CÚM AH5N1 và CÔNG NGHỆ sản XUẤT VACCINE h5n1

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN Trường Đại Học Khoa Học TIỂU LUẬN HỌC PHẦN Công nghệ sinh học hiện đại Chủ đề: “CÚM AH5N1 VÀ CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VACCINE H5N1” Thái nguyên 92014 PHỤ LỤC 1: Đặt Vấn Đề 3 2:Căn Cứ Khoa Học 4 2.1 Cúm A H5N1 4 2.2Triệu chứng bệnh Cúm A(H5N1) 5 2.3 Mức độ nguy hiểm đối với sức khoẻ con người khi bị nhiễm virus cúm AH5N1? 6 2.4 nguyên tắc sản xuất vaccine cúm A H5N1 6 3: Tình hình sản xuất vaccine cúm A H5N1 trong nước và quốc tế 7 4. Quy trình sản xuất vaccine cúm A H5N1 11 5: Kết Luận 15 6: Tài Liệu Tham Khảo 15 1: Đặt Vấn Đề Cúm A là bệnh nhiễm trùng đường hô hấp cấp tính do virus cúm A chủng H1N1, H5N1 và H7N9 gây nên. Người mang virus cúm A có khả năng truyền virus cho những người xung quanh trong thời gian 1 ngày trước tới 7 ngày sau, kể từ khi có triệu chứng của bệnh. Bệnh lây lan càng mạnh, càng nhanh khi có sự tiếp xúc trực tiếp với người bệnh, đặc biệt ở nơi tập trung đông người như trường học, nhà trẻ... Hiện nay chưa có vắcxin đặc hiệu phòng chống cúm A. Trong đó cúm A H5N1 là một phân nhóm có khả năng gây nhiễm cao của virus cúm gia cầm. Chủng virus này lần đầu tiên được phát hiện xâm nhiễm trên người tạiHồng Kông năm 1997. Chín nhóm virus cũng là tác nhân gây dịch cúm trên gia cầm ở Hông Kông lúc đó. Tên gọi phân nhóm H5N1 là liên quan đến loại protein kháng nguyên trên vỏ virus: protein hemagglutinin nhóm 5 (H5) và neuraminidase nhóm 1 (N1). Trước sự nguy hiểm của virus này, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã cảnh báo trong thời gian tới có thể virút cúm gia cầm biến chủng, thành chủng mới có độc lực cao, lây truyền từ người sang người, ước tính khoảng 140 triệu người tử vong. Cùng với các nhà khoa học trên thế giới, vào giữa năm 2004 một nhóm nhà khoa học của Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương (NIHE) đã bắt tay vào nghiên cứu sản xuất vắcxin H5N1. Đến thời điểm này, khi mà quá trình nghiên cứu vắcxin H5N1 đã trải qua hàng trăm cuộc thử nghiệm với những kết quả đáng mừng. Một vài năm không phải là dài đối với một công trình nghiên cứu nhưng chính sự nguy hiểm của virút H5N1 đã thôi thúc các nhà khoa học phải nghiên cứu tìm hiểu về “ cúm A H5N1 và công nghệ sản xuất vaccine ngừa cúm A H5N1”

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN Trường Đại Học Khoa Học

TIỂU LUẬN HỌC PHẦN Công nghệ sinh học hiện đại

Chủ đề: “CÚM A/H5N1 VÀ CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT

VACCINE H5N1”

