Điều tra, xác định bệnh chính hại đậu rau tại huyện Mai Sơn, tỉnh Sơn La năm 2014

để sản xuất được các loại đậu rau có năng xuất cao, an toàn với con người và môi trường chúng ta cần có những biện pháp phòng chống bệnh hại hợp lý dựa trên cơ sở khoa học và thành phần bệnh hại, đặc điểm gây hại, quy luật phát sinh, mức độ gây hại và cách phòng chống... Điều tra, xác định bệnh chính hại đậu rau tại huyện Mai Sơn, tỉnh Sơn La năm 2014

1 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây đậu rau (đậu đũa, đậu cove, đậu Hà Lan…) trồng thuộc họ đậu (Leguminoseae) gieo trồng nhiều vùng sinh thái để sử dụng quả, hạt làm thực phẩm Chúng nguồn thực phẩm quan trọng cho người gia súc Đậu rau loài rau có giá trị dinh dưỡng cao, đặc biệt hàm lượng đường, protein, lipit, vitamin C… Đậu rau thường chế biến (đóng đồ hộp) ăn tươi Chúng thành phần quan trọng phần ăn người châu Âu, châu Mỹ Hàm lượng protein cao, đặc biệt hàm lượng chất béo không no thành phần đậu rau có tác dụng cung cấp dinh dưỡng đồng thời hạn chế bệnh tim mạch nước phát triển Tại châu Á, đậu rau đóng vai trị quan trọng việc nâng cao chất lượng bữa ắn hàng ngày, khắc phục tình trạng suy dinh dưỡng cho trẻ em nước nghèo nguồn cung cấp protein quan trọng cho nước chậm phát triển Tại Việt Nam, đậu rau nguồn thực phẩm quan trọng cho người, nguồn cung cấp nguyên liệu cho chế biến thức ăn chăn nuôi Nhiều vùng trồng đậu rau phục vụ cho nhu cầu thị trường mang lại thu nhập đáng kể cho người dân Diện tích đậu rau ngày mở rộng suất sản lượng tăng chưa tương ứng nguyên nhân bệnh hại gây Trong năm gần đây, diện tích rau huyện Mai Sơn phát triển nhanh quy trình sản xuất mang tính chuyên nghiệp ngày cao, xong nghiên cứu bệnh hại rau nói chung đậu rau nói riêng chưa có nhiều Một số nơi khác, trình ngăn chặn bệnh hại đậu rau, người dân chủ yếu sử dụng thuốc hóa học, khơng gây ảnh hưởng đến mơi trường mà cịn ảnh hưởng đến an toàn vệ sinh thực phẩm Trái lại nhu cầu an tồn thực phẩm giảm nhiễm môi trường đời sống hàng ngày cần trú trọng Vì thế, để sản xuất loại đậu rau có xuất cao, an tồn với người mơi trường cần có biện pháp phòng chống bệnh hại hợp lý dựa sở khoa học thành phần bệnh hại, đặc điểm gây hại, quy luật phát sinh, mức độ gây hại cách phòng chống Trên sở thực tiễn chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Điều tra, xác định bệnh hại đậu rau huyện Mai Sơn, tỉnh Sơn La năm 2014” 1.2 Mục đích Mục tiêu đề tài xác định thành phần mức độ gây hại bệnh hại đậu rau số xã huyện Mai Sơn 1.3 Yêu cầu Điều tra bệnh hại đậu rau (Mường Bon, Chiềng Mung Cò Nòi huyện Mai Sơn, tỉnh Sơn La) vụ hè thu năm 2014 Thu thập mẫu bệnh giám định bệnh dựa triệu chứng, dấu hiệu Xác định tác nhân gây bệnh ELISA, PCR với bệnh virus; phân lập, lây nhiễm nhân tạo giải trình tự gen vùng DNA ribosome bệnh nấm vi khuẩn TỔNG QUAN TÀI LIÊU 2.1.1 Những nghiên cứu nước 2.1.2 Tầm quan trọng số thuộc họ đậu rau Đậu đũa (Vigna sesquipedalis Wight) có nguồn gốc từ Đài Loan hay miền Nam Trung Quốc hay từ Banglades Đậu đũa 10 loại rau quan trọng vùng Đông Nam Á, ngày trồng chủ yếu Ấn Độ, Banglades, Đông Nam Á châu Úc trồng rộng rãi vùng nhiệt đới vụ rau nhỏ, sản lượng đậu đũa Đông Nam Á thường cao châu Phi Sản lượng đậu đũa Ấn Độ – quả/năm (Maesen Vander, 1996) Đậu cove vàng (Phaseolus vulgaris L.) có nguồn gơc từ miền Nam Mexico, Trung Mỹ Ngày nay, đậu cove vàng trồng phổ biến vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới ôn đới Sản lượng đậu cove vàng giới (1979) ước tính khoảng 8,3 triệu Braxin nơi sản xuất nhiều đậu cove giới với sản lượng 2,3 triệu vào giai đoạn 1973 – 1975 (Maesen Vander, 1996) Đậu Hoà Lan (Pisum sativum) loại đậu hạt tròn, dùng làm rau ăn Đây loài thực vật năm, trồng theo vụ vào