : Helicoverpa assulta - Sâu xanh : Helicoverpa armigera - Sâu xanh bướm trắng : Pieris rapae - Sâu khoang : Spodoptera litura - Sâu đục đậu : Maruca testulalis - Sâu đục thân ngô : Pyrausta nubilalis - Sâu ăn đậu : Etiellasp - Bọ xít xanh : Neraza viridulla - Sâu cắn gié : Leucania separata - Rầy nâu : Nilaparvata lugens - Rầy xanh đuôi đen : Nephotetix bipunctatus 11 - Bọ hà khoai lang : Cylas formicarius - Sâu đo xanh : Anomis flava - Câu cấu : Hypomeces squamosus - Sâu xanh ăn bồ đề: Fentonia sp - Mọt gạo : Sitotroga sp - Sâu róm thơng : Dendrrolomus punctatus - Bọ đen hại mía : Alissonotum impressicole - Cánh cam : Anomala cupripes - Sâu róm quế: Malacosoma dentata - Sâu đục cành quế: Arbela bailbarana - Bọ nâu : Exolonthasp, Maladera orientalis - Xén tóc : Bacchisa atritaric - Bọ xít vải : Tessaratoma papillosa - Bọ xít : Leptinotasa acuta 2.2 Quy trình sản xuất thuốc trừ sâu từ vi nấm Metarhizium anisopliae 2.2.1 Lựa chọn chủng giống môi trường để sản xuất * Chủng giống - Nấm Metarhizium anisopliae, chọn chủng nấm Metarhizium anisopliae phân lập rầy nâu, bọ hại dừa - Nấm Metarhizium flavoviride, chọn chủng Metarhizium flavoviride phân lập cào cào, châu chấu * Môi trường - Môi trường nhân giống cấp (trên ống thạch): +) Môi trường Crapeck Dox: Agar 20 g; Sacharoza 30 g; NaNO3 g; KH2PO4 1g; MgSO4.7H2O 0,1 g; KCl 0,5 g; FeSO4 0,01g; H2O 1000 ml; pH 5,5 12 +) Môi trường Sabouraud: Agar 20 g; Glucoza 40 g; Pepton 10 g; H2O 1000 ml; pH +) Mơi trường Sabouroud khống chất: Agar 20 g; Pepton 10 g; Glucoza 40 g; MgSO4 7H2O 0,5 g; KH2PO4 1g; H2O 1000 ml; pH - Môi trường nhân giống cấp (trên ống thạch): +) Môi trường cao nấm men (Rombach Agula, 1988): Cao nấm men 10 g; Pepton 15 g; KH2PO4 g; MgSO4 7H2O 1g; Aga 20 g; H20 1000 ml; pH +) Môi trường Sabouroud, Dextroza, Aga, cao nấm men ( SDAY): Cao nấm men 10 g; Pepton 15 g; Sacharoza 10 g; Aga 20 g; H20 1000 ml; pH 6,5 +) Phương pháp lên men xốp: Bột cám gạo 50%; Bột ngô 30%; Bột đậu tương ( đậu xanh) 10%; Trấu ( bã mía, vỏ lạc) 10% 2.2.2 Phương pháp sản xuất * Phương pháp lên men chìm Với phương pháp giúp dễ dàng thu nhận sinh khối bào tử, tinh thể độc sản phẩm khác chất kháng sinh, độc tố dạng hịa tan mơi trường dinh dưỡng Metarhizium anisopliae để diệt sâu bệnh Ngoài phương pháp có ưu điểm mơi trường dinh dưỡng đáp ứng hồn tồn với nhu cầu sinh lí Metarhizium anisopliae Do hiệu suất thu sản phẩm cao, tự động hóa cơng nghệ giúp giảm nhân cơng diện tích làm việc khơng q lớn [7, 8] Các bước tạo chế phẩm từ Metarhizium anisopliae đường lên men chìm : Bước 1: Chuẩn bị ống giống nuôi - ngày Bước : Nhân giống bình 250ml có 100ml mơi trường, lắc 200v/ phút, nhiệt độ 28 – 300C nuôi 24 Bước 3: Nhân giống bình 1000ml mơi trường Lắc 200v/phút, nhiệt độ 28 - 300C, nuôi 24 13 Bước 4: Lên men hệ thống tự động, khuấy 550v/phút, nhiệt độ 29 -300C nuôi 72 Bước 5: Li tâm lạnh 3000v/phút 40 phút Sau thu sinh khối bổ sung chất phụ gia Bước : Sấy khô 30 - 350C Bước : Nghiền nhỏ, vô bao kín, bảo quản - 100C Trong phương pháp lên men chìm ngồi việc sử dụng