Xác định bệnh virus hại đậu đỗ tại hải phòng

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN THỊ TÂM XÁC ĐỊNH BỆNH VIRUS HẠI ĐẬU ĐỖ TẠI HẢI PHÒNG Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 60 62 01 12 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Hà Viết Cường NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tôi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa công bố cơng trình khoa học khác Tơi xin cam đoan thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Trần Thị Tâm i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp cố gắng thân em nhận nhiều quan tâm giúp đỡ nhiệt tình thầy cô, bạn bè người thân Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Hà Viết Cường, người tận tình hướng dẫn, bảo, khuyến khích em nỗ lực suốt trình thực luận văn Em xin gửi lời cảm ơn tới tập thể thầy, cô giáo môn Bệnh – Khoa Nông Học – Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam tạo điều kiện giúp đỡ em trình thực đề tài Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến Lãnh đạo tập thể cán Chi cục Kiểm dịch thực vật Vùng – Hải Phòng, Trung tâm Nghiên cứu Bệnh Nhiệt đới – Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ đóng góp cho em ý kiến quý báu suốt q trình học tập nghiên cứu hồn thành đề tài Em xin gửi lời cảm ơn tới bà nông dân tạo điều kiện thuận lợi cho em thời gian thực đề tài Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè ln động viên, khích lệ, tạo điều kiện tốt cho em hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Trần Thị Tâm ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract x Phần Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Yêu cầu Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Tầm quan trọng số họ đậu 2.2 Đặc điểm chung chi Begomovirus 2.2.1 Đặc điểm hình thái 2.2.2 Cấu trúc genome Begomovirus 2.2.3 Cấu trúc phân tử DNA-A 2.2.4 Cấu trúc phân tử DNA-B 2.2.5 Phân loại Begomovirus 2.2.6 Triệu chứng bệnh Begomovirus 2.2.7 Phạm vi ký chủ 2.2.8 Lan truyền 2.3 Một số virus quan trọng họ đậu 2.3.1 Bean common mosaic virus (BCMV) 2.3.2 Soybean mosaic virus (SMV) 13 2.3.3 Kudzu mosaic virus (KuMV) 16 2.3.4 French bean seavere leaf curl virus (FbSLCV) 17 Phần Nội dung, vật liệu phương pháp nghiên cứu 18 3.1 Đối tượng, địa điểm thời gian nghiên cứu 18 iii 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18 3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 18 3.1.3 Thời gian nghiên cứu: 2016-2017 18 3.2 Nội dung nghiên cứu 18 3.3 Vật liệu nghiên cứu 18 3.3.1 Mẫu bệnh cây, thí nghiệm 18 3.3.2 Các dòng vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens mang cấu trúc xâm nhiễm KuMV FbSLCV 18 3.3.3 Dụng cụ nghiên cứu 19 3.3.4 Hoá chất 19 3.4 Phương pháp nghiên cứu 19 3.4.1 Phương pháp điều tra đồng 19 3.4.2 Phương pháp thu thập bảo quản mẫu bệnh 20 3.4.3 Phương pháp kiểm tra virus ELISA gián tiếp 20 3.4.4 Phương pháp kiểm tra virus PCR RT-PCR 21 3.4.5 Kỹ thuật Agroinoculation 24 3.5 Phương pháp tính xử lý số liệu 25 Phần Kết nghiên cứu 26 4.1 Điều tra bệnh virus hại đậu đỗ Hải Phòng năm 2016-2017 26 4.1.1 Tình hình sản xuất đậu đỗ Hải Phòng 26 4.1.2 Điều tra bệnh virus đậu cove Hải Phòng năm 2016-2017 26 4.1.3 Điều tra bệnh virus đậu xanh Hải Phòng năm 2016-2017 29 4.1.4 Điều tra bệnh virus đậu đen Hải Phòng năm 2016-2017 30 4.1.5 Điều tra bệnh virus đậu tương Hải Phòng năm 2016-2017 30 4.1.6 Điều tra bệnh virus đậu đũa Hải Phòng năm 2016-2017 32 4.2 Phát virus Elisa mẫu đậu đỗ thu thập Hải Phòng 20162017 32 4.2.1 Phát Potyvirus ELISA mẫu đậu đỗ thu thập Hải Phòng 33 4.2.2 Phát Bean common mosaic virus (BCMV) ELISA mẫu đậu đỗ thu thập Hải Phòng 35 iv 4.2.3 Phát Bean yellow mosaic virus (BYMV) ELISA mẫu đậu đỗ 37 4.2.4 Phát Bean common mosaic necrosis virus (BCMNV) ELISA 39 4.2.5 Phát Soybean mosaic virus (SMV) ELISA mẫu đậu đỗ thu thập Hải Phòng 41 4.2.6 Phát Cucumber mosaic virus (CMV) ELISA mẫu đậu đỗ 43 