mùa có khí hậu mát mẻ nhiều nơi giới Mỗi hạt đậu có khối lượng từ 0,1 đến 0,36 gram.Hạt đậu Hà Lan dùng làm rau ăn dạng tươi, đơng lạnh, đóng hộp, khơ Trong ẩm thực Việt Nam, đậu Hồ Lan non cịn dùng ngun cho xào canh 2.1.3 Thành phần bệnh hại đậu rau Bảng Thành phần bệnh hại đậu rau (theo APS - The American Phytopathological Society) STT Tên tiếng Việt Tên tiếng anh Tác nhân Bệnh Đốm nâu vi Bacterial brown Pseudomonas Vi khuẩn khuẩn spot syringae pv syringae Héo vi Bean wilt Curtobacterium Vi khuẩn flaccumfaciens pv khuẩn flaccumfaciens (Hed ges) Collins & Jones Chấm đỏ Common Xanthomonas Vi khuẩn bacterial blight campestris pv phaseoli (Smith) Dye Đốm vi khuẩn Halo blight Halo blight Pseudomonas syringae pv phaseolicola (Burkholder) Young et al Vi khuẩn Cháy Wildfire Pseudomonas syringae pv tabaci (Wolf & Foster) Young et al Vi khuẩn Thán thư Phấn trắng Đốm vòng 10 Colletotrichum lindemuthianum Ascochyta boltshauseri Sacc and A phaseolorum Sacc Erysiphe polygoni DC Alternaria alternata (Fr.:Fr.) Keissl (= A tenuis Nees) Alternaria brassicae (Berk.) Sacc f sp phaseoli C Brun Alternaria brassicicola (Schwein.) Wiltshire Phaeoisariops is griseola (Sacc.) Ferraris Nấm Anthracnose of bean Ascochyta leaf spot Nấm Đốm Ascochyta Đốm Thối rễ Aphanomyces root rot góc 11 Powdery Mildew Alternaria leaf and pod spot Angular bean leaf spot Aphanomyces euteiches Drechs f sp phaseoli W F Pfender & D J Hagedorn Nấm Nấm Nấm Nấm 12 Thối đen 15 12 16 Đốm Chaetoseptoria Ashy stem blight Macrophomina phaseolina (Tassi) Goidanich Black Phoma exigua node disease Desmaz var diversispora (Bubak) Boerema 11 Thielaviopsis Black root rot basicola (Berk & Broome) Ferraris Cercospora leaf Pseudocercospora spot and blotch cruenta (Sacc.) Deighton Cercospora canescens Ellis & G Martin Cercospora phaseoli Dearn & Barth Cercospora caracallae (Speg.) Vassiljevsky & Karakulin Chaetoseptoria Chaetoseptoria leaf spot wellmanii Stevenson 17 Lở cổ rễ Basal stem rot 18 Thối rễ Pythium Sương mai Collar rot 13 14 10 Thối đen rễ 19 20 21 Đốm Cercospora Entyloma leaf smut (bệnh than Entyloma) 13 14 Floury Rhizoctonia solani Kühn Pythium spp Nấm Phytophthora nicotianae Breda de Haan var parasitica (Dastur) G M Waterhouse Nấm Entyloma petuniae Speg E vignae Bat et al Downy mildew Nấm Nấm Mycovellosiella Nấm Nấm Nấm Nấm Nấm Nấm leaf spot 22 24 Fusarium root rot (thối fusarium) Héo vàng fusarium 25 Phyllosticta leaf spot (Đốm Phyllosticta) Thối rễ Phymatotrichu m Gỉ sắt 28 29 30 31 32 33 34 35 Khảm thường đậu Nấm Phymatotrichum omnivorum Duggar Rust of beans Nấm Phyllosticta phaseolina Sacc Gray mold (mốc xám) 27 Nấm Fusarium oxysporum Schlechtend.:Fr f sp phaseoli J B Kendrick & W C Snyder Cercospora vanderysti P Henn Cercospora castellanii Matta & Belliard Botrytis cinerea Pers.:Fr Gray leaf spot (đốm xám lá) 26 phaseoli (Drummond) Deighton Fusarium solani (Mart.) Sacc f sp Nấm Uromyces appendiculatus Alfalfa mosaic virus Angular mosaic Bean calico mosaic virus (variant of Squash leaf curl virus) Bean common mosaic virus (BCMV) Bean dwarf mosaic virus Bean golden mosaic Nấm Nấm Nấm Virus Virus Virus Virus Virus Virus 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 15 virus Kudu mosaic virus Bean mild mosaic Bean necrosis mosaic virus Bean pod mottle virus Bean rugose mosaic Cowpea severe mosaic virus Southern bean mosaic virus Bean yellow mosaic virus Clover yellow vein virus 16 Cucumber mosaic virus Beet curly top virus Pea early browning virus Pea enation mosaic virus Bean leaf roll virus Virus Virus Virus Virus Virus Virus Virus Virus Virus Virus Virus Virus Virus Virus 2.1.4 Một số bệnh hại đậu đỗ A Bệnh nấm Bệnh thán thư đậu đỗ (Anthracnose of bean) a Tác nhân: Colletotrichum lindemuthianum thuộc ngành Ascomycetes, lớp Deuteromycetes, b Ký chủ: C lindemuthianum tác nhân gây bệnh chủ yếu đậu đỗ nói chung c Tầm quan trọng: Bệnh thán thư tác nhân gây bệnh nấm quan trọng họ đậu, ảnh hưởng đến suất, chất lượng hạt giống khả tiếp cận thị trường trồng (do xấu, ảnh hưởng đến chất lượng quả).Bệnh gây tổn thất lớn vùng ôn đới cận nhiệt d Phân bố: e f g a b Bệnh có phân bố toàn giới xảy nơi họ đậu trồng Triệu chứng: Trên mầm vết bệnh có hình trịn màu nâu đen ướt lõm Vết bệnh thân có hình thoi dài, lõm có màu nâu đỏ Bệnh nặng làm chết rạp Trên thật, vết bệnh thường gây hại phần gân phiến sát gân, hình trịn khơng định hình có màu nâu, xung quanh viền nâu đỏ Trên vết bệnh có chấm đen nhỏ li ti đĩa cành nấm gây bệnh Vết bệnh liên kết với làm bị cháy, khô dễ rụng Vết bệnh cuống thân thường kéo dài, có màu nâu sẫm, lõm, bệnh gây hại hoa làm hoa rụng Trên quả, vết bệnh có hình bầu dục hình trịn có màu nâu vàng lõm, xung quanh có viền nâu đỏ Nấm gây bệnh gây hại hạt với vết bệnh chấm nhỏ màu nâu màu đen Điều kiện phát sinh phát triển bệnh: Bệnh phá hoại mạnh điều kiện ẩm độ khơng khí cao 80%, nhiệt độ 16 – 20oC Bào tử nấm mầm phạm vi nhiệt độ từ – 34oC, thích hợp nhiệt độ 22- 23oC Trong điều kiện ẩm độ nhiệt độ thuận lợi thời kỳ tiềm dục bệnh – ngày Ở nước ta bệnh phát triển mạnh chân ruộng trũng, nước Phịng trừ bệnh: Dùng giống chống bệnh, bệnh Xử lý hạt giống thuốc hóa học Dọn tàn dư bệnh đem đốt hoạc chôn sâu Luân canh – năm với trơng nước ruộng bị nhiêm nặng Hóa học: zined 80WP 0,4%; Daconil 50WP 75WP nồng độ 0,125 – 0,250% Gỉ sắt (Rust of beans) Tác nhân: Uromyces appendiculatus thuộc ngành Basidiomycota, lớp Pucciniomycetes, Pucciniales, họ Pucciniaceae, chi Uromyces, loài Uromyces appendiculatus Ký chủ: c d e f g a b Bệnh phổ biến vùng trồng đậu đỗ giới gây hại mạnh vùng nhiệt đới cận nhiệt, nước ta bệnh gây hại phổ biến trồng họ đậu Gây hại mạnh đậu ăn đỗ: đậu cove, đậu đũa, đậu bở Tầm quan trọng: Nếu bị bệnh giai đoạn đầu phát triển bị chết Gonzalez Garcia (1996) báo cáo bệnh gỉ sắt đậu vùng Velasco, tỉnh Holguin, Cuba gây thiệt hại suất đến 28-54, 8-33 13-29% giống ICA-Pijao, Velasco Largo Bonita 11 (tương ứng) kết làm giảm số lượng trọng lượng hạt giống Phân bố: Bệnh gỉ sắt phân bố phổ biến khắp vùng trồng họ đậu giới Triệu chứng: Bệnh hại chủ yếu vết bệnh xuất thân, phận khác Ban đầu, vết bệnh chấm nhỏ màu vàng trong, sau vết bệnh phát triển tạo thành màu vàng nâu sau chuyển sang nâu đỏ, xung quanh có quầng vàng Đó ổ bào tử hạ nấm gây bệnh (kích thước – mm) Điều kiện phát sinh phát triển bệnh: Bệnh phát sinh phát triển mạnh điều kiện nhiệt độ ôn hòa, độ ẩm cao Lan truyền bào tử hạ nhờ gió, nước tưới, người Nguồn bệnh tồn dạng bảo từ đông vùng ôn đới, bào tử hạ sợi nấm tiềm sinh vùng nhiệt đới Phòng trừ: Dọn tàn dư bệnh sau thu hoạch, luân canh với trồng khác họ, ruộng bị bệnh nặng cần canh với lúa nước Lở cổ rễ (Basal stem rot) Phân loại: Rhizoctonia solani thuộc ngành Basidiomycota, lớp Basidiomycetes, Ceratobasidiales, họ Ceratobasidiaceae, chi Rhizoctonia, loài Rhizoctonia solani Ký chủ: c d e f g a b Là bệnh hại lúa họ đậu nhiều nước giới Tầm quan trọng: Bệnh phá hoại trông suốt thời kỳ sinh trưởng chủ yếu vào thời kỳ làm chét hàng loạt Phân bố: Bệnh phổ biến toàn giới, gây hại nhiều loại trồng số vùng nhiệt đới châu Á (Philippines, Sri Lanka, Ấn Độ, Indonesia, Malaysia, Thái Lan, Việt Nam) ôn đới châu Á (Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc) Triệu chứng: Bệnh hại vào thời kỳ gây héo chết Vết bệnh lúc đầu chấm nhỏ, màu đen phần gốc sau lan rộng bao bọc xung quanh cổ rễ làm cổ rể khô táp lại, gục xuống chết thân xanh Trên vết bệnh có lớp nấm màu trắng xám Vết bệnh thối mục có màu