nồi lên men thơng thường, người ta cịn áp dụng ni cấy đệm plastic quy mô công nghiệp áp dụng nuôi cấy chủng để thu chế phẩm diệt sâu hại Khi áp dụng lên men chìm gặp hạn chế trang thiết bị phức tạp, kinh phí đầu tư cao, kĩ thuật cơng nghệ tiên tiến Khi nuôi cấy Metarhizium anisopliae thu bào tử chồi, bào tử có sức sống kém, thời gian sống ngắn, cấu trúc * Lên men bề mặt không vô trùng Trong điều kiện thiếu trang thiết bị hồn chỉnh để lên men chìm, người ta sử dụng phương pháp lên men bề mặt không vô trùng để thu nhận chế phẩm diệt trùng từ nấm, vi khuẩn [8] Khâu khó khăn quy trình hạn chế nhiễm tạp vi khuẩn lạ môi trường không hấp khử trùng Để khắc phục ta đun môi trường 1000C 30 phút, đến nguội bổ sung thêm kháng sinh streptomycine 0.01% Các bước lên men bề mặt: Bước 1: Nấm nuôi ống thạch nghiêng hay đĩa pertri - 10 ngày nhiệt độ 28 - 300C Bước 2: Lấy bào tử Bước 3: Cho vào chậu thủy tinh lớn có lớp môi trường dịch – 1,5 cm (chậu phải sấy 1000C 30 phút, môi trường dịch đun sôi 100 0C 30 phút) Bước 4: Nuôi 12 ngày nhiệt độ 25 - 300C 14 Bước 5: Vớt thảm nấm có bào tử, đồng thời tròn mặt bào tử Bước 6: Thấm cho nước bổ sung chất phụ gia Bước 7: Nghiền nhỏ máy nghiền Bước 8: Sấy khô 30 - 350C Bước 9: Vô bao, bảo quản -100C Ngoài để đảm bảo phát triển áp đảo chủng vi sinh vật nuôi cấy, cần tuân thủ nguyên tắc sau : - Môi trường sau đun 100 0C 30 phút, để nguội cấy bào tử vào, số bào tử khuếch tán thành màng mỏng khắp bề mặt môi trường Trong thời gian định chúng ngăn cản khơng cho khơng khí khuếch tán vào môi trường Do làm hạn chế tạp nhiễm vi sinh vật lạ Lượng bào tử cấy vào đủ để áp đảo vi sinh vật lạ 1- tỉ bào tử/cm3 - pH môi trường khoảng 5.0 - 5.5 thích hợp cho phát triển nấm, vi khuẩn * Lên men xốp Phương pháp sử dụng thành công để sản xuất nấm Metarhizium số nấm diệt côn trùng khác Trong quy trình này, tác giả sử dụng loại chất khác bột đậu nành, bã đậu phụ, lúa, gạo với dịch dinh dưỡng nuôi cấy nấm Metarrhizium [7, 8] Quy trình mơ tả sau: Bước 1: Chuẩn bị ống giống Bước 2: Cho vào mơi trường xốp bình 250 ml, ni - ngày nhiệt độ 28 – 300C Bước 3: Môi trường xốp chậu thủy tinh (khử trùng 100 0C 40 phút) bổ sung 10% giống, nuôi 10 ngày 28 – 32 0C , độ ẩm tương đối 95% Bước 4: Làm khô nhiệt độ phịng có quạt, độ ẩm 10% sấy 400C Bước 5: Nghiền nhỏ, vô bao, bảo quản - 100C tối 15 2.3 Các chế phẩm sinh học từ nấm Metarhizium anisopliae Nhiều nước giới Úc, Ý, Brazil, Mỹ, Mêxicô, Pháp, Tây Ban Nha, Đức, Ấn Độ, Peru, Colombia, Venezuela, sản xuất thành công chế phẩm sinh học từ nấm Metarhizium anisopliae như: Bio-Blast [42], Ago Bio.Metarhizium 50, Biogreen, Bio 1020, Green Muscle, Granmet-P, Metarhizium Schweizer, Bio-Magic, Meta-Sin, Metaquino, Bio-Path, Metadieca, Metazam, Metarhisa WP, Biocontrol, Cobican [15, 16]… Chế phẩm Metarhizium anisopliae trừ bọ cánh cứng Chế phẩm Metavina 80LS Chế phẩm BIMA Chế phẩm Metament 90DP Hình 2.3 Một số chế phẩm từ Metarhizium sử dụng Việt Nam 16 Cho đến Việt Nam có 13 loại chế phẩm trừ sâu sinh học sản xuất từ nấm trắng, Beauveria bassiana (như: Beauveria, Biobauve DP, Biovip, Cộng hợp vi sinh 32 BTN, Muskardin) nấm xanh, Metarhizium anisopliae (Bemetent, Metament, Vimetarzimm 95 DP, Ometar, Dimez, Metavina 10 DP, Metavina80 LS, Metavina 90 DP) đăng ký vào danh mục thuốc bảo vệ thực vật phép sử dụng Việt Nam (2009) [5] Tình hình nghiên cứu sử dụng vi nấm Metarhizium anisopliae 2.4.1 Tình hình nghiên cứu sử dụng Metarhizium giới Những năm cuối kỷ XX, nhiều cơng trình nghiên cứu khoa học khẳng định điều kiện tự nhiên vi nấm nhân tố gây chết quan trọng nhiều loài sâu, trùng Mỗi nhóm bị ảnh hưởng số vi nấm định Người ta xác định 700 loài vi nấm mầm bệnh cho lồi trùng, sâu bệnh Tuy nhiên, vào mức độ gây chết, điều kiện nuôi cấy, điều kiện sản xuất tác dụng, người ta tập chung nghiên cứu nhóm vi nấm: Metarhizium, Beauveria, Verticilum Paecilomvces Những năm gần đây, xuất ngày nhiều cơng trình nghiên cứu sử dụng vi nấm để diệt sâu bệnh, côn trùng [11, 16] kết 11 chế phẩm vi nấm diệt côn trùng đưa vào sử dụng, có chế phẩm Metarhizium: chế phẩm BioBlast Mỹ dùng để diệt mối đất Đài Loan (Coptotermes formosanus); chế phẩm GreenMuscle Nam Phi để diệt châu chấu (Locusts); chế phẩm BioGreen Úc để diệt bọ ngô đầu đỏ (Red- headed cockchafer) Từ năm 80 kỷ trước (1880-1886), Metschnhikov học trị Isac Craxinstic nghiên cứu hàng loạt môi trường nuôi cấy nấm Metarhizium anisopliae sản xuất thử hàng nghìn kilogram nấm để tách bào tử khiết, sau dùng bào tử nấm trộn với đất bột đem tung đồng ruộng, theo tác giả sau 10 - 14 ngày thí nghiệm sâu non dạng trưởng thành bọ đầu dài hại củ cải đường chết với tỷ lệ 55 - 80% [12, 15] 17 Một số nước (Liên Xô, Ba Lan…) kỹ thuật cơng nghệ hóa sinh đại chiết từ hạt gấc, đậu tương…các loại chất có khả kìm hãm sinh trưởng phát triển sâu bệnh để tạo chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật bước đầu có kết khả quan Tóm lại, việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm loại không chế phẩm nấm xanh Metarhizium nhà khoa học giới sản xuất hàng vạn chế phẩm sinh học để phòng trừ cho hàng chục triệu hecta trồng 2.4.2 Tình hình nghiên cứu sử dụng Metarhizium Việt Nam Việc nghiên cứu nấm gây bệnh sâu bệnh cán khoa học kỹ thuật số trường đại học viện nghiên cứu bắt đầu tìm hiểu sâu nghiên cứu chúng từ năm 70 kỷ trước Theo Phạm Văn Lầm, (1996), sở khoa học phòng trừ sinh học, phòng trừ tổng hợp hiểu quy luật chế tự nhiên điều chỉnh số lượng sâu bệnh, nhằm sử dụng tối ưu chế vào việc hạn chế tác hại chúng gây [4] Năm 1981 GS.TS Nguyễn Lân Dũng nghiên cứu nấm lục cương Metarhizium mơ tả hình thái, phân tích chế tác dụng, hướng dẫn cách phân lập nuôi cấy phương pháp sản xuất sinh khối Metarhizium [1] Từ năm 1992, Phạm Thị Thùy cs thuộc viện Bảo vệ thực vật phân lập, nuôi cấy thử nghiệm chủng Metarhizium thuộc loài Metarhizium anisopliae Metarhizium flavoviride để phịng trừ cho lồi sâu bọ hại nơng, lâm nghiệp phương pháp phun trực tiếp bào tử Metarhizium đồng ruộng [7] Năm 1996, Tạ Kim Chỉnh phân lập, nuôi cấy số chủng Metarhizium anisopliae thử nghiệm để diệt châu chấu di cư lồi sâu bệnh hại