Công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TIỂU LUẬN HỌC PHẦN CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT TÊN TIỂU LUẬN: CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ Ở TẾ BÀO THỰC VẬT THÁI NGUYÊN 2014 MỤC LỤC I. MỞ ĐẦU 2 1.1. Đặt vấn đề 2 1. 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 II. NỘI DUNG 3 2.1. Căn cứ khoa hoc 3 2.1.1. Khái niệm 3 2.1.2. Căn cứ khoa học 3 2.2. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật 5 2.2.1. Khả năng nuôi cấy của các loại mô và tế bào 5 2.2.2. Nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô 5 2.3. Các tồn tại của nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô tế bào 7 2.3.1. Tính bất định về mặt di truyền (genetic instability) 7 2.3.2. Sự nhiễm mẫu đất 7 2.3.3. Sản sinh các chất độc từ mô nuôi cấy 8 2.3.4. Hiện tượng thủy tinh hóa 8 2.4. Những công nghệ mới trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 9 2.4.1. Công nghệ vi nhân giống quang tự dưỡng 9 2.4.2. Bioreactor 10 III. KẾT LUẬN 11 TÀI LIỆU THAM KHẢO 12 I. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Từ xa xưa, con người đã biết nhân giống cây trồng bằng rất nhiều biện pháp. Từ cách gieo hạt đến cách mà người ta lấy trực tiếp một nhánh cây để trồng, gọi là giâm cành, chiết cành… hay ghép những thân cây này với thân cây kia bằng cách ghép cành. Do đó, cùng một lúc chúng ta có thể nhân lên hàng loạt cây trồng mà không mất nhiều thời gian để gieo hạt, chờ cho cây con lớn. Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật hiện đại, công nghệ nuôi cấy mô tế bào ra đời, công nghệ này giúp tạo ra hàng loạt cây trồng mới một cách nhanh chóng mà không nhất thiết là từ các hạt của cây mà có thể lấy từ bất kỳ mô bào nào của cây, trừ những mô bào đã hóa gỗ. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những công nghệ quan trọng của Công nghệ Sinh học, nó là nền tảng để nghiên cứu và áp dụng các công nghệ khác trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật. Trong những năm gần đây, nuôi cấy mô tế bào thực vật đã không ngừng phát triển và đem lại hiệu quả thiết thực trong công tác chọn tạo và nhân giống cây trồng. Những thành tựu trên đã góp phần to lớn vào việc thúc đẩy sự phát triển nền nông nghiệp công nghệ cao mang tính cạnh tranh trong thị trường quốc tế. 1. 2. Mục tiêu nghiên cứu Hiểu rõ khái niệm và các căn cứ khoa học của công nghệ nuôi cấy mô tế bào ở thực vật.

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

-TIỂU LUẬN HỌC PHẦN CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT

TÊN TIỂU LUẬN:

CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ Ở TẾ BÀO THỰC VẬT

THÁI NGUYÊN - 2014

MỤC LỤC

I MỞ ĐẦU 2

1.1 Đặt vấn đề 2

1 2 Mục tiêu nghiên cứu 2

II NỘI DUNG 3

2.1 Căn cứ khoa hoc 3

2.1.1 Khái niệm 3

2.1.2 Căn cứ khoa học 3

2.2 Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật 5

2.2.1 Khả năng nuôi cấy của các loại mô và tế bào 5

2.2.2 Nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô 5

2.3 Các tồn tại của nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô tế bào 7

2.3.1 Tính bất định về mặt di truyền (genetic instability) 7

2.3.2 Sự nhiễm mẫu đất 7

2.3.3 Sản sinh các chất độc từ mô nuôi cấy 8

2.3.4 Hiện tượng thủy tinh hóa 8

2.4 Những công nghệ mới trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 9

2.4.1 Công nghệ vi nhân giống quang tự dưỡng 9

2.4.2 Bioreactor 10

III KẾT LUẬN 11

TÀI LIỆU THAM KHẢO 12

I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Từ xa xưa, con người đã biết nhân giống cây trồng bằng rất nhiều biện pháp Từ cách gieo hạt đến cách mà người ta lấy trực tiếp một nhánh cây để trồng, gọi là giâm cành, chiết cành… hay ghép những thân cây này với thân cây kia bằng cách ghép cành Do đó, cùng một lúc chúng ta có thể nhân lên hàng loạt cây trồng mà không mất nhiều thời gian để gieo hạt, chờ cho cây con lớn Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật hiện đại, công nghệ nuôi cấy mô tế bào ra đời, công nghệ này giúp tạo ra hàng loạt cây trồng mới một cách nhanh chóng mà không nhất thiết là từ các hạt của cây mà có thể lấy từ bất kỳ mô bào nào của cây, trừ những mô bào đã hóa gỗ