nâu đen ủng lan nhanh gặp trời mưa Phát sinh phát triển: Phát triển thuận lợi điều kiện nhiệt độ 25 – 28oC, độ ẩm cao, nóng lạnh thất thường (đặc biệt điều kiện nhà kính bệnh phát triển mạnh) Bệnh phát triể mạnh chân ruộng trũng, ứ đọng nước, đất trồng bị đóng váng sau mưa Nguồn bệnh tồn chủ yếu đất tàn dư trồng dạng hạch nấm, sợ nấm bào tử phân sinh Phòng trừ: Luân canh với lúa nước – năm để hạn chế tích lũy nguồn bệnh đất Cày xâu để chôn vùi hạch nấm, bừa đất kỹ, để ải, bón vơi tiêu diệt nguồn bệnh đất Đốm Cercospora (Cercospora leaf spot) Tác nhân: Bệnh gây Cercospora cruenta Sacc thuộc ngành Ascomycota, lớp Ascomycetes, Mycosphaerellales, họ Mycosphaerellaceae, chi Cercospora Ký chủ: Bệnh hại phổ biến họ đậu (đậu đen, đậu đũa, ) d e f g a b c d e 1989) P syringae pv Syringae tác nhân gây bệnh phổ biến rộng rãi khu vực sản xuất đậu: Wisconsin, Hoa Kỳ P syringae pv syringae phát ngô; sồi, lúa mạch đen (Lindemann et al., 1984) Phân bố: Pseudomonas syringae tác nhân gây bệnh phổ biến giới, có mặt khắp châu lục (châu Á, châu Âu ) Triệu chứng: Ban đầu triệu chứng xuất đốm nhỏ màu xanh vàng sau đốm phát triển thành đốm nâu hoại tử đặc trưng đường kính khoảng 3-8mm thường có viền vàng hẹp Các vết đốm lan rộng, kết hợp lại, rơi cho xuất rách Đốm nâu sâu hình thành Nếu bệnh xảy sớm, bị cong xoắn điểm bị nhiễm nấm gây bệnh Phát sinh phát triển: Phòng trừ: Chấm đỏ (Common bacterial blight) Tác nhân: Xanthomonas campestris pv phaseoli (Smith) Dye vi khuẩn gram âm hình gậy có long roi, khuẩn lạc có màu vàng, nhầy Ký chủ: Bệnh gây hại nhiều thuộc họ đậu (đậu đũa, đậu xanh…) Tầm quan trọng: Bệnh gây hại nghiêm trọng họ đậu, gây giảm xuất khả kiểm sốt bệnh khó khăn Phân bố: Bệnh phân bố phổ biến vùng khí hậu nhiệt đới, cận nhiệt đới ôn đới Triệu chứng: X axonopodis pv phaseoli tạo triệu chứng tương tự lá, quả, thân hạt giống ban đầu vết bệnh điểm nhỏ xanh vàng Các điểm nhỏ mở rộng chuyển sang màu nâu gây hủy hoại mô Vết bệnh bao quanh viền màu vàng sáng (đơi vết bệnh khơng có quầng) f g C a b c d Phát sinh phát triển: Bệnh phát triển mạnh điều kiện nhiệt độ cao, mưa nhiều (vùng nhiệt đới) Nguồn bệnh tồn hạt, tàn dư thực vật bị nhiễm bệnh Vi khuẩn lan truyền nhờ nước mưa, vết thương giới qua hạt giống Phòng trừ: Sử dụng hạt giống bệnh, xử lý hạt giống trước gieo trồng Dùng giống kháng bệnh Loại bỏ tàn dư bệnh Bệnh virus Khảm thường đậu (Bean common mosaic virus) Tác nhân: Bệnh Bean common mosaic virus (BCMV) gây Virus có dạng sợ mềm, kích thước 750 × 15nm Phân bố: BCMV gây hại khắp vùng trồng đậu giới, đặc biệt nước có khí hậu ơn đới, cận nhiệt đới nhiệt đới Triệu chứng: Triệu chứng chủ yếu thể bệnh Triệu chứng bệnh xuất đậu nảy mầm làm sò co lại, hai mép uốn cong, biến dạng Trên thật có nhiều dạng triệu chứng khảm xanh nhạt, xanh đậm, biến dạng có chấm vàng Cây bị bệnh sinh trưởng giảm, sơ trường hợp bị chết Phát sinh phát triển: e a b c d e 2.2 Hình thái đặc tính chống chịu: BCMV có dạng sợi mềm, nhiệt đọ hoạt tính từ 50 – 65oC, ngưỡng pha loãng từ 10-3 – 10-4, thời gian tồn giọt dịch nhiệt độ phòng – ngày Khả lan truyền: virus chuyền qua 11 lồi rệp theo kiểu khơng bền vững, qua tiếp xúc học qua hạt giống Phạm vi ký chủ: phổ kí chủ BCMV hẹp, chủ yếu gây hại đậu rau Phòng trừ: Dùng hạt giống bệnh, sử lý nhiệt trước 34 – 35oC vài phút đến vài trước gieo Phịng trừ trùng mơi giới biện pháp hóa học, sinh học, giới Chọn tạo giống chống chịu bệnh Luân canh với trồng khác họ để cắt đứt nguồn bệnh vụ Kudzu mosaic virus (KuMV) Tác nhân: Kudzu mosaic virus (KuMV) begomovirus có gen kép Phân bố: KuMV phát Việt Nam vào năm 2005 (Hà Viết Cường cs.,2010) phát sắn dây Trung Quốc năm 2008 (mã số GenBank FJ539014) KuMV virus thuộc nhóm Legumovirus phân bố chủ yếu châu Á, châu Âu, châu Phi Triệu chứng: Cây nhiễm bệnh biểu đốm biến vàng lá, sau triệu chứng khảm vàng rõ rệt theo bị nhăn Cây lùn, còi cọc, phát triển (Hà Viết Cường., 2010) Phát sinh phát triển: Phòng trừ: MYMV Những nghiên cứu nước 2.2.1 Tình hình sản xuất họ đậu Việt Nam Cây họ đậu ba loài trồng quan trọng Việt Nam (chỉ đứng sau lúa ngô), năm gần nhu cầu sử dụng họ đậu ngày tăng, đậu tương phục vụ cho chăn nuôi, loại đậu rau cung cấp thực phẩm cho người, lạc, đậu xanh diện tích sản lượng sản xuất đậu rau Việt Nam tăng lên rõ rệt 2.2.2 Vùng sản sản xuất rau huyện Mai Sơn tỉnh Sơn La Sơn La tỉnh miền núi Tây Bắc Việt Nam, có diện tích tự nhiên 1.417.444 ha, chiếm 4,27% tổng diện tích nước, đứng thứ số 64 tỉnh thành phố nước Sơn La có khí hậu nhiệt đới gió mùa vùng núi, mùa đơng lạnh khơ, mùa hè nóng ẩm mưa nhiều Địa hình bị chia cắt sâu mạnh hình thành nhiều tiểu vùng khí hậu cho phép phát triển sản xuất nông - lâm nghiệp phong phú Vùng Cao nguyên Mộc Châu phù hợp với trồng nuôi vùng ôn đới Vùng dọc sông Đà phù hợp với rừng nhiệt đới xanh quanh năm Sơn La có độ cao trung bình 600 – 700m so với mặt biển, địa hình chia cắt sâu mạnh, 97% diện tích tự nhiên thuộc lưu vực Sơng Đà, Sơng Mã Có cao nguyên Mộc Châu Sơn La - Nà Sản Trong năm gần đây, diện tích rau huyện Mai Sơn phát triển nhanh quy trình sản xuất mang tính chun nghiệp ngày cao Ước tồn huyện có khoảng 350 đất trồng rau, tập trung chủ yếu Cò Nòi, Mường Bon, Chiềng Mung thị trấn Hát Lót Nhờ ứng dụng kỹ thuật tốt nên suất rau trung bình đạt 15-17 tấn/ha Đặc biệt, xã Mường Bon xây dựng mô hình trồng rau Mé, Mai Tiên khơng tiêu thụ địa phương mà cịn cung cấp cho thị trường thành phố, huyện tỉnh đến mua vườn… Tại Cò Nòi, nhiều năm Bình Minh, Mé Lếch, tiểu khu Thống Nhất, tiểu khu 1, hình thành quy trình chặt chẽ từ trồng đến thu hoạch tiêu thụ Hầu hết vùng trồng rau Cị Nịi có hệ thống thương lái đến vườn thu mua Ở Mường Bon, Những nông dân trồng rau nắm rõ yêu cầu an toàn vệ sinh thực phẩm Hầu hết tuân thủ bón phân, hạn chế phun thuốc, cách ly thời gian thu hoạch đảm bảo an tồn; chí nhiều nơi áp dụng trồng rau nhà lưới hiệu Trở ngại chi phí đầu tư cho rau cao… Ngồi ra, giá bán khơng chênh lệch nhiều so rau thơng thường, việc mở rộng diện tích rau cịn hạn chế 2.2.3 Các bệnh hại đậu rau Viêt Nam Theo giáo trình bệnh VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm nghiên cứu Điều tra: Điều tra đánh giá diễn biến bệnh thực huyện Mai Sơn (Sơn La) Thí nghiệm phịng: Nghiên cứu tiến hành Trung tâm bệnh nhiệt đới, Học viện Nông nghiệp Việt Nam 3.2 Đối tượng nghiên cứu Bệnh :Các bệnh hại đậu rau (bệnh nấm, vi khuẩn, virus, tuyến trùng) Cây: đậu rau số loài đậu đỗ khác 3.3 Thời gian nghiên cứu Từ tháng 6/2014 đến tháng 12/2014 3.4 Vật liệu nghiên cứu 3.4.1 Cây thí nghiệm Các lồi đậu rau trồng phổ biến vùng trồng rau huyện Mai Sơn tỉnh Sơn La Một số giống đậu đỗ trồng Trung tâm bệnh nhiệt đới 3.4.2 Mơi trường • Mơi trường WA (Water agar): - Agar: 20 g - Nước: 1000 ml Đun 15g agar 800 ml nước cho tan thạch Bổ xung nước cho đủ 1000 ml Hấp khử trùng 121OC/20 phút, để nguội khoảng 55-60OC trước rót đĩa Mơi trường WA thường sử dụng để làm môi trường phân lập nấm, làm giá thể cho bào tử nảy mầm trước cấy đơn bào tử • Mơi trường PDA (Potato Dextrose Agar): Khoai tây: 200g Dextrose (D-glucose): 20 g Agar: 20 g Nước: 1000 ml Khoai tây rửa sạch, cắt lát, đun nước Lọc qua vải lọc, bổ sung agar vào dịch lọc, đun cho tan agar Bổ xung nước cho đủ 1000 ml Hấp khử trùng 121oC/20 phút Để nguội 55-60 OC trước rót đĩa petri Mơi trường PDA thường sử dụng để cấy truyền nấm sau phân lập mơi trường WA, giúp đánh giá hình thái tản nấm nuôi cấy vi sinh vật từ nguồn chuẩn ni cấy điều kiện chuẩn • Môi