Thái nguyên 9/2014

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 2

1: Đặt Vấn Đề 2

2:Căn Cứ Khoa Học 3

2.1 Cúm A H5N1 3

5: Kết Luận 14

6: Tài Liệu Tham Khảo 15

1: Đặt Vấn Đề

Cúm A là bệnh nhiễm trùng đường hô hấp cấp tính do virus cúm A chủng H1N1, H5N1 và H7N9 gây nên Người mang virus cúm A có khả năng truyền virus cho những người xung quanh trong thời gian 1 ngày trước tới 7 ngày sau,

kể từ khi có triệu chứng của bệnh Bệnh lây lan càng mạnh, càng nhanh khi có

sự tiếp xúc trực tiếp với người bệnh, đặc biệt ở nơi tập trung đông người như

trường học, nhà trẻ Hiện nay chưa có vắcxin đặc hiệu phòng chống cúm A

Trong đó cúm A H5N1 là một phân nhóm có khả năng gây nhiễm cao của

virus cúm gia cầm Chủng virus này lần đầu tiên được phát hiện xâm nhiễm trên người tạiHồng Kông năm 1997 Chín nhóm virus cũng là tác nhân gây dịch cúm

trên gia cầm ở Hông Kông lúc đó Tên gọi phân nhóm H5N1 là liên quan đến loại protein kháng nguyên trên vỏ virus: protein hemagglutinin nhóm 5 (H5)

và neuraminidase nhóm 1 (N1)

Trước sự nguy hiểm của virus này, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã cảnh báo trong thời gian tới có thể vi-rút cúm gia cầm biến chủng, thành chủng mới có độc lực cao, lây truyền từ người sang người, ước tính khoảng 1-40 triệu người tử vong Cùng với các nhà khoa học trên thế giới, vào giữa năm 2004 một nhóm nhà khoa học của Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương (NIHE) đã bắt tay vào nghiên cứu sản xuất vắc-xin H5N1

Đến thời điểm này, khi mà quá trình nghiên cứu vắc-xin H5N1 đã trải qua hàng trăm cuộc thử nghiệm với những kết quả đáng mừng Một vài năm không phải là dài đối với một công trình nghiên cứu nhưng chính sự nguy hiểm của vi-rút

H5N1 đã thôi thúc các nhà khoa học phải nghiên cứu tìm hiểu về “ cúm A

H5N1 và công nghệ sản xuất vaccine ngừa cúm A H5N1”

2:Căn Cứ Khoa Học

2.1 Cúm A H5N1

Cúm gia cầm là bệnh truyền nhiễm cấp tính của gia cầm, do nhóm virus cúm A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra, có khả năng lan truyền từ động vật sang người Nhóm virus cúm A có 16 phân type HA (H1 - H16) và 9 phân type NA (N1 - N9) có khả năng tái tổ hợp để tạo nên hàng trăm phân type khác nhau về

độc tính và khả năng gây bệnh H5N1 thể độc lực cao (HPAI) vẫn đang là mối

đe dọa cho chăn nuôi và sức khỏe cộng đồng

Virus cúm A (còn gọi là virus cúm gia cầm, virus cúm gà) có tên khoa học là

Avian Influenza (AI), Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc hình khối

đa diện, đường kính 80 -120 nm, đôi khi cũng có dạng hình sợi, khối lượng phân

tử khoảng 250 triệu Da Phân tích thành phần hóa học một virion có chứa khoảng 0,8 - 1,1% RNA; 70 - 75% là protein; 20 - 24% lipid và 5 - 8% là

carbonhydrate (Murphy, 1996) Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm vỏ (capsid),

vỏ bọc ngoài (envelope) và lõi là RNA sợi đơn âm - negative single strand

(Murphy, Webster, 1996 Vỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus, bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm được đặc hiệu hóa gắn các protein màng của virus Trên bề mặt có khoảng 500 “gai mấu” nhô ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 - 14 nm có đường kính 4 - 6 nm, đó là những kháng nguyên bề mặt

vỏ virus, bản chất cấu tạo là glycoprotein gồm: HA, NA, MA (matrix) và các dấu ấn khác của virus (Bender et al., 1999; Zhou et al., 2007) Vật chất di truyền