Công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật là một trong những công nghệ quan trọng của Công nghệ Sinh học, nó là nền tảng để nghiên cứu và áp dụng các công nghệ khác trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật Trong những năm gần đây, nuôi cấy mô tế bào thực vật đã không ngừng phát triển và đem lại hiệu quả thiết thực trong công tác chọn tạo và nhân giống cây trồng Những thành tựu trên đã góp phần to lớn vào việc thúc đẩy sự phát triển nền nông nghiệp công nghệ cao mang tính cạnh tranh trong thị trường quốc tế

1 2 Mục tiêu nghiên cứu

- Hiểu rõ khái niệm và các căn cứ khoa học của công nghệ nuôi cấy mô tế bào ở thực vật

- Quy trình nuôi cấy mô tế bào ở thực vật

- Các vấn đề tồn tại trong nuôi cấy mô tế bào ở thực vật và công nghệ mới trong nuôi cấy mô tế bào

II NỘI DUNG 2.1 Căn cứ khoa hoc

2.1.1 Khái niệm

Nuôi cấy mô ở tế bào thực vật là một phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy mà nguyên liệu là thực vật hoàn toàn sạch bệnh trên môi trường nhân tạo trong điều kiện vô trùng

Nuôi cấy mô ở tế bào thực vật còn gọi là nuôi cấy thực vật in vitro (trong ống nghiệm) để phân biệt với các quá trình nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên ngoài ống nghiệm, gọi là nuôi cấy in vivo

Nuôi cấy mô ở tế bào thực vật bao gồm:

- Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành

- Nuôi cấy các cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn…

- Nuôi cấy phôi non và phôi trưởng thành

- Nuôi cấy mô sẹo

- Nuôi cấy protoplast (nuôi cấy tế bào trần)

- Nuôi cấy tế bào đơn (huyền phù tế bào)

Hiện nay trên thế giới kĩ thuật nuôi cấy mô đặc biệt kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào được áp dụng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới nhất là trong cây trồng và vật nuôi, nhằm tăng năng suất trong trồng trọt và chăn nuôi đáp ứng được nhu cầu lương thực, thực phẩm cho xã hội loài người ngày nay

2.1.2 Căn cứ khoa học

* Tính toàn năng của tế bào thực vật

Lần đầu tiên Haberlandt (1992) đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh và sau này đó chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy

mô tế bào thực vật

Ngày nay đã chứng minh được tính toàn năng của tế bào Tính toàn năng theo quan điểm sinh học hiện đại chính là mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết của một cơ thể sinh vật đó Khi

gặp điều kiện thuận lợi mỗi tế bào đều có khả năng phát triển tạo thành một cơ thể mới hoàn chỉnh

* Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào

- Sự phân hóa tế bào: là sự chuyển các tế bào phôi sinh ban đầu hình thành các tế bào mô chuyên hóa đảm nhận các chức năng khác nhau Ví dụ: mô dậu ở lá làm nhiệm vụ quang hợp, mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ…

Sơ đồ: các giai đoạn phân hóa của tế bào

Tế bào phôi sinh -> Tế bào dãn -> Tế bào phân hóa (có chức năng riêng biệt)

- Sự phản phân hóa tế bào: Khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên hóa chúng vẫn không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình Trong những điều kiện nhất định cần thiết nếu chúng gặp điều kiện thích hợp lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ Quá trình này gọi là sự phân hóa tế bào nó ngược lại với quá trình phân hóa tế bào

- Sơ đồ: Mối quan hệ giữa quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào

Ví dụ: khi nuôi cấy mô thuốc lá tế bào đã phân hóa của lá gặp điều kiện thuận lợi của môi trường sẽ phân hóa và tiếp tục phân chia liên tục tạo thành các

mô sẹo Các mô sẹo không còn là tế bào có chức năng như tế bào lá nữa Nếu chuyển các mô sẹo sang các môi trường khác nhau tùy theo thành phần môi trường mà tế bào mô sẹo có thể phân hóa theo hướng hình thành chồi, rễ, và có thể tạo thành cây hoàn chỉnh

Như vậy, quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào Vậy kĩ

thuật nuôi cấy mô tế bào xét cho cùng chính là kĩ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật một cách định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào

Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật là auxin và xitokinin Tỷ lệ của hai nhóm chất này trong môi trường sẽ tạo ra sự phát sinh hình thái khác nhau

2.2 Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.2.1 Khả năng nuôi cấy của các loại mô và tế bào

Về nguyên tắc, mọi loại tế bào của một cơ thể thực vật đều giữ được tính toàn năng có nghĩa là khả năng nuôi cấy thành công Tuy nhiên trong thực tiễn các loại tế bào và các loại mô khác nhau thì có biểu hiện rất khác nhau về triển vọng nuôi cấy thành công Một nguyên tắc cơ bản được tổng kết là càng gần trạng tái tế bào phôi bao nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu Như vậy, tế bào và mô của phôi non là triển vọng nhất, sau đó là đến các

tế bào đỉnh sinh trưởng ở trạng thái hoạt động (như chồi ngọn, đầu rễ …) hay ở trạng thái ngủ nghỉ (như phôi mầm, chồi nách …) Cũng rất gần với phôi là các

tế bào sinh dục như noãn bào, tế bào hạt phấn ở giai đoạn non…

2.2.2 Nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô

* Các bước chính trong nhân giống in vitro

Theo Georger (1993) quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm các bước sau:

Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ (các cây cho mẫu nuôi cấy)

- Sạch bệnh đặc biệt là các bệnh virus trong giai đoạn sinh trưởng mạnh

- Các cây mẹ trồng trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu để cấy

Bước 2: Nuôi cấy khởi động: là giai đoạn khử trùng mẫu đưa vào nuôi

cấy in vitro Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu sau: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ

sống sót cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt Chú ý khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây thì sẽ đạt hiệu quả cao

Bước 3: Nhân nhanh: là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình

thái và tăng số lượng thông qua các con đường như hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính Trong bước này phải cần chú ý đến môi trường nuôi cấy và các điều kiện ngoại cảnh để có hiệu quả cao nhất

Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ

Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên

Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao cây sinh trưởng mạnh cần đảm bảo một số yêu cầu sau:

- Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định

- Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp thoát nước…

- Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng như có chế độ dinh dưỡng phù hợp

* Ý nghĩa

Đây là lĩnh vực mang lại hiệu quả kinh tế cao Một trong những ưu việt của phương pháp này là việc sử dụng các mô nuôi cấy có kích thước nhỏ Ở kích thước nhỏ, sự tương tác giữa các tế bào trong mô sẽ đơn giản hơn Mô nuôi cấy

sẽ dễ phân hóa và sau đó dễ tái sinh hơn

Kỹ thuật nhân nhanh in vitro có những ưu việt hơn mà các phương pháp khác không có được như: có thể sản xuất cây giống trên quy mô công nghiệp, có

hệ số nhân giống cao và tạo ra các cá thể có hệ gen hoàn toàn đồng nhất Kỹ thuật nhân nhanh được ứng dụng vào những mục đích sau:

- Duy trì và nhân nhanh các keieru gen quý làm vật liệu cho công tác chọn tạo giống

- Nhân nhanh các loài cây cảnh, loài hoa khó trồng bằng hạt

- Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus.