4.2.7 Phát Bean leaf roll virus (BLRV) ELISA mẫu đậu đỗ thu thập Hải Phòng 45 4.3 Đánh giá tính gây bệnh KuMV lây nhiễm nhân tạo dùng kỹ thuật lây nhiễm vi khuẩn A.tumefaciens mang cấu trúc xâm nhiễm KuMV (kỹ thuật Agroinoculation) 47 4.3.1 Phục hồi dòng vi khuẩn Agrobaterium tumefaciens mang cấu trúc xâm nhiễm KuMV 47 4.3.2 Lây nhiễm nhân tạo agroinoculation KuMV phương pháp châm hạt ủ qua đêm 48 4.4 Đánh giá tính gây bệnh FbSLCV lây nhiễm nhân tạo dùng kỹ thuật lây nhiễm vi khuẩn A.tumefaciens mang cấu trúc xâm nhiễm FbSLCV (kỹ thuật Agroinoculation) 50 4.5 Phát virus mẫu đậu đỗ 51 4.5.1 Phát Potyvirus RT-PCR số mẫu đậu đỗ thu thập Hải Phòng 51 4.5.2 Phát legumovirus PCR số mẫu đậu đỗ thu thập Hải Phòng 52 Phần Kết luận kiến nghị 56 5.1 Kết luận 56 5.2 Kiến nghị 57 Tài liệu tham khảo 58 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa đầy đủ A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens ATP Adenosine triphosphate Bb Base pair CP Coat protein CTAB Cetryl Ammonium Bromide DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid ELISA Enzyme linked immunosorbent assay IgG Immunoglobulin gamma Kb Kilo base LB Luria and Bertani NPP Nitrophenyl phosphate ORF Open reading frame PCR Polymerase Chain Reaction PTA-ELISA Plate trapped antigen - ELISA RE Restriction enzyme RT-PCR Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction TAE Tris – acetate – EDTA Ti-plasmid Tumor inducing plasmid β- ME Beta- Mercaptoethanol vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Các kít ELISA phát virus đậu đỗ (Viện DSMZ) 20 Bảng 3.2 Các mồi sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 4.1 Kết điều tra mức độ nhiễm bệnh virus đậu cove Hải Phòng 2016-2017 28 Bảng 4.2 Kết điều tra mức độ nhiễm bệnh virus đậu xanh Hải Phòng 2016-2017 29 Bảng 4.3 Kết điều tra mức độ nhiễm bệnh virus đậu đen Hải Phòng năm 2016 30 Bảng 4.4 Kết điều tra mức độ nhiễm bệnh virus đậu tương Hải Phòng 2017 31 Bảng 4.5 Kết điều tra mức độ nhiễm bệnh virus đậu đũa Hải Phòng 2016-2017 32 Bảng 4.6 Kết ELISA phát Potyvirus mẫu đậu đỗ thu thập Hải Phòng 2016-2017 34 Bảng 4.7 Kết ELISA phát virus BCMV mẫu đậu đỗ thu thập Hải Phòng 2016-2017 36 Bảng 4.8 Kết 38 Bảng 4.9 Kết 40 Bảng 4.10 Kết 41 Bảng 4.11 Kết 43 Bảng 4.12 Kết 45 Bảng 4.13 Kiểm tra PCR nguồn vi khuẩn A tumefaciens mang cấu 47 Bảng 4.14 Kết lây nhiễm agroinoculation KuMV đậu tương DT26 49 Bảng 4.15 Kết lây nhiễm agroinoculation KuMV số họ đậu 50 Bảng 4.16 Kết lây nhiễm agroinoculation FbSLCV số họ đậu 51 Bảng 4.17 Kết RT-PCR phát Potyvirus số mẫu đậu đỗ thu thập Hải Phòng 52 Bảng 4.18 PCR phát legumovirus mẫu đậu đỗ thu thập Hải Phòng năm 2017 54 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hình thái Begomovirus Hình 2.2 Cấu trúc phân tử DNA-A, DNA-B Begomovirus Hình 2.3 Cấu trúc phân tử DNA-A Begomovirus Hình 2.4 Cấu trúc phân tử DNA-B Begomovirus Hình 2.1 Triệu chứng BCMV hại đậu đỗ (CABI, 2017a) 11 Hình 2.2 Triệu chứng SMV đậu tương (CABI, 2017b): (A) triệu trứng lá, (B) triệu chứng hạt 15 Hình 2.3 Triệu chứng KuMV đậu tương 17 Hình 4.1 Triệu chứng khảm nhăn đậu cove Hải Phòng 2016-2017 27 Hình 4.2 Triệu chứng khảm vàng đậu cove Hải Phịng 2016-2017 27 Hình 4.3 Triệu chứng bệnh virus đậu cove 2016-2017: (A) triệu chứng xoănbiến dạng lá, (B) biểu triệu chứng xoăn- biến dạng dội 28 Hình 4.4 Triệu chứng bệnh virus đậu xanh Hải phòng 2016-2017: khảm nhăn (A), khảm vàng (B) 29 Hình 4.5 Triệu chứng bệnh virus đậu đen Hải Phòng: Khảm xanh (A), biến vàng (B) 30 Hình 4.6 Triệu chứng bệnh virus đậu tương Hải Phòng 2016-2017: (A) nhăn-biến dạng lá; (B) khảm; (C) khảm- phồng 31 Hình 4.7 Triệu chứng đậu đũa thu Hải Phòng 2016-2017: (A) khảm, (B) khảm- nhăn 32 Hình 4.8 Phát virus kỹ thuật ELISA mẫu đậu đỗ thu thập Hải Phòng 2016-2017 33 Hình 4.9 Lây nhiễm nhân tạo agroinoculation KuMV cách châm hạt ủ 48 Hình 4.10 Triệu chứng sau tuần lây nhiễm KuMV đậu tương DT26 (A): sau