nơng nghiệp Phạm Thị Thùy cộng (2002 - 2003), nghiên cứu sử dụng nấm Metarhizium anisopliae để diệt bọ hại dừa cho tỉnh Bình Định phương pháp phun trực tiếp [8] Kết cho thấy chế phẩm nấm Metarhizium anisopliae có hiệu cao với ấu trùng trưởng thành bọ dừa, đặc biệt 18 hiệu kéo dài đến tuần sau phun Điểm giá trị chế phẩm nấm hiệu kéo dài, nấm không gây ô nhiễm môi trường nguy hiểm người, khơng làm lồi kí sinh thiên địch có ích khác Từ năm 1998 đến năm 2002, Trịnh Văn Hạnh cs Trung tâm nghiên cứu phòng trừ mối nghiên cứu tuyển chọn chủng Metarhizium có hiệu lực cao để phịng trừ lồi gây hại điển hình nước ta, loài mối nhà nguy hiểm Coptotermes formosanus Shiraki Chế phẩm Metarhizium từ nghiên cứu Lê Thùy Quyên để diệt trừ loài sâu xanh bướm trắng, sâu khoang ăn đặc biệt khả tiêu diệt số lồi trùng hại trồng đất bọ hung, mối đất Nấm có hiệu cao để phịng trừ bọ đen ăn mía, mối đất ăn thông trắng, bồ đề, hại điều, ăn quả, sâu xanh bướm trắng ăn su hào, bắt cải, sâu khoang hại cà chua…cho kết diệt trừ sâu bệnh 70% Mặc dù có nhiều nghiên cứu tiến hành chế phẩm thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc từ sinh học Việt Nam thời gian qua cịn có mặt hạn chế: - Giá thành sản phẩm cao cơng nghệ sản xuất phức tạp, địi hỏi chi phí cao, khơng có trợ giá, người nơng dân khó chấp nhận - Tác dụng chậm nên tâm lý người nơng dân cịn ngại sử dụng - Cơng nghệ sản xuất số chế phẩm đơn giản, thủ cơng nên số lượng sản xuất chưa có nhiều để phục vụ sản xuất Cải tiến hồn thiện quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học để giảm giá thành, hiệu cao sản xuất với số lượng lớn để phục vụ sản xuất Gần đây, quy trình sản xuất nấm Metarhizium anisopliae chuyển giao rộng rãi đến hộ nông dân Đồng Sông Cửu Long để phòng trừ rầy nâu hại lúa 19 III KẾT LUẬN Như vậy, số tác nhân sinh học sử dụng phòng trừ sâu hại trồng vi nấm Metarhizium anisopliae lồi có tiềm lớn Các nhà khoa học giới Việt Nam nghiên cứu thành công nhiều loại chế phẩm trừ sâu từ loại vi nấm cho kết khả quan Vi nấm Metarhizium anisopliae tiêu diệt nhiều lồi sâu hại chúng có hiệu cao với lồi trùng chích hút Sử dụng chế phẩm sinh học từ vi nấm Metarhizium anisopliae phòng trừ sâu hại, vừa mang lại hiệu kinh tế, vừa đảm bảo an tồn mơi trường sinh thái vệ sinh an toàn thực phẩm Với tiến khoa học kỹ thuật đại đặc biệt lĩnh vực công nghệ sinh học cho phép ứng dụng rộng rãi quy trình cơng nghệ để sản xuất chế phẩm sinh học trừ sâu từ vi nấm Metarhizium anisopliae, phòng trừ sâu hại trồng Có thể sử dụng nguồn nguyên liệu có sẵn, giá thành rẻ để sản xuất chế phẩm nên khắc phục hạn chế mà quy trình sản xuất cũ mang lại Do đó, sản phẩm tạo có giá thành rẻ nên cạnh tranh với sản phẩm khác từ chế phẩm trừ sâu sinh học sử dụng rộng rãi 20 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Nguyễn Lân Dũng, 1981 Sử Dụng Vi Sinh Vật Để Phòng Trừ Sâu Hại Cây Trồng, NXB Khoa Học Kỹ Thuật Nguyễn Văn Đĩnh cộng , 2004 Giáo trình biện pháp sinh học bảo vệ thực vật, NXB Nông nghiệp Hà Quang Hùng, 2000 Giáo trình quản lý dịch hại tổng hợp, NXB