Nghiên cứu xác định bệnh virus đậu đỏ tại hải phòng năm 2013

50 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI      NGUYỄN ðỨC HOAN NGHIÊN CỨU XÁC ðỊNH BỆNH VIRUS ðẬU ðỖ TẠI HẢI PHÒNG NĂM 2013 CHUYÊN NGÀNH : BẢO VỆ THỰC VẬT Mà SỐ : 60.62.10 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. HÀ VIẾT CƯỜNG HÀ NỘI - 2013 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam đoan, các số liệu và kết quả nghiên cứu trình bày trong luận văn này là trung thực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày … tháng … năm 2013 Tác giả Nguyễn ðức Hoan Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Hà Viết Cường. Thầy ñã luôn tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện ñề tài và hoàn thành luận văn tốt nghiệp của mình. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo Khoa Sau ðại học; Khoa Nông học và ñặc biệt là các thầy, cô giáo, các cán bộ nhân viên Bộ môn Bệnh cây - Trường ðH Nông Nghiệp Hà Nội ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực hiện ñề tài và hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia ñình, bạn bè ñã nhiệt tình giúp ñỡ, cộng tác và khích lệ tôi thực hiện ñề tài tốt nghiệp này. Hà Nội, ngày … tháng … năm 2013 Tác giả Nguyễn ðức Hoan Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iii MỤC LỤC Lời cam đoan………………………………………………………………… i Lời cảm ơn………………………………………………………………… ii Mục lục………………………………………………………………………iii Danh mục bảng……………………………………………………………….vi Danh mục đồ thị…………………………………………………………… vii Danh mục viết tắt………………………………………………………… viii 1. MỞ ðẦU 50 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích và yêu cầu của đề tài 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Bệnh virus hại cây họ đậu 3 2.1.1. Soybean mosaic virus (SMV, chi Potyvirus) 3 2.1.2. Bean common mosaic virus (BCMV, chi Potyvirus) 6 2.1.3. Các begomovirus gây hại cây họ đậu 10 2.2. Những nghiên cứu về bệnh virus hại cây họ đậu tại Việt Nam 12 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 14 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu 14 3.1.2. Địa điểm nghiên cứu 14 3.1.3. Thời gian nghiên cứu 14 3.2. Vật liệu nghiên cứu 14 3.3. Nội dung nghiên cứu 15 3.3.1. Phương pháp nghiên cứu 15 3.3.2. Phương pháp kiểm tra virus bằng PCR 18 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 21 4.1. Điều tra bệnh virus hại cây họ đậu tại Hải Phòng năm 2013 21 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iv 4.2. Xác định virus bằng ELISA từ các mẫu đậu đỗ thu tại Hải Phòng năm 2013 28 4.3. Xác định begomovirus bằng PCR các mẫu đậu đỗ thu tại Hải Phòng năm 2013 51 4.3.1. Phát hiện begomovirus bằng PCR 51 4.3.2. Phát hiện legumovirus bằng PCR …………………………………52 4.3.3. Phát hiện KuMV bằng PCR 55 4.3.4. Phát hiện MYMV bằng PCR 57 4.4. Kiểm tra ELISA phát hiện một số virus truyền qua hạt đậu đỗ nhập khẩu 60 4.5. Kiểm tra ELISA 62 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Các kít ELISA phát hiện virus đậu đỗ (Viện DSMZ) 16 Bảng 3.2. Các mồi được sử dụng trong nghiên cứu 19 Bảng 4.1. Điều tra bệnh virus trên đậu tương tại Hải Phòng năm 2013 23 Bảng 4.2. Điều tra bệnh virus trên đậu xanh tại Hải Phòng năm 2013 25 Bảng 4.3. Điều tra bệnh virus trên đậu đen tại Hải Phòng năm 2013 26 Bảng 4.4. Phát hiện các potyvirus (chi Potyvirus) trên các mẫu đậu đỗ thu tại Hải Phòng năm 2013 30 Bảng 4.5. Phát hiện các comovirus (chi Comovirus) trên các mẫu đậu đỗ thu tại Hải Phòng năm 2013 