tuần lây; (B): đối chứng 49 Hình 4.12 Kết kiểm tra PCR phát legumovirus mẫu đậu đỗ cặp mồi chung Leg-CP-F/R 55 Hình 4.13 Kết kiểm tra PCR phát KuMV mẫu đậu đỗ cặp mồi đặc hiệu KuMV (KuA-F1/R1) 55 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Trần Thị Tâm Tên Luận văn: Xác định bệnh virus hại đậu đỗ Hải Phòng Ngành: Bảo Vệ Thực Vật Mã số: 60 62 01 12 Tên sở đào tạo: Học Viện Nơng Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Xác định thành phần loài virus hại đậu đỗ Hải Phòng Phương pháp nghiên cứu Trong nghiên cứu này, mẫu bệnh virus hại họ đậu thu thập vùng trồng đậu đỗ Hải Phịng, sau làm khơ hạt silicagel Các mẫu kiểm tra ELISA phát virus kit ELISA Viện DSMZ Đức cung cấp Các mẫu có triệu chứng đặc trưng kiểm tra PCR RT-PCR Sử dụng cặp mồi chung CI-F/R phát potyvirus cặp mồi chung LegA-cpF1/R1 phát legumovirus Sử dụng cặp mồi đặc hiệu MY-A-F1/R1 KuA-F1/R1 để phát đặc hiệu MYMV KuMV Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo dùng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (agroinoculation) nhằm đánh giá tính gây bệnh KuMV FbSLCV số họ đậu Kết kết luận Điều tra, thu thập mẫu bệnh virus loại họ đậu khác (đậu xanh, đậu tương, đậu cove, đậu đũa đậu đen) với loại hình triệu chứng Trong đó, triệu chứng điển hình khảm Tỉ lệ bệnh tương đối thấp, cao huyện An Dương, dao động từ 0,7%-7,5% Kiểm tra ELISA 40 mẫu đậu đỗ thu Hải Phòng, phát mẫu nhiễm BCMV, mẫu nhiễm BYMV, 11 mẫu nhiễm CMV mẫu BLRV Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo KuMV agroinoculation giống đậu tương DT26 ;đậu cove TLP68, PN03; đậu đũa VA009 đậu xanh DX208 Kết tỉ lệ nhiễm KuMV đậu tương với tỉ lệ rât thấp 1/40 (2,5%) Kiểm tra PCR phát legumovirus cặp mồi chung LegA-CpF1/R1 phát 8/13 mẫu dương tính với legumovirus mẫu đậu tương, đậu cove, đậu đũa, đậu đen Đây lần phát legumovirus đậu cove, đậu đen đậu đũa Không phát thấy MYMV; phát thấy KuMV đậu tương ix 4.3.2 Lây nhiễm nhân tạo agroinoculation KuMV phương pháp châm hạt ủ qua đêm KuMV Begomovirus với gen kép (có DNA-A DNA-B) Việc lây nhiễm bipartite Begomovirus agroinoculation khó đặc điểm tái sinh, phương thức gây bệnh cần có mặt DNA-A DNA-B Mục tiêu thí nghiệm đánh giá tính gây bệnh KuMV đậu đỗ agroinoculation Hình 4.9 Lây nhiễm nhân tạo agroinoculation KuMV cách châm hạt ủ qua đêm Sau lây nhiễm, chúng tơi tiến hành gieo hạt, chăm sóc theo dõi 4.3.2.1 Đánh giá tính gây bệnh KuMV giống đậu tương DT 26 KuMV phát sắn dây (kudzu) đậu tương Các nghiên cứu Trung tâm NC BC nhiệt đới chứng tỏ KuMV tạo triệu chứng điển hình giống DT84, DT96 Trong thí nghiệm này, chúng tơi đánh giá tính gây bệnh virus giống đậu tương DT26 Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Đậu đỗ- Viện Cây lương thực Cây thực phẩm chọn lọc từ tổ hợp lai ĐT2000 x ĐT12 Cả cấu trúc xâm nhiễm DNA-A DNA-B sử dụng để lây nhiễm Kết lây nhiễm trình bày bảng 4.14 hình 4.10 48 Bảng 4.14 Kết lây nhiễm agroinoculation KuMV đậu tương DT26 Cây thí nghiệm Ngày lây Số lây Đậu tương DT26 14/7/2017 30 0 0 21/8/2017 40 0 1 1/40 A B Số biểu triệu chứng tuần tuần tuần tuần Tỉ lệ (%) B A Hình 4.10 Triệu chứng sau tuần lây nhiễm KuMV đậu tương DT26 (A): sau tuần lây; (B): đối chứng Kết sau tuần lây lần lây ngày 21/8, đậu tương DT26 biểu triệu chứng khảm rõ rệt KuMV với tỉ lệ thấp 1/40 (2,5%) Các lại theo dõi tiếp Giống lần thí nghiệm trước, tỷ lệ nhiễm bệnh thí nghiệm thấp thực chất trình lây nhiễm trình chuyển gen Hiệu xuất chuyển gen chủng vi khuẩn Agrobacterium (LBA4044) họ đậu nhìn chung thấp họ cà Ngồi ra, để bệnh xuất hiện, cấu trúc virus phải chuyển đồng thời vào nên làm giảm tỷ lệ nhiễm bệnh 49 Cây nhiễm bệnh, nguồn vật liệu ban đầu tốt để phục vụ nghiên cứu đánh giá tính gây bệnh dùng bọ phấn làm vector 4.3.2.2 Đánh giá tính gây bệnh KuMV đậu đỗ khác KuMV phát thấy sắn dây đậu tương Tuy nhiên tính gây bệnh KuMV họ đậu đỗ khác chưa nghiên cứu nhiều Mục tiêu nghiên cứu đánh giá tính gây