3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.2.Phương pháp kiểm tra virus bằng PCR
3.3.2.1.Chiết DNA tổng số từ mô lá
DNA tổng số từ mô lá ựược chiết bằng NaOH (Wang và cs, 1993): Cho khoảng 50 mg mô lá mẫu bệnh vào tube 1,5 mL, cho tiếp 500 ộl dung dịch NaOH 0,5 M vào tube 1,5mL, dùng chày nhựa chuyên dụng ựể nghiền nhuyễn mẫu lá. Lấy 100 ộl dung dịch ựệm Tris 0,1 M, pH = 8 vào tube 1,5mL mới. Sau khi nghiền mẫu xong lấy 2 ộl dịch nghiền cho vào tube 1,5mL chứa dung dịch ựệm Tris 0,1M, pH = 8. Dịch hòa loãng này ựược dùng ựể chạy PCR.
3.3.2.2. Tiến hành phản ứng PCR
+ Các phản ứng PCR ựược thực hiện trong tube 0,5 mL với tổng thể tắch phản ứng 20 ộL, thành phần của mỗi phản ứng PCR:
H2O : 16,5ộl 10* Dream Taq BF : 2ộl
dNTPs : 0,3ộl Mồi xuôi dòng 20ộM : 0,3ộl
Mồi ngược dòng 20ộM : 0,3ộl Dream Taq : 0,1ộl DNA : 0,5ộl Tổng thể tắch : 20ộl + Quy trình thực hiện phản ứng PCR: 94oC 4 phút x 1 94 oC 52-54 oC 72 oC 30 giây 35 giây 1 phút x 35 72 oC 4 phút x 1 3.3.2.3. Mồi PCR
Các mồi sau (Bảng 2) ựược sử dụng ựể phát hiện begomovirus bằng PCR.
Bảng 3.2. Các mồi ựược sử dụng trong nghiên cứu
No Mồi Trình tự Mục ựắch, kắch thước 1 BegoAReV1 5Ỗ-ATHCCMDCHATCKTBCTiTGCAATCC*- 3Ỗ 2 BegoAFor1 5Ỗ-TGYGARGGiCCiTGYAARGTYCARTC* - 3Ỗ Phát hiện Begomovirus, 1.2 kb 3 LegA-cpF1 GGTCAAGTKTTYAACATGTATGA Phát hiện các begomovirus ựậu ựỗ dựa trên gen CP, 280 bp
4 LegA-cpR1 GCATGAGTACATGCCATATAC 5 MYA-For1 CAATTTGAGTGCTGTGTTATCAG 6 MYA-Rev1 CTCAATAGTGGATCCAAGTTAC
Phát hiện ựặc hiệu MYMV, 566 bp
7 KuA-For1 CTTTGAGACTCGCATTATTCTC 8 KuA-Rev1 TCAATTCAGGCGATACAACATC
Phát hiện ựặc hiệu KuMV, 565
3.3.2.4.Chạy ựiện di sản phẩm PCR và xem kết quả phản ứng
Chuẩn bị:
- Pha ựệm ựiện di TAE 1x từ dung dịch gốc (TAE 5x): Lấy 100ml TAE 5x cho vào cốc ựong, bổ sung thêm 400 ml nước cất, lắc ựều.
- Chuẩn bị bản gel: Cân 1g agarose cho vào trong lọ, bổ sung 100ml TAE 1x, sau ựó lắc nhẹ lọ ựể hoà tan agarose, sau khi agarose ựã tan hoàn toàn ựun trong lò vi sóng 3 Ờ 4 phút, bổ sung Ethidium Bromide theo tỷ lệ cứ 100 ml dung dịch gel cho 4ộl, lắc ựều, ựể lọ ở nhiệt ựộ phòng.
- Khi dung dịch agarose 1% nằm trong khoảng 40oC thì ựổ vào khuôn có ựặt lược tạo lỗ khuôn. để khuôn ở nhiệt ựộ phòng.
- Lấy các tube 0,5mL ựã hấp khử trùng, ựánh số thứ tự. Cho vào mỗi tube 4 ộl Loading Dye X6, ựảo ựều và Spin trong 5 giây.
Tiến hành:
Sau 30 phút ựể khuôn ở nhiệt ựộ phòng thì tiến hành rút lược (cầm chắnh giữa lược, rút ựều tay ựể không vỡ giếng).
- đặt cả khay khuôn gel vào bể ựiện di, ựổ dung dịch ựệm TAE 1x phủ ngập gel.
- Nhỏ mẫu vào giếng: Dùng pipet hút 7 Ờ 10 ộl dung dịch mẫu cần chẩn ựoán cho vào mỗi giếng theo thứ tự. Ngoài các mẫu chạy PCR còn nhỏ thêm 1 giếng Marker làm chuẩn.
- Cắm nguồn ựiện cho máy ựiện di, ựặt ở hiệu ựiện thế 100V trong 25 - 30 phút, tắt máy ựiện di, ựặt bản gel ựược kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại, quan sát các vệt DNA hiện lên và chụp ảnh.