(còn gọi là hệ gen) của virus cúm A là RNA sợi đơn âm (viết tắt là (-) ssRNA), gồm 8 phân đoạn riêng biệt (HA, NA, M, NS, NP, PA, PB1 và PB2) nối với nhau thành một sợi duy nhất bên trong vỏ virus, mã hóa cho 11 protein tương ứng của virus, trong đó phân đoạn M mã hóa cho 2 protein là M1 và M2; phân đoạn NS mã hóa cho 2 protein là NS và NEP, phân đoạn PB1 mã hóa cho 2

protein là PB1 và PB1-F2 (Ito et al., 1998; Conenello et al., 2007)

Vì bản chất của virut cúm là lipoprotein nên virut cúm có sức đề kháng yếu, dễ

bị bất hoạt bởi bức xạ mặt trời, tia tử ngoại, dễ bị tiêu diệt ở nhiệt độ 560C và các chất hòa tan lipid như ether, beta-propiolacton, formol, chloramine, cresyl, cồn… Tuy nhiên, virut cúm có thể tồn tại hàng giờ ở ngoại cảnh, đặc biệt khi thời tiết lạnh và độ ẩm thấp Bệnh cúm nguy hiểm là do tính lây lan nhanh và gây thành dịch Bệnh có thể xảy ra dưới nhiều mức độ khác nhau: đại dịch, dịch nhỏ địa phương và các trường hợp tản phát Trong các vụ dịch cúm hàng năm,

5-15% dân số bị nhiễm khuẩn đường hô hấp trên Bệnh nặng và tử vong xảy ra chủ yếu ở những nhóm người có nguy cơ cao như trẻ em, người cao tuổi và người mắc bệnh mạn tính

2.2Triệu chứng bệnh Cúm A(H5N1)

Cúm gia cầm (còn gọi là cúm gà) là bệnh do virus cúm A H5N1 gây ra Bệnh

có diễn biến nhanh, tỷ lệ tử vong cao Nếu được phát hiện sớm, điều trị kịp thời

có thể cứu sống bệnh nhân, do vậy cần đặc biệt lưu ý khi ở vùng có nhiều gia cầm (gà, vịt, ngan, ngỗng) chết, lại xuất hiện những người có biểu hiện ho, sốt cao, đau đầu, đau mỏi người

Bệnh nhân sốt thành cơn hay sốt liên tục cả ngày Nhiệt độ có thể lên tới 40- 41độ c; có những trường hợp chỉ sốt nhẹ 38- 38,5độ c, những trường hợp này thường xảy ra ở những bệnh nhân sức đề kháng giảm nhiều như: suy giảm miễn dịch, người già, trẻ nhỏ, có các bệnh mạn tính kèm theo; Biểu hiện da nóng, đỏ xuất hiện ở những bệnh nhân sốt cao, khi có suy hô hấp có tím môi, đầu chi; Bệnh nhân thường

có cảm giác đau đầu, đau mỏi người, có thể thấy đau quanh hốc mắt Trường hợp nặng bệnh nhân có thể có rối loạn ý thức

2.3 Mức độ nguy hiểm đối với sức khoẻ con người khi bị nhiễm virus cúm A/H5N1?

- Virus cúm A/H5N1 có khả năng lây nhiễm rất cao Lần đầu tiên tìm thấy qua

vụ dịch cúm ở Hồng Kông vào năm 1997 Virus cúm A/H5N1 được phát tán môi trường bên ngoài qua nước bọt, dịch mũi, phân và trong các tế bào niêm mạc ruột non của một số loài chim di cư Virus có thể gây đột biến gien mạnh

và trở thành những chủng virus có độc tính rất cao

- Một người bị mắc bệnh cúm gia cầm thường có liên quan đến tiếp xúc, chăm sóc thủy cầm, gia cầm, chim cảnh Hoặc liên quan đến các khâu giết mổ, ăn thịt hoặc các sản phẩm chế biến từ thịt gia cầm, thủy cầm bị bệnh