bệnh, đặc biệt triệu chứng biểu KuMV số họ đậu khác Cây thí nghiệm giống đậu cove TLP68, PN03, đậu đũa VA009 đậu xanh DX208 Bảng 4.15 Kết lây nhiễm agroinoculation KuMV số họ đậu STT Cây thí nghiệm Số lây Số biểu triệu chứng tuần tuần tuần tuần Đậu cove TLP68 40 0 0 Đậu cove PN03 40 0 0 Đậu đũa VA009 30 0 0 Đậu xanh DX208 30 0 0 Kết thí nghiệm cho thấy khơng có giống đậu biểu triệu chứng Điều chứng tỏ, so với đậu tương, đậu đỗ khác ký chủ mẫn cảm KuMV Một khả đậu đỗ thí nghiệm ký chủ phù hợp lây nhiễm vi khuẩn A tumefaciens nên hiệu chuyển gen thấp 4.4 ĐÁNH GIÁ TÍNH GÂY BỆNH CỦA FBSLCV BẰNG LÂY NHIỄM NHÂN TẠO DÙNG KỸ THUẬT LÂY NHIỄM BẰNG VI KHUẨN A.TUMEFACIENS MANG CẤU TRÚC XÂM NHIỄM CỦA FBSLCV (KỸ THUẬT AGROINOCULATION) FbSLCV lần phát Việt Nam gần đó, tính gây bệnh virus cần phải đánh giá đầy đủ Dòng vi khuẩn A tumerfaciens chứa cấu trúc xâm nhiễm mẫu virus VN194 chuẩn bị sẵn từ trước Trung tâm nghiên cứu bệnh nhiệt đới Dòng vi khuẩn xđược cấy trải môi trường LB agar chứa kháng sinh (rifampicin, streptomycin kanamycin) Sau khuẩn lạc mọc môi 50 trường tiến hành nuôi mơi trường LB lỏng có bổ sung ba loại kháng sinh nhiệt độ 28 oC có lắc 220 rpm qua đêm để nhân sinh khối vi khuẩn chuẩn bị cho lây nhiễm Dịch vi khuẩn thu sau nuôi lỏng ly tâm 5000 g/ phút cặn vi khuẩn hòa đệm MgCl2 10mM Acetylsyringone 100 µM Nồng độ vi khuẩn điều chỉnh tương đương OD600 =1 Các đậu đỗ lây nhiễm với dòng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiễm (agroinoculation) theo phương pháp châm hạt ủ qua đêm Madal et al (1997) Sau lây nhiễm, thí nghiệm gieo trồng chăm sóc theo dõi Tuy nhiên, kết lây nhiễm giống khơng biểu triệu chứng Ngun nhân việc lây nhiễm virus agroinoculation họ đậu khó, tỉ lệ lên cực thấp hiệu chuyển gen vi khuẩn khơng cao Do đó, thí nghiệm cần thực lây nhiễm lặp lại nhiều lần để đánh giá xác tính gây bệnh FbSLCV họ đậu Bảng 4.16 Kết lây nhiễm agroinoculation FbSLCV số họ đậu STT Cây thí nghiệm Số lây Số biểu triệu chứng tuần tuần tuần tuần Đậu tương DT26 40 0 0 Đậu cove TLP68 30 0 0 Đậu cove PN03 30 0 0 Đậu đũa VA009 30 0 0 4.5 PHÁT HIỆN VIRUS TRÊN CÁC MẪU ĐẬU ĐỖ THU THẬP TẠI HẢI PHÒNG BẰNG PCR VÀ RT-PCR 4.5.1 Phát Potyvirus RT-PCR số mẫu đậu đỗ thu thập Hải Phòng Potyirus chi virus thực vật lớn nhất, chiếm khoảng 20% tổng số virus thực vật Tất potyvirus có gen phân tử RNA sợi đơn, cực dương, kích thước ~ 10 kb Dựa kết kiểm tra ELISA phẩn 4.2 (cả 40 mẫu kiểm tra âm 51 tính với ELISA potyvirus số mẫu lại có phản ứng dương với BCMV BYMV), 13 mẫu đậu đỗ lựa chọn tiến hành kiểm tra RT-PCR Acid nucleic tổng số 13 mẫu đậu đỗ chiết phương pháp CTAB sử dụng để kiểm tra RT-PCR cặp mồi chung CI-For CIRev (Ha et al., 2008b) Kết RT-PCR trình bày bảng 4.17 Kết RT-PCR (lặp lại lần) cho kêt âm tính với cặp mồi CIFor CI-Rev Kết chứng tỏ mẫu có phản ứng ELISA dương với BCMV BYMV không nhiễm potyvirus Đáng ý, mẫu đậu đen VN-1721 có giá trị OD cao (1,579) BYMV (mục 4.2.2) cho kết âm tính Do điều kiện vật liệu chiết mẫu thiếu (kít chiết RNA) nên phản ứng RTPCR lặp lại RNA tinh chiết mẫu Bảng 4.17 Kết RT-PCR phát Potyvirus số mẫu đậu đỗ thu thập Hải Phòng STT Mã mẫu Cây Giai đoạn Triệu chứng sinh trưởng RTPCR VN-17-1 Đậu xanh Ra Khảm vàng - VN-17-9 Đậu cove Quả già Khảm nhăn - VN-17-11 Đậu cove Ra nhánh Nhăn, xoăn - VN-17-13 Đậu cove Ra hoa, Khảm vàng - VN-17-15 Đậu cove Ra Khảm nhăn, biến dạng - VN-17-18 Đậu cove Ra Khảm nhăn - VN-17-20 Đậu đen Ra Biến vàng - VN-17-21 Đậu đen Ra Khảm xanh - VN-17-25 Đậu đũa Ra nhánh Khảm - 10 VN-17-26 Đậu đũa Ra Phồng, nhăn - 11 VN-17-35 Đậu tương Ra hoa Khảm xanh - 12 VN-17-38 Đậu tương Ra hoa Khảm phồng - 13 VN-17-40 Đậu tương Ra Nhăn, biến dạng - 4.5.2 Phát legumovirus PCR số mẫu đậu đỗ thu thập Hải Phòng Legumovirus Begomovirus nhiễm họ đậu (legume) Chúng Begomovirus có gen kép hình thành cụm riêng biệt phả 52 hệ (Briddon et al., 2010) Tại Việt Nam, có begomovirus xác định gần họ đậu Kudzu mosaic virus (KuMV) gây bệnh khảm đậu tương Miền Bắc (Hà Viết Cường, 2010) Mung bean yellow mosaic virus (MYMV) gây bệnh khảm đậu xanh Miền Trung (Tsai et al., 2013) Tuy nhiên, số lượng legumovirus ghi nhận Châu Á nhiều, với legumovirus công bố (Muhammad, 2010) Mục tiêu nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR dùng cặp mồi chung cho tồn nhóm legumovirus mồi đặc hiệu cho MYMV KuMV để phát virus mẫu có triệu chứng điển hình thu Hải Phịng Kết thí nghiệm trình bày bảng 4.18, hình 4.12 hình 4.13 Đầu tiên, 13 mẫu đậu đỗ lựa chọn từ kết ELISA (phần 4.2) kiểm tra legumovirus sử dụng cặp mồi chung LegA-cpF1 LegA-cpR1 Cặp mồi thiết kế dựa gen CP legumovirus tạo sản phẩm PCR có kích thước ~ 280 bp Phản ứng PCR dùng cặp mồi chung cho phản ứng dương tính 7/13 mẫu (không kể mẫu đối chứng mẫu đậu tương DT26 lây nhiễm KuMV) (hình 4.12) Các mẫu dương tính gồm tất mẫu đậu tương, mẫu đậu cove VN-17-13 (khảm vàng), mẫu đậu đen VN-17-20 (biến vàng), mẫu đậu đũa VN-17-25 (khảm) VN-17-26 (phồng, nhăn) Ngoại trừ mẫu đậu tương biểu triệu chứng đặc trưng nhiễm KuMV giống nghiên cứu trước lần nghiên cứu phát họ đậu đậu tương nhiễm legumovirus Các legumovirus, có gen kép, nên thường gây triệu chứng đặc trưng gồm khảm, khảm biến vàng, biến vàng đậu đỗ, giống triệu chứng quan sát thấy mẫu đậu cove, đậu đen đậu đũa phản ứng dương tính thí nghiệm Tiếp theo, tất 13 mẫu đậu đỗ kiểm tra PCR dùng cặp mồi đặc hiệu MYMV MY-A F1/R1 (tạo sản phẩm ~ 600 bp) Kết kiểm tra cho thấy tất mẫu phản ứng âm tính với cặp mồi So sánh triệu chứng nhận thấy mẫu kiểm tra có triệu chứng khơng giống với triệu chứng điển hình đậu xanh nhiễm MYMV giới Việt Nam Cuối cùng, dùng cặp mồi đặc hiệu KuMV, KuA-F1/R1 để kiểm tra 11 mẫu đậu đỗ lựa chọn từ kết KuMV xác định nhiễm tự nhiên đậu tương Hải Phòng năm 2013 (Nguyễn Đức Hoan, 2013) Kết kiểm tra PCR (hình 4.13) cho thấy mẫu đậu tương có phản ứng dương tính với cặp mồi đặc hiệu KuMV 53 Bảng 4.18 PCR phát legumovirus mẫu đậu đỗ thu thập Hải Phòng năm 2017 STT Mã mẫu Cây Giai đoạn sinh trưởng Triệu chứng Legumovirus LegA-CP F/R (280 bp) MYMV MY-A F1/R1 (600 bp) KuMV KuA-F1/R1 (565 bp) VN-17-1 Đậu xanh Ra Khảm vàng - - - VN-17-9 Đậu cove Quả già Khảm nhăn - - Không thử VN-17-11 Đậu cove Ra nhánh Nhăn, xoăn - - Không thử VN-17-13 Đậu cove Ra hoa, Khảm vàng + - - VN-17-15 Đậu cove Ra Khảm nhăn, biến dạng - - - VN-17-18 Đậu cove Ra Khảm nhăn - - - VN-17-20 Đậu đen Ra Biến vàng + - - VN-17-21 Đậu đen Ra Khảm xanh - - - VN-17-25 Đậu đũa Ra nhánh Khảm + - - 10 VN-17-26 Đậu đũa Ra Phồng, nhăn? + - - 11 VN-17-35 Đậu tương Ra hoa Khảm xanh + - + 12 VN-17-38 Đậu tương Ra hoa Khảm phồng + - + 13 VN-17-40 Đậu tương Ra Nhăn, biến dạng + - + 14 Đ/c (+) + - + 7/13 0/13 3/13 KuMV (lây agro) Số mẫu PCR (+)/ Số mẫu kiểm tra 54 Dựa kết PCR, legumovirus mẫu đậu cove (VN-17-13, khảm vàng), đậu đen (VN-17-20, biến vàng) đậu đũa (VN-17-25, khảm) xác định giải trình tự Ba mẫu lặp lại PCR dùng cặp mồi LegACP-F/R Sản phẩm PCR tinh chiết từ gel agarose giải trình tự trực tiếp dùng mồi LegA-CP-F Tuy nhiên sản phẩm giải trình tự nhiễu khơng thể xác định trình tự để định danh Do giới hạn điều kiện nghiên cứu, phản ứng giải trình tự khơng thể lặp lại Hình 4.12 Kết kiểm tra PCR phát legumovirus mẫu đậu đỗ cặp mồi chung Leg-CP-F/R M thang DNA 100 bp (GeneRuler 100 bp, Thermo Scientific) với băng tham khảo mũi tên Các giếng từ – 13 mẫu đậu đỗ trình bày Bảng 4.18 Giếng 14 mẫu đối chứng (cây đậu tương lây DT26 nhiễm KuMV) Hình 4.13 Kết kiểm tra PCR phát KuMV mẫu đậu đỗ cặp mồi đặc hiệu KuMV (KuA-F1/R1) M thang DNA 100 bp (GeneRuler 100 bp, Thermo Scientific) với băng tham khảo mũi tên Các giếng từ – 13 mẫu đậu đỗ trình bày bảng 4.18 Giếng 14 mẫu đối chứng (cây đậu tương lây DT26 nhiễm KuMV) 55 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Đã điều tra thu thập mẫu triệu chứng bệnh virus đậu đỗ Hải Phòng năm 2016-2017 loạt họ đậu