34 Bảng 4.6. Phát hiện các luteovirus (họ Luteoviridae) trên các mẫu đậu đỗ thu tại Hải Phòng năm 2013 38 Bảng 4.7. Phát hiện các carlavirus (họ Betaflexiviridae ) trên các mẫu đậu đỗ thu tại Hải Phòng năm 2013 41 Bảng 4.8. Phát hiện CMV (Cucumber mosaic virus) trên các mẫu đậu đỗ thu tại Hải Phòng năm 2013 44 Bảng 4.9. Phát hiện TMV, CPMoV, SBMV trên các mẫu đậu đỗ thu tại Hải Phòng năm 2013 47 Bảng 4.10. PCR phát hiện begomovirus trên các mẫu đậu đỗ thu tại Hải Phòng năm 2013 dùng cặp mồi chung BegoAFor1/BegoARev1 52 Bảng 4.11. PCR phát hiện legumovirus trên các mẫu đậu đỗ thu tại Hải Phòng năm 2013 dùng cặp mồi chung LegA-cpF1 và LegA- cpR1 54 Bảng 4.12. PCR phát hiện Kudzu mosaic virus (KuMV) trên các mẫu đậu đỗ thu tại Hải Phòng năm 2013 dùng cặp mồi đặc hiệu KuA-For1 và KuA-Rev1 56 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vi Bảng 4.13. PCR phát hiện Mungbean yellow mosaic virus (MYMV) trên các mẫu đậu đỗ thu tại Hải Phòng năm 2013 dùng cặp mồi đặc hiệu MyA-For1 và MyA-Rev1 59 Bảng 4. 14. Danh lục các mẫu đậu đỗ thu thập tại các cửa khẩu cảng biển Hải Phòng 60 Bảng 4.15. Kiểm tra ELISA phát hiện BCMV (Bean common mosaic virus) chủng BlCMV trên các mẫu đậu đỗ thu thập tại các cửa khẩu cảng biển Hải Phòng 63 Bảng 4.16. Kiểm tra ELISA phát hiện BYMV (Bean yellow mosaic virus) chủng BlCMV trên các mẫu đậu đỗ thu thập tại các cửa khẩu cảng biển Hải Phòng 64 Bảng 4.17. Kiểm tra ELISA phát hiện CMV (Cucumber mosaic virus) trên các mẫu đậu đỗ thu thập tại các cửa khẩu cảng biển Hải Phòng 65 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vii DANH MỤC HÌNH Hình 4.1. Điều tra bệnh virus trên đậu đỗ tại Hải Phòng, 2013 22 Hình 4.2. Triệu chứng bệnh virus trên đậu tương Hải Phòng: 24 Hình 4.3. Triệu chứng bệnh virus trên đậu xanh Hải Phòng: Khảm 25 Hình 4.4. Triệu chứng bệnh virus trên đậu đen Hải Phòng 27 Hình 4.5. Triệu chứng bệnh khảm lá virus trên đậu đũa Hải Phòng 27 Hình 4.6. Kiểm tra ELISA phát hiện virus trên mẫu đậu đỗ thu tại Hải Phòng 2013……………………………………………………… 28 Hình 4.7. PCR phát hiện begomovirus trên các mẫu đậu đỗ thu tại Hải Phòng năm 2013 dùng cặp mồi chung BegoAFor1/BegoARev1 53 Hình 4.8. PCR phát hiện legumovirus trên các mẫu đậu đỗ thu tại Hải Phòng năm 2013 dùng cặp mồi chung LegA-cpF1 và LegA-cpR1 55 Hình 4.9. PCR phát hiện Kudzu mosaic virus (KuMV) trên các mẫu đậu đỗ thu tại Hải Phòng năm 2013 dùng cặp mồi đặc hiệu KuA- For1 và KuA-Rev1 57 Hình 4.10. Cây sắn dây nhiễm KuMV cạnh ruộng đậu tương nhiễm KuMV tại Hải Phòng (ảnh giữa). Triệu chứng nhiễm KuMV trên đậu tương (ảnh trái) và trên sắn dây (ảnh phải) 57 Hình 4.11. Thu thập và phân loại mẫu hạt đậu đỗ nhập khẩu thu thập tại cảng Hải phòng 61 Hình 4.12 . Chuẩn bị mẫu kiểm tra ELISA mậu đậu đỗ nhập khẩu 61 Hình 4.13: Kiểm tra ELISA phát hiện virus trên đậu đỗ nhập khẩu 62 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 1 1. MỞ ðẦU 1.1. ðặt vấn ñề Cây đậu đỗ (Fabaceae) là nhóm cây trồng quan trọng của Việt Nam và thế giới do có hàm lượng dinh dưỡng, đặc biệt là protein cao. Cây họ đậu, tùy theo loài, có thể được sử dụng như cây rau, cây công nghiệp, thậm chí cây dược liệu. Ngoài tác dụng về dinh dưỡng, cây họ đậu là cây trồng duy nhất có tác dụng cải tạo đất, làm tăng độ màu mỡ cho đất nông nghiệp. Một trong những yếu tố chính hạn chế năng suất đậu đỗ là sâu bệnh hại, trong đó có các bệnh về virus. Thành phần virus hại cây họ đậu rất đa dạng. Trên