- bảo quản tập đoàn gen

Với phương pháp này hiện nay người ta đã tạo ra được nhiều giống cây nông nghiệp có năng suất cao tạo được các loài cây cảnh, cây lâm nghiệp được phổ biến nhanh vào trong sản xuất

2.3 Các tồn tại của nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô tế bào

2.3.1 Tính bất định về mặt di truyền (genetic instability)

Mục đích của nhân giống in vitro là tạo ra quần thể cây đồng nhất với số lượng rất lớn Tuy nhiên, trong một số trường hợp phương pháp này cũng tạo ra những biến dị soma Tần số biến dị cũng hoàn toàn khác nhau và không lặp lại Cây tạo ra do nuôi cấy tế bào mô sẹo có nhiều biến dị hơn so với nuôi cấy chồi đỉnh

Những nhân tố gây ra biến dị tế bào soma có thể là:

- Kiểu di truyền: tần số biến dị ảnh hưởng bởi genotyp của các loài cây trồng khác nhau Nói chung cây càng có mức bội thể cao thì càng dễ biến dị

- Số lần cấy chuyển càng nhiều thì độ biến dị càng cao Theo Amstrong và Philips (1998): khi nuôi cấy lâu dài thường gây ra biến dị nhiễm sắc thể

- Loại mô: nói chung nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh in vitro ít

bị biến dị hơn so với nuôi cấy các cơ quan khác

2.3.2 Sự nhiễm mẫu đất

Các vi sinh vật như nấm, vi khuẩn nói chung đều bị loại trừ khi khử trùng mẫu đưa vào nuôi cấy Tuy nhiên, một số loại vi khuẩn như: Agrobacterium, Bacills, Corylabacterium, Erwinnia và Pseudomonas có thể xâm nhiễm vào mô dẫn, tồn tại trong mô và bắt đầu gây tác hại khi tế bào bắt đầu phân chia (sau 1-2 tuần nuôi cấy) Để khắc phục được hiện tượng trên trước hết cần lựa chọn cây

mẹ đúng tiêu chuẩn Có thể sử dụng một số chất kháng sinh để chống hiện tượng nhiễm khuẩn và nấm Nhưng mô thực vật rất mẫn cảm với kháng sinh và phản ứng đến kiểu di truyền do đó cần rất thận trọng khi sử dụng kháng sinh Chất

kháng sinh thường gây ra những hủy hoại ở ty thể và lạp thể nên có ảnh hưởng đến di truyền tế bào chất

2.3.3 Sản sinh các chất độc từ mô nuôi cấy

Trong nuôi cấy mô thường quan sát thấy hiện tượng hóa nâu hay đen mẫu, mẫu này có thể khuếch tán trong môi trường Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy

có chứa nhiều chất tanin hoặc hydroxyphenol Thí dụ các chất phenol eucomicacid và tyramine đã làm hóa nâu mẫu cây lan Cattleya khi nuôi cấy Các phương pháp trừ sự hóa nâu:

- Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuô cấy (0,1-0,3%), phương pháp này đặc biệt có hiệu quả trên các loài phong lan Phalenopsis, Cattleya và Aerides Tuy nhiên than hoạt tính có thể làm chậm quá trình nhân nhanh cây do hấp phụ một số chất điều tiết sinh trưởng và dinh dưỡng cần thiết khác

- Bổ sung polyvinyl pyrolidone (PVP) có tác dụng khử nâu hóa tốt ở mẫu một số cây ăn quả (táo, hồng)

- Sử dụng mô non, gây vết thương nhỏ nhất khi khử trùng

- Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic và xytric vài giờ trước khi cấy

- Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng, oxi thấp, không có ánh sáng (1-2 tuần)

- Cấy chuyển mẫu liên tục (1-2 ngày/lần) sang môi trường tươi trong 1-2 tuần

2.3.4 Hiện tượng thủy tinh hóa

Cây bị “thủy tinh hóa” – thân lá cây mọng nước, trong suốt, cây rất khó sống khi đưa ra ngoài môi trường do bị mất nước rất mạnh Thường xảy ra khi nuôi cấy trong môi trường lỏng hay môi trường ít agar, sự trao đổi khí thấp Đặc biệt thường xảy ra khi nuôi cấy táo, mận, hoa cẩm chướng, hoa đồng tiền và hoa cúc Cây bị thủy tinh hóa thường có hàm lượng lớp sáp bảo vệ thấp, cấu tạo có nhiều phân tử phân cực nên dễ hấp thụ nước Cây in vitro thường có mật độ khí khổng cao, khí khổng có dạng tròn chứ không elip, khí khổng mở liên tục trong

quá trình nuôi cấy Để tránh hiện tượng thủy tinh hóa có thể tiến hành một số giải pháp:

- Giảm sự hút nước của cây bằng cách tăng nồng độ chất đường hoặc các chất gây áp suất thẩm thấu cao