đậu tương, đậu xanh, đậu đen, đậu đũa, đậu cove Dạng triệu chứng điển hình triệu chứng khảm Tỉ lệ nhiễm virus cao huyện An Dương dao động từ 0,7-7,5% Đã sử dụng kỹ thuật ELISA phát virus 40 mẫu đậu đỗ thu Hải Phịng, kết có virus phát bao gồm BCMV, BYMV, CMV, BLRV Trong đó, mẫu phản ứng dương tính với BCMV, phản ứng dương tính BYMV, 11 mẫu phản ứng dương tính CMV mẫu phản ứng dương tính BLRV Tuy nhiên, ngoại trừ mẫu ngoại trừ mẫu đậu đen VN-17-21 có giá trị OD cao với BCMV, tất mẫu dương tính cịn lại có giá trị OD thấp so với ngưỡng Đã thực lây nhiễm nhân tạo KuMV agroinoculation giống đậu tương DT26 ,đậu cove TLP68, PN03, đậu đũa VA009 đậu xanh DX208 Kết cho thấy KuMV nhiễm đậu tương DT26 (với tỉ lệ nhiễm rât thấp, 2,5%) Đã thực lây nhiễm nhân tạo FbSLCV agroinoculation giống đậu tương DT26, đậu cove TLP68, PN03, đậu đũa VA009 Kết khơng có giống biểu triệu chứng Đã sử dụng kỹ thuật RT- PCR phát potyvirus cặp mồi chung CI-F/R 13/40 mẫu đậu đỗ có triệu chứng nhiễm virus thu thập Hải Phịng Kết kiểm tra khơng phát thấy potyvirus mẫu Đã sử dụng kỹ thuật PCR cặp mồi chung LegA-CpF1/R1 phát 7/13 mẫu (không kể mẫu đối chứng mẫu đậu tương DT26 lây nhiễm KuMV agroinoculation) dương tính với legumovirus gồm mẫu đậu tương, mẫu đậu cove, mẫu đậu đen mẫu đậu đũa Các mẫu dương tính biểu triệu chứng khảm, khảm vàng, biến vàng đặc trưng nhiễm legumovirus Đây lần phát thấy legumovirus đậu cove, đậu đen đậu đũa Đã sử dụng kỹ thuật PCR cặp mồi đặc hiệu MYMV KuMV 56 không phát thấy MYMV 13 mẫu đậu đỗ, kể mẫu dương tính với legumovirus Tất mẫu đậu tương kiểm tra dương tính với KuMV 5.2 KIẾN NGHỊ -Tiếp tục xác định thành phần loài virus họ đậu Hải Phịng - Tiếp tục có nghiên cứu sâu đặc trưng sinh học, phân bố KuMV FbSLCV 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT: Bùi Chí Bửu (2012) Phát triển trồng biến đổi gen làm thức ăn gia súc Việt Nam, tiềm thách thức http://iasvn.org/upload/files /NV932IJES4pha t%20trien%20cay% 20tro ng%20BDG.pdf Hà Viết Cường (2010) Phát đặc trưng phân tử Kudzu mosaic virus đậu tương miền Bắc Việt Nam Tạp chí bảo vệ thực vật 05 tr 11-17 Hà Viết Cường (2011) Virus thực vật, phytoplasma viroid Trường ĐH NN Hà Nội Hà Viết Cường (2014) Đặc trưng phân tử sinh học French bean severe leaf curl virus (FbSLCV) gây bệnh đậu cove Kỷ yếu Hội thảo Quốc gia Bệnh hại thực vật Việt Nam lần thứ 13 Trường ĐH Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh 6-7/2014.NXB Nơng nghiệp, Hồ Chí Minh tr 5-20 Lê Lương Tề (1998) Giáo trình bệnh Nông Nghiệp NXB Nông Nghiệp Niên Giám Thống Kê (2013) Tổng cục Thống Kê NXB Thống Kê Nguyễn Đức Hoan (2013) Nghiên cứu xác định bệnh virus đậu đỗ Hải Phịng Luận văn thạc sỹ nơng nghiệp Học viện nông nghiệp Việt Nam tr 56-58 Phan Xuân Thiệu, Lê Quang Vượng Nguyễn Thị Hương (2006) Chất lượng số giống đậu xanh (Vigna radiata (L) Wilzeck) trồng tỉnh Thanh Hóa, Tóm tắt báo cáo Hội thảo khoa học trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội Trần Đình Long Lê Khả Tường (1998) Cây đậu xanh NXBNN, Hà Nội 10 Ủy Ban Nhân Dân Thành Phố Hải Phòng (2016) Báo cáo tổng hợp đề án Tái cấu ngành Nơng Nghiệp thành phố Hải Phịng theo hướng nâng cao giá trị gia tăng phát triển bền vững đến năm 2020, định hướng đến năm 2030 11 Vũ Triệu Mân (2003) Chẩn đoán nhanh bệnh hại thực vật NXB Nông Nghiệp, Hà Nội TÀI LIỆU TIẾNG ANH: 11 Ashby J.W (1984) Bean leafroll virus AAB descriptions of plant viruses No 286 12 Babovic M., A Bulajic, G Delibašic, S Milijic and D Todorovic (1996, July) Role of bean seed in transmitting Bean common mosaic virus and Cucumber mosaic virus Acta Hortic 462 pp 253-258 58 13 Berger P H., S D.Wyatt, P J Shiel, M J Silbernagel, K Druffel and G I Mink (1997) Phylogenetic analysis of the Potyviridae with emphasis on legume-infecting potyviruses Archives of virology, 142(10) pp 1979-1999 14 Bernardo, P., M Golden, M Akram, N Nadarajan, E Fernandez, M Granier and P