trường King’B (KBM): Agar: 15g Proteose peptone số 3: 20g Glycerol, C.P.: 10ml K2HPO4: 1,5g MgSO4: 1,5g Nước cất: 1l Trộn chung tất thành phần ngoại trừ MgSO Chỉnh độ pH tới 7,2 ± 0,2 Từ từ thêm MgSO4 lắc Hấp đổ vào đĩa petri 90mm Dùng để phân lập nuôi cấy số loại vi khuẩn 3.4.3 Vật liệu ELISA phát virus - 3.4.4 Mồi PCR phát virus STT Tên mồi Trình tự Mục đích CTTTGAGACTCGCATTATTCTC Dùng để phát DNA – A KuMV KuA – F1 KuA – R1 KuBSeqFor1 TCAATTCAGGCGATACAACAT C TCGCCATTAATACCACGAAC KuBSeqRev CTGCTGCTTGTTCTATTGACG MYA-For MYA Rev Dùng để phát DNA – B KuMV Dùng để phát MYMV 3.4.5 Chất kháng sinh Các kháng sinh sử dụng nghiên cứu gồm: Rifampicin, kanamycin, streptomycin, tetracylin Các kháng sinh chuẩn bị dạng dung dịch gốc sau: • Rifampicin 34 μg/μl: hịa 0,034 g ml Methanol • Kanamycin 100 μg/μl: hịa 0,1 g ml nước cất hai lần • Streptomycin 50 μg/μl: hòa 0,05 g ml nước cất hai lần • Tetracylin 12,5 μg/μl: hịa 0,012 g ml ethanol 70 % Các kháng sinh bảo quản tủ lạnh sâu – 20oC, rifampicin kanamycin bọc kín giấy bạc 3.4.6 Hóa chất • Cồn tuyệt đối • Cồn (ethanol) 70%, NaOCl Ca(OCl)2 1-2 % • Các hóa chât dùng phản ứng ELISA PCR 3.4.7 Kit thương mại • Kít PCR: GoTaq Green (hãng Promega) chứa sẵn đệm phản ứng, Taq polymerase, dNTPs 3.4.8 Các thiết bị chủ yếu Kính hiển vi Kính hiển vi soi Buồng cấy vô trùng Nồi hấp Tủ ấm Bếp điện Máy PCR Thiết bị điện di Máy đọc ELISA 10 Máy li tâm 3.5 Phương pháp • Điều tra đậu rau • Đếm tồn cây/giống • Tính Tỷ lệ nhiễm loại bệnh • Giai đoạn điều tra: sau trồng 30, 45 60 ngày 3.5.1 Thu mẫu Điều tra thu mẫu theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia phương pháp điều tra phát dịch hại trồng 3.5.2 Phân lập nấm vi khuẩn 3.5.2.1 Phân lập bảo quản nấm  Phân lập nấm • Chuẩn bị: Dao mổ, kéo, panh, que cấy nấm Đèn cồn, giấy thấy thấm vơ trùng, thớt nhựa, đĩa mơi trường Hố chất khử trùng: Cồn (ethanol) 70%, NaOCl Ca(OCl)2 1-2 % • Trình tự: Chọn mẫu bệnh có triệu chứng điển hình, Rửa mẫu bệnh đất cát nước vòi (đặc biệt mẫu rễ) Cắt chọn mảnh mơ bệnh thích hợp Khử trùng bề mặt mảnh mô dung dịch khử trùng bề mặt Ethanol 70%, NaOCl Ca(OCl) 1-2 % Thời gian khử trùng từ 1/2-3 phút tùy vật liệu Rửa lại nước cất vô trùng Thấm khô mảnh mô giấy thấm vô trùng Cắt tiếp dao mổ vô trùng mảnh mô thành mảnh nhỏ 1-3 mm (chứa phần mô bệnh mô khoẻ) Dùng panh vô trùng đặt mảnh nhỏ vào môi trường WA Ghi cẩn thận bút viết kính: Ngày, cây, bệnh Để mẫu điều kiện nhiệt độ ánh sáng thích hợp Theo dõi phát triển sợi nấm mọc từ mô bệnh Khi nấm phát triển từ mô bệnh môi trường, lấy phần đỉnh sợi nấm chuyển sang môi trường thích hợp PCA, PDA  Bảo quản nấm • Bảo quản nước cất: Cắt mẩu thạch vuông cm từ viền tản nấm mọc mạnh cịn Đặt miếng thạch có chứa nấm vào lọ McCartney có chứa nước vô trùng vặn chặt nắp Lọ bảo quản để nơi mát Không bảo quản tủ lạnh số lồi bị chết nhiệt độ thấp Các mẫu cất giữ từ tháng đến năm, tùy theo loài Các mẫu hồi phục cách lấy miếng thạch từ lọ cấy lên mơi trường cho mặt có nấm tiếp xúc với bề mặt môi trường Cần đảm bảo nước miếng thạch không bị tạp vi khuẩn (sự có mặt vi khuẩn làm cho nấm chết nhanh chóng) • Bảo quản hạch nấm: Hạch nấm lưu giữ thời gian dài điều kiện khô mát lọ thủy tinh nhỏ có nắp vặn Đây kỹ thuật thích hợp để lưu giữ loài Sclerotium rolfsii, Sclerotinia sclerotiorum, Rhizoctonia spp (các loài tạo hạch nấm) Tại vùng nhiệt đới tốt nên lưu giữ hạch nấm giấy thấm tiệt trùng đặt bên silica gel màu xanh lọ McCartney (hoặc lọ có nắp vặn tương tự) để đảm bảo ẩm độ thấp trình bảo quản 3.5.2.2 Phân lập bảo quản vi khuẩn  Phân lập vi khuẩn - Thu mẫu đất chất có vi khuẩn từ 100-150g, trường hợp số vi khuẩn có mặt mẫu phải ni tích lũy cách ủ mẫu, bổ sung chất dinh dưỡng điều kiện lý, hóa cần thiết bổ sung chất ức chế sinh trưởng vi sinh vật kèm - Cân lấy 1g mẫu có vi khuẩn cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng, khuấy đũa thuỷ tinh cho tan hết mẫu Ta có dung dịch mẫu pha loãng 10-1 lần - Lấy 1ml dịch huyền phù độ pha loãng10-1 đưa vào ống nghiệm chứa 9ml nước vơ trùng Trộn ta có dịch pha lỗng 10-2 lần - Tiếp tục làm trên, ta có loạt độ pha loãng dịch mẫu khác ý - Cấy dịch huyền phù lên môi trường đặc hộp Petri - + Dùng pipet vô trùng nhỏ 1ml dịch huyền phù pha loãng nồng độ định lên bề mặt môi trường hộp Petri + Dùng que trang dàn giọt dịch huyền phù tồn bề mặt mơi trường hộp thạch + Đậy hộp Petri, gói lại đặt vào tủ ấm nhiệt độ 28 - 300C 48 – 72h - Trộn dịch mẫu pha lỗng mơi trường thạch nóng chảy Dùng pipet vơ trùng nhỏ 1ml dịch huyền phù pha loãng nồng độ định vào mơi trường thạch nóng chảy để nguội đến 45 - 500C bình nón, lắc Bổ sung thêm chất ức khuẩn khoảng 0,3-0,5‰, tiếp tục lắc lần đổ hộp Petri hộp cở 15ml Gói hộp Petri lại, đặt vào tủ ấm nhiệt độ 28 - 300C 48 - 72h - Phân lập vi khuẩn que cấy vòng + Nung đỏ đầu que cấy vịng, làm nguội khơng khí khoảng 15s Cho vòng que cấy chấm vào dịch huyền phù pha lỗng có chứa vi khuẩn cần phân lập + Tay trái mở nắp hộp thạch Đặt đầu que cấy vào góc hộp thạch, chấm nhẹ để loại bớt tế bào lần Từ điểm đẩy nhẹ đầu que cấy lướt nhanh bề mặt thạch theo đường zích zắc Xoay đĩa tiếp tục vạch đường zích zắc cho khơng trùng lên khoảng trống lại, nhằm tạo điều kiện cho khuẩn lạc mọc rời Đậy nắp hộp Khử trùng que cấy trước cắm vào giá + Các thao tác phải nhanh tay làm lửa đèn cồn đặt tủ cấy, đảm bảo vô trùng  Bảo quản vi khuẩn: + Cấy truyền định kỳ môi trường thạch nghiêng (1 tháng/1lần) + Giữ vi khuẩn nhiệt độ 4-50C tủ lạnh phòng lạnh + Trộn vi khuẩn với glycerol vô trùng với tỉ lệ 1:20 giữ nhiệt độ 30 C + Bảo quản vi khuẩn cát chủng có bào tử + Phương pháp đông khô v.v 3.5.3 Phương pháp xác định nhanh vi khuẩn kỹ thuật lam ép: • Nhỏ giọt nước cất lên lam • Dùng dao mổ cắt mảnh nhỏ mô mép vết bệnh (chứa phần bệnh phần khoẻ) • Đặt mảnh mô vào giọt nước đậy lamen • Quan sát dòng vi khuẩn tiết từ mảnh mơ kính hiển vi với vật kính x10, x40, x100 3.5.4 ELISA phát virus (BCMV) 3.5.4.1 Kỹ thuật ELISA trực tiếp kiểu DAS-ELISA (Double antibody sandwich ELISA) Cố định IgG đặc hiệu virus vào ELISA: IgG hoà dung dịch đệm phủ cho vào giếng với lượng 100µl/giếng Bản ELISA ủ hộp ẩm 37OC khoảng 2-4 Bản ELISA, thường cấu tạo polystirene có khả liên kết không đặc hiệu với protein liên kết với phân tử IgG (là protein miễn dịch) Sau ủ, giếng rửa đêm rửa nước Cố định dịch vào ELISA: Nghiền mẫu đệm chiêt mẫu thành dịch Dịch cho vào giếng với lượng100 µl/giếng Bản ELISA ủ 37OC khoảng 2-4 qua đêm 4-6 OC Nếu dịch có chứa virus virus liên kết đặc hiệu với IgG có sẵn giếng protein virus khác không liên kết Sau ủ, ELISA rửa bước Cố định IgG liên kết enzim: Hoà IgG liên kết enzim (IgG-E) đệm liên kết cho vào giếng với lượng 100 µl/giếng IgG giống IgG bước khác liên kết từ trước với enzim Alkaline Phosphatase (AP) Bản ELISA ủ rửa bước Cố định chất đánh giá kết quả: Hoà chất đệm chất theo tỷ lệ 0.6mg/ml) cho giếng với lượng100 µl /giếng Chất Nitrophenyl phosphate (NPP) Bản ELISA ủ nhiệt độ phòng hộp ẩm tối 60 phút Phản ứng hoá học NPP bị thuỷ phân thành Nitrophenol phosphate xúc tác enzim AP Nitrophenol phosphate chất có màu vàng, nhận biết mắt máy đọc ELISA (máy so màu) Hiển nhiên, nồng độ NPP giống giếng nên giếng có màu vàng đậm chứng tỏ nồng độ enzim cao tức nồng độ virus mẫu thử cao Có thể ngừng phản ứng thuỷ phân cách bổ sung dung dịch NaOH 3M với lượng 25-50 µl /giếng 3.5.4.2 Phản ứng ELISA gián tiếp kiểu PTA-ELISA (Plate Trapped Antigen Indirect ELISA) Cố định dịch vào ELISA: Nghiền mẫu đệm phủ cho 