thế giới, ít nhất 76 virus thuộc các loài khác nhau đã được xác định gây hại trên cây họ đậu (CABI, 2007). Ở Việt Nam, cho tới nay có rất ít các công bố về thành phần virus nhiễm trên cây họ đậu. Đầu tiên là một nghiên cứu dựa trên phân tích miễn dịch liên kết men (Enzyme Liked Immunosorbent Assay - ELISA) và giải trình tự từ các mẫu hạt giống đậu đỗ thu thập ở miền Bắc Việt Nam. Dựa trên nghiên cứu này, các tác giả (Ngô Bích Hảo và cs, 2003) đã xác nhận sự có mặt của Bean common mosaic virus (BCMV) trên hạt đậu (Vigna unguiculata) và cho thấy tỷ lệ hạt đậu nhiễm virus là từ 0,8 tới 12,4 %. Nghiên cứu thứ hai là các phân tích trình tự gen từ 9 mẫu BCMV phân lập từ các cây họ đậu biểu hiện triệu chứng bệnh như đậu đen, đậu đỏ, đậu đũa, đậu tương và muồng 3 lá (một cây che phủ cà phê) thu thập tại nhiều tỉnh ở Việt Nam (Hà Viết Cường và cs, 2008). Gần đây hơn, một begomovirus là Kudzu mosaic virus (KuMV) cũng mới được phát hiện thấy gây hại trên cây đậu tương tại miền Bắc Việt Nam (Hà Viết Cường, 2011). Tuy nhiên, trên đồng ruộng triệu chứng nhiễm virus thường quan sát thấy trên các cây họ đậu. Việc xác định thành phần bệnh virus hại cây họ đậu là Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 2 yêu cầu quan trọng nhằm cung cấp thông tin khoa học cho công tác phòng chống như xây dựng và điều chỉnh danh mục đối tượng kiểm dịch thực vật và tạo giống kháng bệnh. Xuất phát từ tình hình thực tiễn trên, được sự phân công của Bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học, Trường Đại học Nông nghiệp Hải Phòng, dưới sự hướng dẫn của TS. Hà Viết Cường, chúng tôi tiến hành nghiên cứu, thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xác ñịnh bệnh virus hại ñậu ñỗ tại Hải Phòng năm 2013” 1.2. Mục ñích và yêu cầu của ñề tài 1.2.1. Mục ñích Xác định thành phần bệnh virus trên cây họ đậu tại Hải Phòng. 1.2.2. Yêu cầu - Điều tra tình hình bệnh virus hại cây họ đậu tại một số vùng thuộc Hải Phòng năm 2013. - Thu thập mẫu bệnh virus tại một số vùng thuộc Hải Phòng và phụ cận năm 2013 - Mô tả các dạng triệu chứng bệnh trên cây họ đậu do virus gây ra. - Xác định bệnh virus trên cây họ đậu bằng phản ứng ELISA và PCR (Polymerase chain reaction). [...]... danh pháp: Virus có ARN s i ñơn dương (ssRNA), h Potyviridae, chi Potyvirus, loài Bean commom mosaic virus Virus còn có m t s tên khác như Bean common mosaic potyvirus, Bean mosaic virus, Bean virus 1, Bean western mosaic virus, Phaseolus virus 1, Mungbean mosaic virus, Common bean mosaic virus (CABI, 2010b) Tên thư ng ñư c dùng ph bi n là Bean commom mosaic virus, vi t t t BCMV Theo k t qu nghiên c... n n, các kháng huy t thanh c a các virus th nghi m - Các hoá ch t dùng trong RT - PCR 3.3 N i dung nghiên c u 1 Mô t các d ng tri u ch ng b nh trên cây h ñ u do virus gây ra 2 ði u tra di n bi n b nh virus h i cây h ñ u t i m t s vùng thu c H i Phòng năm 2013 3 Thu th p m u b nh virus t i m t s vùng thu c H i Phòng năm 2013, k c m u h t nh p kh u 4 Xác ñ nh b nh virus trên cây h ñ u và cây thí nghi... u ch ng b nh kh m lá virus trên ñ u ñũa H i Phòng Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 27 4.2 Xác ñ nh virus b ng ELISA t các m u ñ u ñ thu t i H i Phòng năm 2013 Cây h ñ u b r t nhi u virus gây h i Tri u ch ng b nh virus trên cây h ñ u thư ng ít có giá tr ch n ñoán vì nhi u virus có th t o ra các tri u ch ng ñ c trưng Cho t i nay m i ch có 2 virus ñư c công b chính... danh pháp: Virus có ARN s i ñơn dương (ssRNA), h Potyviridae, gi ng Potyvirus, loài Soybean mosaic potyvirus, ngoài ra virus còn có m t s tên khác như Soja virus 1, Soybean virus 1 Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 3 Tên thư ng dùng Soybean mosaic virus, vi t t t SMV SMV và các Potyvirus như Cowpea aphid-borne mosaic virus, Passionfruit woodiness virus, Zucchini... u H i Phòng và ph c n - Trung tâm Nghiên c u B nh cây nhi t ñ i - Trư ng ð i h c Nông nghi p H i Phòng 3.1.3 Th i gian nghiên c u - Năm 2013 3.2 V t li u nghiên c u - M u cây b nh có tri u ch ng ñi n hình ñư c thu th p t các ñ a ñi m ñi u tra, sau ñó ñư c b o qu n khô b ng h t Silicagel ñ ki m tra virus * Thi t b nghiên c u: Máy ñ c b n ELISA, máy PCR, t l nh b o qu n m u, t ñ nh ôn * D ng c nghiên. .. 2 virus m i thu c chi Begomovirus nhi m trên cây h ñ u là kudzu mosaic virus (KuMV) trên cây s n dây và mimosa yellow leaf curl virus (MiYLCV) trên cây x u h Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 13 3 V T LI U, N I DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 3.1 ð i tư ng, ñ a ñi m và th i gian nghiên c u 3.1.1 ð i tư ng nghiên c u B nh virus h i cây h ñ u 3.1.2 ð a ñi m nghiên. .. trung t i hai huy n An Dương và Ki n Th y Trong năm 2013, chúng tôi ñã ñi u tra tình hình b nh virus trên m t lo t các cây ñ u ñ t i H i Phòng, t p trung vào 2 huy n An Dương và Ki n Th y (Hình 4.1) Hình 4.1 ði u tra b nh virus trên ñ u ñ t i H i Phòng, 2013 4.1.1 B nh virus trên ñ u tương Quan sát ñ ng ru ng cho th y ñ u tương bi u hi n 3 tri u ch ng nhi m virus là (A) nhăn-bi n d ng-lùn, (B) kh m vàng... calico mosaic virus (BcaMV) gây h i trên cây ñ u cove leo ñư c công b Mexico năm 1988 (ICTV, 2006) - Bean golden yellow mosaic virus (BGYMV) gây h i trên cây ñ u cove leo ñư c mô t l n ñ u tiên Colombia năm 1976 - Bean dwarf mosaic virus (BDMV), cowpea golden mosaic virus (CpGMV), vigna mungo yellow mosaic virus (VMYMV), soybean blistering mosaic virus (SbBMV), bean leaf curl Madagascar virus (BLCMV)... mosaic necrosis virus (BCMNV, chi Potyvirus) Ngô Bích H o và cs (2003) ñã xác nh n s có m t c a BCMV trên h t ñ u (V unguiculata spp.) và cho th y t l h t ñ u nhi m virus là t 0,8 ñ n 12,4% Tác gi cũng ñã xác ñ nh ñư c các virus truy n qua h t gi ng mi n b c Vi t Nam như BCMV, BlCMV, cowpea mosaic virus (CPMV), SCPMV, CMV Hà Vi t Cư ng và cs (2008), d a trên phân tích ñ u 3’ c a b gen potyvirus ñã phát... 4 Bean yellow mosaic virus BYMV DAS-ELISA AS-0717 5 Broad bean true mosaic virus BBTMV DAS-ELISA AS-0152 6 Broad bean wilt virus 2 BBWV-2 DAS-ELISA AS-0862 7 Cowpea aphid-born mosaic virus CABMV DAS-ELISA AS-0417 8 Cowpea mild mottle virus CPMMV DAS-ELISA AS-0907 9 Cowpea mosaic virus CPMV DAS-ELISA AS-0012 10 Cowpea mottle virus CPMoV DAS-ELISA AS-0212 11 Cowpea severe mosaic virus CPSMV DAS-ELISA . tại Hải Phòng năm 2013 25 Bảng 4.3. Điều tra bệnh virus trên đậu đen tại Hải Phòng năm 2013 26 Bảng 4.4. Phát hiện các potyvirus (chi Potyvirus) trên các mẫu đậu đỗ thu tại Hải Phòng năm 2013. Xác định virus bằng ELISA từ các mẫu đậu đỗ thu tại Hải Phòng năm 2013 28 4.3. Xác định begomovirus bằng PCR các mẫu đậu đỗ thu tại Hải Phòng năm 2013 51 4.3.1. Phát hiện begomovirus bằng. Hình 4.1. Điều tra bệnh virus trên đậu đỗ tại Hải Phòng, 2013 22 Hình 4.2. Triệu chứng bệnh virus trên đậu tương Hải Phòng: 24 Hình 4.3. Triệu chứng bệnh virus trên đậu xanh Hải Phòng: Khảm 25