- Giảm nồng độ các chất chứa nito trong môi trường

- Giảm sự sản sinh ethylen trong bình nuôi cấy

- Sử lý axit adsixic hoặc một số chất ức chế sinh trưởng

2.4 Những công nghệ mới trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.4.1 Công nghệ vi nhân giống quang tự dưỡng

Là bước phát triển của công nghệ nuôi cấy mô tế bào do giáo sư T.Koyoki Kozai đề xuất và nghiên cứu từ hơn 2 thập kỷ qua Công trình nghiên cứu tập chung vào vấn đề nhân giống cây nuôi cấy mô trên môi trường không có đường nhưng được điều khiển chủ động chế độ ánh sáng và cung cấp CO2 Công nghệ này đã được thử nghiệm thành công trên nhiều đối tượng cây trồng như cà chua, khoai lang, rau spinach, dưa chuột, xà lách, keo, cà phê, xoài, tre, thông… Công nghệ này đang được tiếp tục hoàn thiện để làm cơ sở cho hệ thống nhân giống công nghiệp hóa

Lợi ích của công nghệ vi nhân giống quang tự dưỡng:

- Tốc độ sinh trưởng, chất lượng và tỷ lệ sống của mô thực vật được nâng cao ở tất cả các bước trong nhân giống trong điều kiện tự dưỡng

- Thiệt hại do sự nhiễm mẫu được hạn chế do không sử dụng đường trong môi trường

- Tỷ lệ đột biến có thể được giảm vì cây được nuôi trong điều kiện môi trường giống tự nhiên

- Tự động hóa và do đó giảm được chi phí lao động

Nhược điểm:

- Chi phí cao cho việc điều khiển môi trường (ánh sáng, nhiệt độ, CO2, O2)

- Cây vấn sinh trưởng trong điều kiện vô trùng vì vậy dẫn đến chi phí cao cho hệ thống bình nuôi chuyên dụng và chuẩn bị giá thể

2.4.2 Bioreactor

* Sự phát triển công nghệ Bioractor trong vi nhân giống cây trồng

Takayama và Miasawa là những người đầu tiên nghiên cứu sử dụng bioreactor vào nhân giống cây trồng: nhân củ siêu nhỏ khoai tây, củ giống hoa

ly, hoa lan hồ điệp, cỏ ngọt với công suất 20000 chồi/bình bioreator 500lit…

Công nghệ này cho phép nhân nhanh vô hạn các giống cây trồng nhờ thiết

bị bioreator hoàn toàn tự động hóa Ví dụ: một bioreactor inbro – mier (rung và trộn) trang bị với các ống silicone sục khí tự do đã có khả năng sản xuất 100000 phôi vô tính của cây trạng nguyên trong một lít dung dịch huyền phù nếu như dung dịch đó được đặt trên một tấm giấy lọc và phát triển trong 4 tuần

Tuy nhiên, công nghệ này đòi hỏi thiết bị hiện đại và đắt tiền, vận hành rất phức tạp đặc biệt là khâu chống nhiễm cho huyền phù nuôi cấy

* Thuận lợi của hệ thống bioreactor so với môi trường nuôi cấy trong bình

- Thể tích nuôi cấy tăng, thường là ít nhất 1 lít Điều này cho phép sản xuất nhiều phôi, chồi hơn mà không cần những kỹ thuật cao cấp

- Hầu hết các bình bioreator được thiết kế với một cơ chế khuấy, bằng cơ học hay bằng thổi khí, để duy trì nuôi cấy gần như đồng dạng

- Khi thao tác nuôi cấy liên tục, môi trường nuôi cấy và môi trường vật lý

có thể được kiểm soát thích hợp cho sinh trưởng Có những chỉ dẫn về các nhân

tố môi trường như pH và oxygen hòa tan Điều này không thể thực hiện được với hệ thống nuôi cấy bình tam giác

* Cách nhân giống bằng bioreactor

Bioreator có thể được ứng dụng để vi nhân giống thực vật trên quy mô thương mại theo 3 hướng:

(1) Tạo chồi (chuối, dứa, hoa lan…)

(2) Tạo củ in vitro (khoai tây, lily…)

(3) Tạo phôi soma (cà phê, cao su,…)