Roumagnac (2013) Identification and characterisation of a highly divergent geminivirus: evolutionary and taxonomic implications Virus research, 177(1) pp 35-45 15 Birthal, P S., P Parthasarathy Rao, S N Nigam, M C S Bantilan and S Bhagavatula (2010) Groundnut and Soybean Economies in Asia Facts, Trends and Outlook, International Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics Patancheru, 502(324) pp 92 16 Bos, L (1972) Soybean mosaic virus CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses, No, 93 17 Briddon, R W., B L Patil, B Bagewadi, M S Nawaz-ul-Rehman and C M Fauquet (2010) Distinct evolutionary histories of the DNA-A and DNA-B components of bipartite Begomoviruses BMC Evolutionary Biology, 10(1) pp 97 18 Brunt, A A., K Crabtree, M J Dallwitz, A J Gibbs and L Watson (1996) Viruses of plants Descriptions and lists from the VIDE database Cab International 19 CABI (2017a) Bean common mosaic virus http://www.cabi.org/cpc/datasheet/9424 20 CABI (2017b) Soy bean mosaic virus http://www.cabi.org/cpc/datasheet/48750 21 Chen, P Y., C W Choi, G P Rao, S M P Khurana and S L Lenardon (2008) Soybean mosaic virus Characterization, diagnosis and management of plant viruses Volume 1: industrial crops pp 389-422 22 Doyle, J J (1987) A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue Phytochem Bull, 19 pp 11-15 23 Duke, J (2012) Handbook of legumes of world economic importance Springer Science & Business Media 24 Edwardson, J R and R G Christie (1991) CRC handbook of viruses infecting legumes CRC Press 59 25 French, R and R Duncan (2010) Bean common mosaic virus (BCMV) External factsheets No.PLPA-Bea10-01 Texas A&M University System, College Station, Texas, USA (http://amarillo.tamu.edu/files/2010/11/BeanCommonMosaicVirus.pdf) 26 Gafni, Y (2003) Tomato yellow leaf curl virus, the intracellular dynamics of a plant DNA virus Molecular plant pathology, 4(1) pp.9-15 27 Gunasinghe, U B., S Flasinski, R S Nelson and B G Cassidy (1994) Nucleotide sequence and genome organization of peanut stripe potyvirus Journal of general virology, 75(9) pp 2519-2525 28 Ha, C., S Coombs, P A Revill, R M Harding, M Vu, and J L Dale (2008b) Design and application of two novel degenerate primer pairs for the detection and complete genomic characterization of potyviruses Archives of virology, 153(1) pp 25-36 29 Ha, C., S Coombs, P A Revill, R M Harding, M Vu and J L Dale (2008b) Molecular characterization of Begomoviruses and DNA satellites from Vietnam: additional evidence that the New World geminiviruses were present in the Old World prior to continental separation Journal of General Virology, 89(1) pp 312-326 30 Ha, C., P Revill, R M Harding, M Vu and J L Dale (2008a) Identification and sequence analysis of potyviruses infecting crops in Vietnam Archives of virology, 153(1) pp 45-60 31 Hart, L P and A W Saettler (1981) Bean Common Mosaic Virus Extension Bulletin E-1561, MSU Ag Facts, Michigan State University, East Lansing pp 32 Hema, M., P Sreenivasulu, B L Patil, P L Kumar and D V Reddy (2014) Tropical food legumes: virus diseases of economic importance and their control Advances in virus research, 90 pp 431-505 33 ICTV (International Committee on Taxonomy of Viruses) (2012) The viruses In A M Q King, M J Adams, E B Carstens and E J Lefkowitz (Eds.), Virus taxonomy—Ninth report of the international committee on taxonomy of viruses (pp 21–1197) United Kingdom: Elsevier/Academic Press 34 Jacquemond, M (2012) Cucumber mosaic virus Adv Virus Res, 84 pp 439-504 60 35 Larsen, R C., P N Miklas, K L Druffel and S D Wyatt (2005) NL-3 K strain is a stable and naturally occurring interspecific recombinant derived from Bean common mosaic necrosis virus and Bean common mosaic virus Phytopathology, 95(9) pp 1037-1042 36 Lewis, G P (2005) Legumes of the World Royal Botanic Gardens Kew 37 Madal, A., Varma and V G Malathi 1997 Systemic