- Tại Việt Nam, các ca mắc cúm gia cầm H5N1 xuất hiện đầu tiên vào năm

2003, tính từ 2004 đến 2013 có 35 cas mắc cúm A/H5N1 và tử vong 29 cas Chủng virus cúm này đã biến đổi thành một chủng có độc lực mạnh, tỷ lệ tử vong cao, có thời điểm đến 100% Nguy hiểm nhất của bệnh cúm gia cầm là khi lây sang người có thể gây viêm phổi cấp tính, tổn thương đa tạng, tỷ lệ tử vong cao

2.4 nguyên tắc sản xuất vaccine cúm A H5N1

Sản xuất vacxin cúm gia cầm là một công việc phức tạp, đòi hỏi kỹ thuật cao và điều kiện sản xuất nghiêm ngặt Hiệu quả của vacxin phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng giống virut, đặc biệt tính tương đồng của chủng virut vacxin với chủng virut gây bệnh và hàm lượng protein HA chứa trong liều vacxin Người ta

đã chứng minh được nếu trình tự các axit amin giữa chủng vacxin và chủng gây bệnh giống nhau khoảng 87% là có mối tương quan rất rõ đến hiệu quả phòng bệnh

Hiện nay vacxin cúm gia cầm H5N1 được sản xuất dùng công nghệ nuôi cấy virut trên phôi gà 10 – 11 ngày tuổi Việc xác định được nồng độ virut gây nhiễm, nhiệt độ nuôi cấy, thời gian thu hoạch thích hợp để có thể thu được dịch

niệu mô với hiệu giá virut cao và ổn định là yếu tố quyết định đến thành công

và đảm bảo tính kinh tế khi sản xuất vacxin cúm gia cầm

Để sản xuất được vacxin cúm gia cầm vô hoạt nhũ dầu có chất lượng, ngoài các yếu tố về giống virut, điều kiện nuôi cấy thích hợp, thì việc nghiên cứu có được một công thức nhũ ổn định cũng là một yếu tố mang tính quyết định đến chất lượng của sản phẩm và đáp ứng được yêu cầu khi sản xuất ở qui mô công nghiệp

Theo dõi tính ổn định của nhũ dầu trong thời gian bảo quản cho thấy vacxin không có hiện tượng chuyển màu, không tách pha nước Các chỉ tiêu về tính ổn định, độ nhớt vẫn đạt yêu cầu như kiểm tra ở thời điểm sau khi sản xuất Tuy nhiên khi bảo quản ở điều kiện lạnh trong thời gian dài, quan sát thấy có một lớp dầu tách ra từ 0,1-0,3 mm trên bề mặt vacxin và trong một số trường hợp có thể hình thành một lớp cặn ở dưới đáy lọ vacxin Hiện tượng này đã được kiểm tra và xác nhận không ảnh hưởng đến chất lượng của vacxin

3: Tình hình sản xuất vaccine cúm A H5N1 trong nước và quốc tế

Các chủng virus cường độc A/H5N1 sau 1996, qua thời gian tiến hóa, có xu hướng biến đổi nội gen nhằm tăng tính gây bệnh, và thay đổi thành phần nội gen kháng nguyên làm mất tương quan miễn dịch giữa chúng và các chủng vaccine được tạo ra Do vậy, vấn đề này phải được hết sức chú ý trong chiến lược kiến tạo vaccine, cũng như sử dụng vaccine được tạo ra (Horimoto, Kawaoka, 2006)

Trong tự nhiên, “lệch kháng nguyên” và “glycosyl hóa” là các hiện tượng xảy ra liên tục theo thời gian, còn “trộn kháng nguyên” tái tổ hợp subtype

Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) thường định kỳ xảy ra giữa các loài mắc nhằm tạo nên các biến thể virus cúm mới mà hệ miễn dịch của cơ thể vật chủ không có khả năng nhận dạng đáp ứng và kịp hình thành miễn dịch H5N1 sử dụng

thụ thể sialic xâm nhập tế bào (Yamada et al., 2006) Hemagglutinin cùng với protein

enzyme neuraminidase, được xác định là protein có vai trò kháng nguyên và độc lực,

(Scholtissek et al., 2002; Wagner et al., 2002 ; Keawcharoen et al., 2005) và các

protein kháng nguyên có nguồn gen từ các chủng H5N1 của Việt Nam, cũng được nghiên cứu sản xuất bằng kỹ thuật tái tổ hợp và sử dụng với các mục đích khác nhau trong đó có thử nghiệm làm kháng nguyên kích thích miễn dịch và chẩn đoán

(Nguyễn Tiến Minh et al., 2004; Simmons et al., 2007).

Đối với bệnh truyền nhiễm, vaccine được coi là biện pháp có tính chiến lược, nhằm ngăn chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch (Subbarao, Luke, 2007) Đối với dịch cúm A/H5N1 ở gia cầm và dự phòng dịch cúm trên người, nghiên cứu phát triển vaccine không những ngăn ngừa làm giảm được bệnh ở gia cầm,

mà còn khống chế nguồn truyền lây của loại virus nguy hiểm này sang người(Horimoto, Kawaoka, 2001; OIE, 2005; Subbarao, Luke, 2007) Kháng thể đặc hiệu có thể được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng nguyên trong vaccine, và đó là các kháng thể kháng HA, NA, MA và nhiều loại hình khác của virus đương nhiễm, góp phần vô hiệu hóa virus cúm đúng đối tượng khi chúng xâm nhập vào Có nhiều loại kháng thể, nhưng trước hết chỉ kháng thể kháng HA(H5) có vai trò tiên quyết quan trọng trong quá trình trung hòa virus cho bảo

hộ miễn dịch Các vaccine phòng bệnh hiện nay dựa trên cơ sở hai loại chính: vaccine truyền thống và vaccine thế hệ mới (Subarao, Luke, 2007; Capua, Alexander, 2008)

Vaccine truyền thống: bao gồm vaccine vô hoạt đồng chủng và dị chủng Vaccine vô hoạt đồng chủng (homologous vaccine), đó là các loại

vaccine được sản xuất chứa cùng những chủng virus cúm gà giống như

chủng gây bệnh trên thực địa (Swayne, Suarez, 2000) Vaccine vô hoạt dị chủng (heterologous vaccine) là vaccine sử dụng các chủng virus có kháng

nguyên HA giống chủng virus trên thực địa, nhưng có kháng nguyên NA dị chủng

Vaccine thế hệ mới hay vaccine công nghệ gen: là loại vaccine được sản xuất dựa trên sử dụng kỹ thuật gen loại bỏ các vùng “gen độc” đang được

nghiên cứu và đưa vào sử dụng phổ biến, bao gồm:

- Vaccine tái tổ hợp có vector đậu gia cầm dẫn truyền: sử dụng virus đậu gia cầm làm vector tái tổ hợp song gen H5 và N1 phòng chống virus type H5N1

và H7N1 (Qiao et al., 2006) Ví dụ, hãng Merial của Pháp sản xuất vaccine

TrovacAIV-H5 lấy nguồn gen H5 từ chủng A/Turkey/Ireland/83 (H5N2), sử dụng được cho gia cầm lúc 1 ngày tuổi

- Vaccine dưới nhóm chứa protein kháng nguyên NA, HA tái tổ hợp và tách

chiết làm vaccine (Peyre et al., 2008; Prel et al., 2008).

- Vaccine tái tổ hợp có vector dẫn truyền: sử dụng adenovirushoặc Newcastle virus hoặc virus đậu chim làm vector dẫn truyền, lắp ghép gen kháng nguyên H5 vào hệ gen của adenovirus, tạo nên virus tái tổ hợp làm

vaccine phòng chống virus cúm A/H5N1 (Hoelscheret al., 2006; Gao et al., 2006; Römer-Oberdörfer et al., 2008).

- Vaccine DNA: sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp chứa gen HA, NA, NP,

M2 đơn lẻ hoặc đa gen (Kodihalli et al., 1999; Keawcharoen et al., 2005).