100µl/giếng ủ ELISA qua đêm 4-6 OC hộp ẩm Sáng hôm sau, rửa lần đệm rửa Protein virus dịch (nếu có) liên kết không đặc hiệu vào thành giếng Cố định IgG thỏ đặc hiệu virus vào ELISA: Hoà IgG đặc hiệu virus đệm huyết cho 100µl /giếng ủ ELISA 25OC 1-2 hộp ẩm Rửa ELISA bước Cố định IgG đặc hiệu IgG thỏ liên kết AP vào ELISA: Hoà IgG đặc hiệu IgG thỏ liên kết AP đệm liên kết cho 100µl /giếng ủ 25OC 1-2 IgG liên kết AP thứ IgG tạo tiêm IgG thỏ vào loài động vật khác thỏ (chẳng hạn dê) nên không liên kết với virus mà liên kết với IgG thỏ đặc hiệu virus bước Sau ủ, rửa bước 3.5.5 3.5.6 - Cố định chất vào ELISA: Thực tương tự DASELISA PCR phát virus (MYMV, KuMV) Các bước tiến hành PCR xác định bệnh hại: Thiết kế mồi: tự thiết kế mồi lựa chọn mồi từ nghiên cứu công bố Tách chiết acid nucleic tổng số từ mô Tiến hành PCR Kiểm tra, đánh giá kết điện di Lây nhiễm nhân tạo nấm Cercospora số loài đậu đỗ Thu mẫu bệnh nấm Cercospora đậu đũa Cạo bào tử từ vết bệnh cho vào nước cất vơ trùng Kiểm tra mật độ bào tử có dung dịch (mật độ bào tử n 105 phù hợp để lây nhiễm nhân tạo) Tiến hành lây nhiễm bệnh nhân tạo lên lá: Nhỏ vài giọt dịch bào tử lên số Nhỏ vài giọt nước cất vô trùng lên số làm đối chứng Đặt chậu tủ ẩm che túi ny lông nhà lưới, tránh ánh nắng trực tiếp Kiểm tra so sánh lây bệnh với đối chứng Quan sát ghi nhận triệu chứng so sánh triệu chứng với triệu chứng quan sát đồng ruộng 4.1 4.1.1 - NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Điều tra tình hình bệnh hại đậu rau Mai Sơn – Sơn La Điều tra bệnh hại đậu rau Đối tượng điều tra: đậu rau Thời gian điều tra: điều tra định kỳ tháng lần Chỉ tiêu: xác định tỷ lệ bệnh, số bệnh Điểm Số lượng Bệnh hại điều tra (n) (xã) ( hay giai đoạn sinh trưởng ? ??? ) cò nòi Mường bon Chiềng mung Điều tra đợt Điều tra đợt Tỷ lệ bệnh Tỷ lệ bệnh Chỉ số bệnh Chỉ số bệnh Điều tra đợt Tỷ lệ Chỉ số bệnh bệnh Bảng.1 điều tra tình hình bệnh hại A Mai Sơn – Sơn La Điều tra Tỷ lệ Chỉ s bệnh bệnh 4.1.2 - Điều tra trạng sử dụng thuốc BVTV bệnh hại Phỏng vấn nơng dân Chỉ tiêu: hiểu biết bệnh nông dân (nông dân có biết bệnh khơng, bệnh có quan trọng khơng, sử dụng thuốc BVTV nào, cách phòng trừ khác ) Bảng Tình hình sử dụng thuốc BVTV A Điểm Bệnh Thuốc điều tra Tên Cách sử (xã) thuốc dụng 1 2 4.2 4.2.1 Xác định bệnh nấm Triệu chứng bệnh nấm đậu rau Cây Bệnh Lá 1 2 Triệu chứng Thân Quả Đặc điểm hình thái số nấm gây bệnh đậu rau Bệnh Hình thái Bào tử Cành Đĩa cành Quả phân sinh BTPS cành Nấm - Hình dạng - kích thước 4.2.2 4.2.3 4.2.4 4.3 4.3.1 Tản nấm Xác định nấm gây bệnh hại phương pháp giải trình tự vùng ITS Lây nhiễm nhân tạo số loại nấm gây bệnh Xác định bệnh vi khuẩn Triệu chứng bệnh vi khuẩn đậu rau Cây Bệnh Triệu chứng Lá Thân Quả Rễ 1 Rễ 4.3.2 4.3.3 4.3.4 4.4 4.4.1 4.4.2 4.4.3 2 Đặc điểm hình thái số vi khuẩn gây bệnh đậu rau Vi Bệnh Hình thái khuẩn Khuẩn Tế bào lạc vk1 vk2 Gram Xác định vi khuẩn gây bệnh hại đậu rau phương pháp giải trình tự vùng 16SRNA Lây nhiễm nhân tạo số lồi vi khuẩn gây hại đậu rau Xác định bệnh virus Triệu chứng bệnh virus đậu rau ELISA phát virus đậu rau PCR RT – PCR phát virus đậu rau ... tài: ? ?Điều tra, xác định bệnh hại đậu rau huyện Mai Sơn, tỉnh Sơn La năm 2014? ?? 1.2 Mục đích Mục tiêu đề tài xác định thành phần mức độ gây hại bệnh hại đậu rau số xã huyện Mai Sơn 1.3 Yêu cầu Điều. .. Điều tra bệnh hại đậu rau (Mường Bon, Chiềng Mung Cò Nòi huyện Mai Sơn, tỉnh Sơn La) vụ hè thu năm 2014 Thu thập mẫu bệnh giám định bệnh dựa triệu chứng, dấu hiệu Xác định tác nhân gây bệnh ELISA,... mung Điều tra đợt Điều tra đợt Tỷ lệ bệnh Tỷ lệ bệnh Chỉ số bệnh Chỉ số bệnh Điều tra đợt Tỷ lệ Chỉ số bệnh bệnh Bảng.1 điều tra tình hình bệnh hại A Mai Sơn – Sơn La Điều tra Tỷ lệ Chỉ s bệnh bệnh