Infection of Vigna mungo Using the Cloned DNAs of the Blackgram Isolate of Mungbean Yellow Mosaic Geminivirus through Agroinoculation and Transmission of the Progeny Virus by Whiteflies J Phytopathology 145 pp 505-510 38 Masuda, T and P D Goldsmith (2009) World soybean production: area harvested, yield, and long-term projections International Food and Agribusiness Management Review, 12(4) pp 143-162 39 Mello, R N., M A A Cotrim, E F Lopes, A G Moreira, F S Contin, E P B Fontes and F M Zerbini (2002) Survey of Begomoviruses associated with soybean and identification of Sida mottle virus (SiMoV) infecting this crop in Brazil Virus Reviews and Research, 7(sSupl) 40 Mink, G I., J Vetten, C W Ward, P H Berger, F Morale, J R Myers, M J Silbernagel and O W Barnett (1994) Taxonomy and Classification of Legume-Infecting Potyviruses - a Proposal from the Potyviridae Study-Group of the Plant-Virus Subcommittee of ICTV Archives of Virology 139(1-2) pp 231-235 41 Morales, F J and L Bos (1988) Bean common mosaic virus AAB descriptions of plant viruses No 337 42 Mukeshimana, G., P L Hart and J D Kelly (2003) Bean common mosaic virus and Bean common mosaic necrosis virus Extension Bulletin E-2894 (Major Rev of E-1561) Michigan state university extension (http://fieldcrop.msu.edu/uploads /documents/E2894.pdf) 43 Muhammad I., J Qazi, S Mansoor and R W Briddon (2010) Genetic diversity and phylogeography of begomoviruses infecting legumes in Pakistan Journal of General Virology 91 (8) pp 2091-2101 44 Padidam, M., S Sawyer and C M Fauquet (1999) Possible emergence of new geminiviruses by frequent recombination Virology, 265(2) pp 218-225 61 45 Picó, B., M J Díez, and F Nuez (1996) Viral diseases causing the greatest economic losses to the tomato crop II The tomato yellow leaf curl virus—a review Scientia Horticulturae, 67(3-4) pp 151-196 46 Rybicki, E P (1994) A phylogenetic and evolutionary justification for three genera of Geminiviridae Archives of virology, 139(1) pp 49-77 47 Stanley, J., D M Bisaro, R W Briddon, J K Brown, C M Fauquet, B D Harrison, E P Rybicki and D C Stenger (2005) Geminiviridae In: Virus Taxonomy VIIIth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (C.M Fauquet, M.A Mayo, J Maniloff, U Desselberger and L.A Ball, eds) Elsevier/Academic Press London pp 301 - 326 48 Tsai, W S., S L Shih, A Rau, R Safitri, N Hidayati, B T T Huyen and L Kenyon (2013) Genetic diversity of legume yellow mosaic Begomoviruses in Indonesia and Vietnam Annals of applied biology, 163(3) pp 367-377 49 Vetten, H J., D E Lesemann and E Maiss (1992) Serotype A and B strains of Bean common mosaic virus are two distinct potyviruses In Potyvirus Taxonomy (pp 415-431) Springer Vienna 50 Ward, C., P Berger, F Morales, J Myers, M Silbernagel and O Barnett (1994) Taxonomy and classification of legume-infecting potyviruses A proposal from the Potyviridae Study Group of the Plant Virus Subcommittee of ICTV Arch Virol, 139 pp 231-235 51 Zhang, J and Z J Wu (2013) First Report of Kudzu mosaic virus on Pueraria montana (Kudzu) in China Plant Disease, 97(1) pp 148-148 52 Zhang, W., N H Olson, T S Baker, L Faulkne, M Agbandje-McKenna, M I Boulton and R McKenna (2001) Structure of the Maize streak virus geminate particle Virology, 279(2) pp 471-477 62 ... ? ?Xác định bệnh virus hại đậu đỗ Hải Phịng” 1.2 MỤC ĐÍCH Xác định thành phần loài virus hại đậu đỗ Hải Phòng 1.3 YÊU CẦU - Điều tra thu thập mẫu bệnh có triệu chứng điển hình vùng trồng đậu đỗ. .. tra bệnh virus hại đậu đỗ Hải Phòng năm 2016-2017 26 4.1.1 Tình hình sản xuất đậu đỗ Hải Phòng 26 4.1.2 Điều tra bệnh virus đậu cove Hải Phòng năm 2016-2017 26 4.1.3 Điều tra bệnh virus. .. văn: Xác định bệnh virus hại đậu đỗ Hải Phòng Ngành: Bảo Vệ Thực Vật Mã số: 60 62 01 12 Tên sở đào tạo: Học Viện Nơng Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Xác định thành phần loài virus hại đậu đỗ