- Vaccine nhược độc virus cúm nhân tạo: đượcsản xuất bằng kỹ thuật di truyền ngược, đó là việc lắp ghép virus cúm nhân tạo chứa đầy đủ hệ gen, trong

đó các gen kháng nguyên H5 có vùng "độc" đã được biến đổi bằng kỹ thuật gen (Liu et al., 2003; Tian et al., 2005) Có 3 loại vaccine đã được Tổ chức Y tế thế

giới (WHO) công nhận về độ an toàn và khuyến cáo đưa vào chương trình sản xuất vaccine trên thế giới hiện nay, đó là NIBRG-14 (NIBSC), VN/04xPR8-rg (SJCRH) và VNH5N1-PR8/CDC-rg (CDC) Hai chủng cúm A/H5N1 cung cấp nguồn gen H5 và N1 là A/Vietnam/1194/2004(H5N1) hoặc

A/Vietnam/1203/2004(H5N1) (Nicolson et al., 2005) Trung Quốc cũng là nước

sản xuất nhiều giống virus vaccine chống cúm, ví dụ, Viện Nghiên cứu Thú y Harbin (Cáp - Nhĩ - Tân) đã thành công trong việc tạo giống vaccine vô hoạt nhũ dầu đơn chủng lấy nguồn gen H5 và N2 từ chủng A/Turkey/England/N-28/73(H5N2), loại subtype H5N2 có độc lực yếu; hay giống vaccine vô hoạt nhũ dầu đơn chủng lấy nguồn gen H5 và N1 từ chủng

A/Goose/Guangdong/1996(H5N1), loại có độc lực yếu (Tian et al., 2005;

Qiao et al., 2006) Các loại vaccine này đã được nhập và sử dụng tại Việt Nam

từ năm 2006 cho đến nay

Vaccine thế hệ mới chủng NIBRG-14: Chủng NIBRG-14 là giống virus

vaccine nhược độc (attenuated vaccine) thế hệ mới, thuộc loại hình vaccine được xóa gen bằng công nghệ gen (gene-deletion vaccines), được lắp ráp nhân tạo bằng

kỹ thuật di truyền ngược (reverse genetics –based technology) và thích ứng nhân lên khi nuôi cấy trên phôi gà (Marsh, Tannock, 2005).Phương pháp di truyền ngược được sử dụng để tạo ra chủng virus nhân tạo nhược độc làm vaccine, cụ thể

hệ gen của chủng nhân tạo NIBRG-14 này được tái tổ hợp gen trên cơ sở sử dụng chủng gốc PR8/34 (A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1)) cung cấp 6 gen khung là PA, PB1, PB2, NP, MA, NS làm nền, còn các gen kháng nguyên HA(H5) và NA(N1) được lấy từ chủng cúm cường độc gây bệnh phân lập năm

2004 tại Việt Nam (A/Vietnam/1194/2004(H5N1)) (Tian et al., 2005) Bằng thao

tác kỹ thuật gen, gen H5 đã bị đột biến làm mất hẳn 4 amino acid RRRL, cùng

với một số đột biến điểm ở các bộ mã ở hai đầu của vùng “độc”, làm thay đổi 3

amino acid tại vùng gây độc Như vậy về mặt miễn dịch học, mặc dù virus được

xử lý làm mất độc tính gây bệnh nhưng vẫn giữ nguyên bản chất đặc tính kháng nguyên bề mặt giống hệt như virus cúm A/H5N1 đã lấy mẫu ban đầu, do vậy, có khả năng tạo kháng thể kháng lại kháng nguyên bề mặt loại virus H5N1 gây bệnh

trong tự nhiên (Doherty et al., 2006; Peyre et al., 2008).

4 Quy trình sản xuất vaccine cúm A H5N1

Bước 1: Thu nhận mẫu bệnh và thông tin tình hình dịch tễ bệnh cúm:

Công đoạn này được tiến hành thường xuyên trong năm bởi các nhân viên

y tế, nhân viên giám sát hoặc Trung tâm cúm quốc gia (National Influenza