Nông nghiệp Phạm Văn Lầm, 1996 Biện pháp sinh học phịng chống dịch hại, NXB Nơng nghiệp Nguyễn Cơng Thuật, 1996 Phịng trừ tổng hợp sâu bệnh hại trồng nghiên cứu ứng dụng, NXB Nông nghiệp Phạm Thị Thuỳ, 2004 Công nghệ sinh học bảo vệ thực vật, NXB Đại học quốc gia Hà Nội Phạm Thị Thuỳ cộng sự, 1993 Một số kết nghiên cứu sản xuất thử nghiệm nấm Beauveria bassianavà Metarhiziumtrên rầy nâu hại lúa sâu đo hại đay, Tạp chí Nơng nghiệp cơng nghiệp thực phẩm số 5/1993 Phạm Thị Thùy cộng sự, 2003 Nghiên cứu công nghệ sản xuất ứng dụng chế phẩm Beauveria Metarhizium để phòng trừ số sâu hại trồng Tuyển tập cơng trình nghiên cứu Bảo vệ thực vật NXB Nông Nghiệp Tiếng anh Alexandr Jegorov, Petr Sedmera, Vladimr Havlek and Vladimr Mat'ha 1998 Destruxin Ed1 a cyclopeptide from the fungus Metarhizium anisopliae [Online] Phytochemistry Volume 49, Issue 6, 20 November 1998, Pages 18151817 10 Amiri, B L Ibrahim and T M Butt 1999 “Antifeedent properties of destruxins and their potential use with the entomogenous Metarhizium 21 anisopliae for improved control of crucifer pests” Biocontrol Science and Technology 9: 487- 498 11 Baron, G L 1968 The Genera of Hyphomycetes from Soil Robert E Krieger Publishing Compny, Malabar, Florida 12 Cerenius, L., P O Thornqvist, A Vey M W, Johansson and K Soderhall 1990 “The effects of the fungal toxin destruxin E on isolated grayfish haemocytes” Journal of Insect Physiology (1992): 785-789 13 Hamill, R L 1969 “Diversity in Beauvericin and Enniatins H, I, and MK1688 by Fusarium oxysporum isolated from potato” International Journal of Food Microbiology 122 (3): 296-301 14 Humber, R.A 1997 Fungi: identification In: Lacey, L.A (ed) Manual of Techniques in Insect Pathology Academic Press, London pp 153-185 15 Marcos R De Faria and Stephen P Wraight 2007 Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types Biological Control 43 (2007) 237 – 256 16 Sason, R.A., H.C Evans and J.P Latge’ 1988 Alas of Entomopathogenic Fungi Springer Verlag, Berlin 17 Suziki, K Kawakami, Alexandr Jegorov, Petr Sedmera, Vladimr Havl and Vladimr Mat'ha 1998 “Destruxin Ed1 a cyclopeptide from the fungus Metarhizium anisoplia” Phytochemistry 49 (6): 1815-1817 18 Vimala Devi, P.S., 1994 “Conidia production of the entomopathogenic fungus, Paecilomyces and its evalution of the effect of the Spodoptera litura (Fab.)” in Ricinus communis J, Invert 63: 144-145 22 ... anisopliae chế kháng sâu bệnh chúng, quy trình sản xuất thuốc trừ sâu từ loại vi nấm này, tiến hành giới thiệu ? ?thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ vi nấm Metarhizium anisopliae” 1.2 Mục tiêu - Giới... ăn quả, sâu xanh bướm trắng ăn su hào, bắt cải, sâu khoang hại cà chua…cho kết diệt trừ sâu bệnh 70% Mặc dù có nhiều nghiên cứu tiến hành chế phẩm thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc từ sinh học... diệt sâu hại Trong nhiều thập kỷ qua, loại thuốc hóa học diệt trừ sâu bệnh sử dụng phổ biến rộng rãi Các hợp chất có tác dụng tiêu diệt sâu bệnh nhanh chóng hiệu Tuy nhiên, với thời gian thuốc trừ